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INTRODUO

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DOENAS CAUSADAS POR VRUS

Osmar Nickel

Com cerca de 30 anos de idade, ocupando uma rea aproximada de 30 mil hectares, em quatro Estados da Unio (RS, SC, PR e SP) a pomicultura brasileira se depara com questes de sanidade do material propagativo muito similares quelas j enfrentadas pelos pases tradicionais produtores de mas. Embora programas europeus e norteamericanos de limpeza clonal tenham sido iniciados em meados dos anos 50, ainda nos anos 80, a contaminao com vrus e doenas similares em pomares e viveiros de ma podia chegar at 60% dos clones amostrados. Isto d uma idia do carter de longa durao de um programa at a eliminao total de vrus e similares e da necessidade de permanente monitoramento. Assim, no surpreende que o material propagativo utilizado na implantao dos primeiros pomares brasileiros estivesse altamente contaminado e que at mesmo introdues recentes dos Estados Unidos, da Europa e do Japo ainda contenham vrus. Os vrus so agentes patognicos que se encontram, segundo definio consensual, alm da fronteira que delimita e agrupa os seres vivos; afetam o desenvolvimento das plantas, interferindo de forma parastica no metabolismo vegetal. Cerca de 30 doenas de macieiras so causadas por vrus, virides e agentes similares e, segundo a virulncia do isolado viral, a suscetibilidade do tecido afetado e

as condies ambientais, podem manifestar-se em folhas, flores, frutos, na casca e na madeira de troncos e em galhos estruturais, ramos e razes. A ttulo de simplificao da abordagem, far-se- distino entre dois grupos de vrus em macieiras: aqueles que produzem sintomas reconhecveis visualmente nas variedades comerciais e os chamados vrus latentes que exigem a indexagem (enxertia em plantas indicadoras lenhosas e inoculao mecnica em plantas herbceas, e testes serolgicos e moleculares) para sua deteco. No primeiro grupo incluem-se a depresso-do-lenho (Flat Limb), ruga-verde (Green crinkle), rachadura-estrela (Star crack) e o lenho-mole (Apple rubbery wood), de natureza ainda desconhecida, o vrus-do-mosaico-da-macieira(Apple mosaic virus, ApMV), e casca-spera (Apple rough skin). Por no produzirem sintomas visualmente perceptveis na maioria das cultivares comerciais, os vrus latentes podem passar despercebidos e ser propagados indefinidamente. Incluem-se neste grupo: vrus-do-acanalamento-dotronco-da-macieira (Apple stem grooving virus, ASGV), vrus-das-caneluras-dotronco-da-macieira (Apple stem pitting virus, ASPV), e o vrus da mancha clortica da folha da macieira (Apple chlorotic leafspot virus, ACLSV). Embora haja controversia, existem evidncias experimentais de que o sintoma epinastia e declnio do Spy (Spy epinasty and decline, SED) possa ser causado por ASPV, razo porque o mesmo, a ttulo

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de simplificao, abordado neste contexto, como sintoma de ASPV. H farta documentao cientfica sobre os efeitos negativos de vrus em macieiras. Entre os danos causados por infeces virais, destacam-se: Danos em mudas reduo do pegamento de enxertias de material infectado, vigor reduzido das mudas, cancros nos porta-enxertos sensveis e declnio da planta no viveiro ou aps a implantao do pomar. Reduo de produo de frutas pode variar de 16% a 84% segundo a variedade de ma e do isolado viral ou da mistura dos vrus. Reduo no crescimento das plantas reduo do calibre dos frutos, do tamanho e do vigor das plantas, do dimetro do tronco, do comprimento dos ramos laterais e da brotao. Aumento da suscetibilidade a infeces por fungos plantas infectadas so mais sensveis ocorrncia de podrides foliares e radiculares, cancros e pragas o que torna necessrio o aumento do uso de agrotxicos. Reduo da capacidade de aproveitamento de fertilizantes plantas livres de vrus crescem satisfatoriamente com doses menores de fertilizantes, reduzindo o impacto ambiental e o custo de produo. Reduo da armazenabilidade das frutas. Aumento da sensibilidade a geadas tardias pela induo de florao precoce de plantas infectadas.

