Fermentacin Alcohlica

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INTRODUCCION La fermentacin alcohlica es una biorreaccin que permite degradar azcares en alcohol y dixido de carbono. La conversin se representa mediante la ecuacin:

Las principales responsables de esta transformacin son las levaduras. La Saccharomyces cerevisiae, es la especie de levadura usada con ms frecuencia. Por supuesto que existen estudios para producir alcohol con otros hongos y bacterias, como la Zymomonas mobilis, pero la explotacin a nivel industrial es mnima. A pesar de parecer, a nivel estequiomtrico, una transformacin simple, la secuencia de transformaciones para degradar la glucosa hasta dos molculas de alcohol y dos molculas de bixido de carbono es un proceso muy complejo, pues al mismo tiempo la levadura utiliza la glucosa y nutrientes adi cionales para reproducirse. Para evaluar esta transformacin, se usa el rendimiento biomasa/producto y el rendimiento producto/ substrato. El rendimiento terico estequiomtrico para la transformacin de glucosa en etanol es de 0.511 g de etanol y 0.489 g de CO 2 por 1 g de glucosa. Este valor fue cuantificado por Gay Lussac. En la realidad es difcil lograr este rendimiento, porque como se seal anteriormente, la levadura utiliza la glucosa para la produccin de otros metabolitos. Variables de la fermentacin alcohlica y sus efectos sobre el proceso Con el fin de obtener altos rendimientos en la fermentacin alcohlica es necesario considerar ciertos parmetros y realizar un estudio sobre los efectos que en mayor o menor grado alteren la buena marcha del proceso. Clase de microorganismo: Los microorganismos ms empleados para la produccin de etanol a partir de azcares son las levaduras del gnero Saccharomyces y Kluyveromyces y las bacterias Zymomonas mobilis. Concentracin del sustrato: El carbono es suministrado por los azcares contenidos en la materia prima, siendo la concentracin de azcar un valor que se debe considerar ya que afecta la velocidad de la fermentacin, el comportamiento y el desarrollo de las clulas de la levadura. Suele ser satisfactoria una concentracin de azcar del 10 al 18%, el valor ms corriente es del 12%. Cuando se trabaja con concentraciones de azcar muy altas, del orden de 22%, se observa una deficiencia respiratoria en la levadura y un descenso de la velocidad de fermentacin; por el contrario, al trabajar con concentraciones muy bajas, el proceso resulta antieconmico ya que requiere un mayor volumen para la fermentacin. Concentracin de Etanol: La levadura es afectada en alto grado por la concentracin de alcohol, una concentracin alcohlica del 3% ya influye sobre el crecimiento; una concentracin de un 5% influye 1

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tanto sobre el crecimiento como en la fermentacin. Cuando la concentracin es del 10%, en algunas levaduras el crecimiento sufre la paralizacin total. Temperatura: La seleccin de esta variable es influenciada tanto por factores fisiolgicos como por problemas fsicos (prdidas debidas a la evaporacin de etanol al trabajar con temperatura elevada). Se debe tener en cuenta que para cada levadura existe una temperatura ptima de desarrollo, en la cual se muestra activa. Adems, se tiene una zona independiente de la temperatura ptima en la cual la levadura an presenta actividad; a medida que se aleja de la temperatura ptima su actividad disminuye notablemente. Por debajo de la temperatura sealada como mnima y por encima de la mxima, las levaduras continan viviendo en estado latente, sin embargo, al exponer cualquier levadura a una temperatura de 55 C por un tiempo de 5 minutos se produce su muerte. En el caso de la Saccharomyces cerevisae se tiene un desarrollo ptimo entre 28-35 C, recomendable 30 C. pH: Este es un factor importante en la fermentacin, debido a su importancia en el control de la contaminacin bacterial como tambin al efecto en el crecimiento de las levaduras, en la velocidad de fermentacin y en la formacin de alcohol. Durante la fermentacin la levadura toma el nitrgeno de los aminocidos orgnicos, perdiendo su carcter anftero y pasando a cidos, lo cual origina una disminucin del pH del medio. Cuanto ms bajo el pH del medio, tanto menor el peligro de infeccin, pero si se trabaja con pH muy bajos la fermentacin es muy lenta, ya que la levadura no se desarrolla de la forma conveniente. Segn estudios se hall que el pH ms favorable para el crecimiento de la Saccharomyces cerevisiae se encuentra entre 4.4 - 5.0, con un pH de 4.5 para su crecimiento ptimo. Concentracin de nutrientes: Como ya se dijo, la presencia de sustancias nutritivas adecuadas es una condicin necesaria para el crecimiento y desarrollo de la levadura, siendo su concentracin un factor primordial en la actividad vital de la levadura. Las principales sustancias nutritivas y las ms influyentes son el nitrgeno, fsforo, azufre, vitaminas y trazas de algunos elementos.

