BIOLOGA. Tema 8 DNA RECOMBINANTE Y BIOTECNOLOGA.

(Corresponde al captulo 17 de Vida y 19 y 20 de Iniciacin a la Biologa de Freeman) BIOTECNOLOGA Conjunto de tcnicas que permite la manipulacin y transferencia de genes. Su objetivo es la mejora de productos alimentarios aunque tiene grandes aplicaciones en medicina. El descubrimiento de enzimas que cortan en DNA por lugares especficos as como de enzimas que unen fragmentos de DNA da la posibilidad de trasladar genes de un lugar a otro. Es una aplicacin de la manipulacin del DNA. La Biotecnologa emplea las clulas microbianas, vegetales y animales para producir materiales tiles para las personas. Los vectores de expresin pueden convertir las clulas en fbricas de protenas. Para la expresin de un gen y la sntesis de sus productos en la clula husped hace falta: - un promotor bacteriano para la unin a la RNA polimerasa - un finalizador de la transcripcin - una secuencia especial sobre el mRNA para la unin al ribosoma. Formas de un vector de expresin: promotor inducible, promotor de tejido especfico y secuencias blanco. La biotecnologa permite: - fabricar protenas de utilidad mdica mediante la tecnologa del DNA recombinante (cuadro 17.1) p.e insulina humana o activador tisular del plasmingeno (TPA): activa la plasmina par disolver en su momento el cogulo de sangre que se ha formado para detener la hemorragias en una herida o Eritropoyetina (EPO), hormona que estimula la divisin celular para producir eritrocitos o Insulina humana (estimula a las clulas para captar glucosa de la sangre). La manipulacin del DNA est cambiando la agricultura (cuadro 17.2). La mejora tradicional ha consistido en conservar fenotipos deseables; se sigui con el advenimiento de la gentica en la tcnica de cruzamientos. La tecnologa del DNA recombinante tiene dos ventajas: o es un proceso ms preciso y ms rpido que el tradicional o se puede introducir cualquier gen de cualquier organismo en una planta o animal - obtener plantas transgnicas que fabrican sus propios insecticidas. Sustituyen a los insecticidas con todos sus problemas de toxicidad. Genes modificados de cepas de B. thurigiensis se han introducido en clulas vegetales de tomate, maz, patata y algodn dndoles resistencia a insectos depredadores - obtener animales clonados que expresan genes tiles para producir medicamentos (produccin de seda de araa en la leche de oveja) - anlisis de huellas personales de DNA (el DNA es nico)

cultivos resistentes a herbicidas. Algunas bacterias del suelo han mutado, desarrollando una enzima que degrada el glifosato. Se ha aislado y clonado el gen responsable y se ha insertado en plantas como maz, algodn y soja hacindolas resistentes al glifosato (herbicida) Los granos han mejorado las caractersticas nutricionales, p.e. el arroz transgnico con gen de narciso que posee enzimas que convierten el precursor en beta-caroteno (provitamina A). El arroz normal no contiene beta-caroteno y la alimentacin sla con l (en muchas naciones) produce falta de vitamina A.

Existe preocupacin pblica respecto a la biotecnologa por: la manipulacin gentica interfiere de manera artificial en la naturaleza los alimentos genticamente modificados son inseguros para ser ingeridos las plantas genticamente modificadas son peligrosas para el ambiente.

Debe procederse con cautela dada la escasa experiencia en el tema. La tcnica de anlisis de huellas dctiles del DNA usa la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Un individuo puede ser identificado por una huella dactilar gentica por medio de la secuencia de bases de su DNA que es nica. El genoma humano tiene ms de 3.000 millones de nucletidos; entre ellos hay genes polimrficos con alelos diferentes en los distintos individuos.. En la prctica se utilizan enzimas de restriccin y electroforesis en gel. Clonacin de DNA Por insercin del gen en un plsmido bacteriano (pequea molcula de DNA circular). Con la reproduccin del plsmido se multiplica el gen Por el mtodo de la PCR (reaccin en cadena de la polimerasa)

ADN Recombinante

En un tubo de ensayo el DNA es cortado en fragmentos pequeos y los fragmentos de diferentes fuentes se ligan en forma covalente para crear ADN recombinante. Este ADN puede ser introducido en una clula husped para que fabrique un nuevo producto gnico. Ela Biotecnologa o Ingeniera Gentica aplicable en frmacos, plantas de cultivo y animales (ej. Cabra que da seda en la leche) Tanto la transcripcin como la traduccin, mecanismos de replicacin del ADN como todas las tcnicas del ADN recombinante se basan en el apareamiento de bases complementarias A (adenina) con T (timina)( U (uracilo)) y G (guanina) con C (citosina). Se trata de un conjunto de tcnicas que permiten obtener nuevas combinaciones de material hereditario que no se encuentra en la naturaleza (ADN recombinante) y la clonacin de genes en clulas heterlogas.

