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ISSN (EN LINEA): 1850 - 1158

ESTUDIO CINETICO DE LA ACTIVIDAD PROTEOLITICA DE LA ENZIMA FICINA KINETIC STUDIES OF THE ACTIVITY OF THE ENZYME FICIN.
M.G. Bertoluzzo, S. M. R. Bertoluzzo, R. Rigatuso
Facultad de Ciencias Bioqumicas y Farmacuticas - Universidad Nacional De Rosario TALLER DE FISICA Suipacha 531 - (2000) Rosario - Argentina Facultad de Ciencias Mdicas - Universidad Nacional De Rosario Santa Fe 3100- (2000) Rosario- Argentina e-mail: mgbysmb@cablenet.com.ar

La ficina es una enzima proteoltica proveniente del ltex de Ficus carica (higuera). Su actividad proteoltica se manifiesta al desnaturalizar sus protenas sustrato mediante la ruptura de los enlaces disulfuro generados por aminocidos sulforados (cistena). Pertenece al grupo de las tiol proteasas y es muy similar a la papana que se extrae del ltex de papaya. Como la extraccin de ltex de la planta se hace difcil en invierno, se dise y construy a escala de laboratorio, un liofilizador para conservar ltex de higuera por largo tiempo y a temperatura ambiente. De esta manera se puede obtener ficina para su uso en el laboratorio a bajo costo y sin modificacin de su actividad enzimtica. El objetivo de este trabajo es determinar la actividad enzimtica de la ficina a partir del ltex de higuera liofilizado.

Palabras Claves: liofilizador, ficina, actividad enzimtica


Ficin is a proteolytic enzyme obtained from latex of Ficus carica. This protein belongs to the group of thiol protease enzymes and is very similar to papain from latex of papaya. As the extraction of latex from fig tree becomes difficult in winter, a lyophilizator was designed and built to operate at laboratory scale in order to conserve the latex for a long time at room temperature. With this procedure, ficine for laboratory use can be obtained at low cost. The objective of this work is to determine the enzymatic activity of ficin from lyophilized fig tree latex.

Key Word: lyophilizator, ficin, enzymatic activity

I. INTRODUCCIN La ficina de ltex de diversas especies de Ficus (familia moreceas) al igual que la papana obtenida del fruto inmaduro de la papaya (familia cariccea) es una enzima proteoltica. Hidroliza pptidos, amidas y steres, y ha sido tambin denominada pepsina vegetal. A diferencia de la pepsina, acta tanto en medio cido como en medio neutro o alcalino. Se ha utilizado en la digestin de protenas, para el ablandamiento de carnes y en la fabricacin de quesos. Pertenece al grupo de las tiol proteasas (grupo 3.4.4), ya que en el sitio activo se encuentra un grupo sulfhidrilo (-SH). La actividad de esta enzima depende de la edad de la planta, as como tambin de la poca del ao en que se realiza la extraccin del mismo. En invierno la extraccin de ltex es muy limitada.(1, 2) En la figura 1 se muestra una micrografa de micelas de ltex de higuera. Se dise y construy a escala de laboratorio, un liofilizador para conservar ltex de higuera por largo tiempo y a temperatura ambiente. De esta manera se puede obtener ficina para su uso en el laboratorio a bajo costo y sin modificacin de su actividad enzimtica. La liofilizacin es un procedimiento de secado cuyo principio es la sublimacin del hielo de un producto congelado. Es un proceso utilizado principalmente en la

industria alimentaria para la eliminacin de agua mediante desecacin al vaco y a muy bajas temperaturas. Es una tcnica bastante costosa comparada con los mtodos tradicionales de secado, pero origina productos de una mayor calidad. En nuestro caso, el proceso se desarrolla en dos fases, una fase de sublimacin propiamente dicha, llamada deshidratacin primaria, que elimina alrededor del 90% del agua y una fase de desorcin o de desecacin secundaria, que elimina el 10% de agua ligada restante. Como la sublimacin slo puede tener lugar a una temperatura inferior a 0C y a una presin inferior a 4,00 mmHg, en la primera etapa se trabaja con la muestra congelada y una bomba de vaco (Siemens-Schuckert:220 V, 25 A). En la segunda etapa se realiza una evaporacin al vaco pero a una temperatura entre 20C y 60C. A las presiones aplicadas en liofilizacin, el vapor de agua ocupa volmenes muy grandes, y como ste no puede ser absorbido por la bomba y es indispensable eliminarlo, se coloc un baln de destilacin con una serpentina de cobre montada dentro de su cuello, por la cual circula una solucin de NaCl a 0C.(3) En este trabajo analizamos la actividad enzimtica de ltex de higuera liofilizado.