Fermentacin Alcohlica Cintica de Produccin de Etanol Muestra 0 1 2 3 4 5 6 t (horas) 0 5.68 22.83 31.67 93.45 99.28 120.66

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G.L. 0 6 8 8.5 9.5 9.5 9.5

g/L 0 47.34 63.12 67.065 74.955 74.955 74.955

El clculo para convertir de G.L. a g/L se muestra a continuacin, tomando en cuenta que el resto ser anlogo a este: . . = 1000 100 6 . . 0.789 1000 = . / 100 Grfica 1. Cintica de Produccin de Etanol
80 70 Concentraci EtOH (g/L) 60 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 120 140 t (horas)

Fermentacin Alcohlica Rendimiento

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El rendimiento terico reportado en la bibliografa es de 0.51 g de Etanol por cada gramo de disacrido usado. La concentracin de slidos en el mosto se ajust a 25 Bx, sin embargo no todos los slidos disueltos corresponden a azcares, se consider entonces que la concentracin de azcar se encontraba alrededor de 18 Bx. Si tenamos 5 L de jarabe de 18Bx, tenemos en total 900 gramos de azcar, por lo que el rendimiento total esperado es de 637.5 gramos de etanol. 10 18(5) = 900 1 Bx

Se obtuvieron 374.775 gramos de etanol totales (obtenido de multiplicar la concentracin final de Etanol por el volumen total de mosto), por lo que el rendimiento que tenemos es: 0.41 g de Etanol por cada gramo de disacrido usado. La grfica 1 muestra la produccin de etanol a lo largo de la fermentacin, como se puede observar la produccin de etanol es significativamente mayor durante las primeras horas de la fermentacin, esto es debido a la alta disponibilidad de sustrato en el medio y a medida que ste se va agotando las velocidad de produccin disminuye hasta alcanzar un estado estacionario. Por otro lado, existen algunas variables que afectan de forma importante el desarrollo de la fermentacin y con ello el red el rendimiento como son el tipo de microorganismo, la concentracin de sustrato, temperatura, pH, concentracin de nutrientes, entre otros. Todos los factores antes mencionados fueron medido y ajustados en el medio de cultivo al inicio de la fermentacin con la finalidad de establecer las condiciones ptimas para llevar a cabo el proceso. El rendimiento obtenido fue de 0.41

muy bueno.

Ms aun, industrialmente se obtienen rendimientos de 0.46 a 0.48

el cual, al ser comparado con el rendimiento terico 0.51

considerando que industrialmente las condiciones de fermentacin se encuentran perfectamente controladas, el rendimiento obtenido a nivel laboratorio resulta bastante satisfactorio.

es

Fermentacin Alcohlica CONSUMO DE SUSTRATO

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Los azcares que la levadura no ha consumido, azcares residuales, se miden al emplear el mtodo de Fehling. Se tomaron 5 mL de muestra de cada tiempo tomado de la fermentacin y se colocaron en un matraz aforado de 100 mL, al cual se le agreg 20 mL de agua y 5 mL de cido clorhdrico concentrado. El siguiente paso es calentar la muestra a ebullicin durante 5 minutos, pasado ese tiempo se aaden 1.5 mL de hidrxido de amonio y se lleva a 100 mL con agua destilada. Con esta solucin se titula el reactivo de Fehling, el cual se prepara con 5 mL de Fehling A y 5 mL del Reactivo de Fehling B, con una gota de azul de metileno. De las determinaciones anteriores se obtuvieron los siguientes datos: Muestra Gasto de la titulacin 7.9 0 8.6 1 10.8 2 11.1 3 15.0 4 15.0 5 15.8 6 El contenido de azcares reductores se calcula con la siguiente expresin matemtica: %Azcares reductores = FxV x 100 mxg

