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1- Comentar estructura 1, 2 y 3 de las protenas. 2- Qu es la cadena respiratoria transportadora de electrones?. Dnde la pomedos encontrar? Qu funcin tiene?.

3- Qu son las enzimas de restriccin?. Qu utilidad tienen en biotecnologa? 4- Un dibujo de la Membrana plasmtica. Habia que nombras las partes . como ocho partes 5- Qu es el splicing o ayuste alternativo? qu cansecuencias y ventajas tiene? 6- Hacer un esquema de la anafase en meiosis 2n=6. 7- Definir conceptos: Fragmentos OKAZAKI, cebador, hebra retardada o retrasada, topoisomerasa, telmero. 8- En qu consiste el proceso de diferenciacin celular? y para que sirve o porqu se hace.? ...algo asi..! no me acuerdo bien de esta ltima parte. 9- Problema de mendel ligado al X. 10- Qu eran las Dominio Archaea. caracteristicas.

Gradiente de protones atraves de la membrana tilacoidal y la funcion del atp.


Segn la teora quimiosmtica de Mitchell( ganador del premio Nobel en 1978), el sistema transportador de electrones produce un gradiente de protones entre los dos lados de la membrana mitocondrial interna, que crea una diferencia de pH y un potencial de membrana. De acuerdo a esta teora, los protones son bombeados de la matriz mitocondrial hacia el compartimiento intermembranal, a medida que los electrones del NADH2 se mueven a travs de una cadena transportadora de electrones, la cual forma parte de la membrana mitocondrial. Cada par de electrones cruza la membrana tres veces, transportando en cada una de ellas dos protones hacia el espacio intermembranal. Se forma as un gradiente de protones y de potencial elctrico ( gradiente electroqumico) , que origina un movimiento inverso de protones hacia la matriz, a travs de canales de difusin formados por la ATP asa ( ATP sintetiza). A medida que los protones (H+) pasan a travs de la ATP sintetiza, la energa libre liberada potencia la sntesis de ATP a partir de ADP y fosfato. Por cada NADH2 que se oxida, se traslocan 6 protones los que al regresar a la matriz generan 3 molculas de ATP. La sntesis de ATP acoplada al consumo de oxgeno se llama fosforilacin oxidativa.

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FOSFORILACIN FOTOSINTTICA
La sntesis de ATP producida en los cloroplastos, mediante la utilizacin de energa luminosa, se denomina fotofosforilacin:

En la membrana tilacoidal como resultado de la fotlisis del agua ( ) y de la oxidacin de la plastoquinona ( ) se generan protones (H+ ), que originan un alto gradiente de concentracin de protones, al ser transportados del lumen tilacoidal hacia el estroma. Ese gradiente de pH a travs de la membrana es responsable de la sntesis de ATP, catalizada por la enzima ATP sintetasa. FIGURA TRANSPORTE DE ELECTRONES EN LA MEMBRANA TILACOIDAL

Son los metodos aplicado correctos?


En la ltima dcada, las aplicaciones de la biologa molecular-AP enfoques han proporcionado informacin nica en el inculto las comunidades microbianas de suelos y aguas, ya que evitar sesgos inherentes a la cultura tradicional basada en microbiolgicos mtodos (16). La validez de la utilizacin de tcnicas moleculares en el estudios del medio ambiente depende de la obtencin de representante ex-

extensiones de los cidos nucleicos a partir de todas las comunidades microbianas. Nucleic mtodos de extraccin de cido, sin embargo, sufren de comgolpean las ineficiencias en los pasos de componentes individuales, incluyendo la lisis celular incompleta, absorcin de ADN para la superficie del suelo, coextraccin de los inhibidores enzimticos del suelo y la prdida, degradacindacin, o el dao del ADN. As, los estudios de extraccin de ADN tcnicas (14, 23, 24, 27) han indicado que estas tcnicas puede introducir sesgos de los suyos. Una desventaja importante lisis de los mtodos directos es que ms-sustancias inhibidoras de PCR se extraen junto con el ADN (29, 36, 39). Adems, el nmero y diversidad de la extraccin de ADN lisis directa proprotocolos utilizados por los suelos y los sedimentos son de enormes proporciones (1113, 20, 27, 29, 30, 44), pero cada protocolo suele incluir de uno a todos los tres de los siguientes elementos bsicos: ruptura fsica, lisis qumicos, y la lisis enzimtica. ). La eficacia de los diversos componentes qumicos lisis de rered en gran parte desconocida, ya que slo la obtencin del ADN total despus de lisis celular y la posterior purificacin se informa. Por otra parte, la eficacia de la lisis celular en cada paso de un protocolo se informa slo en raras ocasiones (27). Un ltimo componente de extraccin de ADN muchas tcnicas es la lisis enzimtica. La lisozima (4, 8, 11, 14, 31, 36, 38), proteinasa K (25, 36, 44), achromopeptidase (7), y pronase E (14) han sido empleados para promover la lisis celular, y digestin de la lisozima es el procedimiento ms ampliamente utilizado. Debido a que * Responsable de la correspondencia. Direccin postal: Investigacin de Animales para Carne a la falta de estudios comparativos, no est claro qu efecto tiene la

Adems de un paso de lisis enzimtica tiene en el rendimiento de ADN


Por lo tanto, la seleccin de un ADN adecuado extraccin y el procedimiento de purificacin de entre los procediprocedimientos que se han descrito hasta la fecha sigue siendo un problema importanteblema en la aplicacin de tcnicas moleculares para estudios de suelo y los sedimentos comunidades microbianas. Los objetivos de este estudio fueron comparar la mayora de los comelementos comunes de extraccin de ADN y protocolos de purificacin y utilizar la informacin obtenida para desarrollar un comprensivoSIVE mtodo para la obtencin de ADN y la comunidad entera del suelo y muestras de sedimentos que contienen diferentes cantidades de omateria orgnica. Nueve procedimientos de extraccin con diferentes concontrastantes, fsicos, qumicos y enzimticos elementos fueron evauated sobre la base de los siguientes criterios: (i) la eficiencia de la clula lisis, (ii) el rendimiento total del ADN, y (iii) los tamaos moleculares de la Fragmentos de ADN. Cuatro procedimientos de purificacin tambin se evauated mediante pruebas para detectar la presencia de sustancias inhibidoras-PCR y la prdida de ADN durante el procedimiento. Homogeneiza bolas de molino neizacin se optimizaron las condiciones de entonces con dos diferentes

en los instrumentos a fin de obtener la mayor homogeneizacin cantidad de ADN con la menor cantidad de corte del ADN. El resultado fue un optimizado lisis de extraccin directa de ADN y purificacin del protocolo de los suelos y los sedimentos que tiene diversas importa el contenido orgnico. RESULTADOS Comparacin de los procedimientos de extraccin. Cuando la diferencia de nueve diferentes procedimientos de extraccin de ADN (Tabla 2) se utilizaron con liofilizado muestras, todos los procedimientos, salvo los procedimientos 6 y 9 dio ethiduim manchada bandas en agarosa-bromuro de geles (Fig. 1). Aunque la extraccin de GTC es til para el ARN extraccin de suelos y sedimentos (19, 40), es evidente que no propicio para la extraccin de ADN. La distribucin del tamao del ADN fragmentos (de 16 a 3,5 kb) obtenido con cada uno de los restantes procedimientos de extraccin (procedimientos del 1 al 5, 7 y 8) por el gel electroforesis revel que algunos de corte limitada se llev a cabo durante la extraccin, sin importar el mtodo de ruptura fsica empleado. El ADN de los rendimientos variaron considerablemente de la muestra a muestra y el procedimiento de extraccin utilizados (Cuadro 3). Genpor va oral, los rendimientos de ADN fueron mayores con el sedimento de los humedales lisis celular. Los efectos de los procedimientos de extraccin de ADN en la lisis celular se examinaron slo con los sedimentos de los humedales. Obtuvo rendimientos significativos Nuestros resultados apoyan la resultados de estudios previos (20, 21, 27, 33) en el que mayor ADN rendimientos se obtuvieron con la homogeneizacin molino de perlas que con congelacin y descongelacin lisis fsico. Sin embargo, encontramos que la inclusin de pretratamiento de la lisozima, Chelex 100, o GTC haba perjudiciales efectos y, o bien disminuye el rendimiento de ADN (lisozima y GTC) o la recuperacin de aumento del cido hmico (Chelex 100). Incluyendo cin de disolventes orgnicos (fenol y cloroformo) sustancialmente en aument el rendimiento de ADN (19 y 35%, respectivamente). A pesar de los cuatro procedimientos de purificacin se analizaron tenan efecto beneficioso, los mtodos difieren con respecto tanto a la cantidad y la calidad del ADN recuperado. Sephadex G-200 SpinBind columna y columna de purificacin, a base de slice resultado en el ADN mayor rendimiento y elimina ms contamiinants que cualquiera de electroforesis en gel o acetato de amonio precipitacin. Sephadex G-200 columnas fueron superiores a los de slice columnas basadas basa tanto en el rendimiento y la pureza, sino que rerequeridas ms tiempo de preparacin y centrifugacin a baja velocidad (130 g) durante el embalaje para asegurar que la columna de Sephadex G-200 granos se mantuvo intacta (3). Aunque no han sido evaluados en este estudio, Sepharosa 4B columnas de la vuelta han sido recientemente informado rival de Sephadex G-200 columnas de la vuelta en trminos de ADN recuperacin y purificacin (17). Las primeras pruebas en nuestro laboratorio demostr que los cidos hmicos en nuestros extractos se mantuvieron ligeramente

ya en la sefarosa 4B columnas. Una cuidadosa comparacin de la eficacia de Sephadex G-200 y Sepharosa 4B collumnas envasados a baja velocidad se debe hacer con cada suelo o tipo de sedimento para determinar qu sistema de purificacin es mejor para cada tipo de muestra. Ninguno de los cuatro mtodos de purificacin sido totalmente probada eliminar todos los contaminantes, y la purificacin adicional pasos que involucran el bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) y polivinilpolipirrolidona ya sea durante o despus de la extraccin puede ser necesaria para reducir la contaminacin de polisacridos (25, 28, 44) y la contaminacin de cidos hmicos (7, 13, 15, 20, 25, 35, 43, 44), respectivamente. En una comparacin directa, estos dos compuestos dado eficiencias de depuracin equivalente, pero los niveles de la recuperacin del ADN son mucho mayores con CTAB (44). . Un supuesto principal en este trabajo fue que una mayor recuperacin de ADN refleja un representante ms (diverso) de la muestra de ADN de la comunidad microbiana. Mientras que rendimiento de ADN no es la mejor forma de estimar la diversidad, el uso de cuantitativos de medidas de diversidad de ADN en este estudio han sido muy lento. Nuevas herramientas para comparar rpidamente los la diversidad de los extractos de ADN son necesarias para calcular mejor el la eficacia de los protocolos de extraccin de ADN. Es importante reiterar la extraordinaria complejidad del suelo y tipos de sedimentos y el hecho de que existen mltiples factores que pueden afectar la eficacia de un mtodo de extraccin de ADN. Generalizaciones a partir de este estudio puede limitarse a limo suelos francos y los sedimentos que tienen contenido de materia orgnica de diferentes tiendas de campaa, sin embargo, nuestros resultados tambin proporcionan guas tiles que se puede aplicar a los protocolos de desarrollo para otros tipos de Las muestras tambin.