Mediante determinadas enzimas (endonucleasas de restriccin y ADN ligasas) que actan sobre los cidos nucleicos, se cortan, modifican y unen molculas de ADN de manera controlada en el laboratorio. Tcnicas fundamentales - Hibridacin. Identifica los genes con sondas especficas - Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Amplifica un gen - Secuenciacin del ADN. Caracteriza un gen. Mtodo Didesoxi (fig. 19.9 y 19.10 del Freeman) - Electroforesis en gel . Separa y aisla los genes - Microchips. Analiza la expresin diferencial de los genes. Tcnica del PCR.- Reaccin de sntesis del DNA in vitro en la que una seccin especfica del DNA se replica mltiples veces, generando muchas copias idnticas de dicha seccin (fig. 19.7 pg. 395 del Freeman). Son necesarios : un DNA de plantilla abundancia de los 4 desoxinucletidos (ATP,GTP,TTP,CTP) la enzima TaqPolimerasa (estable al calor) cebadores o promotores

Fases de la PCR: desnaturalizacin (separacin) de la doble cadena del DNA por calentamiento a 94C Hibridacin (emparejamiento de bases complementarias y promotores en cada cadena)por enfriamiento a 55C Elongacin, sntesis y ampliacin de la hebra complementaria cDNA en cada cadena) con calentamiento a 72C

La secuenciacin de un gen es importante para: analizar diferentes secuencias de alelos (por qu un gen funciona de distintas maneras) conocer la secuencia de aminocidos y la estructura primaria de la protena comparacin entre secuencias gnicas de distintas especies

El mtodo didesoxi se fundamenta en aadir ddNTP (didesoxirribonuclesido trifosfato) junto con las dNTP (desoxirribonuclesidos trifosfatos) en la fase de crecimiento de la hebra del DNA en la PCR y se para el proceso de sntesis de la hebra. Los productos transgnicos son aquellos en los que se ha introducido un gen en su organismo. El objetivo del trabajo con ADN recombinante es producir muchas copias (clones) de un gen para producir un producto proteico en cantidad. Se necesitan hospedadores. Los principales hospedadores de genes forneos son: - Bacterias (inicialmente) - Levaduras. Tienen la ventaja de una divisin celular rpida - Clulas vegetales y animales.

Pasos en la clonacin de genes: - Corta y pega de fragmentos de DNA con enzimas - Transporte de genes con vectores, los cuales deben tener una secuencia de reconocimiento y un marcador gentico - Utilizacin de clulas hospedadoras 1.- Corte y reparacin del genoma original Se utilizan enzimas de restriccin: cortan el ADN por un sitio especfico o Diana y permiten luego unir diferentes fragmentos (origen bacteriano). Hay ms de 100 enzimas de restriccin con diferentes dianas de corte. Son herramienta clave para la ingeniera gentica (son tijeras moleculares). Cortan el DNA cada vez que encuentran una determinada secuencia de bases especfica de la enzima en cuestin, permitiendo obtener fragmentos cortos de DNA y reproducirlos de manera controlada. Estas enzimas se encuentran en las bacterias y realmente son mecanismos de defensa frente a la invasin de virus bacterifagos. 2.- El fragmento cortado se une a un vector que lo transporta a una clula hospedadora El DNA vector una vez cortado por la misma enzima se une al gen a clonar por la zona de dianas comunes y se pegan con la enzima ligasas (pegamento molecular) Los vectores utilizados son plsmidos o virus que infectan bacterias inyectando su DNA al interior de la bacteria. El gen a clonar no altera su capacidad de replicarse posteriormente en el interior de la bacteria. Los vectores son molculas de DNA con capacidad de replicarse por s mismos y con regiones donde se insertan fragmentos de DNA exgeno. Hay vectores especficos para clulas de levaduras, mamferos y vegetales. 3.- Introduccin del gen en la clula hospedadora y establecimiento de un linaje de clulas que lo reproduzcan para obtener el producto del gen Los plsmidos y virus se introducen en la bacteria con su gen forneo y se reproducen rpidamente. Es una fbrica artificial de genes que puede pararse su reproduccin por congelacin e iniciar nuevamente su crecimiento en el momento deseado. Las principales clulas hospedadoras para el clonaje de genes son las bacterias. Tambin las clulas vegetales y animales pueden ser hospedadoras de genes heterlogos. 4.- Electroforesis Esta tcnica permite la separacin de macromolculas que tienen carga elctrica y por tanto al someterlas a un campo elctrico se movern hacia la direccin fijada por su carga elctrica. Las molculas de DNA pueden separarse por electroforesis en gel.. Pueden reconocerse DNAs homlogos. Desnaturalizacin del DNA: rotura de los puentes de H y separacin de las dos cadenas de la doble hlice. Esto se hace sometiendo el DNA a temperaturas superiores a 80C o a la accin de lcalis. Al bajar la temperatura pueden volver a juntarse las