Donde:

F = Factor de Fehling = 0.05 g de dextrosa (glucosa) equivalentes a 10 ml de la mezcla de reactivos de Fehling. V = Volumen del aforo = 100 ml m = Masa de la muestra = 5 ml g = Gasto de la titulacin. Ejemplo de clculo: Tomemos el ltimo tiempo para ejemplificar el clculo de los azcares en el medio de cultivo: 0.05 100 % = 100 5 15.8 % = 6.33 % 5

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De la manera anterior se calculan todos los dems datos de azcares reductores, tales resultados se concentran en el siguiente cuadro: Muestra 0 1 2 3 4 5 6 Tiempo de fermentacin (horas) 0 5.68 22.83 31.67 93.45 99.28 120.66 Gasto de la titulacin (mL) 7.9 8.6 10.8 11.1 15.0 15.0 15.8 % Azcares Reductores 12.65 11.62 9.26 9.009 6.66 6.66 6.33

Grfico 2.- Cintica de consumo de sustrato

14 12 10 8 6 4 2 0 0 20 40 60 80 100 120 140 Tiiempo de fermentacin (hrs)

Interpretacin de resultados Al inicio de la fermentacin los azcares se espera que sean altos ya que la levadura an no consume el sustrato y el metabolismo es lento. En las horas siguientes, el metabolismo se acelera y el consumo de sustrato por la levadura aumenta, este consumo lo hace principalmente para mantenimiento celular y 6

% Azcares REductores

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para generacin de biomasa, adems de que la levadura al no contar con oxgeno en el medio tiene que fermentar, por lo tanto genera un metabolito que utiliza como ltimo aceptor de electrones (acetaldehdo) para formar el etanol. Esto se observa en el grfico de consumo de sustrato perfectamente ya que en los primeros tiempos de fermentacin el consumo es elevado y se incrementa a una velocidad elevada; conforme transcurre la fermentacin el consumo va disminuyendo, se puede observar que en los ltimos tiempos los azcares reductores no cambian, esto indica un cese del crecimiento de levaduras, ya no hay consumo de sustrato, muy posiblemente las levaduras han alcanzado una fase de muerte celular y no consumen el sustrato.

CONCENTRACIN CELULAR Mtodo de la Cmara de Neubauer.

Muestra Promedio de clulas contadas por cuadro 2.00 2.52 3.12 7.68 9.60 3.20 1.00 Clulas por celda x 25) ( 50 63 78 192 240 80 25

0 1 2 3 4 5 6

Clculo de clulas en (g/L) Las clulas que se contabilizaron por celda se encuentran en 0.1 mm3 , por lo que se procede a realizar los siguientes clculos: Para la muestra inicial 50 1 1106 3 (20) = 0.5 3 9 0.1 2010 1 Muestra 0 1 2 3 g de levadura/L 0.50 0.63 0.78 1.92 Hora de toma de la muestra 0 5.68 22.83 31.67

Fermentacin Alcohlica 4 5 6 2.40 0.80 0.25

Laboratorio de Ingeniera de Fermentaciones 93.45 99.28 120.66

Grfico 3.- Cintica de crecimiento de biomasa

3

2.5

2 g levadura/L

1.5

0.5

0 0 20 40 60 80 100 120 140 Tiempo (h)

Discusin Es posible observar en la grafica de la cintica de crecimiento microbiano que el punto en que se presento la mayor cantidad de levaduras en la fermentacin fue a las 90 horas aproximadamente, el tiempo anterior a este se llevo a cabo el crecimiento de las levaduras mientras que posterior a las 90 horas se observa una disminucin de los gramos de levadura que contienen cada litro de la muestra. Esta reduccin en la cantidad celular se puede atribuir a que la levadura es capaz de fermentar un mosto hasta niveles de etanol que van de un rango entre 4 a12% (v/v), por tal motivo si se llega a estos niveles de etanol las levaduras dejan ce crecer y es por ello que observamos una disminucin de la cintica de crecimiento.

