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2. PEPTIDASAS VEGETALES
2.1. ESTRATEGIAS PARA EL AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DE PROTENAS VEGETALES 2.1.1. Aislamiento de protenas
La metodologa empleada en la extraccin de protenas determina su naturaleza y estabilidad, permitiendo validar los resultados obtenidos en procedimientos posteriores. En particular, la extraccin de protenas vegetales presenta problemas inherentes a la estructura de la clula vegetal, pues comparada con los tejidos animales y las clulas bacterianas, tiene menor contenido de protenas y contienen en sus vacuolas peptidasas, alcaloides y compuestos polienlicos (flavonoides, taninos) que pueden interferir en la actividad proteica. En consecuencia, la estrategia de extraccin depende de las caractersticas especficas de la protena en estudio y de su localizacin (Michaud & Asselin, 1995). La primera etapa en el aislamiento de una protena es su liberacin de las clulas que la contienen. El mtodo elegido depende de las caractersticas mecnicas del tejido de procedencia, as como de la localizacin celular de la protena de inters. Como mtodos de ruptura mecnica de las clulas vegetales para liberar sus protenas se pueden mencionar: 1) trituracin con arena o almina, 2) trituracin en mezclador de alta velocidad, 3) homogeneizador a pistn, 4) prensa francesa, 5) sonicacin y 6) congelacin con nitrgeno lquido y macerado (Voet & Voet, 1992). La diversidad de protenas involucradas en procesos de crecimiento, desarrollo y defensa impide la formulacin de un procedimiento de extraccin universal que permita recuperar todas las protenas de un tejido vegetal. Sin embargo, la solubilidad de las protenas de plantas, que est relacionada con la localizacin intracelular, permite formular diferentes mtodos de extraccin. Ellos incluyen: 1) extraccin con buffer acuoso, 2) extraccin con detergentes, 3) precipitacin directa con TCA, 4) precipitacin con acetona y 5) precipitacin con TCA-acetona (Michaud & Asselin, 1995). Para prevenir la protelisis durante la extraccin se debe utilizar alguno/s de los procedimientos siguientes: 1) extraer con buffer que contenga SDS (sodio dodecil sulfato), 2) extraer con TCA fro al 10 % (p/v), 3) adicionar un cctel de inhibidores de peptidasas al buffer de extraccin, 4) trabajar a baja temperatura durante perodos cortos de tiempo, 5) usar buffers de pH por encima o por debajo del ptimo, 6) adicionar agentes protectores como dimetil sulfxido (10 %, v/v) o glicerol (25 % v/v) o agentes reductores

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como ditiotreitol (1mM), L-cistena (5 mM) o -mercaptoetanol (1mM)) o 7) adicionar agentes quelantes como EDTA (2 mM) o EGTA (2mM) para remover cationes bivalentes que son cofactores de metalopeptidasas y de varias peptidasas sernicas (Michaud & Asselin, 1995). Los compuestos fenlicos pueden inactivar las protenas al formar puentes de hidrgeno con los tomos de oxgeno de los enlaces peptdicos y tambin cuando los fenoles son oxidados a quinonas pueden condensarse con los grupos -SH y -NH2 de las protenas. Estas interacciones qumicas determinan la formacin de dmeros y polmeros de protena entrecruzadas por polifenoles, afectando la calidad del patrn proteico observado en los geles. Para evitar la accin de los compuestos fenlicos se pueden usar varias estrategias: 1) precipitar todas las protenas triturando los tejidos en TCA fro (no permite medir actividad biolgica), 2) adicionar polivinilpirrolidona (PVP) que compleja los fenoles y alcaloides, 3) en combinacin con PVP, inactivar la fenoloxidasa con agentes reductores como ascorbato, -mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT), dietilditiocarbamato de sodio, metabisulfito de sodio o tiourea, 4) agregar EDTA que secuestra el cobre que es un cofactor necesario para la expresin de la polifenoloxidasa, 5) usar un buffer de extraccin de bajo pH que ayuda a prevenir la formacin de quinonas y favorece la unin de PVP a fenoles y 6) remover fenoles y alcaloides por gel filtracin (Michaud & Asselin, 1995).