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d[ P] = k 2 [ ES ] dt
Como la concentracin total de enzima ([Eo]) es:

[ E o ] = [ E ] + [ ES ]
Obtenemos finalmente: d [ P] [S ] [S ] = k 2 [Eo ] = Vmx dt K M + [S ] K M + [S ] II. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Se recolectaron muestras de ltex de higuera; parte de las muestras se congel para su posterior liofilizacin mediante un equipo que bsicamente consta de una cmara hermtica donde se coloca el producto a liofilizar congelado y se procede a realizar vaco en la misma hasta alcanzar una presin por debajo de la presin de vapor correspondiente al hielo a la temperatura de congelamiento. (Figura 2)

Fig. 1: Micelas de ltex de higuera, vistas al microscopio. 40X

La cintica de Michaelis-Menten describe la velocidad de reaccin de muchas reacciones enzimticas. Este modelo es vlido cuando la concentracin de sustrato es mayor que la concentracin de enzima, y para condiciones de estado estacionario, o sea que la concentracin del complejo enzima-sustrato es constante. Para determinar la velocidad mxima (Vmx) de una reaccin enzimtica, la concentracin de sustrato ([S]) se aumenta hasta alcanzar una velocidad constante de formacin de producto. En este caso, los sitios activos de la enzima estn saturados con sustrato. Las enzimas pueden ser caracterizadas por la concentracin de sustrato a la cual la velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad mxima. Esta concentracin de sustrato se conoce como constante de Michaelis-Menten (KM). Segn el modelo propuesto, las reacciones catalizadas enzimticamente ocurren en dos etapas: 1-Formacin del complejo enzima-sustrato (ES) 2-Formacin del producto (P) y enzima libre (E): Reaccin irreversible

E+S

k1 k 1

ES k 2 E + P
Fig. 2. Equipo de liofilizacin

Siguiendo la aproximacin del estado estacionario, la concentracin del complejo enzima-sustrato (ES) es pequea y se mantiene casi constante a lo largo de la reaccin enzimtica.

d [ ES ] = k1 [ E ][ S ] k 1 [ ES ] k 2 [ ES ] = 0 dt k [ E ][ S ] [ ES ] = 1 k 1 + k 2
Definimos la constante de Michaelis-Menten (KM) como:

KM =
Entonces,

k 1 + k 2 k1

[ ES ] =
La velocidad de reaccin es:

[ E ][ S ] KM

Obtenida una dilucin de ltex recin extrado de las hojas de higuera y muestras de ltex liofilizadas se determin su actividad enzimtica utilizando BAPNA (N--benzoyl-bL-Arginine4-nitroanilide- hydrocloride) como sustrato. La interaccin especfica con BAPNA se produce a travs del residuo de fenilalanina. La hidrlisis de este enlace peptdico genera entre otros productos de reaccin, la p-nitroanilina, de color amarillo, lo que permiti seguir espectrofotomtricamente el progreso de la reaccin mediante la medida de la velocidad de formacin de ese producto. Para ello se midi el aumento de absorbancia de la disolucin en funcin del tiempo, a la longitud de onda de mxima absorcin de la p-nitroanilina 400nm, para distintas concentraciones iniciales de BAPNA(4).

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Tabla I Velocidad inicial para distintas concentraciones de BAPNA

La cuantificacin del producto p-nitroanilina se determin usando el coeficiente de extincin (405=9890 M-1cm-1) y los datos se ajustaron con la ecuacin de Michaelis-Menten. La concentracin de enzima Eo se determin midiendo la absorbancia de la muestra a 280 nm y aplicando la relacin(1):
mg Pr otena = A280 nm x0.47 ml
1/Vo (s/Ab)

[BAPNA] M 0,0006 0,0011 0,0017 0,0023 0,0029 0,0038

Vo Ab/s 0,00118 0,00220 0,00316 0,00405 0,00481 0,00578

1000 800 600 400 200 250 500 750 1000 1250 1500 1750 1/[BAPNA] M-1

Vmx= (0.0200.001) Ab/s Km=(0.00920.0005) M

III-RESULTADOS Y CONCLUSIONES En la figura 3 se muestra la absorbancia en funcin del tiempo para distintas concentraciones de BAPNA. Las pendientes de las rectas representan las velocidades iniciales Vo. (Tabla I)
[BAPNA] 0.00383M 0.00295M 0.00230M 0.00174M 0.00113M 0.00058M

2,4 2,0 1,6 Abs 1,2 0,8 0,4 0,0 0

Fig. 4. Grfico de Lineweaver-Burk.

50

100

150

200

250

Tiempo(s)

La velocidad mxima obtenida para las muestras liofilizadas fue de (2.00.1)x10-6 M/s, para una concentracin de enzima de 1.7x10-5 M, obtenindose una constante cataltica de 0.119 s-1, similar a la obtenida para las muestras de ltex fresco. Las muestras liofilizadas mantienen intacta la actividad enzimtica, mientras que las muestras sin liofilizar guardadas en el freezer durante 5 meses mostraron desnaturalizacin de la protena y prdida de la actividad enzimtica. Referencias
1Liener, I.E., and Friedenson, B., Ficin. Meth. Enzymol.,19, 261-273 (1970). 2Caygill,J.C. Sulhydryl plant proteases. Enzyme and Microb. Technology, v. 1, p.233-42 (1979). 3-Mayer,L; Bertoluzzo, S.M.; Bertoluzzo, M.G. Conservacin de alimentos. Diseo y construccin de un liofilizador. Invenio 9(17), p. 147-157. (2006) 4-Cornely K.,et al, Kinetics of papain. J. of Chemical Education, vol. 76, 5, p. 644-645 (1999).

Fig. 3- Absorbancia en funcin del tiempo para los primeros 4 minutos de iniciada la reaccin.

La dependencia de Vo con la concentracin de BAPNA sigue la cintica propuesta por MichaelisMenten, la grfica de Vo en funcin de la concentracin de BAPNA es una hiprbola. A partir de estos datos construimos un grfico de Lineweaver-Burk y calculamos las constantes cinticas, KM y Vmx. (Figura 4).

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