LUTROPIN

Misso
Desenvolvimento de tecnologias em sade com alto nvel de qualidade e segurana buscando sempre a inovao em seus processos e o bem estar da sociedade tendo como base os princpios ticos de resespeito a pessoa humana

PROCESSO PRODUTIVO

- PRODUTO: LUTROPIN - PRINCIPIO ATIVO: - SOMATROPINA (Hormnio GH-Recombinante) - DOSAGENS: 5,3mg (16 UI) / 12mg (36 UI)

SOMATROPINA (Hormnio GH) um polipeptdeo com 191 aminocidos;

Produzido em maior quantidade pela hipfise anterior; Produo a partir de 1958 a partir da hipfise de cadveres; Extrao a partir da hipfise descontinuada a partir de 1985. Incio da oferta de hormnio GH por meio de DNA recombinante

A protena recombinante de uso teraputico cujo processo de purificao objeto do presente estudo o liormnio de crescimento;

Suas principais aplicaes so no tratamento do nanismo, da deficincia parcial do hormnio do crescimento, em casos de severas debilitaes em queimaduras graves, na osteoporose e em casos de deficincia renal ou cardaca;

Tcnica de Produo de Protenas Recombinantes Isolar e preparar o DNA; Escolher o vetor apropriado; O fragmento de DNA a clonar introduzido em vetores de clonagem, formando-se o DNA recombinante; O DNA recombinante inserido na clula hospedeira (transformao), que possui mecanismos enzimticos para a replicao do DNA e para a sntese proteica; Seleo e identificao de clulas que incorporam o DNA recombinante; Verificar se a protena foi expressa; Remoo e purificao das protenas.

OBJETIVOS

Expressar, isolar, purificar e esterelizar GHrec a partir da poro periplasmtica e citoplasmtica de E. Coli em escala industrial, disponbilizando um produto vivel para comercializao como medicamento de uso injetvel dentro dos padres preconizados pela legislao vigente.

Seleo do Microorganismo

E.Coli produtora de hGH:

Escherichia coliKl2 (cepa RRl) transformadas com vetor de expresso;

Obtida em um banco de clulas na cidade de Belo Horizonte.

Processo Fermentativo

Inculo

Semeadura da cepa produtora em placas de petri contendo meio nutritivo (slido) associado a tetraciclina durante 18h a 30C em estufa controlada.

Aps o crescimento das bactrias, uma colonia extrada da placa e adicionadaa 400 mL de meio nutritivo contendo tetraciclina (lquido) e incubada a 30 C, em Shaker, sob agitao de 300 rpm, at atingir uma absorvncia em comprimento de onda de 600 nm. O contedo total desse inoculo utilizado para a fermentao;

Fermentao em Reator A fermentaose deu em um reator agitado mecanicamente (tipo aerador agitador) de 20 litros, para fermentao submersa de clulas livres sob condies seletivas, a uma temperatura de 30C. Utilizou-se um meio nutritivo no dobro da concentrao usual. tambm adicionada uma mistura contendo traosdos metais Fe, Mn, Zn, Mo, B, Co e K; Como fonte de carbono utiliza-se glicose, adicionada em quantidade de 1,2 g/L h, desde o inicio do processo, durante 5 horas, em um fluxo constante (60 mL/h).

Espera-se 5 horas para o incio da ativao do metabolismo microbiano. Eleva-se a temperatura a aproximadamente 42C e manten-se est temperatura por mais 6 horas; Coletado um pool do fermentado e realizado espectrofotometria. Deixa-se o fermentado em descanso at a prxima fase do processo produtivo. Salienta-se que durante tood o processo fermentativo o pH, a temperatura e os nveis de oxignio fornecidos so controlados por meio de leituras constantes. A produo foi descontinuada com retirada total do produto apenas no final do processo.

ETAPAS DE DOWNSTREAN

Ruptura Celular
Optou-se por realizar a ruptura por choque osmtico para extrao de protenas no espao periplsmtico sem ruptura da clula. Este mtodo favorece os processos posteriores de purificao da molcula alvo. Em um segundo momento tambm foi utilizada a ruptura celular por meio de termlise buscando um maior rendimento para o processo produtivo.

Choque osmtico

Choque osmtico

A suspenso bacteriana foi submetida centrifugao em ambiente refrigerado primeiramente em um meio hipertnico (20% de sacarose) e posteriormente hipotnico. Logo aps isso retirou-se o sobrenadante que continha a protena de interesse e outros metablitos do micororganismo. Aps o processo de ruptura por choque osmtico. Submeteu-se a soluo ainda restante a agitao sob temperatura de 90C durante 15 minutos afim de se obter um melhor rendimento. A ruptura por termlise favorece o processo de purificao por gerar fragmentos celulares maiores facilitando sua remoo.

Purificao de baixa resoluo

Precipitao

Precipitao primria com sulfato de amnio objetivando-se concentrar a protena de interesse seguindo-se uma primeira separao por HPLC.

Purificao de alta resoluo

HPLC

A coluna foi lavada com tampo bicabornato de amnio e NacL a 50mM primeiramente. Posteriormente se elevou a concentrao de NacL para 100mM. Sob ests condies foi obtida com sucesso a eluio do GH-rec a 120mL/H. O pool obtido nas etapas iniciais de purificao foi submetido cromatrografia diversas vezes para melhor rentabilidade do processo prodrutivo.

Produto Final
Esterilizao

Filtrao por membrana Foi o metodo usado para esterelizao por se tratar de um produto recombinante, esta tecnica consiste em passar a protena purificada j associada a seus adjuvantes uma membrana muito fina (0,22m) e que capaz de reter micro-organismo ainda presentes.

Rendimento

70%;

Viabilidade
Produto vivel e oferece uma alternativa teraputica segura para tratamentos de pacintes especiais.

Consideraes finais

Pode-se concluir que a utilizao de ferramentas biotecnolgicas para a obteno de produtos para a sade uma das alternativas mais promissoras para o desenvolvimento de pesquisas na atualidade.

Referncias Bibliogrficas

Purificao de hormnio de crescimento humano recombinante obtido no espa E. Coli , visando sua aplicao clinica. Autarquia associada Universidade de So Pa .1-77

http://www.redetec.org.br/inventabrasil/crescer.htm http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio24/biorreat.pdf

http:// www.slideshare.net/labimuno/produo-protenas-recombinantes-presentation# btnNext

OBRIGADO!