Versin traducida de 1999 Miller1.pdf


Pgina 1 Un Y PPLIED E MEDIO AMBIENTE M ICROBIOLOGY , 0099-2240/99 / $ 04,00 0 Noviembre 1999, p. 4715-4724 Vol. 65, N 11 Copyright 1999, Sociedad Americana de Microbiologa. Todos los derechos reservados. Evaluacin y Optimizacin de la extraccin y purificacin del ADN Procedimientos para suelos y sedimentos muestras MILLER DN, JE * BRYANT, MADSEN EL , Y WC GHIORSE Seccin de Microbiologa de la Divisin de Ciencias Biolgicas, Universidad de Cornell, Ithaca, New York 14853-8101 Recibido 01 de julio 1999/Accepted 06 de agosto 1999 Se han comparado estadsticamente y evalu la efectividad de nueve procedimientos de extraccin de ADN mediante el uso de congelados y se secaron las muestras de dos suelos franco limo y un sedimento franco humedales limo con materia orgnica diferentes contenido. Los efectos de diferentes extractantes qumicos (sodio dodecil sulfato [SDS], cloroformo, fenol, Chelex 100 y isotiocianato guanadinium), diferentes mtodos de interrupcin fsica (homogeneizacin molino de perlascin y congelacin y descongelacin de lisis), y la digestin lisozima fueron evaluados en funcin del rendimiento y el tamao molecular de la recuperar ADN. Las comparaciones pareadas de los nueve procedimientos de extraccin revel que homogeneizacin molino de perlascin con SDS combinado con cloroformo o fenol optimizar tanto la cantidad de ADN extrado y el tamao molecular del ADN (el tamao mximo, entre 16 y 20 kb). Ni la digestin lisozima antes del tratamiento SDS isotiocianato de guanidina, ni el tratamiento ni adicin de resina Chelex 100 mejora los rendimientos de ADN. Molino de bolas homogeneizacin en una mezcla que contiene cloroformo lisis, SDS, NaCl, Tris y tampn fosfato (pH 8) se encontr que la lisis tcnica fsica mejor cuando el rendimiento de ADN y la eficiencia de lisis celular se utilizaron como criterios. La grano condiciones homogeneizacin molino se optimizaron tambin para la velocidad y la duracin con dos diferentes homonizers. Recuperacin de peso molecular de ADN de alto fue mayor cuando se utiliz velocidades ms bajas y tiempos ms cortos (30 a 120 s). Se evaluaron cuatro diferentes mtodos de purificacin de ADN (basado en el ADN de slice unin, gel de agarosa

electroforesis, la precipitacin de acetato de amonio, y Sephadex G-200 de filtracin en gel) para la recuperacin de ADN y eliminacin de los inhibidores de la PCR a partir de extractos crudos. Sephadex G-200 de purificacin de columna de la vuelta se encontr que la mejor mtodo para la eliminacin de sustancias que inhibe la PCR y reducir al mnimo la prdida de ADN durante la purificacin. Nuestro resultados indican que para este tipo de muestras, la obtencin del ADN ptimo requiere, de baja velocidad del grano molino breve homogeneizacin de la presencia de un-buffered SDS-cloroformo mezcla de fosfato, seguida de Sephadex G-200 columna de purificacin. En la ltima dcada, las aplicaciones de la biologa molecular-AP enfoques han proporcionado informacin nica en el inculto las comunidades microbianas de suelos y aguas, ya que evitar sesgos inherentes a la cultura tradicional basada en microbiolgicos mtodos (16). La validez de la utilizacin de tcnicas moleculares en el estudios del medio ambiente depende de la obtencin de representante exextensiones de los cidos nucleicos a partir de todas las comunidades microbianas. Nucleic mtodos de extraccin de cido, sin embargo, sufren de comgolpean las ineficiencias en los pasos de componentes individuales, incluyendo la lisis celular incompleta, absorcin de ADN para la superficie del suelo, coextraccin de los inhibidores enzimticos del suelo y la prdida, degradacindacin, o el dao del ADN. As, los estudios de extraccin de ADN tcnicas (14, 23, 24, 27) han indicado que estas tcnicas puede introducir sesgos de los suyos. En los esfuerzos iniciales para extraer ADN de los sedimentos y los suelos los trabajadores se utiliza tanto la extraccin de clulas (la recuperacin de las clulas de la la matriz del suelo previo a la lisis celular) o lisis directa en el suelo la matriz (13, 29, 35). lisis tcnicas directas, sin embargo, han sido utilizan ms porque producen ms ADN y, presumiblemente, un menos sesgada de la muestra de la diversidad de la comunidad microbiana de tcnicas de extraccin de clulas rendimiento (13, 21, 35). Una desventaja importante lisis de los mtodos directos es que ms-sustancias inhibidoras de PCR se extraen junto con el ADN (29, 36, 39). Adems, el nmero y diversidad de la extraccin de ADN lisis directa proprotocolos utilizados por los suelos y los sedimentos son de enormes proporciones (1113, 20, 27, 29, 30, 44), pero cada protocolo suele incluir de uno a todos los tres de los siguientes elementos bsicos: ruptura fsica, lisis qumicos, y la lisis enzimtica. Cuatro tcnicas de interrupcin fsica diferente,-hielo-deshielo cin (8, 16, 20, 31, 38), la homogeneizacin del molino de bolas (4, 20, 22, 27, 35), ultrasonidos (30), y la molienda en atmsfera de nitrgeno lquido (41, 44), se han descrito, y la interrupcin de congelacin y descongelacin homogeneizacin molino del grano son los ms comunes. Es as establecido grano molino rendimientos ms homogeneizacin de ADN que de deshielo interrupciones rendimientos congelacin (20, 21, 27, 33). El sorteode espaldas a la homogeneizacin molino de perlas incluyen el hecho de que las grandes

cantidades de contaminantes cidos hmicos se recuperan (21, 29, 33) y el hecho de que, en algunos casos, el ADN es cortado (21). Los procedimientos de lisis qumicos utilizados en los mtodos que Se han descrito tambin varan, pero las mezclas lisis se puede clasifican en mezclas que contienen detergente (o lo que se mediano dodecil sulfato [SDS] [4, 8, 12, 14, 15, 20, 25, 28, 36-38, 44] o Sarkosyl [14, 34, 37]), mezclas que contienen NaCl, y mezclas que contienen diversos tampones (por lo general Tris o fosfato fosfato, pH 7 a 8). Las modificaciones de la lisis qumica bsica tcnicas incluyen alta temperatura (60 C hasta que hierva) incubacin cin (4, 20, 34, 35), un fenol (8, 33, 38) o cloroformo (12) etapa de extraccin, y la incorporacin de agentes quelantes (EDTA y Chelex 100) para inhibir nucleasas y dispersar las partculas del suelo (6, 18). La eficacia de los diversos componentes qumicos lisis de rered en gran parte desconocida, ya que slo la obtencin del ADN total despus de lisis celular y la posterior purificacin se informa. Por otra parte, la eficacia de la lisis celular en cada paso de un protocolo se informa slo en raras ocasiones (27). Un ltimo componente de extraccin de ADN muchas tcnicas es la lisis enzimtica. La lisozima (4, 8, 11, 14, 31, 36, 38), proteinasa K (25, 36, 44), achromopeptidase (7), y pronase E (14) han sido empleados para promover la lisis celular, y digestin de la lisozima es el procedimiento ms ampliamente utilizado. Debido a que * Responsable de la correspondencia. Direccin postal: Investigacin de Animales para Carne Centro del ARS del USDA, PO Box 166, Clay Center, NE 68933. Telfono: (402) 762-4208. Fax: (402) 762-4209. E-mail: miller@email.marc.usda . Gov. Direccin actual: 19 Barnett San E1, New Haven, CT 06515. 4715 Pgina 2 a la falta de estudios comparativos, no est claro qu efecto tiene la Adems de un paso de lisis enzimtica tiene en el rendimiento de ADN. Una capa adicional de complejidad cuando el ADN rendimientos obtenidos con diferentes protocolos se comparan es la purificacin de ADN mtodo empleado. Para la mayora de los suelos que contienen altas concentraciones de ciones de los cidos hmicos, electroforesis en gel de agarosa (16, 22, 25, 27, 28, 43, 44), Sephadex G-200 columna de cromatografa (7, 8, 12, 20, 31, 39), y basados en el ADN de slice de unin (5, 27, 44) han sido utilizarse por separado o en combinacin para separar los cidos hmicos y otros inhibidores de la enzima de ADN. Purificacin de la eficiencia suele ser juzgados por la cantidad de ADN recuperado y el xito de los mtodos utilizados para eliminar los contaminantes que inhibe las enzimas del PCR y otras enzimas necesarias para Molecanlisis cular. Si bien las fortalezas y debilidades de los distintos completa mtodos de extraccin y purificacin se han discutido previamente riormente (17, 20, 21, 27, 35, 39, 44), en general detallada compaparaciones de los elementos individuales de los mtodos (por ejemplo, la eficacia de dad de la extraccin con o sin un agente quelante) no han

llevado a cabo. comparaciones significativas son tambin confundido por la variedad de tipos de muestras examinadas y por la variable procedimientos analticos utilizados para cuantificar la eficiencia de extraccin de ADN eficiencia y pureza. Por lo tanto, la seleccin de un ADN adecuado extraccin y el procedimiento de purificacin de entre los procediprocedimientos que se han descrito hasta la fecha sigue siendo un problema importanteblema en la aplicacin de tcnicas moleculares para estudios de suelo y los sedimentos comunidades microbianas. Los objetivos de este estudio fueron comparar la mayora de los comelementos comunes de extraccin de ADN y protocolos de purificacin y utilizar la informacin obtenida para desarrollar un comprensivoSIVE mtodo para la obtencin de ADN y la comunidad entera del suelo y muestras de sedimentos que contienen diferentes cantidades de omateria orgnica. Nueve procedimientos de extraccin con diferentes concontrastantes, fsicos, qumicos y enzimticos elementos fueron evauated sobre la base de los siguientes criterios: (i) la eficiencia de la clula lisis, (ii) el rendimiento total del ADN, y (iii) los tamaos moleculares de la Fragmentos de ADN. Cuatro procedimientos de purificacin tambin se evauated mediante pruebas para detectar la presencia de sustancias inhibidoras-PCR y la prdida de ADN durante el procedimiento. Homogeneiza bolas de molino neizacin se optimizaron las condiciones de entonces con dos diferentes en los instrumentos a fin de obtener la mayor homogeneizacin cantidad de ADN con la menor cantidad de corte del ADN. El resultado fue un optimizado lisis de extraccin directa de ADN y purificacin del protocolo de los suelos y los sedimentos que tiene diversas importa el contenido orgnico. MATERIALES Y MTODOS Suelo y los sedimentos de muestreo y preservacin. Muestras de un solo tipo de suelo (Limo franco Collamer) tanto desde el sector agrcola y un bosque adyacente y una los sedimentos de los humedales que tena la textura franco limo mismo, pero contena una diferente cantidad de materia orgnica (Tabla 1) se utilizaron en este estudio. El bosque y los suelos agrcolas se obtuvieron de McGowan Woods y un agrcolas adyacentes campo cultural (Universidad de Cornell, Ithaca, Nueva York), respectivamente. El etanol flameado esptula se utiliza para recoger muestras de 400 g aproximadamente de la parte superior de 2 a 5 cm de suelo en cada sitio. Las muestras de suelo fueron transportados de inmediato a la laboratorio, 200 ml Nalgene botellas estriles. Aproximadamente 400 ml de humedales los sedimentos que contienen materia orgnica en descomposicin de la vegetacin fue recogido en Sapsucker Woods (Ithaca, Nueva York) de la interfaz sedimento-agua por immersING y llenar una previamente esterilizado ml botella de Nalgene-500. La muestra fue inmediatamente en hielo y regres al laboratorio. Se compararon tres submuestras (aproxmadamente 100 g de suelo o 200 ml de sedimento) se reservaron para su uso en productos qumicos y