2.1.2. Purificacin de protenas

Las protenas se purifican mediante procedimientos de fraccionamiento. En una serie de etapas independientes, se aprovechan las diversas propiedades fisicoqumicas de las protenas que interesan para separarlas progresivamente de otras protenas y/o de las dems sustancias. Las caractersticas de las protenas que se emplean en los diversos procedimientos de separacin son: solubilidad, carga inica, tamao molecular, propiedades de absorcin y capacidad de unin a otras molculas biolgicas (Voet & Voet, 1992).

2.1.2.1. Solubilidad
Los mltiples grupos cido-base de una protena determinan que sus propiedades de solubilidad dependan de la concentracin de las sales disueltas, de la polaridad del disolvente, del pH y de la temperatura (Voet & Voet, 1992).

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2.1.2.2. Separaciones cromatogrficas

La fase mvil de una cromatografa consiste en una mezcla de sustancias que se van a fraccionar disueltas en un lquido, que se hace fluir a travs de una columna de una matriz porosa, que constituye la fase estacionaria. Las interacciones de los solutos individuales con la fase estacionaria determinan que cada componente migre con velocidades diferentes y que la mezcla se separe en bandas de sustancias puras. Los diversos mtodos cromatogrficos surgen de la interaccin dominante entre la fase estacionaria y las sustancias que estn siendo separadas y son: cromatografa de intercambio inico, de adsorcin, de exclusin molecular, de interaccin hidrofbica o de afinidad (Voet & Voet, 1992).

2.1.2.3. Separaciones electroforticas

La electroforesis es un mtodo analtico de alto poder resolutivo que permite la separacin de molculas biolgicas cargadas por la combinacin de su migracin en un campo elctrico y el efecto de tamizado molecular a travs de un gel de corrida. Las protenas, al ser molculas anfotricas polivalentes, migran en un campo elctrico de acuerdo con su carga neta, que a su vez depende de la carga macromolecular, del tamao y de la forma, como as tambin de las propiedades fisicoqumicas del medio electrofortico (Makowski & Ramsby,1997). La incorporacin del detergente SDS a la solucin proteica permite separar todos los tipos de protenas, incluyendo las insolubles en agua. El SDS se une a las regiones hidrofbicas de las molculas proteicas haciendo que se desplieguen las cadenas polipeptdicas, liberndolas de sus asociaciones con otras molculas proteicas o lipdicas. En estas condiciones la electroforesis separa los polipptidos en funcin de su tamao, lo que proporciona informacin sobre su peso molecular. Adems, el agregado de un agente reductor como el -mercaptoetanol reduce los enlaces disulfuro que pudieran existir en las protenas, de modo que se pueden visualizar todos los polipptidos constitutivos de las molculas polimricas (Voet & Voet, 1992).

2.1.2.4. Deteccin inmunolgica

La exposicin de las protenas presentes en una muestra a un anticuerpo especfico contra la protena en estudio y el revelado con un anticuerpo contra el primero acoplado a una enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina) o a un colorante fluorescente, permite su identificacin tanto en separaciones electroforticas (Western blotting) como en los tejidos (inmunohistoqumica).

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Las ventajas de estos mtodos son las siguientes: a) no se necesitan reactivos radiactivos, b) no se requieren precauciones especiales para mantener la conformacin nativa de la protena y c) regiones de la protena que estn ocultas en la conformacin nativa pueden exponerse durante la electroforesis desnaturalizante, lo que permite usar anticuerpos antipeptdicos (Scheidtmann et al., 1997).

2.2. ROL FISIOLGICO DE LAS PEPTIDASAS VEGETALES

La mayor importancia de las peptidasas radica en que permiten la reutilizacin de los aminocidos constituyentes de protenas, lo que es fundamental en los procesos de desarrollo. As, durante la germinacin movilizan las reservas proteicas; durante el crecimiento y desarrollo permiten el recambio de las protenas existentes por aquellas que la planta necesita para adaptarse a los cambios ambientales y, durante la senescencia producen los aminocidos que sern reservados para su uso por la prxima generacin. Sin embargo, se han identificado varias peptidasas que no parecen cumplir ninguna funcin en el crecimiento y desarrollo o se encuentran en cantidades muy superiores a las que la planta necesita para estas funciones. A tales peptidasas se las llama protenas secundarias, por analoga con los metabolitos secundarios (Boller, 1986).