cadenas, es la renaturalizacin; cuando este apareamiento se hace entre DNAs heterlogos (con algn punto de homologa) se denomina hibridacin de cidos nucleicos y es la base para la identificacin de DNAs. 5.- Biochips En esta tcnica confluyen la microelectrnica, la biologa molecular y la informtica. El chip de DNA permite localizar y analizar en pocas horas los constituyentes de una mezcla compleja de miles de secuencias diferentes de DNAs de RNAs. Tienen grandes aplicaciones prcticas por ejemplo para saber si una persona est infectada con un determinado virus patgeno. Slo hay que aplicar una pequea muestra de sangre a un chip comercial y el ordenador dar la informacin precisa. Es necesario el conocimiento de los genomas y la existencia de bases de datos de secuencias de diferentes organismos. Son aplicables tambin en fraudes alimentarios, para la deteccin de patgenos en aguas, aire, productos farmacuticos Todas las tcnicas clave en la tecnologa del DNA recombinante hacen uso del apareamiento de bases complementarias A con T ( U) y G con C. Las nucleasas de restriccin son enzimas producidas por bacterias para luchar contra los virus. Son bisturs para cortar muestras de DNA en fragmentos pequeos. La electroforesis en gel identifica el tamao de los fragmentos de DNA y as pueden examinarse individualmente. Los fragmentos de DNA se reasocian al bajar la temperatura y quedan unidos por la enzima DNA ligasa que sella con enlace covalente cada cadena de DNA. Los cientficos pueden formar un DNA recombinante usando nucleasas de restriccin (para cortar) y DNA ligasas para reasociar diferentes molculas de DNA. Objetivo del trabajo con DNA recombinante: producir copias (clones) de genes con fines de anlisis o para producir un producto proteico en cantidad. Los genes pueden ser insertados tanto en clulas procariontes como en eucariontes. Si el DNA debe producir su protena debe de estar insertado en una clula husped que debe ser elegida aquella que cuente con una secuencia de inters que permita ser marcada con facilidad para seguirle la pista. Se porque:han utilizado con xito las bacterias como huspedes o clulas hospedadoras crecen y se manipulan con facilidad su biologa celular es conocida pueden utilizarse muchos marcadores gnicos contienen plsmidos (cromosomas circulares) para el transporte del DNA

Pero las bacterias no son adecuadas o ideales para el estudio de los genes eucariontes, entre otras cosas porque carecen de Splicing. Adems cuando el propsito es producir un organismo transgnico (organismo al que se le agrega un gen) el husped debe ser un animal o una planta.

Huspedes adecuados para las clulas eucariontes son las levaduras del pan y de la cerveza (Sacharomyces) ya que: - tienen divisin celular rpida - su cultivo en laboratorio es fcil - el tamao de su genoma es pequeo La clulas vegetales son buenos huspedes para cuando se quiere crear una planta transgnica. Son totipotenciales El objetivo es insertar DNA nuevo en una clula y lograr que se replique a medida que sta se divide; el DNA ingresa formando parte de una secuencia transportadora que ya posee origen de replicacin: este DNA transportador se denomina Vector. Este vector debe tener un marcador gentico que nos detecte su presencia en la clula husped y adems debe de ser pequeo respecto al cromosoma husped. Los plsmidos son ideales para la introduccin de DNA recombinante en la clula ya que: - tienen origen de replicacin - aparecen de forma natural - son pequeos (presentan un solo sitio para una enzima de restriccin dada) - una vez cortados por la enzima se aparean fcilmente con fragmentos de DNA - contienen genes con resistencias a antibiticos (proporciona marcador gentico) - tienen facilidad de replicacin independiente del cromosoma husped. Los virus como vectores Tienen mayor capacidad de replicacin que los plsmidos (5.000 pares de bases), lo cual les hace interesantes para acomodar DNA de gran tamao. Pueden utilizarse virus con 45.000 pares de bases. No requieren medios artificiales ya que los virus infectan slos y por su natural a las clulas. Son importantes para transferir nuevos genes a personas en terapias gnicas. Los cromosomas artificiales como vectores Se ha creado en laboratorio, el YAC (cromosoma artificial de levadura) con su origen de replicacin, secuencias para el centrmero y telmeros. Se trata de un verdadero cromosoma eucarionte. Plsmidos como vectores para las plantas Se usa el plsmido contenido en la bacteria Agrobacterium tumefaciens. Es el TI (inductor de tumores) Formas para insertar DNA recombinante en la clula husped Hay que vencer la barrera de la membrana plasmtica con carga negativa al igual que el DNA. Esto se soluciona neutralizando la carga del DNA con sales de Ca++ o eliminando en clulas vegetales la pared celular por hidrlisis con clulas micticas.