Tamao del anlisis de partculas. Todas las muestras utilizadas para la extraccin de ADN se congel a 20 C en el da de la toma, liofilizada (Labconco Lyph de bloqueo de 4.5 liofilizador), de tierra a un polvo fino con un mortero, y se almacena a 20 C. Todos los superficies en contacto con el suelo eran estriles o que haban sido previamente enjuagado con un 10% (vol / vol) de solucin de Clorox y luego con agua destilada estril para eliminar cualquier contaminacin de ADN. Anlisis de suelos y sedimentos. La textura, el contenido de carbono orgnico y pH de los suelos y los sedimentos se determinaron por mtodos estndar en el suelo de Cornell Fondo para el anlisis en el Departamento de suelo, cultivos, y Ciencias de la Atmsfera (Tabla 1). El recuento de bacterias totales para cada muestra se calcul utilizando una naranja de acridina directa mtodo de recuento de epifluorescencia (2, 10) y un Zeiss microscopio de epifluorescencia equipado de serie con un Zeiss 09 combinaciones de filtros cin. Diseo experimental de los procedimientos de extraccin de ADN. Un total de nueve diferentes procedimientos fueron evaluados mediante el uso de cada uno de los tres tipos de muestras (Tabla 2). Estos procedimientos fueron diseados para evaluar los efectos de varias combinaciones de SDS, disolventes orgnicos, la quelacin, el pretratamiento enzimtico con lisozima, y homogeneizacin molino de perlas o de la descongelacin lisis congelacin de extraccin de ADN y el rendimiento. 50 mg de las muestras por triplicado de los sedimentos de los humedales y cuatro ejemplares de 100 mg muestras de los suelos agrcolas y forestales se han aadido a la tapa de plsticotornillo 2 ml TABLA 1. Anlisis de suelos y sedimentos utilizados para la extraccin de ADN Suelo o los sedimentos una De horizontes Textura (%) pH b Carbono orgnico contenido (mg g [Peso seco] 1 ) c Contenido bacteriano (10 9 clulas g [Peso seco]

1 ) d Arena Limo Arcilla Collamer franco limoso (agrcolas) A1 13 71 16 6.5 38 1.9 0.5 Collamer franco limoso (bosque) 01 17 70 13 6.1 75 4.3 1.4 los sedimentos de Humedales (franco limoso) 17 68 15 5.7 442 11.0 4.1 una Ver texto para ms detalles. b Medido despus del equilibrio con agua destilada. c Prdida de masa del material seco durante el encendido. d Microscpico recuentos obtenidos con las muestras por triplicado y los campos de 15 utilizando naranja de acridina directa procedimientos de recuento (2, 10). TABLA 2. Enzimtica, qumica, fsica y de extraccin de ADN procedimientos de prueba con los tres congelacin sedimento seco y los tipos de muestras de suelo se muestran en la Tabla 1 Procedimiento La lisozima pretratamiento una Qumica tratamiento

b Fsica tratamiento c Referencia 1 SDS B 27 2 SDS-fenol B En este trabajo se 3 SDS-cloroformo B 12 4 SDS-Chelex 100 B 6 5 SDS FT 11 6 GTC FT 19 7 SDS FT En este trabajo se 8 SDS B En este trabajo se 9 GTC B En este trabajo se una Para el tratamiento previo lisozima (procedimientos de 5 y 8), 450 - porciones l de una solucincin que contena 150 mM NaCl, 100 mM EDTA (pH 8), y 15 mg de lisozima por ml se han aadido a los frascos, y los viales se incubaron durante 2 horas a 37 C. Despus de pretratamiento de la lisozima, 450 - porciones l de una mezcla de lisis SDS (ver ms abajo) se agreg a los viales.

b Para los procedimientos 1 y 7, 450 l de tampn fosfato (100 mM NaH 2 PO 4 , El pH 8) y 450 l de una mezcla de lisis SDS (100 mM NaCl, 500 mM Tris pH [8], el 10% [P / vol] SDS). Para los procedimientos 2 y 3, 300 l de tampn fosfato, 300 litros de la mezcla de lisis SDS, y 300 l de fenol o tampn (pH 8) o -Cloroformo alcohol isoamlico (24:1) se han aadido. Procedimiento 4 es idntica a procedimiento 1, excepto que el 15% (wt / vol) de la resina Chelex 100 (Bio-Rad, Hercules, California) se aadi a la mezcla de lisis SDS. Los tratamientos GTC (6 procedimientos y 9) se compona de 900 l de 4 M GTC. c B, homogeneizacin molino de perlas con el batidor de bolas Mini a 1.600 rpm; FT, Tratamiento de congelacin y descongelacin (tres ciclos de que consta de 2 minutos en el lquido N 2 seguido de 5 minutos en un bao de agua C 65 ). 4716 Miller et al. Un PPL . E NVIRON . M ICROBIOL . Pgina 3 viales (Laboratorio de venta Productos, Rochester, NY), que contiene 2 g de estriles, 0,1 mm de dimetro-silicona de circonio cuentas (BIOSPEC Productos, Bartlesville, Oklahoma). Enzimtica, qumica, y la lisis tratamientos fsicos. El pretratamiento enzimticotos, tratamientos qumicos, y la lisis condiciones fsico utilizado para el ADN nueve procedimientos de extraccin se muestran en la Tabla 2. Debido a que la proporcin de volumen de lquido el volumen influye en la eficiencia de lisis de sedimentos, el extracto de volumen de lquido utilizado para todas las extracciones fue de 900 l. molino de bolas de homogeneizacin se us en los procedimientos de un a 4, 8, y 9 despus de los tratamientos qumicos se realizaron (Tabla 2). La tubos se agitaron durante dos perodos de 5 minutos a 1.600 rpm en una batidora de bolas Mini (Productos BIOSPEC). Tres ciclos de congelacin-descongelacin fueron utilizados en los procedimientos de 5 a 7. Cada ciclo consisti en la inmersin durante 2 minutos en nitrgeno lquido, seguido de

inmersin durante 5 minutos en un bao de agua C 65 . Recuperacin y purificacin de ADN. ADN liberado durante cada extraccin procedimiento fue recuperado por el mtodo de Herrera et al. (12). En pocas palabras, los granos y suelo o los sedimentos fueron separados de suspensiones por centrifugacin (10 s, 10,000 g) con una microcentrfuga (modelo 235C; Fisher Scientific), y cada extracto lquido se transfiri a un tubo Eppendorf estril ml-2. El lquido que quedan en los intersticios de la cama del grano fue recogida luego por la perforacin de la parte inferior del tubo con una aguja de calibre 27 caliente y colocar el tubo perforado en uno de 15 ml, el cloroformo de seguridad, con tapn de rosca del tubo de polipropileno (Corning) que contiene un ml tubo Eppendorf-1.5 con su superior retirado. Los tubos fueron anidados siglo despustrifuged durante 15 minutos (1.400 g) con una centrfuga de mesa (modelo TJ6; Beckman). Durante la centrifugacin, el lquido atrapado en el lecho de bolas de drenaje en la parte baja 1,5 ml del tubo. Este lquido se agruparon a continuacin, con la recogida con anterioridad lquido la muestra. El volumen de cada extracto (excepto los extractos que contiene iso guanidiniotiocianato [CCC] [ver ms abajo]) se redujo a 100 l mediante la eliminacin de agua con butanol (32), y los extractos concentrados se purificaron en a base de slice, SpinEnlazar columnas (FMC Bioproducts) utilizando el protocolo del fabricante. ADN se eluy de las columnas SpinBind con 50 l de agua tibia (50 C) de agua estril. Debido a la extraccin de butanol no eliminan eficazmente el agua del GTC extractos, el ADN de cada uno de estos extractos se precipit durante la noche a 20 C con un volumen igual de isopropanol. El precipitado se sedimentan por centrifugacin gacin, se lava con 70% (vol / vol)-etanol fro de hielo, se seca, y se disolvi en destilada estril H 2 O hasta un volumen final de 100 l (para los dos tipos de extracto de suelo) o 50 l (para extraer el sedimento). Estimacin de la lisis celular en muestras de sedimento extrado. Los efectos de la procedimientos de extraccin de ADN en la lisis celular se estimaron slo con el hmedo los sedimentos de la tierra, de la siguiente manera. 50 mg por triplicado muestras fueron sometidas a cada procedimiento de extraccin (Tabla 2) y el procedimiento de ADN posterior recuperacin como se describe anteriormente. Tres formalina en conserva, liofilizadas muestras fueron tambin processed de la etapa de recuperacin del ADN a travs de la DAPI (4 ,6-diamidino-2fennylindole) el paso de tincin y se desempe como "no-extraccin de ADN" los controles que ac-

contado por la prdida de clulas debido a la manipulacin de la muestra. El sedimento y los granos queda despus de la ADN extracto crudo fue removido fueron trasladados a un nio de 10 ml con tapn de rosca del tubo que contiene 4 ml de solucin salina tamponada con fosfato (145 mM NaCl, 500 mM NaH 2 PO 4 , PH 7.4) y 50 l de un 37% (vol / vol) de solucin de formalina. El tubo se agit durante 15 minutos a 200 rpm en un agitador rotatorio para dispersar a los sedimentos partculas y bacterias. El tubo se agit durante 15 s, y los granos fueron los se deja reposar durante 10 s. Un mililitro del sobrenadante se centrifug durante 10 min a 10 000 g para que sedimenten las bacterias, y el sedimento se resuspendi en 1,0 ml de solucin salina tamponada con fosfato mediante agitacin. El paso de lavado era necesario eliminar cualquier resto de fenol o cloroformo de la muestra, lo que habra preferentemente absorbe los tintes fluorescentes. A 5 - l cada de la resuspendido muestra se mezcla con un 5 - cada de l de una solucin de DAPI (0,05 mg de DAPI / ml de desionizada) en un lavado con diapositivas etanol y cubiertos con una de 22 mm 2 encubrimiento deslizamiento. El nmero total de bacterias por mililitro de la suspensin original era determinado por el recuento de la DAPI manchado azul fluorescente las clulas nmero por campo microscpico utilizando un Zeiss Estndar 18 microscopio de epifluorescencia equipado con una 100 Neofluar lente y un filtro de combinacin adecuada de DAPI. Una-a-volumen clculo del rea y la dilucin se utilizaron factores apropiados para convertir los resultados del recuento de clulas por mililitro y luego a las clulas por gramo (Peso seco), como se describi previamente (2). La eficacia de la lisis celular por un muestra extrada (expresado en porcentaje) se calcul sobre la base de las difela diferencia entre el recuento de clulas bacterianas de la preparacin extrados y la recuento de clulas bacterianas de la extraccin de ADN de control no. Evaluacin de los procedimientos de purificacin de ADN. Extraccin de ADN procedimiento 4 (SDS-Chelex 100 el tratamiento con homogeneizacin molino de bola) se encontr que proproducir la polimerizacin en cadena inhibidora extractos-sobre todo de los procedimientos de extraccin de ADN probado con la prueba de inhibicin de la PCR (ver ms abajo). Por lo tanto, el ADN extrado por este procedimiento se utiliz para probar los procedimientos de purificacin del ADN, de la siguiente manera. Un