2.2.1. Adquisicin de nutrientes

Debido a que las plantas son auttrofas, los procesos digestivos no presentan en general gran importancia. Las excepciones las constituyen las plantas carnvoras y el establecimiento de relaciones parasitarias o simbiticas. Plantas carnvoras Las peptidasas de las plantas insectvoras son capaces de digerir las protenas presentes en la presa capturada y por lo tanto aportar nutrientes a la planta. Las plantas carnvoras que muestran mayor secrecin de enzimas digestivas son las de la familia Nepenthaceae, quienes presentan hojas transformadas en rganos huecos que atrapan insectos y otros invertebrados pequeos (Mutlu & Gal, 1999). Las peptidasas aisladas de Nepenthes tienen un pH ptimo en el rango cido y son inhibidas por pepstatina (Tkes et al., 1974). Tambin se encuentran secreciones digestivas en especies de los gneros Drosera, Dionaea, Drosophyllum y Pinguicula (Boller, 1986). Al igual que en el estmago de los vertebrados, las plantas insectvoras secretan HCl para mantener una alta acidez de los fluidos digestivos. Las diferentes plantas insectvoras utilizan mecanismos especiales para secretar el cido y las peptidasas. En Nepenthes las glndulas secretan un fluido neutro que contiene las peptidasas pero que

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a ese pH estn prcticamente inactivas; frente a la captura de la presa, se secretan protones y se inicia la actividad digestiva. En Pinguicula las peptidasas se acumulan en las clulas glandulares superiores, mientras que el HCl lo hace en las clulas basales y se libera despus de la estimulacin (Boller, 1986). Plantas parsitas Las plantas parsitas presentan rganos diferenciados, los haustorios, que penetran en el husped estableciendo un contacto directo con las clulas del xilema y/o del floema y toman sus nutrientes. La penetracin y el desarrollo de los haustorios parece requerir de la accin de peptidasas (Boller, 1986).

2.2.2. Defensa contra patgenos y predadores

Al igual que muchos metabolitos secundarios, algunas peptidasas son consideradas agentes protectores contra patgenos, parsitos y herbvoros (Bell, 1981). En general, estas peptidasas estn localizadas en la vacuola o en la pared celular. Al lesionarse un tejido, las hidrolasas liberadas de las vacuolas rotas constituyen la primera lnea de defensa contra potenciales patgenos. La presencia de abundantes peptidasas en algunos frutos (anan, kiwi, papaya) podra relacionarse con esta funcin (Boller, 1986). En el caso de Cynara cardunculus L., Ramalho-Santos et al. (1997) postulan que a semejanza de los inhibidores de peptidasas que desencadenan una hiperproduccin de peptidasas digestivas en el tracto digestivo de los insectos, la cardosina podra cumplir la funcin de proteger al estigma floral del ataque de herbvoros. Recientemente Schaller & Ryan (1996) han determinado que las heridas, el metil jasmonato y la sistemina inducen la sntesis del mARN de una AP en las hojas de tomate postulando que estas enzimas intervendran en las respuesta de defensa de las plantas de tomate contra el ataque de herbvoros.