e ornamentais alm de espcies de outros gneros. Sua relevncia econmica, em virtude do elevado potencial de destruio, grande, mas varivel segundo a estirpe viral e a cultivar contaminada. Em mdia, a produo de plantas infectadas reduzida em cerca de 10% a 20%. Embora considerado um vrus relativamente pouco importante por causa da tolerncia observada nos principais porta-enxertos comerciais, adquiriu destaque em algumas regies pomicultoras brasileiras com o incremento significativo do uso do portaenxerto Maruka-kaido, altamente sensvel, resultando em declnio de plantas adultas em conseqncia de severas caneluras na madeira e necrose interna da casca do porta-enxerto (Fig.1). comum observarse depsitos de resduos da casca necrosada nas caneluras.
Foto: O. Nickel

Fig. 1. Caneluras (C) na madeira e necrose interna (N) da casca do porta-enxerto Maruba-kaido causadas por ACLSV. Notar que os sintomas no atingem a copa da cv. Fuji (So Joaquim, SC).

VRUS LATENTES Vrus-da-manchaclortica-foliar-damacieira (ACLSV)

O ACLSV um vrus latente amplamente difundido em macieiras em todo o mundo; afeta tambm a pra, Prunus spp., outras espcies de rosceas frutferas

ACLSV transformou-se em problema em razo do uso de porta-enxertos clonais infectados e, na ausncia de matrizes livres de vrus, pela utilizao indiscriminada de plantas de pomares, infectadas, noindexadas, como matrizes de material propagativo (borbulheiras). Levantamentos em Santa Catarina e no Rio Grande do Sul revelam que ACLSV ocorre de forma latente com freqncia nos porta-enxertos das sries M e MM.

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ASGV ocorre em todas as regies do mundo onde se planta ma. O vrus infecta um espectro considervel de hospedeiros, incluindo a maioria das variedades comerciais de Malus domestica sem produzir nestas, reaes perceptveis visualmente. Estimase que 75% do material proveniente do Japo contenha ASGV, que causa, em mdia, uma reduo da produo de cerca de 15%. No Brasil, ASGV foi diagnosticado em 1997 em Santa Catarina como causa de declnio e morte generalizada de plantas de viveiro, nas cvs. Fuji, Royal Gala, Belgolden, Braeburn e outras, enxertadas no porta-enxerto sensvel Maruba-kaido (M. prunifolia var. ringo), nas quais se observam necrose (cancro) e destruio total da casca do porta-enxerto (Fig.2), declnio e morte de mudas. Alguns isolados de ASGV no produzem sintomas em espcies de Malus normalmente sensveis. Na indicadora Virginia Crab o ASGV produz uma clssica necrose na unio de enxertia e provoca o inchamento da base do ramo da indicadora (Fig. 3).

Fig. 2. Cancro da casca do porta-enxerto Maruba-kaido causado por ASGV em mudas de viveiro cv. Fuji. Notar que a necrose no atinge o filtro MM106 (Fraiburgo, SC).
Foto: O. Nickel

Vrus-das-canelurasdo-tronco-da-macieira (ASPV)
O vrus das caneluras do tronco da macieira ocorre em todas as regies pomicultoras do mundo, freqentemente em combinao com ACLSV e epinastia e declnio do Spy 227. O vrus latente na maioria das cultivares comerciais e no causa sintomas perceptveis, exceto o efeito sobre crescimento e a produo, a qual pode ser reduzida em cerca de 10% a 20%. A epinastia e declnio de Spy (SED) uma disfuno causada por um vrus latente, considerado por alguns autores idntico a ASPV. Nesse contexto, ambas as disfunes so consideradas conjunta-

Fig. 3. Necrose na unio de enxertia (N) e inchamento da base do ramo da indicadora Virginia Crab (VC) (IN) causados por ASGV; inculo cv. Hillwell (Vacaria, RS).

mente. ASPV produz em Spy 227 epinastia foliar em 4-6 semanas ps-inoculao (Fig. 4). A formao de caneluras em Virginia Crab requer incubao no mnimo de um ano.