Mg forestales 500 muestras de suelo, un suelo agrcola de la muestra-de 500 mg, y 200 mg muestra de sedimento se obtuvieron como se describe anteriormente. El volumen final de la extractos crudos se ajusta a 1,5 ml con, agua destilada estril. El ARN en cada extracto crudo fue digerido por la adicin de 150 l de una solucin de RNasa (10 mg de RNasa por ml, 100 mM Tris HCl, 10 mM EDTA, pH [8]) e incubando la preparacin durante 1 hora a 37 C. Se compararon tres submuestras (25 a 100 l) de la RNasa suelo digerido y los extractos de sedimento fueron purificados por cuadruplicado utilizando los cuatro mtodos (I mtodos a iv) se describe a continuacin. (I) Mtodo i. muestras del extracto (100 l) se han aadido a SpinBind columnas (FMC Bioproductos) y se purificaron utilizando el protocolo del fabricante. En pocas palabras, ADN fue unido a un soporte de slice en condiciones caotrpico, enjuagarse con Tris etanol, y se eluy con 100 l de tampn TE. (Ii) ii Mtodo. Submuestras fueron sometidos a electroforesis en gel de agarosa por carga de 25 l de extracto crudo en un 1% (wt / vol) en gel de agarosa y electrforosando la preparacin durante 30 minutos a 5 V / cm. El bromuro de etidio manchado de ADN banda se visualiz con luz UV y extirpados. ADN en la divisin de agarosa se recuperados mediante el uso de columnas SpinBind (FMC Bioproducts) segn lo recomendado por el fabricante. (Iii) Mtodo iii. Un volumen de agua destilada estril y un volumen de 7,5 M acetato de amonio se aadieron 100 l de extracto crudo, y la mezcla fue la incub en hielo durante 5 min para precipitar la protena. La muestra se centrifuga durante 10 minutos a 10.000 g, y se retir el sobrenadante y se mezcla con 2 volmenes de etanol fro, hielo y 20 g de glucgeno. La mezcla se dej reposar durante la noche a 20 C. El ADN precipitado se sedimentan por centrifugacin cin durante 15 minutos a 10.000 g, y luego se lav con 200 l de helado de 70% (Vol / vol) de etanol, secado al aire, y se resuspendieron en 100 l de agua destilada estril. (Iv) iv Mtodo. Sephadex G-200 columnas de la vuelta (mtodo de Erb y WagnerDoblas [8], modificado por Boccuzzi et al. [3]) fueron utilizados para la purificacin del ADN (12). En pocas palabras, 1 g de seca Sephadex G-200 se hidrat, se lav cinco veces en alto contenido de sal tampn TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl pH [8]), y autoclave. La suspensin se envasan de manera asptica en jeringas de 1 ml conectado a la parte inferior con hilo dental acuario filtro estril por centrifugacin repetida (130 g, 10 minutos) dentro de 15 ml, tubos de tapa de rosca de plstico estril hasta el final compactado

el volumen fue de 1,1 ml. Las columnas de relleno se lavaron con 100 l de alto contenido de sal TE tampn, se centrifuga (130 g, 10 min), y trasladado a las nuevas estriles de 15 ml -Tapn de rosca de los tubos de plstico. Se compararon tres submuestras (100 l) del extracto crudo se cargaron en las jeringas, y el ADN se eluy con tres consecutivos 100 - partes de l de alto contenido de sal tampn TE, cada uno seguido por centrifugacin (130 g, 10 min). La volumen final de, purifica el ADN eluido se redujo a 100 litros por extraccin butanol (32). inhibicin de la PCR. Para determinar si los inhibidores de la PCR se presente en los extractos de ADN purificado, se dise un ensayo basado en la amplificacin de la rRNA gen 16S de Methylomonas BG8 albus (26). Volmenes iguales de purificado soluciones de ADN de tres o cuatro rplicas de purificacin de ADN se ejecuta se agruparon y en serie diluido en incrementos de 10 veces con, agua destilada estril. Un 10 - l parte de cada dilucin fue agregado a una pared de PCR de tubo delgado y modificado con 0,5 ng de purificado M. ADN BG8 albus en 5 l de agua destilada. La M. BG8 albus ADN fue extrado y purificado a partir de cultivos utilizando mtodos estndar (1). Dos gotas de, la luz de aceite mineral estril, se sumaron a cada tubo. Despus de la la muestra fue calentada a 80 C, 10 litros de una solucin buffer de PCR se concentr agreg a cada tubo, cada uno preparado contenida (concentraciones finales) 50 mM KCl, 10 mM de tampn Tris (pH 8.8), 1.5 mM MgCl 2 , 0.1 mg de suero bovino albmina por ml, 0,05% (vol / vol) de Tween 20, 0,5 M de oligonucletidos cebadores PCR 10 (5), 0,5 M de oligonucletidos cebadores PCR P5 (11), cada desoxinuclesidos trifosfato a una concentracin de 0,5 mM, y 0.025 U de Taq polimerasa por l. amplificacin por PCR se llev a cabo con un termociclador (modelo PTC-150, MJ Investigacin, Watertown, MA) utilizando el siguiente programa: 95 C durante 2 min, 30 que consiste en ciclos de 95 C durante 1 minuto, 60 C durante 1 min y 72 C durante 2 min, y una final paso que consiste en la extensin de 72 C durante 5 min. Despus de que el programa de amplificacin fue completado, 10 l de cada tubo de PCR se someti a electroforesis junto con - Hin dIII normas de ADN (Gibco / BRL) en un 1,5% (wt / vol) en gel de agarosa al 4 V / cm por 1a 2 h. El punto de ebullicin del producto de PCR 215 resultado (albus amplicn BG8 M.) se visualiz por tincin con bromuro de etidio. La PCR se consider positiva si el exDe 215 pb amplificado se detect inesperados. Cuando el amplicn BG8 se detect en la misma dilucin de los tres replicar o sedimento muestras de suelo, una puntuacin de 3 fue asignado, del mismo modo, las puntuaciones de 1 y 2 fueron asignados para reflejar el xito amplifi-

cin de uno y dos de las muestras, respectivamente. Influencia de los parmetros de homogeneizacin del grano en el molino de extraccin de ADN. Nosotros examinaron la influencia de la fbrica de la velocidad homogeneizacin del grano en el rendimiento de ADN y el fragmento de tamao mediante el uso de los suelos forestales y dos bolas de molino de diferentes homonizers, el Mini bolas batidor (vase ms arriba) y un mini bolas batidor-8 (BIOSPEC Productos). La homogeneizacin de las velocidades utilizadas para la batidora de bolas Mini se calibrado entre 1.600 y 5.000 rpm, utilizando un estroboscopio para medir la superando a la velocidad. Para los ensayos, el tiempo de homogeneizacin se mantuvo constante (5 min) y un procedimiento de extraccin (Tabla 2) con la purificacin SpinBind (como se describe anteriormente) fue empleado. El rendimiento de ADN se cuantific como se describe a continuacin. El ADN distribucin de tamao de fragmento se determin por electroforesis (3 V / cm por 1.5 h) en un 0,8% (wt / vol) en gel de agarosa, las normas utilizadas fueron los - Hin dIII ADN normas descritas anteriormente. La influencia de la duracin de la homogeneizacin del molino de bolas (1, 2, 5 10 minutos) en la eficiencia de extraccin de ADN se examin en dos velocidades diferentes para cada cuenta homogeneizador de molino (3.300 y 3.800 rpm para el batidor de bolas Mini y 2510 y 2670 rpm para el Mini bolas batidor-8). En estos experimentos, los procedimientos de extraccin procedimientos 1 y 3 (vase ms arriba, Tabla 2) se utiliza en combinacin con SpinBind purificacin. El rendimiento de ADN se cuantific como se describe a continuacin. Los fragmentos de ADN tamao del sector estatal se determin como se describe anteriormente. cuantificacin de ADN. El ADN en extractos crudos y purificados fue cuantificada por comparar las intensidades de fluorescencia de teido de muestras de ADN con bromuro de etidiobandas de ejemplo a la intensidad de fluorescencia de las normas de ADN en geles de agarosa por utilizando el mtodo de Zhou et al. (44). Este mtodo fue modificado mediante la realizacin de RNasa digestin del ADN extractos antes de la electroforesis y la inclusin de geles de agarosa en el control de carriles negativa que contenga slo el colorante de carga en V OL . 65, 1999 EXTRACCIN DE ADN suelo y los sedimentos 4717

Pgina 4 fin de controlar las diferencias y vertical horizontal en la parte posterior observadensidad baja de los geles teidos (26). Las densidades de banda de ADN en un gel (Menos el valor de fondo) se midieron utilizando una invertida, escaneado, electrnicamente la imagen impresa del gel (42) y el dominio pblico NIH Image programa, que fue desarrollado en los Institutos Nacionales de Salud de EE.UU. (40 bis). Un estndar de la curva de ADN se obtuvo de cada gel de agarosa utilizando las densidades (Menos el valor de fondo) de los ms pequeos fragmentos de ADN de seis o cinco, en cuatro replicar a seis carriles que contiene 100 a 250 ng de Hin DIII-digeridos ADN fragmentos (Gibco / BRL). Replicacin y anlisis estadsticos. Todos los anlisis estadsticos se realizaron por utilizando el software estadstico Minitab (Minitab Inc., State College, Pensilvania). Tres o cuatro repeticiones por mtodo de extraccin de ADN se utiliza para la comparacin estadstica anlisis de los nueve procedimientos de extraccin de ADN. Los rendimientos de ADN fueron normaleszado para el rendimiento obtenido con un procedimiento de extraccin para cada suelo y los sedimentos dividiendo el ADN rendimiento obtenido con el procedimiento en cuestin por el ADN rendimiento obtenido con el procedimiento 1. Para las comparaciones por pares de los procedimientos, dos muestras, pruebas de cara t-una se utiliza para determinar si un procedimiento dado ADN ms significativa que cualquier otro mtodo. Para determinar la eficiencia de recuperacin de ADN despus de la purificacin, cuatro repeticiones por cada uno de purificacin mtodo para cada tipo de muestra de suelo. El porcentaje de ADN recuperado para cada de la muestra y el procedimiento se determin mediante la comparacin de los rendimientos de ADN despus de puricacin con el rendimiento del ADN obtenido sin purificacin. Optimizado de extraccin de ADN-homogeneizacin de depuracin de protocolo. QuadrupliCate mg alcuotas 100 de liofilizado suelo agrcola, suelo forestal, o los humedales los sedimentos se aadieron a una serie de ml con tapn de rosca de plstico viales-2 que contiene 2 g de estril, 0.1 mm de dimetro-silicona de circonio cuentas. Igualdad de volmenes (300 litros) de 100 mM NaH 2 PO 4 (PH 8), una mezcla de lisis SDS (100 mM NaCl, 500 mM Tris [pH 8], el 10% [p / v de SDS]), y cloroformo alcohol isoamlico (24:1), se sumaron a cada uno de los viales (procedimiento de extraccin de ADN 3). Molino de bolas de homogeneizacin (2