2.2.3. Movilizacin de reservas

Durante la germinacin, las protenas almacenadas en las semillas son expresadas en rganos especficos (endosperma o mesfilo del cotiledn), siendo generalmente sintetizadas como precursores que sern procesados antes de su depsito en los cuerpos proteicos. Para ello pareciera que es importante la co-localizacin en la misma organela de varias peptidasas (Mutlu & Gal, 1999). Muchas peptidasas estn involucradas en la movilizacin de las protenas de reserva de la semilla, proveyendo los aminocidos para el crecimiento de la planta. Entre ellas se encuentran las cisten-peptidasas de Vigna y de maz (Boller, 1986), las amino- y dipeptidasas de cebada (Mikola & Mikola, 1986) y las aspartil peptidasas de arroz (Doi et

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al., 1980), trigo (Belozerski et al., 1989), cebada (Kervinen et al., 1993; Sarkkinen et al., 1992), cacao (Biehl et al., 1993) y colza (D'Hondt et al., 1993). Tambin Voigt et al. (1997) asocia las altas actividades de peptidasas asprticas encontradas en semillas no germinadas de varias angiospermas a funciones biolgicas durante la maduracin. La movilizacin de reservas de la aleurona de cebada se encuentra bajo control hormonal. El cido giberlico (GA3) derivado del embrin estimula la secrecin de enzimas proteolticas y su accin es antagonizada por el cido abscsico (ABA). Esto se debera a que el GA3 incrementara la sntesis y transporte de peptidasas (cistenicas y asprticas) hacia las vacuolas que almacenan protenas y/o a la disminucin del pH del lumen de esta organela, lo que activara dichas enzimas. Se comprob que el tratamiento con GA3 incrementa la actividad de tres peptidasas cistenicas, mientras que no estimula significativamente a las APs (Bethke et al., 1996; Swanson & Jones, 1996; Swanson et al., 1998).

2.2.4. Senescencia
Es conocida la participacin de peptidasas en los procesos de muerte celular de animales y plantas. La senescencia es un proceso programado dentro del desarrollo de la planta que involucra una serie de cambios enzimticos y metablicos que tienen lugar de forma simultnea o secuencial en los diferentes tejidos que envejecen. Se produce una movilizacin y exportacin masiva de carbono, nitrgeno y minerales con un eficiente reciclaje de los nutrientes (Kaur-Sawhney & Galston, 1986). En general, los estudios sobre la enzimologa de los procesos degradativos en plantas adolecen de rigor tcnico y han sido realizados en circunstancias experimentales muy diferentes que han llevado a resultados conflictivos. Un elemento de confusin adicional es que si bien el 95 % de las pptido-hidrolasas se encuentran en las vacuolas de las clulas del mesfilo, la mayor degradacin de protenas en la senescencia ocurre en el interior del cloroplasto. Actualmente, parece claro que el cloroplasto tiene sus propias peptidasas que seran codificadas en el ncleo, pues no se ha identificado en el ADN cloroplstico ninguna secuencia homloga a las peptidasas conocidas. El control de la actividad de estas peptidasas durante la senescencia podra ocurrir bien por sntesis de novo de la protena, por activacin de enzimas preexistentes en forma de proenzimas o por compartimentalizacin, es decir co-localizando enzima y sustrato (Valpuesta et al., 1993). Ejemplos de un posible rol en la senescencia lo constituyen las APs encontradas en hojas de naranjo (Garca-Martnez & Moreno, 1986), de cebada (Kervinen et al., 1995) y de flores de cardo (Heimgartner et al., 1990, Cordeiro et al., 1994a).

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2.2.5. Interaccin polen-pistilo

La papila estigmtica es el lugar donde interacta primero el polen con el tejido esporoftico femenino en su camino hacia el ovario. En la superficie del estigma es capturado, hidratado y germina. Todos estos procesos involucran eventos moleculares de reconocimiento, sealizacin y respuesta (Elleman & Dickinson, 1990, 1994). El hecho que la cardosina A est localizada en las vacuolas de las papilas estigmticas de C. cardunculus L. llev a Ramalho-Santos et al. (1997) a postular que esta enzima estara involucrada en la interaccin polen-pistilo, participando en eventos extracelulares de degradacin proteica que permitan la correcta adhesin y/o germinacin del polen. Adems, la presencia de la triada Arg-Gly-Asp (RGD) en la secuencia de la cardosina A (caracterstica de las protenas celulares que unen integrina) que puede ser reconocida por una protena de 100 kDa del polen, apoyan la hiptesis de la intervencin de la cardosina A en el interaccin polen-pistilo (Frazo et al., 1999).