Foto: O. Nickel

Vrus do acanalamento do tronco da macieira (ASGV)

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Foto: O. Nickel

em toda a superfcie foliar, ou ocupar toda a rea entre as nervuras (Fig. 5).
Foto: O. Nickel

Fig. 5. Manchas e reas irregulares de cor amarelo-creme de macieiras infectadas com ApMV (Vacaria, RS).

Fig. 4. Epinastia foliar em Spy 227 causada por ASPV (inculo cv. Gala; Vacaria, RS).

VRUS E OUTROS AGENTES TRANSMISSVEIS POR ENXERTIA Vrus-do-mosaicoda-macieira (ApMV)

Por conta da facilidade de visualizao dos sintomas em variedades comerciais, o vrus do mosaico-da-macieira causa uma das doenas virais mais conhecidas da macieira. Os sintomas foliares variam, segundo a virulncia do isolado e a sensibilidade da cultivar e podem ser muito discretos, passando despercebidos. Plantas infectadas mostram reas irregulares de cor amarelo-creme nas folhas, podendo reduzir-se a diminutas manchas nas nervuras, bandeamento de nervuras, manchas

Os sintomas, geralmente, so mais fortes em primaveras frias. comum as cvs. Gala e Granny Smith conterem o vrus de forma latente. Aps perodos de forte expresso de sintomas podem ocorrer flores anormais, atrofiadas e queda de frutas jovens (no confundir com infeco de fungos). ApMV causa danos relevantes macieira, reduzindo a pega da enxertia e o crescimento da planta. A reduo de produo pode ser da ordem de 30%, mas varia segundo a cultivar, o ano e a estirpe do vrus. O efeito de ApMV especialmente forte quando ocorre infeco mista com vrus latentes.

Lenho-mole-da-macieira (Apple rubbery wood )

O lenho-mole ou emborrachamentodo-lenho uma disfuno de natureza ainda desconhecida. O envolvimento de agentes do tipo fitoplasma, bactrias restritas ao xilema e ricketsias na etiologia dessa doena foi proposto, mas no h prova de patogenicidade. uma doena muito difundida em variedades comerciais de macieiras e pereiras e porta-enxertos clonais. Provoca perdas de produo, em mdia, de cerca de 20% a 30%. A flexibilidade anormal da madeira, principal

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sintoma da doena, resultado de sntese deficiente de lignina, dificulta a formao das macieiras; os ramos, sem frutos, curvam-se sob a ao do prprio peso. O calibre dos frutos menor e a maturao retardada. Os interns so curtos e o crescimento vegetativo reduzido. A condio lenho-mole observa-se principalmente nos ramos jovens, do 2 ano de crescimento, com espessura de no mximo um dedo. Mais tarde as plantas podem produzir madeira normal e ladres oriundos do lder e de galhos estruturais, e os sintomas podem desaparecer por completo. A transmisso da doena ocorre pela unio de tecidos ou pela propagao vegetativa de porta-enxertos clonais infectados.

longitudinais que se alargam, dando lugar s depresses da madeira (Fig. 6). O agente pode ser eliminado por termoterapia.
Foto: O. Nickel

Vrus-da-mancha-anelardo-tomateiro (Tomato ringspot virus, ToRSV)

Este Nepovirus (vrus transmitido por nematides, com partculas polidricas) associado necrose-da-unio-da-enxertia da macieira. Essa forma um anel marrom ao redor do tronco, na juno da copa com o porta-enxerto. s vezes, ao invs desse anel necrtico observam-se caneluras muito discretas na unio de enxertia. A necrose impede a soldadura da enxertia, deixa a planta debilitada e raqutica, e passvel de ser derrubada por ventos fortes. ToRSV induz sintomas em cultivares-copa e porta-enxertos comerciais das sries MM, EM e MAC. ToRSV facilmente transmissvel pela enxertia durante a propagao clonal.