min a 3.300 rpm con el batidor de bolas Mini) se utiliz para alterar fsicamente las clulas bacterianas, y el ADN extracto crudo se recuper de los viales como se describe anteriormente. Despus de que el extracto crudo de volumen se redujo a 100 l, el ADN se purific mediante el uso de Sephadex G-200 columnas y se cuantific (vase ms arriba). RESULTADOS Comparacin de los procedimientos de extraccin. Cuando la diferencia de nueve diferentes procedimientos de extraccin de ADN (Tabla 2) se utilizaron con liofilizado muestras, todos los procedimientos, salvo los procedimientos 6 y 9 dio ethiduim manchada bandas en agarosa-bromuro de geles (Fig. 1). Aunque la extraccin de GTC es til para el ARN extraccin de suelos y sedimentos (19, 40), es evidente que no propicio para la extraccin de ADN. La distribucin del tamao del ADN fragmentos (de 16 a 3,5 kb) obtenido con cada uno de los restantes procedimientos de extraccin (procedimientos del 1 al 5, 7 y 8) por el gel electroforesis revel que algunos de corte limitada se llev a cabo durante la extraccin, sin importar el mtodo de ruptura fsica empleado. El ADN de los rendimientos variaron considerablemente de la muestra a muestra y el procedimiento de extraccin utilizados (Cuadro 3). Genpor va oral, los rendimientos de ADN fueron mayores con el sedimento de los humedales ) Muestras (rango, 6-53 g / g de peso seco [peso], intermedio con el suelo del bosque (de 4 a 35 g / g [peso seco]), el ms pequeo y con la suelo agrcola (1,5 a 7,9 g / g [peso seco]). Para cada muestra, procedimientos que incluyen homogeneizacin y un molino de perlas disolvente orgnico (o fenol o cloroformo) junto con el SDS produjo grandes cantidades de ADN de procedimientos que incluyen tres ciclos de congelacin y descongelacin con SDS, el pretratamiento enzimtico, y el quelante Chelex 100. El anlisis de varianza (ANOVA) mostr que el tipo de muestra (Suelo o sedimento) y la extraccin de procedimiento empleado tena la efectos significativos sobre el rendimiento de ADN (P 0.001 para ambos). Tambin hubo un suelo mtodo de interaccin significativa (P 0,001), lo que indica que el efecto del mtodo de extraccin de ADN depende del tipo de suelo a prueba. Con el fin de comparar el ADN procedimientos de extraccin para los tres tipos de muestras, se necesario para normalizar los rendimientos de ADN en la base de la media rendimiento de ADN obtenido con uno de los procedimientos de extraccin de ADN procedimientos (procedimiento 1 fue seleccionado). Cuando esto se hizo, ANOVA mostr que el tipo de muestra no tiene un signifino puedo efecto sobre el rendimiento de ADN (P 0,129), mientras que el efecto de el mtodo de extraccin fue muy significativa (P 0,001). diferencias significativas en los rendimientos de ADN se detectaron cuando dos muestras, pruebas de cara t-uno en el que qumicos seleccionados y La figura. 1. Comparacin de las distribuciones de tamao de fragmentos de ADN y relativo de ADN

los rendimientos obtenidos con los nueve procedimientos de extraccin de ADN se describe en la Tabla 2. -Microlitro Cinco porciones de tres extracciones replicar se agruparon, digeridos con RNasa y electroforesis en un 0,8% (wt / vol) en gel de agarosa. Los resultados obtenidos de los sedimentos de los humedales se muestran. ADN de extractos obtenidos de los bosques y los suelos agrcolas que se producen resultados similares. Lane M contena 500 ng de - Hin dIII marcador. TABLA 3. La eficacia de los procedimientos de extraccin de ADN evaluados sobre la base de la produccin de ADN y la lisis celular Procedimiento Qumica tratamiento una Fsica tratamiento b rendimiento de ADN (GG [peso seco] 1 ) c Lisis de la clula% con los sedimentos de los humedales (Media SE) d Del suelo agrcola Suelo forestal Los sedimentos de los humedales 1 SDS B 7.0 0.5 26 4 32 1 68 4 2 SDS-fenol B 7.8 0.2 31 5 40 4 77

5 3 SDS-cloroformo B 7.9 1.2 35 7 53 8 81 4 4 SDS-Chelex 100 B 6.2 0.3 19 5 32 2 68 7 5 La lisozima-SDS FT 1.5 0.7 4 3 6 1 65 4 6 GTC FT 0.1 0.1 0.2 0.3 64 3 7 SDS FT 2.7 0.8 6 3

6 1 63 6 8 La lisozima-SDS B 1.5 1.2 9 4 7 4 69 2 9 GTC B 0.1 0.1 0.1 67 4 una Vase el cuadro 2, notas al pie a y b. b Vase el cuadro 2, c nota. c Calculado a partir de la densidad media de bromuro de las bandas de ADN-manchado de etidio utilizando software de imgenes de los NIH. Los valores son promedios errores estndar basado en tres o cuatro extracciones independientes. d Estimarse a partir de los conteos DAPI de las clulas bacterianas por campo microscpico antes y despus de la extraccin de ADN. Los valores son porcentajes promedio de las clulas lisadas errores estndar basado en tres extracciones de ADN independientes realizaron mediante el procedimiento de extraccin de ADN mismo. 4718 Miller et al. Un PPL . E NVIRON . M ICROBIOL . Pgina 5 tratamiento de los parmetros fsicos (por ejemplo, la homogeneizacin molino de perlas

frente a los tres ciclos de congelacin-deshielo) se compararon con los normalesdatos industrializados (Cuadro 4). molino de bolas de homogeneizacin se encontr que era superior a la tcnica de congelacin-descongelacin para la obtencin de ADN cuando de otro modo los procedimientos idnticos fueron comparados. Del mismo modo, proprocedimientos en los que se incluy fenol cloroformo o en la lisis mezcla dio ms ADN que los procedimientos comparables en que estos disolventes orgnicos no se utilizan. Sin embargo, cuando un agente quelante (Chelex 100) o tratamiento previo fue lisozima incluido en el procedimiento de extraccin, la produccin disminuy ADN significativamente (tablas 3 y 4). Procedimiento 3, que incluye homogeneizacin molino del grano, SDS, y cloroformo en la extraccin mezcla cin, produjo un rendimiento normalizado ADN superior todos los otros procedimientos, segn lo determinado por el de la muestra de dos t pruebas (Tabla 4). Por lo tanto, el procedimiento 3 fue la ptima proprocedimiento para la obtencin de ADN en este estudio. lisis celular. Los efectos de los procedimientos de extraccin de ADN en la lisis celular se examinaron slo con los sedimentos de los humedales. El grado de lisis vari entre 63 y 81% (Cuadro 3). Todos los los procedimientos, incluso los tratamientos contra el que no GTC ADN se recuper, dio lugar a la lisis celular considerable. ANOVA indic que el procedimiento de extraccin de ADN tambin tena un sigefecto significativo en la lisis celular (P 0,003). Dos muestras, una prueba t unilateral confirm que la extraccin con un disolvente orgnico (Fenol o cloroformo) produjo una mayor lisis significativamente que la extraccin sin un solvente orgnico (P 0,001). Alaunque homogeneizacin molino del grano como resultado una mayor lisis de tres ciclos de congelacin y descongelacin (68% 4% frente al 63% 6%), la efecto no fue estadsticamente significativa (P 0,17) y no representan el ADN mayor rendimiento significativamente. Ms bien, el agitacin vigorosa durante la homogeneizacin, probablemente como resultado la liberacin de ms de ADN de organismos zadas en el mezcla de extraccin de ADN en lugar de los otros asociados con las partculas del suelo y restos celulares. Los resultados de la lisis celular en la presencia de Chelex 100 (procedimiento 4) tampoco fueron estadsticamentecamente diferentes de los resultados de la extraccin sin Chelex 100 (modalidad 1) (P 0,48). Como era de esperar, hubo una fuerte correlacin positiva entre el rendimiento de ADN y el alcance de celulares lisis (r 0,71) en los procedimientos que produjeron importantes cantidades de ADN (los procedimientos de 1 a 5, 7 y 8). Comparacin de los mtodos de purificacin de ADN. Extraccin de ADN procedimiento 4 (SDS-Chelex 100 tratamientos qumicos combinados con la homogeneizacin molino del grano) dio lugar a la ms oscura de ADN

contiene extractos. Estos extractos se encuentran tambin a la la mayora de los extractos inhibieron en el ensayo de inhibicin de la PCR. En efecto, en comparacin con todos los procedimientos de extraccin de ADN de otros, el procedimiento 4 requiere por lo menos una 10 veces dilucin adicional para el xitoplenamente PCR amplificar el ADN (datos no presentados). Por lo tanto, al procedimiento 4 se utiliz para las pruebas posteriores que afecta a cuatro de ADN diferentes procedimientos de purificacin (Tabla 5). En estas pruebas el nivel de la obtencin del ADN se expresa como un porcentaje del ADN en el extracto crudo. Los valores obtenidos con la purificacin de cuatro TABLA 4. Pares de comparacin estadstica de los parmetros principales para distinguir los nueve procedimientos de extraccin de ADN Extraccin de las variables o procedimientos Procedimientos en comparacin una Normalizados ADN rendimiento (media SE) b P c Primer procedimiento procedimiento de Segunda molino de bolas frente al congelamiento-deshielo lisis 1y7 1.00 0.09 0.22 0.10 0.001 molino de bolas frente al congelamiento-deshielo lisis 8y5 0.26 0.15 0.18 0.09 0.086 La omisin frente a la inclusin de Chelex 100 1y4 1.00 0.09 0.86 0.16 0.011 La omisin frente a la inclusin de la lisozima 1y8 1.00 0.09

0.26 0.15 0.001 La omisin frente a la inclusin de la lisozima 7y5 0.22 0.10 0.18 0.09 0.200 Inclusin vs omisin de fenol 2y1 1.19 0.13 1.00 0.09 0.001 Inclusin vs omisin de cloroformo 3y1 1.35 0.30 1.00 0.09 0.001 Procedimiento 3 vs procedimiento 2 3y2 1.35 0.30 1.19 0.13 0.066 Procedimiento 3 vs procedimiento 4 3y4 1.35 0.30 0.86 0.16 0.001 Procedimiento 3 vs procedimiento 5 3y5 1.35 0.30 0.18 0.09 0.001 Procedimiento 3 vs el trmite 7 3y7 1.35 0.30 0.22

0.10 0.001 Procedimiento 3 vs procedimiento 8 3y8 1.35 0.30 0.26 0.15 0.001 una Ver Materiales y Mtodos y en la Tabla 2 para ms detalles sobre los procedimientos de extraccin. b Todos los rendimientos de ADN fueron normalizados en relacin con el rendimiento de ADN obtenido con el procedimiento 1 (SDS tratamiento y homogeneizacin molino de perlas con el batidor de bolas Mini a 1.600 rpm). c probabilidad calculada de que el rendimiento de ADN de la primera intervencin en la comparacin por pares es menor o igual al rendimiento del ADN del segundo procedimiento. TABLA 5. La eficacia de los procedimientos de purificacin de ADN segn la evaluacin de la recuperacin del ADN y la inhibicin de la PCR Mtodo de la purificacin % De recuperacin de ADN (media SE) una Nmero de amplificacin de PCR con xito las siguientes diluciones del extracto b : Del suelo agrcola Suelo forestal Los sedimentos de los humedales 10 0 10 1 10 2 10 3 No purificacin 100 7 100 9 100 15 0

0 0 2 f SpinBind columna 83 3 80 5 41 8 0 1 c 3 3 Electroforesis en gel 40 12 38 12 10 1 0 2 d 3 3 Acetato de amonio precipitacin 85 4 76 9 69 6 0 0 0 3 Sephadex G-200 columna 80 7 95 6 80 8 0 2 e 3

3 una rendimiento de ADN se calcul mediante el uso de la densidad media de bromuro de las bandas de ADN-manchado de etidio analizados con el software NIH Image. b ADN de cada suelo o el sedimento se diluy marcado con el ADN purificado, amplificado por PCR, y obtuvo sobre la base de la presencia de un punto de ebullicin BG8 amplicn-215 como se describe en Materiales y Mtodos. c amplificacin por PCR fue posible slo a partir de ADN del suelo forestal. d amplificacin por PCR fue un xito slo de suelo forestal y el ADN de sedimentos de los humedales. e amplificacin por PCR fue posible slo a partir del suelo agrcola y el ADN de sedimentos de los humedales. f amplificacin por PCR fue posible slo a partir del suelo agrcola y el ADN del suelo forestal. V OL . 65, 1999 EXTRACCIN DE ADN suelo y los sedimentos 4719 Pgina 6 los mtodos de produccin eran muy diferentes (Tabla 5). ANOVA demoniodemostrado que tanto el tipo y mtodo de la purificacin de la muestra tuvo un efecto significativo en la recuperacin de ADN (P 0,001 cada uno). Cuando los niveles de recuperacin de ADN fueron comparados a travs de los tipos de muestras, el Sephadex G-200 mtodo de purificacin de la columna como resultado los niveles ms altos de la recuperacin del ADN (85% 8%), seguido de el acetato de amonio mtodo de precipitacin (un 76% 8%), la SpinBind mtodo de purificacin (68% 23%), y el gel de electrophoresis mtodo de purificacin (29% 17%). Segn lo determinado por un lado, muestra la prueba t-dos, el nivel de recuperacin de ADN despus de Sephadex G-200 de purificacin de la columna se encontr que era significativamente mayor que la tasa de recuperacin despus de gel de elecpurificacin trophoresis (P 0,018). Sin embargo, la estadstica evidencia de que el G-columna de purificacin mtodo 200 Sephadex dio ms ADN que el SpinBind y acetato de amonio mtodos de precipitacin no fue tan fuerte (P 0,18 y P