Por electroporacin (con corriente de alto voltaje) Por inyeccin (con pipeta muy fina) til en clulas grandes Por lipofeccin (recubriendo el DNA con un lquido) Por bombardeo de partculas

Los marcadores genticos identifican las clulas huspedes que contienen ADN recombinante. Se puede marcar el DNA recombinante inactivando los genes. Cada marcador gentico proporciona una marca en una posicin del cromosoma. El marcador y el fenotipo van ligados estrechamente (fig. 19.11 del Freeman). Ciertos marcadores genticos se heredan con el gen correspondiente (fig. 19.12 del Freeman). Con ayuda de los marcadores genticos puede construirse el mapa gentico, de grandes aplicaciones en identificacin de pedigres, en medicina, paleontologa etc. Hay marcadores de resistencia a antibiticos, de fluorescencia (medusas) y de luminiscencia (lucirnagas). El uso de marcadores fluorescentes simplifica la secuenciacin gnica (fig. 19.10 del Freeman) Fuentes de genes para clonacin: - trozos aleatorios de cromosomas (bibliotecas gnicas) - haciendo una copia de DNA por transcripcin inversa del mRNA - DNA sintetizado en laboratorio - DNA mutado en laboratorio Herramientas adicionales para la manipulacin del DNA Los genes pueden ser inactivados por recombinacin homloga. Se trata de reemplazar un gen dentro de una clula con una forma inactivada de ese mismo gen y luego observar qu ocurre cuando el gen inactivad es parte del organismo (tcnica Knockout) Los chips de DNA pueden revelar mutaciones en el DNA y expresin del RNA. Se detectan tambin variantes genticas. Estos chips proporcionan grandes series de secuencias de hibridacin. Son portaobjetos de vidrio sobre los que se pegan secuencias de DNA preestablecidas en un orden preciso (hasta 60.000 secuencias diferentes en un chip) y se controlan por computadora. Fig17.11 El RNA antisentido ( de sentido contrario), complementario al mRNA y las ribozimas pueden prevenir la expresin de genes especficos. El RNA antisentido bloquea la traduccin del mRNA, bloqueando la sntesis de su protena.. Esta tcnica se ha utilizado para bloquear el crecimiento de las clulas de cncer. La ribozima es una secuencia especial de RNA que cataliza el clivaje de su RNA blanco

Resmen de algunas tcnicas y herramientas empleadas en Ingeniera gentica (cuadro 19.1, pg. 406 y 407 del Freeman) Herramientas: Transcriptasa inversa. Enzima que cataliza la sntesis de un DNA complementario a partir de un RNA plantilla Endonucleasas de restriccin. Enzimas que cortan el DNA en una secuencia concreta, a menudo en una palindrmica de 5 pares de bases DNA ligasa. Enzima que enlaza nucletidos de la misma hebra de DNA Plsmidos. Pequeas molculas de DNA circulares. Presentes en bacterias y levaduras Taq Polimerasa. Cataliza la sntesis de DNA a partir de una plantilla de DNA con cebador (es estable a T de 95C). Utilizada en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) SNP (polimorfismo de un nico nucletido). Lugar del DNA donde la identidad de las bases es variable entre los individuos de una poblacin. til para la bsqueda de genes

Tcnicas DNA Recombinante. Tomar un gen de un individuo y colocarlo en el genoma de otro individuo correspondiente a otra especie distinta PCR (Reaccin en cadena de la polimerasa). Produccin de mltiples copias de una secuencia determinada de DNA Secuenciacin Didesoxi. Determinacin de la secuencia de bases de un gen o de una secuencia de DNA. Precisa monmeros de ddNTP (didesoxirribonuclesidos) Biblioteca gentica. Coleccin de todas las secuencias de DNA de una fuente determinada. Permiten catalogar los genes expresados en un determinado tipo celular Sondas de DNA. Permite encontrar secuencias concretas de de una secuencia de DNA entre una coleccin de ellas. Usa un fragmento de DNA conocido y marcado Mapas genticos. Muestran las posiciones relativas de secuencias concretas de DNA en los cromosomas. Como aplicaciones estn el uso de marcadores genticos para encontrar genes desconocidos asociados a distintos fenotipos