Fig. 6. Sintomas de depresso-do-lenho na cv. Royal Gala, 3 anos de idade (Caxias do Sul, RS).

DOENAS DE MENOR IMPORTNCIA ECONMICA TRANSMISSVEIS POR ENXERTIA

A depresso-do-lenho, cuja natureza ainda se desconhece, inicia-se com depresses locais, curtas, em ramos jovens; posteriormente, desenvolvem-se ranhuras

Em pomares mais velhos foram observadas frutas infectadas com ruga verde. Os sintomas desenvolvem-se em frutinhos de cerca de 2 a 3 cm de dimetro, logo aps a florao, na forma de pequenas depresses da casca, que se tornam mais severas (Fig. 7). O tecido abaixo das depresses verde, mais escuro que o tecido que o circunda. O agente foi transmitido somente pela enxertia, mas h relatos de disseminao vagarosa em pomares. Assim, medidas de sanidade, como a termoterapia, representam a melhor forma de preveno. O patgeno, de natureza ainda desconhecida, latente em algumas variedades comerciais, e afeta a produo e a armazenabilidade. Embora ocorra raramente, a rachaduraestrela foi constatada em pomares mais antigos. A natureza do agente, transmissvel

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Fig.7. Sintomas de ruga-verde em frutinhos da cv. Gala Standard (Vacaria, RS).

pela enxertia, desconhecida, mas o agente pode ser eliminado por termoterapia. Os isolados mais virulentos causam, alm da rachadura tpica, distoro e reduo do tamanho dos frutos (Fig. 8), reduo do vigor, declnio e cancros ao redor das gemas.
Foto: O. Nickel

Fig.8. Sintomas de rachadura-estrela em frutinhos da cv. Gala Standard (Vacaria, RS).

DIAGNSTICO DE VRUS
Geralmente, chama-se indexagem o diagnstico de vrus de fruteiras perenes. Pode ser biolgica, enxertando-se tecidos de plantas suspeitas em plantas indicadoras

em casa de vegetao, telado ou em campo, ou conduzida em laboratrio por serologia e tcnicas moleculares como a PCR. Muitos vrus so latentes em macieiras e, por isso, usam-se plantas indicadoras para realizar a indexagem biolgica (Tabela 1). Sintomas dessas indicadoras, quando infectadas, incluem: manchas necrticas e/ou clorticas, mosaico, necrose foliar, distoro foliar, bandeamento clortico das nervuras, epinastia, morte de ponteiros, necrose da casca e da unio de enxertia, caneluras na madeira, enfezamento e declnio da planta, entre outros. O teste imunoenzimtico ELISA (e variaes) , atualmente, o mais amplamente utilizado teste serolgico para a deteco de doenas virais em fruteiras em geral. Consiste na reao de um extrato da amostra com um anticorpo especfico que ser detectado por um anticorpo (especfico ou universal) ligado a uma enzima. Uma vez adicionado mistura o substrato dessa enzima, a reao positiva produzir uma alterao de cor visvel a olho nu. Apesar de algumas peculiaridades (sazonalidade do teste; distribuio desuniforme dos vrus em certos tecidos) que podem dificultar o diagnstico em certas estaes do ano o diagnstico serolgico apresenta-se como instrumento que rene simplicidade, possibilidade de execuo em larga escala, baixo custo e alta sensibilidade. Anticorpos e conjugados existentes no mercado, necessrios execuo de ELISA, ainda so importados. A PCR ou reao de polimerase em cadeia (e suas variaes) um mtodo de deteco extremamente sensvel que permite o diagnstico de agentes virais, geralmente, desde que se conhea pelo menos parte do vrus. Consiste no uso de pequenos oligonucleotdeos chamados iniciadores, que se pareiam com o vrus e permitem sua amplificao em reaes catalizadas por enzimas. Os produtos resultantes dessa amplificao so visualizados sob luz ultravioleta. A necessidade de extrao dos cidos nuclicos virais das amostras com agentes desproteinizantes, enquanto ELISA