0,13, respectivamente). Para los anlisis moleculares, uno de los atributos ms importantes del ADN extrado es su pureza. Para asegurarse de que una prueba se , La pureza sensibles se estim mediante un ensayo de inhibicin de la PCR en la que M. ADN genmico BG8 albus (0,5 ng) se aadi a Extractos de ADN y se utiliza como plantilla para la amplificacin por PCR del gen 16S ARNr (Tabla 5). La concentracin del ADN total ciones (ADN nativo ms agregaron ADN) en las mezclas de PCR vari desde 0,8 hasta 1,9 ng / l para el suelo agrcola, de 1,2 a 3,1 ng / l para el suelo del bosque, y de 0,5 a 5,0 ng / l para el sedimentos de los humedales. El gen 16S ARNr de M. BG8 albus fue xito amplificado de ADN purificado slo despus de 1000 a veces dilucin 10.000 (Tabla 5). Por el contrario, el Sephadex G-200 de la columna y la electroforesis en gel mtodos de purificacin permite la amplificacin de PCR que se produzca en la dilucin de la muestra de menor ciones (10 veces) en dos de las tres muestras y en todos los muestras diluidas de 100 veces (Tabla 5). Por lo tanto, la columna de Sephadex G-200 y purificacin de los mtodos electroforticos fueron superiores a la otros mtodos para la eliminacin de sustancias que inhibe la PCR. Procedimientos Sin embargo, cuando tanto la produccin de ADN y la pureza fueron consideradas, la Sephadex G-200 procedimiento de la columna se consider superior en la base de un ADN de mayor rendimiento (Cuadro 5). Optimizacin de los parmetros de homogeneizacin del grano molino. El efectos de dos parmetros clave molino de homogeneizacin del grano (velocidad y duracin) en la extraccin de ADN se analiz mediante el muestras de suelo forestal. Los dispositivos de homogeneizacin probado (Mini Bolas batidor y Mini bolas batidor-8) eran de la misma fabricante (Productos BIOSPEC), pero difieren en la muestra la capacidad, el diseo y las especificaciones mecnicas. El Mini bolas Tiene un batidor de 2 ml solo tubo, se mueve con la accin de la mueca a travs de un cm de distancia agitar-1.6 con un cambio suave, y operates a velocidades relativamente altas (hasta 5.000 rpm). Por el contrario, Mini bolas batidor-8 tiene ocho tubos de 2 ml y se mueve con pistn de accin a travs de un cm de distancia agitar-3.2 con un fuerte inversin, sino que opera a velocidades relativamente bajas (hasta 2.700 rpm). Cuando un procedimiento de extraccin (Cuadro 2) se utiliza con el Mini bolas batidor, el tamao del ADN disminuy dramticamente en velocidades superiores a 3.300 rpm (Fig. 2A). La adicin de cloroforma (el trmite 3) no influy en la corte del ADN velocidades ms altas (datos no presentados). corte de ADN similares no se observ cuando las muestras se procesaron con los procedimientos de extraccin miento 1 utilizando el mini bolas batidor-8 operado en el Maxvelocidad mnima (2.700 rpm) (Fig. 3A). El tamao de los ms grandes fragmento de ADN que fue en general mayor con el Mini bolas Batidor-8 en el rango de funcionamiento de conjunto (18 a 20 kb) que con el Mini bolas batidor (de 8 a 18 kb). Con el Mini bolas Batidor, el rendimiento de ADN fue mayor a una velocidad media, 3300 rpm (Fig. 2A), mientras que con el Mini bolas batidor-8, el maxirendimiento mnimo se obtuvo ADN a velocidades que van de 2.500 a 2.600 rpm (Fig. 3A).

Cuando la duracin de la homogeneizacin con la bolas Mini Durante el procedimiento de un batidor se cambi a dos velocidades crticas (3.300 y 3.800 rpm), el tamao y el rendimiento de ADN modificado drsticamente (Fig. 2B y C). El rendimiento del ADN y el tamao en 3300 revoluciones por minuto fueron significativamente mayores que el rendimiento de ADN y el tamao en 3.800 rpm, y mayor tiempo de homogeneizacin como resultado pequeos fragmentos de ADN. Una vez ms, la presencia de cloroformo (Procedimiento 3) durante la homogeneizacin tuvo poco efecto sobre el ADN tamao cuando el Mini bolas batidor se utiliz. Cuando los dos ADN rendimiento y el tamao fueron examinados, la velocidad ptima y la duracin para el batidor de bolas Mini se determin que 3.300 rpm y 120 s, respectivamente. Variando el Mini bolas batidor-8 durante la homogeneizacin de velocidadING procedimiento 3 produjo un rendimiento y tamao de los fragmentos de ADN patrn que era muy diferente de la obtenida con la Mini bolas batidor en las mismas condiciones (Fig. 3B y C). Cuando el tiempo de homogeneizacin se vari con el procedimiento 1, el rendimiento de ADN con mayor homogeneizacin ya veces, pero el tamao de los fragmentos de ADN se redujo ligeramente (16 a 13 La figura. 2. Efectos de la Mini homogeneizacin velocidad del batidor de bolas y la duracin de ADN rendimiento y fragmento de ADN de tamao mximo. (A) Influencia de la homogeneizacin velocidad en el rendimiento y tamao de los fragmentos de ADN cuando la extraccin de ADN un procedimiento se utilizados. (B y C) Influencia del tiempo de homogeneizacin en el rendimiento de ADN (B) y tamao de los fragmentos mxima (C) a dos velocidades homogeneizacin (3.300 y 3.800 rpm) cuando la extraccin de ADN procedimiento 3 se utiliz. Las barras de error indican estndar errores (n 4). GDW, el gramo (peso seco). 4720 Miller et al. Un PPL . E NVIRON . M ICROBIOL . Pgina 7 kb). Cuando el cloroformo fue incluido en la preparacin de extraccincin (trmite 3), el rendimiento de ADN fue sustancialmente mayor (Fig. 3B), pero el promedio de ADN derivado tamao de los fragmentos se mucho ms pequeo (Fig. 3C). Con el trmite 3 y el de bolas Mini Batidor-8, hubo dos ajustes ptimos en funcin de la necesidades del experimento. Para recuperar la mayor cantidad de

ADN, 2.510 rpm durante 120 s se utiliz. Cuando molecular elevado ADN de peso era ms importante, la configuracin correcta para velocidad y la duracin fueron 2.510 rpm y 30 s, respectivamente. ADN de recuperacin con la extraccin optimizado homogeneizacin De depuracin de protocolo cin. Los rendimientos obtenidos con el ADN suelo agrcola, el suelo del bosque, y los sedimentos de los humedales al el protocolo optimizado (corregida por las prdidas de purificacin) fue utilizados fueron 14.7 2.8, 75.6 9.2, y 107.9 2,1 g / g (en seco peso), respectivamente (Cuadro 6). Estas cifras corresponden a la eficiencia de extraccin de 7,7, 17,6 y 9,8 fg de ADN por clula bacteriana, respectivamente, sobre la base de la fluorescente naranja de acridinafluorescencia microscpica cuenta se muestra en la Tabla 1. Los niveles de ADN de recuperacin del suelo agrcola, suelo forestal, y en hmedo los sedimentos de la tierra, sobre la base de un promedio de valor supuesto, de 9 de fg de ADN por clula (38), fueron 86, 195, y 109%, respectivamente. DISCUSIN Seleccin de extraccin de ADN ptimo y purificacin proprocedimientos. Los datos en los cuadros 3 a 5 y la figura. 1 a 3 establecer criterios para la eleccin de los procedimientos y condiciones en oder para lograr objetivos especficos de la extraccin de ADN. La experimentacin configuracin tal que se utiliz permiti evaluar estadsticamente la eficacia de los distintos elementos de extraccin de ADN y purifiprocedimientos de educacin, incluida la incorporacin de quelantes y disolventes orgnicos en las mezclas de lisis. Nuestros resultados apoyan la resultados de estudios previos (20, 21, 27, 33) en el que mayor ADN rendimientos se obtuvieron con la homogeneizacin molino de perlas que con congelacin y descongelacin lisis fsico. Sin embargo, encontramos que la inclusin de pretratamiento de la lisozima, Chelex 100, o GTC haba perjudiciales efectos y, o bien disminuye el rendimiento de ADN (lisozima y GTC) o la recuperacin de aumento del cido hmico (Chelex 100). Incluyendo cin de disolventes orgnicos (fenol y cloroformo) sustancialmente en aument el rendimiento de ADN (19 y 35%, respectivamente). A pesar de los cuatro procedimientos de purificacin se analizaron tenan efecto beneficioso, los mtodos difieren con respecto tanto a la cantidad y la calidad del ADN recuperado. Sephadex G-200 SpinBind columna y columna de purificacin, a base de slice resultado en el ADN mayor rendimiento y elimina ms contamiinants que cualquiera de electroforesis en gel o acetato de amonio precipitacin. Sephadex G-200 columnas fueron superiores a los de slice columnas basadas basa tanto en el rendimiento y la pureza, sino que rerequeridas ms tiempo de preparacin y centrifugacin a baja velocidad (130 g) durante el embalaje para asegurar que la columna de Sephadex G-200 granos se mantuvo intacta (3). Aunque no han sido evaluados en este estudio, Sepharosa 4B columnas de la vuelta han sido recientemente informado

rival de Sephadex G-200 columnas de la vuelta en trminos de ADN recuperacin y purificacin (17). Las primeras pruebas en nuestro laboratorio demostr que los cidos hmicos en nuestros extractos se mantuvieron ligeramente ya en la sefarosa 4B columnas. Una cuidadosa comparacin de la eficacia de Sephadex G-200 y Sepharosa 4B collumnas envasados a baja velocidad se debe hacer con cada suelo o tipo de sedimento para determinar qu sistema de purificacin es mejor para cada tipo de muestra. Ninguno de los cuatro mtodos de purificacin sido totalmente probada eliminar todos los contaminantes, y la purificacin adicional pasos que involucran el bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) y polivinilpolipirrolidona ya sea durante o despus de la extraccin puede ser necesaria para reducir la contaminacin de polisacridos (25, 28, 44) y la contaminacin de cidos hmicos (7, 13, 15, 20, 25, 35, 43, 44), respectivamente. En una comparacin directa, estos dos compuestos dado eficiencias de depuracin equivalente, pero los niveles de la recuperacin del ADN son mucho mayores con CTAB (44). Inicial La figura. 3. Efectos de la mini-8 homogeneizacin velocidad del batidor de bolas y la duracin y la extraccin de protocolo sobre la produccin de ADN y de fragmentos de ADN de tamao mximo. (A) Influencia de la velocidad de homogeneizacin en el rendimiento y tamao de los fragmentos de ADN cuando el ADN un procedimiento de extraccin se utiliz. (B y C) Influencia del tiempo de homogeneizacin de rendimiento de ADN (B) y el tamao del fragmento mxima (C) con dos velocidades de homogeneizacin (2.510 rpm [smbolos abiertos] y 2.670 rpm [smbolos slida]) cuando la extraccin de ADN procedimiento 1 (crculos) y el trmite 3 (tringulos) se utilizaron. Las barras de error indican los errores estndar (n 4). GDW, el gramo (peso seco). TABLA 6. Eficacia de la extraccin de ADN de la extraccin optimizadoDe depuracin de protocolo de homogeneizacin basada en el rendimiento de ADN y acridina fluorescente directa cuenta naranja Suelo o los sedimentos una ADN rendimiento (GG [Peso seco] 1 ) b ADN celular contenido (Fg celular 1 ) Recuperacin la eficiencia