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Grfico 4.- Cinticas de crecimiento, consumo de sustrato y generacin de biomasa

3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 20 40 60 80 100 120 140 Tiempo de Fermentacin g de levadura/L % Azcares Reductores g/L 80 70 60 g levadura/ mL 50 40 30 20 10 0

DISCUSIN GENERAL Podemos ver en el grfico 4 que el crecimiento de biomasa es una tpica cintica de crecimiento, donde al inicio se puede ver la fase de adaptacin de la levadura al medio de cultivo donde se realiza la sntesis de la maquinaria metablica para poder degradar la solucin de piloncillo. Si vemos los azcares reductores podemos ver que han sido consumidos por las levaduras para poder mantener sus funciones metablicas, generacin de biomasa y produccin de etanol. Se puede observar que el etanol se produce desde las primeras horas de fermentacin, por lo que podemos decir que es un metabolito asociado al crecimiento. Al seguir el tiempo de fermentacin, se observa una fase de crecimiento logartmico al tiempo 22.63 y 31.67 horas en la cual existe una gran produccin de alcohol. Posteriormente, por el comportamiento de las tres grficas puede deducirse que existe una fase de mantenimiento donde el crecimiento microbiano desacelera y ste aumenta muy poco; de igual forma la produccin de alcohol disminuye. Por ltimo, en los ltimos tres tiempos de fermentacin (desde 93.45 a 120.66 horas) los valores de concentracin de etanol son exactamente iguales, es decir, no hubo sntesis de etanol durante este tiempo, lo que puede significar que la levadura ha muerto y no produce ms metabolito. Lo anterior lo podemos comprobar con las otras cinticas; los azcares reductores no variaron durante ese tiempo, por lo que se deduce que no existi consumo de sustrato; la biomasa disminuy, as que presumiblemente hay muerte microbiana y las clulas hubieron floculado y precipitado al fondo del reactor, eso pudo haber disminuido el conteo celular tan drsticamente en este lapso de tiempo.

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Las condiciones de operacin no fueron las ms ptimas, adems de que la temperatura vari durante todo el tiempo de fermentacin, disminuyendo el crecimiento por la noche y favorecindolo en el da. Las condiciones aspticas no fueron cuidadosamente manejadas debido a que ste tipo de fermentacin y por sus caractersticas no permite el crecimiento de otros organismos: al inicio existe un pH bastante cido y la concentracin de azcares es muy alta lo que limita el crecimiento de bacterias. Posteriormente durante la fermentacin se vuelve anaerobia, eliminando as las bacterias aerobias presentes en el medio. Por ltimo la concentracin de alcohol en la ltima fase de la fermentacin es lo bastante alta como para limitar el crecimiento de otros organismos. Lo anterior permite establecer que la fermentacin alcohlica aparte de ser un proceso relativamente barato para la obtencin de alcohol, es poco susceptible a contaminacin y posee altos rendimientos, lo que se busca industrialmente es buscar un sustrato ms barato proveniente de algn desecho o residuo para evitar gastar mucho en sacarosa. Cabe sealar que muchos productos de gran calidad como vinos, cervezas, tequila y otras bebidas alcohlicas se obtienen por este tipo de fermentacin, en muchos de los casos el metabolito no se separa totalmente del producto (no se purifica), ya que perdera propiedades sensoriales, como en el caso de la cerveza que no sufre proceso de destilado.

CONCLUSIONES La levadura es capaz de fermentar mosto en un perodo de tiempo aceptable para producir niveles de etanol con un rango entre 4 a 12 % (v/v). La levadura redujo la cantidad de azcares de 12.65% a 6.33%, en las 120.66 horas de fermentacin. La biomasa mxima obtenida fue de 2.4 g de levadura/ L a las 93 horas, la mnima fue de 0.25 g de levadura/ L lo que pudo deberse a floculacin El etanol alcanz una concentracin mxima de 74.9 g de alcohol/ L La produccin de etanol est relacionada directamente con el crecimiento de la levadura. Las condiciones ambientales no controladas pudieron haber afectado el crecimiento de la levadura y por lo tanto la produccin de alcohol

BIBLIOGRAFA
http://docencia.izt.uam.mx/mleh/alimentos_fermentados/otros_sitios/Contenido.htm
http://www.science.oas.org/Simbio/mbio_ind/cap5_mi.pdf

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