Foto: O. Nickel

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Tabela 1. Espcies/cultivares utilizadas na indexagem biolgica de vrus de macieiras e os sintomas que desenvolvem. Espcie / Variedade M. domestica LL-S5 M. adstringens Hopa M. platycarpa M. prunifolia cv. ringo Mo84, Maruba-kaido M. domestica Spy 227 M. domestica R-12740.A Pyronia veitchii M. domestica cv. Virginia Crab M. domestica cv. Radiant Crab M. domestica cv. Lord Lambourne M. micromalus cv. GMAL 273.A M. domestica cv. Golden Delicious M. domestica cv. Gala M. domestica cv. Gravenstein Vrus ACLSV ACLSV ACLSV Sintomas 1 MC, DF, M MV, MN, NF, NC, LA MC, EC, MAC2)

ACLSV MC, NF, MP, NIC, E, EC, (C) ASPV-SED, ACLSV MC, C, E, NIC ACLSV MC, NF, NIC, C ACLSV, ASGV, ASPV MAC, BC, C2) ASGV, ASPV NUE, C, IBE ASPV E, NN Lenho-mole, ApMV M, CR ASGV NC, MN, E, DF Rachadura-estrela, Lenho-mole, ApMV REF, CR, M3) Ruga-verde DSF3) Depresso-do-lenho DL3)

1) LL-S5: Lord Lambourne Seedling n 5; Mo84: Maruba-kaido Seleo Morioka n 84; BC: bandeamento clortico de nervuras; C: caneluras; CR: curvatura de ramos; DF: deformao foliar; DSF: depresses verde-escuras na superfcie dos frutos; E: epinastia; EC: erupes da casca; IBE: inchamento da base do enxerto; LA: lenho avermelhado; M: mosaico; MAC: manchas anelares clorticas; MC: manchas clorticas; MN: manchas necrticas; MP: morte de ponteiros; MV: manchas vermelhas, que se tornam necrticas; NF: necrose foliar; NIC: necrose interna da casca; NC: necrose do caule; NN: necrose de nervuras; NUE: necrose na unio de enxertia; REF: rachadura de frutos; DL: depresso longitudinal do lenho; ( ): sintoma ocorre com certos isolados, no via de regra. Fonte: 2) Siebert & Engelbrecht, 1981; 3) Fridlund, 1989.

e suas variaes usam seiva bruta ou clarificada, reduz a versatilidade da PCR como mtodo para anlises massais. Ambos os mtodos, entretanto, tm seu lugar no instrumentrio de diagnstico, e especialmente na limpeza clonal, formando um trip com a indexagem biolgica.

PRODUO DE PLANTAS LIVRES DE VRUS

Controle de vrus sempre profiltico. Consiste na preveno. No h mtodos curativos ou viricidas aplicveis em pomares. Planta infectada, uma vez no pomar, permanece infectada e irrecupervel. O nico controle eficiente de vrus, especificamente daqueles de fruteiras lenhosas, que se transmitem exclusivamente pela enxertia, consiste no uso de plantas livres de vrus na formao do pomar.

comum, na ausncia de plantas livres de vrus de uma variedade ou clone de importncia comercial, que essas plantas tenham que ser desenvolvidas a partir do material infectado, o que pode ser feito por a) avaliao de escapes naturais (plantas que permaneceram sadias) via indexagem; b) termoterapia; c) por cultura de tecidos. Na prtica, comum a associao de termoterapia cultura de tecidos. Termoterapia ou tratamento com calor (nesse contexto entendido como ar quente) pratica-se, hoje, como nos anos 60, quando estes trabalhos se iniciaram nos EUA e Europa. Para o tratamento trmico, utilizam-se desde cmaras de crescimento totalmente automatizadas at simples gabinetes de madeira com lmpadas como fontes internas de calor. Cmaras de termoterapia devem preencher trs requisitos bsicos: ser controlveis, confiveis e permitir a exposio a temperaturas constantes.