(%) Del suelo agrcola 14.7 2.8 7.7 86 Suelo forestal 75.6 9.2 17.6 195 Los sedimentos de los humedales 107.9 2.1 9.8 109 una Ver Tabla 1 para una descripcin de los suelos y fluorescentes cuenta bacteriana directa. b ADN de rendimiento basadas en el ADN de recuperacin de 85% en Sephadex G-200 de purificacin cin. Media error estndar. V OL . 65, 1999 EXTRACCIN DE ADN suelo y los sedimentos 4721 Pgina 8 experimentos realizados en nuestro laboratorio con polyvinylpolyextraccin pirrolidona despus de la lisis celular tambin revel que hay fue una prdida significativa de ADN durante la purificacin (no publicado de datos). Primera extraccin de los extractos crudos con CTAB seguido por Sephadex 200 columna de purificacin-G puede producir incluso una mayor purificacin de los extractos de Sephadex G-200 collumna purificacin solo. prdidas y eficiencias de purificacin de ADNcie, sin embargo, deben ser cuantificados. Seleccin de ptimas condiciones de molino de homogeneizacin del grano. Un gran esfuerzo se hizo en este estudio para optimizar el molino de perlas parmetros de homogeneizacin (velocidad y duracin) con el fin de obtener grandes cantidades de peso molecular de ADN de alto. Previunidades organizativas de trabajo ha demostrado que la homogeneizacin molino del grano puede producir ya sea de alta cizalladura o de alto peso molecular del ADN-ADN (21, 22), y que estaban interesados en la conciliacin de estos contraresultados contradictorios. Se encontr que corte se produjo durante mayor tiempo de homogeneizacin y a velocidades ms altas. Ademsms, incluyendo el cloroformo en la mezcla de extraccin, espeparticularmente cuando el Mini bolas batidor-8 se emple, tambin en-

hanced corte a travs de un mecanismo desconocido. Amplia cantidades de peso molecular de ADN de alto, sin embargo, podra ser obtenidos mediante cualquiera homogeneizador molino de perlas con o sinde cloroformo por molino de grano homogeneizacin siguiendo de cercacin de velocidad y duracin. Cuando las condiciones del grano molino de homogeneizacin se seleccionan, se fundamental para identificar en primer lugar el uso previsto del ADN purificado. Si el ADN va a ser clonado, fragmentos grandes son necesarios Para reducir al mnimo el nmero de clones que deben ser seleccionados. Por otro lado, si el ADN se va a utilizar en la PCR, fragmento de ADN de tamao no puede ser tan importante como el ADN de rendimiento (Aunque la formacin quimera puede ser un problema). En el caso de Mini bolas batidor, pareca haber un conjunto de condiciones ciones (120 s a 3.300 rpm) que maximiza tanto la produccin de ADN y Tamao de los fragmentos de ADN cuando la extraccin de ADN procedimiento 3 se utilizado (Cuadro 7). En el caso de la Mini bolas batidor-8, la formaSin embargo, hay dos conjuntos de condiciones de homogeneizacin que ya sea de ADN al mximo rendimiento o fragmento de ADN de tamao mximo (Tabla 7). Para maximizar el tamao de los fragmentos de ADN para la clonacin, que utiliza homogeneizacin molino de perlas con el Mini bolas batidor-8 en 2510 rpm durante 30 s y la extraccin de ADN procedimiento 3. Este mtodo produjo cantidades amplias de alto peso molecular la clonacin de ADN propicio. Si un rendimiento de ADN de alto fue el principal preocupacin y tamaos ms pequeos fragmento de ADN (6-9 kb) no fueron detrimento de los objetivos experimentales posteriores, a continuacin, homogeneizacin molino de perlas con el Mini bolas batidor-8 en 2510 rpm durante 120 s en combinacin con el procedimiento de extraccin de ADN 3 fue el mtodo de eleccin. Independientemente del molino de perlas homogenization mtodo o procedimiento de extraccin empleado, Sephadex G-200 columna de purificacin y de la columna SpinBind (A base de slice) de purificacin se debe utilizar para eliminar la PCR-ensustancias inhibitoria sobre la base de la necesidad de altos niveles de ADN recuperacin y purificacin de tiempos cortos, respectivamente. Evaluacin de la extraccin optimizado homogeneizacinprotocolo de purificacin. Una estimacin de la eficiencia global de la obtencin de ADN de toda la comunidad-es uno de los ms valiosos criterios para la evaluacin de una tcnica de extraccin. Dos mtodos, la recuperacin del ADN de los microorganismos aadido a las muestras de suelo y la recuperacin del ADN de una cantidad conocida de los pueblos indgenas microorganismos, se han utilizado para evaluar la eficacia de la extraccin. Hemos evitado el primer mtodo para evaluar la recuperacin del ADN de los microbios del suelo por dos razones. Aadido organismos no representan toda la diversidad de microorganismos indgenas (Pequeas y grandes organismos de diferentes capacidades para la lisis), y el uso de tales organismos no da cuenta de la matriz del suelo efectos (parcial a la plena proteccin de las bacterias asociadas con la o las superficies interiores de las partculas del suelo) que la lisis celular lmite. Nosotros consider que este ltimo mtodo, la comparacin de ADN para la recuperacin directa

recuentos de microorganismos indgenas mediante una unin al ADN fluorocromo, como la DAPI, a condicin de una mejor comparacin de los mtodos de ADN. los rendimientos de ADN y fluorescentes conteo directo de Las clulas bacterianas son slo ocasionalmente reportados, y el rango de los valores informados es 0,5 a 5,36 fg de ADN por clula bacteriana (8, 9, 27, 35, 44). Esto es equivalente a 6 en el ADN de recuperacin del 60% basado en un promedio de valor supuesto, de 9 de fg de ADN por clula (38). Cuando nuestro extraccin optimizado, homogeneizacin, y protocolo de purificacin con el batidor de bolas Mini se aplic a el suelo agrcola, el suelo del bosque, y los sedimentos de los humedales, la eficiencia de recuperacin de ADN fueron 86, 195, y 109%, respectivamente tivamente. Estos altos valores de relieve la eficacia de la optimizar la extraccin de ADN procedimiento utilizado para liofilizado muestras. Estos resultados tambin muestran que es necesario evaluar ADN piscinas no bacteriana. Hay varias explicaciones posiblesciones de la eficiencia de extraccin de ms de 100%. Un gran nmero de microorganismos eucariotas o cantidades importantes de alto peso molecular de ADN de plantas y animales podran detrticos cuenta de la eficiencia de extraccin de ADN de ms de 100%. En Adems, la extraccin de la eficiencia de ADN se basan en fluorescente conteo directo de las bacterias en congelacin suelos secos y sedimentos. lisis de la clula inicial durante el secado al proceso de congelacin puede llevar a un censo incompleto de los microorganismos y falsamente inflar La eficiencia de extraccin de ADN. Se encontr que los rendimientos de ADNaument rpidamente durante las muestras refrigeradas y la disminucin lenta durante varias semanas para las muestras congeladas y que la liofilizacin un reducir al mnimo la prdida de la muestra de ADN. El trabajo futuro debe explorar la beneficios del proceso de secado por congelacin, que incluyen muestras la preservacin, la lisis celular inicial, y la eficiencia de lisis aumentado debido daos a la pared celular durante el proceso de congelacin-secado. Dos factores, la eficiencia de extraccin de ADN y la lisis celular, se utiliza para medir la eficacia de nuestra extraccin de ADN optimizadoscin y el procedimiento de purificacin. A pesar de la lisis celular y la eficiencia de extraccin de ADN eran muy, completa la lisis celular de alta durante la extraccin del ADN sigue siendo difcil de alcanzar. Al igual que los resultados de un estudio previo realizado en nuestro laboratorio (27), inmunofluorescencia directa recuentos mostraron que las pequeas bacterias muy persisti en el interior del suelo partculas despus de que el protocolo de extraccin de ADN fue optimizado utilizados. Sobre la base de esta observacin, llegamos a la conclusin de que hay todava un cierto sesgo hacia la extraccin de ms grande, ms expuestos las clulas bacterianas con la extraccin de ADN optimizados y purifiTABLA 7. ptima del grano homogeneizacin condiciones molino para obtener el rendimiento mximo de ADN y / o fragmento de ADN de tamao mximo Homogeneizador Extraccin mtodo Homogeneizacin condiciones Caractersticas del ADN una

Purificacin mtodo Velocidad (rpm) Tiempo (s) Rendimiento Tamao de los fragmentos de ADN Mini bolas batidor Procedimiento 3 3,300 120 Mejor Mejor Sephadex G-200 Mini bolas batidor-8 Procedimiento 3 2,510 30 Aceptar Mejor Sephadex G-200 Mini bolas batidor-8 Procedimiento 3 2,510 120 Mejor Aceptar Sephadex G-200 una El ADN se caracteriza sobre la base del rendimiento total y el tamao de los fragmentos de ADN ms grande. Mejor indica mxima o el mximo rendimiento o el tamao del fragmento de ADN en comparacin con todas las dems condiciones probadas. OK indica que no mximas de rendimiento de ADN, pero adecuado o el tamao del fragmento. 4722 Miller et al. Un PPL . E NVIRON . M ICROBIOL . Pgina 9 cacin del protocolo. Un supuesto principal en este trabajo fue que una mayor recuperacin de ADN refleja un representante ms (diverso) de la muestra de ADN de la comunidad microbiana. Mientras que rendimiento de ADN no es la mejor forma de estimar la diversidad, el uso de cuantitativos de medidas de diversidad de ADN en este estudio han sido muy lento. Nuevas herramientas para comparar rpidamente los la diversidad de los extractos de ADN son necesarias para calcular mejor el

