Professional Documents
Culture Documents
Introduccin
Existe una gran atraccin por los hongos filamentosos debido a su capacidad natural de secretar grandes cantidades de protenas (principalmente enzimas hidrolticas) dentro del medio de crecimiento. Otra de las ventajas es que los hongos como hospederos de expresin poseen una maquinaria para procesar protenas que requieren modificaciones post-traduccionales, por ejemplo la glicosilacin (adicin de azcares a la protena en posicin especfica), escisin proteoltica o la formacin de mltiples enlaces disulfuro. As como otros hospederos microbianos explotados industrialmente, algunas cepas de hongos filamentosos se han ido mejorando con el uso de la ingeniera gentica creando mutantes que secretan grandes cantidades de protenas. En una comparacin general con otros sistemas de expresin para protenas heterlogas, en cultivos lquidos, los hogos filamentosos funcionan muy bien, con buenos rendimientos y siendo una opcin barata.
Hongos filamentosos que dominan los mercados como hospederos de produccin: Aspergillus niger, A. oryzae y Trichoderma reesei. Aspergillus nidulans es del que se tiene mayor informacin sobre expresin de protenas heterlogas y est bien caracterizado genticamente. Uno de los sistemas mas interesantes es Chrysosporium lucknowense en la produccin industrial de protenas (enzimas) heterlogas y homologas. Ventajas: produccin de protenas a pH neutro, baja viscosidad en el caldo de fermentacin y tiempos cortos de fermentacin.
Rendimiento filamentosos
de
protenas
heterlogas
producidas
en
hongos
Este tipo de protenas son empleadas principalmente como enzimas industriales y como productos de genes de organismos superiores los cuales tienen valor farmacutico. Los rendimientos de protenas heterlogas expresadas en hongos son aproximados a 1gr/l. Se han realizado varios experimentos probando diferentes especies y cepas de Aspergillus en conjunto con varios promotores para evaluar sus rendimientos. Se demostr que las transformantes que expresaron hIL-6 [interleucina humana] (bajo el
promotor glaA) como una protena fusionada al acarreador endgeno glucoamilasa A, produjeron el mayor rendimiento. Otros de los puntos importantes de la expresin de protenas heterlogas es el uso de hospederos con deficiencia de proteasas y el perfeccionamiento de las condiciones de cultivo en los reactores. En la tabla 2 se muestran algunos ejemplos de productos de genes humanos que han sido expresados en sistemas heterlogos:
Enfoques genmicos y postgenmicos para el mejoramiento de la produccin y secrecin de protenas en hongos filamentosos
Algunos enfoques genmicos sobre cuestiones biolgicas se enlistan el la siguiente tabla:
Glicosilacin de protenas
La glicosilacin de protenas es sin duda uno de las reas ms importantes de investigacin en relacin con la expresin de genes heterlogos. Una correcta glicosilacin es esencialmente importante en protenas de potencial farmacutico. Existen recientes estudios sobre la glicosilacin N-ligada en la levadura Pichia pastoris, y se demuestra que hay cepas recombinantes que producen N-glicanos casi homogneos en una protena humana producida heterlogamente. A pesar del progreso reportado en levaduras, existen estudios limitados en hongos filamentosos. Recientes estudios en la ruta de glicosilacin N-ligada de una cepa de A. niger fue humanizada con la sobreexpresin de dos protenas, cuyos resultados detectaron la glicosilacin de solo el 40% de las protenas sintetizadas. Recientes estudios con la celobiohidrolasa (Cel7A) de T. reesei han demostrado que el medio de cultivo en el que crecen las clulas tambin afecta la glicosilacin de las protenas, es mejor el uso de medios mnimos y no los medios complejos.
Perspectivas futuras
Los sistemas de expresin de genes actuales se basan en cualquier promotor fuerte inducible o constitutivo, preferentemente homologo al hospedero. Una de las desventajas en el uso de la expresin constitutiva es que los genes promotores son funcionales durante el crecimiento y por lo tanto inadecuados para la sobreexpresin de protenas forneas que puedan ser txicas para las clulas del hospedero. Una mayor desventaja de los genes promotores inducibles es su represin por glucosa y otras fuentes de carbono simples. El mtodo tradicional de cultivo de hongos filamentosos para la produccin de protenas es por fermentacin sumergida en medios lquidos. Recientemente hay un
inters por el uso de medios slidos porque se obtienen mejores rendimientos de protenas secretadas en estos sistemas. Otro factor clave es el establecimiento de protocolos efectivos para la transformacin para ser ms eficientes y flexibles. Los avances en las tecnologas de microscopia representan grandes promesas en la visualizacin de rutas metablicas e interacciones protena-protena en sistemas vivos.
Informacion extra
Qu propiedades deben tenerse en cuenta para seleccionar un buen hospedero? 1. Un buen hospedero debe producir grandes cantidades del producto proteico. Adems de una transcripcin y una traduccin eficaces, se debe considerar que las protenas forneas que se sintetizan dentro del hospedero pueden ser destruidas con la misma rapidez por accin de las enzimas proteolticas de la clula hospedera. Esto se puede solucionar cambiando las condiciones de cultivo o utilizando cepas mutantes que produzcan menos enzimas proteolticas. 2. Un buen hospedero debe cultivarse con facilidad. Debe crecer rpidamente en un medio barato y condiciones de cultivo sencillas. 3. La biologa de un buen hospedero debe conocerse adecuadamente. Podran resolverse problemas que se presenten ms fcilmente. 4. Un buen hospedero debe producir la forma correcta del producto proteico. Despus de la traduccin, la nueva protena se pliega de manera particular, y frecuentemente se modifica. Generalmente, las protenas humanas estn glicosiladas, es decir, ciertas molculas de azcar especificas se encuentran unidas a la protena en determinadas posiciones.