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Os procedimentos consistem de: a) escolha da variedade segundo critrios agronmicos, pomolgicos, fitossanitrios e mercadolgicos; b) preparao da cultivar destinada ao tratamento trmico em plntulas de semente bem desenvolvidas e enraizadas. Uma vez soldado o enxerto, a planta recebe tratamento para fomentar vigorosa brotao e crescimento, permitindo o acmulo de substncias de reserva na raiz e no tronco, fundamental para o xito da termoterapia, que um tratamento bastante agressivo. Forte poda, boa fertilizao e suprimento de gua foram nova brotao sob temperaturas que variam de 36C a 40C, por diferentes perodos, conforme o vrus ou o isolado. Nessas condies de temperatura, o crescimento vegetativo da planta mais rpido que a replicao e o movimento do vrus na planta. Como conseqncia os pices laterais e apicais de plantas tratadas tm alta probabilidade de estar livres de vrus (virides no so, aparentemente, afetados pela termoterapia). Esses pices so cortados e enxertados em cunha, em porta-enxertos preparados simultaneamente. Deve-se ter em mente que a termoterapia tem efeito diferenciado sobre os diversos vrus. ACLSV e ApMV so de fcil eliminao pelo calor, ASPV-SED ocupa posio intermediria e ASGV, extremamente termoestvel, segundo a termossensibilidade do isolado, pode no ser eliminado pela termoterapia. Neste ltimo, e em outros casos, a termoterapia pode ser um timo pr-tratamento do material destinado cultura de meristemas. Como o tratamento trmico no representa garantia de que todos os vrus sejam eliminados, procedimento-padro a indexagem (biolgica, serolgica e molecular) na seqncia da termoterapia, segundo a disponibilidade de material. Aps a termoterapia, se no houver a eliminao

total dos vrus, pelo menos ter ocorrido uma forte reduo na sua concentrao, possivelmente inferior ao nvel de deteco, o que exige cuidados especiais na avaliao das plantas e determina o monitoramento posterior durante trs enfolhamentos. A cultura de tecidos engloba procedimentos para a eliminao de vrus de tecidos vegetais, entre os quais destacam-se a cultura de meristemas e a microenxertia in vitro. A cultura de meristemas j foi usada com xito para eliminar um grande nmero de vrus de numerosas espcies de plantas. H relatos da eliminao de ASGV de macieiras por microenxertia. A concentrao de vrus em plantas reduz-se na proximidade do meristema apical. Geralmente, no prprio meristema no h vrus. Esse o fundamento do uso desse tecido para a limpeza clonal. Trata-se de um tecido ainda no diferenciado, de cerca de at 0,25 mm de comprimento. O meristema extrado sob lupa em condies assticas, de tecidos que podem ter sido submetidos previamente termoterapia, e cultivado em meios de cultivo para: iniciao de cultivo, proliferao e enraizamento. As plntulas, na seqncia, so aclimatadas em casa de vegetao, reduzindo-se gradativamente a umidade, e so submetidas, assim que possvel, aos primeiros testes de vrus, idnticos aos descritos em plantas oriundas da termoterapia e enxertia de pices caulinares. Os procedimentos de limpeza clonal de macieiras, seja pela termoterapia seja por cultura de tecidos, caracterizam aes de longa durao, envolvendo etapas de indexao (trs enfolhamentos), avaliao da autenticidade varietal e o monitoramento dos materiais egressos desses procedimentos.