la eficacia de los protocolos de extraccin de ADN. Es importante reiterar la extraordinaria complejidad del suelo y tipos de sedimentos y el hecho de que existen mltiples factores que pueden afectar la eficacia de un mtodo de extraccin de ADN. Generalizaciones a partir de este estudio puede limitarse a limo suelos francos y los sedimentos que tienen contenido de materia orgnica de diferentes tiendas de campaa, sin embargo, nuestros resultados tambin proporcionan guas tiles que se puede aplicar a los protocolos de desarrollo para otros tipos de Las muestras tambin. AGRADECIMIENTOS Esta investigacin fue financiada por la beca ES 05950-03 del NIEHS / Superfund de Investigacin Bsica y el Programa de Educacin. Estamos muy agradecidos a David Hinman y Eaglesham Barbara apoyo tcnico. Damos las gracias a los productos BIOSPEC para el uso de la Mini Batidor de bolas-8. Agradecemos especialmente a Jim Herrick por su cuidadosa revisin y de perspicaces comentarios sobre una versin anterior del manuscrito. REFERENCIAS 1. Ausubel, F., R. Brent, Kingston RE, Moore DD, JG Seidman, JA Smith y K. Struhl. 1997. protocolos de corta distancia en la biologa molecular. John Wiley and Sons, Inc., Nueva York, NY 2. Beloin, RM, Sinclair JL, y Ghiorse WC. 1988. Distribucin y actividad de los microorganismos en los sedimentos del subsuelo de un rea de estudio prstinas Oklahoma. Microb. Ecologa: 16. 85-97. 3. Boccuzzi, VM, Straube WL, J. Ravel, Colwell RR, Hill y RT. 1995. La eliminacin de sustancias contaminantes a partir de muestras del medio ambiente antes de la PCR por Sephadex G-200 columnas girar, resumen. N-168, p. 361. En los resmenes de la Junta General 95 de la Sociedad Americana de Microbiologa de 1995. American Society for Microbiology, Washington, DC 4. Bruce, WD Cuernos KD, Hobman JL, AM Osborn, p. Strike, y DA Ritchie. 1992. La amplificacin de ADN de poblaciones nativas de bacterias del suelo utilizando la reaccin en cadena de la polimerasa. Appl. Medio Ambiente. Microbiol. - 58: 3413 3416. 5., GA, ES, Bulygina y RS Hanson Brusseau. 1994. Filogentico anlisis y desarrollo de sondas para la diferenciacin de metilotrfica bacrios. Appl. Medio Ambiente. Microbiol. 60 626-636. 6. Bryant, JE 1995. La deteccin de ooquistes de Cryptosporidium parvum en el suelo utilizando la reaccin en cadena de la polimerasa. tesis de maestra. Universidad de Cornell, Ithaca, NY 7. DeGrange, V. y R. Bardin. 1995. Deteccin y recuento de Nitrobacter poblaciones en el suelo por PCR. Appl. Medio Ambiente. Microbiol. 61 desde 2093 hasta 2098. 8. Erb, OR, y Wagner I. Dobler. 1993. La deteccin de bifenilos bi-

genes fenilo en sedimentos contaminados por la extraccin directa del ADN y el polmeroreaccin en cadena de asa. Appl. Medio Ambiente. Microbiologa: 59. 4065 a 4073. 9. Fuhrman, JA, Lee SH, Y. Masuchi, Davis AA, y Wilcox RM. 1994. Caracterizacin de las comunidades marinas a travs de procariotas ADN y ARN. Microb. Ecologa: 28. 133-145. 10. Haldeman, DL, PS Amy, D. Ringelberg, DC, RE Garen Blanca, y Ghiorse WC. 1995. El crecimiento microbiano y reanimacin alterar la comunidad estructura despus de la perturbacin. FEMS Microbiol. Lechuga: 17. 27-38. 11., JB, EL, Madsen CA, Batt y WC Ghiorse Herrera. 1993. PolmeroASE reaccin en cadena de naftaleno y 16S ARNr catablico secuencias de genes de las bacterias del sedimento indgenas. Appl. Medio Ambiente. Microbiol: 59. 687 a 694. 12. Herrick, JB, Miller DN, Madsen EL, y Ghiorse WC. 1996. Extraccin, purificacin y amplificacin de ADN microbiano de los sedimentos y los suelos, p. . 130-133 En JF Burke (ed.), PCR: tcnicas esenciales. John Wiley & Sons, New York, NY 13. Holben, NOSOTROS, Jansson JK, Chelm BK, y Tiedje JM. 1988. ADN sonda mtodo para la deteccin de microorganismos especficos en la CAV del suelo terial de la comunidad. Appl. Medio Ambiente. Microbiologa: 54. 703-711. 14. Holben, WE 1994. El aislamiento y purificacin de ADN bacteriano del suelo, p. 727-751. En Weaver RW, S. Angulo, P. Bottomley, D. Bezdicek, S. Smith, A. Tabatabai, y A. Wollum (ed.), Mtodos de anlisis de suelo, parte 2. Microbicidasy bioqumicas ological. Sociedad de la Ciencia del Suelo de Amrica, Inc., Madison, Wisconsin 15. Holben, WE 1997. El aislamiento y purificacin del ADN de la comunidad bacteriana a partir de muestras ambientales, p. 431-436. En Hurst CJ, Knudsen recursos genticos, McInerney MJ, Stetzenbach LD, y Walter MV (ed.), Manual de mtodos en microbiologa ambiental. Sociedad Americana de Microbiologa, Washington, DC 16., P., BM, Goebel y NR ritmo Hugenholtz. 1998. Impacto de la culturaestudios independientes sobre el punto de vista filogentico emergentes de la diversidad bacteriana. J. Bacteriol. 180 4.765 hasta 4.774. 17. Jackson, CR, JP Harper, D. Willoughby, Rosen EE, y PF Churchill. 1997. Un mtodo simple y eficiente para la separacin de la sub-hmico posturas y el ADN de muestras ambientales. Appl. Medio Ambiente. Microbiol. 63: 4993-4995. 18. Jacobsen, CS, y de Rasmussen. 1992. Desarrollo y aplicacin de un nuevo mtodo para extraer ADN de la bacteria del suelo basada en la separacin de bacterias del suelo con resina de intercambio catinico. Appl. Medio Ambiente. Microbiol. 58: 2458-2462. 19. Rey, GM 1994. Asociaciones de metantrofos con las races y Rhizomes de la vegetacin acutica. Appl. Medio Ambiente. Microbiol. 60 3220 a 3.227.

20. Kuske, CR, Banton KL, Adorada DL, PC, KK Hill Stark, y PJ Jackson. 1998. muestra en pequea escala de ADN mtodo de preparacin para el campo de la polimerizacin en cadena deteccin de las clulas microbianas y las esporas en el suelo. Appl. Medio Ambiente. Microbiol. 64: 2463-2472. 21. Leff, LG, Dana JR, McArthur JV, y Shimkets LJ. 1995. ComparIson de los mtodos de extraccin de ADN de sedimentos fluviales. Appl. Medio Ambiente. Microbiologa: 61. 1,141 a 1.143. 22. Liesack, W. y E. Stackebrandt. 1992. La aparicin de nuevos grupos de la Las bacterias de dominio segn lo revelado por el anlisis de material gentico aislado de un medio ambiente terrestre de Australia. J. Bacteriol. 174 desde 5.072 hasta 5078. 23. Madsen, EL 1998. Epistemologa de la microbiologa ambiental. Medio Ambiente. Ciencia. Tecnologa: 32. 429-539. 24. Madsen, EL 1996. Un anlisis crtico de los mtodos para la determinacin del composicin y biogeoqumicos actividades de las comunidades microbianas del suelo en in situ. Bioqumica del suelo: 9. 287-370. 25. Malik, M., J. Kain, C. Pettigrew, y OGRAMA A.. 1994. Purificacin y anlisis molecular de ADN microbiano del abono. J. Microbiol. Mtodos 20: 183-196. 26. Miller, DN 1996. Biogeoqumicos, microbiolgicos, moleculares y puntos de vista en los controles de las emisiones de metano de un pantano. Ph.D. tesis. Universidad de Cornell, Ithaca, NY 27. Mor, JB Herrick MI, MC Silva, Ghiorse WC, y Madsen EL. 1994. lisis celular cuantitativos de microorganismos indgenas y rpida extraccin cin de ADN microbiano del sedimento. Appl. Medio Ambiente. Microbiol. - 60: 1572 1580. 28. OGRAMA, A. 1998. El aislamiento de cidos nucleicos a partir de muestras ambientales, p. 273-288. En Burlage RS, R. Atlas, D. Stahl, G. Geesey y Sayler G. (ed.), Tcnicas en ecologa microbiana. Oxford University Press, Nueva York, NY 29. OGRAMA, A., GS, y T. Barkay Sayler. 1987. La extraccin y purificacin de ADN microbiano de los sedimentos. J. Microbiol. Mtodos 7: 57-66. 30. Picard, C., C. Ponsonnet, E. Paget, X. Nesme y Simonet P.. 1992. Deteccin cin y el recuento de bacterias en el suelo por la extraccin directa del ADN y reaccin en cadena de la polimerasa. Appl. Medio Ambiente. Microbiologa: 58. 2717 a 2722. 31. Rochelle, NY, Fry JC, Parkes RJ, y Weightman AJ. 1992. ADN extraccin para anlisis gentico 16S ARNr para determinar la diversidad gentica en profundidad comunidades de sedimentos. FEMS Microbiol. Lechuga:. 100 59-66. 32. Sambrook, J., Fritsch EF, y T. Maniatis. 1989. la clonacin molecular: un manual de laboratorio, 2 ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, fro Spring Harbor, NY 33. Smalla, K., N. Crespo, LC Mendonca-Hagler, Wolters A., y JD van

Alsacia. 1993. Rpido ADN protocolo de extraccin de suelo para la cadena de la polimerasa Mediada por amplificacin de la reaccin. J. Appl. Bacteriol: 74. 78-85. 34. Smith, GB, y Tiedje JM. 1992. Aislamiento y caracterizacin de un nitrito gen reductasa y su uso como una sonda para las bacterias desnitrificantes. Appl. Medio Ambiente. Microbiol. 58 376 hasta 384. 35. Steffan, RJ, J. Goksoyr, AK Bej, y RM Atlas. 1988. Recuperacin del ADN de los suelos y sedimentos. Appl. Medio Ambiente. Microbiologa: 54. 2.908 a 2.915. 36. Tebbe, CC y Vahjen W.. 1993. Interferencia de los cidos hmicos y el ADN extrados directamente de la tierra en la deteccin y la transformacin de recombinante ADN de las bacterias y levadura. Appl. Medio Ambiente. Microbiologa: 59. 2,6572,665. 37. Trevor, JT, H. Lee, S. y Cook. 1992. Directo de extraccin de ADN del suelo. Microb. Mdulos 1: 111-115. 38. Tsai, Y., y Olson BH. 1991. Mtodo rpido para la extraccin directa de ADN del suelo y los sedimentos. Appl. Medio Ambiente. Microbiologa: 57. 1070 hasta 1074. 39. Tsai, Y., y Olson BH. 1992. Mtodo rpido para la separacin de las bacterias ADN de las sustancias hmicas en los sedimentos de la reaccin en cadena de la polimerasa. Appl. Medio Ambiente. Microbiologa: 58. 2292-2295. 40. Tsai, Y., MJ Park, y Olson, BH. 1991. Mtodo rpido para la directa extraccin de ARNm de los suelos sembrados. Appl. Medio Ambiente. Microbiol. 57: 765 768. 40 bis. EE.UU. Institutos Nacionales de Salud. 1999. [En lnea]. NIH programa de imagen. Institutos Nacionales de la Salud, Washington, DC http://rsb.info.nih.gov/nihimagen. [7 de septiembre de 1999, fecha del ltimo acceso.] V OL . 65, 1999 EXTRACCIN DE ADN suelo y los sedimentos 4723 Pgina 10 41. Volossiouk, T., Robb EJ, y Nazar RN. 1995. Directo de extraccin de ADN para Mediada por PCR de los organismos del suelo. Appl. Medio Ambiente. Microbiol. 61: 3972 3976. 42. Winans, SC, y Torres MJ. 1993. Sensible, fotografa de laboratorio econmicotodocumentation usando la cmara de vdeo estndar y una impresora trmica. BioTcnicas 14: 902. 43. Jvenes, RL Burghoff CC, LG Keim, V. Minak Bernero, Lute JR, y Hinton SM. 1993. Polivinilpirrolidona-purificacin electroforesis en gel de agarosacacin de reaccin en cadena de ADN-polimerasa amplificable suelos. Appl. Medio Ambiente. Microbiologa: 59. 1972-1974. 44. Zhou, J. Bruns, MA, y Tiedje JM. 1996. ADN de recuperacin de los suelos de composicin diversa. Appl. Medio Ambiente. Microbiol. 62 316 a 322.

4724 Miller et al. Un PPL . E NVIRON . M ICROBIOL .

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