Conservacin de germoplasma in vitro A la evolucin del hombre le acompaan diversos progresos pero sin duda uno de los ms importantes

fue el descubrimiento y desarrollo de la agricultura. Hasta nuestros das el avance de la agricultura a llegado a un limite en el que las tcnicas modernas de produccin de variedades mejoradas, han provocado la reduccin de la variabilidad gentica de las especies cultivadas, y debiramos preguntarnos, que sucedi con las fuentes originales. Es en este contexto cuando se habla de conservacin de germoplasma, subrayando que su objeto es: una preservacin adecuada y conservar con gran integridad posible la variabilidad gentica de las poblaciones seleccionadas. Mtodos empleados para la conservacin de germoplasma La estrategia para mantener la conservacin de germoplasma depende de la naturaleza del material vegetal, y est definida por la duracin de su ciclo de vida, el modo de reproduccin y el tamao de sus individuos. Los mtodos de conservacin de germoplasma pueden dividirse en: mtodos in situ, se basan en la conservacin de las plantas en sus hbitats naturales e incluyen la conservacin en parques nacionales y en reservas ecolgicas. y mtodos ex situ, se basan en el mantenimiento del material biolgico en bancos de semillas, bancos de cultivo in vitro, colecciones de plantas. Para la conservacin de semillas el International Plant Genetic Resouces Institute (IPGRI) recomienda su desecacin hasta un 3-7% de humedad y su almacenamiento a bajas temperaturas (-18C). Este protocolo es en general, el ms recomendado para la mayora de las especies que se propagan por semillas ortodoxas, resisten la desecacin sin que ello implique prdida de viabilidad. Por otro lado tenemos a las semillas que pierden rpidamente la viabilidad cuando son sometidas a procesos de desecacin a estas se las denominan semillas recalcitrantes. Otro mtodo de conservacin de germoplasma ex situ, es mediante el cultivo in vitro de tejido; cubre un amplio espectro de tcnicas que implican el cultivo, bajo condiciones de asepsia, de rganos o fragmentos de rganos, en un medio de cultivo artificial definido, bajo condiciones ambientales controladas. Estas tcnicas de almacenamiento se realizan a mediano plazo, es decir, se basan en reducir el metabolismo celular y con ello reducir el crecimiento y el nmero de subcultivos durante meses hasta un ao, sin que ello afecte la viabilidad de los cultivos. Tambin se realizan experimentos tendientes a optimizar las tcnicas de conservacin in vitro a largo plazo, que consisten en el almacenamiento a la temperatura del nitrgeno lquido (-196C) crioconservacin, con lo cual se consigue la supresin del crecimiento hasta llegar a un estado de suspensin animada. La crioconservacin consta de seis pasos: Seleccin del material se debe tener la absoluta seguridad de que a partir del mismo se obtendrn plantas completas. El explante seleccionado depender del objetivo de conservacin y est estrechamente relacionado con el tipo de propagacin de la especie. Por ejemplo mediante el cultivo de microestacas o de meristemas. Deshidratacin es necesario eliminar toda el agua libre presente en el tejido vegetal, minimizando as posibles daos debidos a congelacin; puede realizarse en una cmara a 0C o en cmaras hermticamente cerradas utilizando sustancias higroscpicas como silica gel o glicerol (5- 20%), o sometiendo al explante a una corriente de aire en un flujo laminar de aire estril.

 Aclimatacin La aclimatacin puede realizarse en forma rpida consiste en colocar el explante directamente en nitrgeno lquido, con o sin la adicin exgena de crioprotectores, como azcares (sacarosa, glucosa), alcoholes (glicerol, etileglicol, manitol y sorbitol), dimetilsulfxido (DMSO) y polivinilpirrolidona (PVP). La aclimatacin lenta se realiza bajando gradualmente la temperatura (0.1-3C/min.) a una velocidad adecuada, A fin de preparar el explante para enfrentar las bajas temperaturas a las que ser sometido, se utilizan sustancias crioprotectoras. Almacenamiento De acuerdo al material vegetal que se utilice - Sistemas secos: comprenden todos aquellos tejidos vegetales endgenamente resistentes y tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratacin. - Sistemas hidratados: son todos aquellos tejidos vegetales no tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratacin, por lo cual se requiere de una proteccin exgena. Descongelamiento y rehidratacin Cuando se desea recuperar el explante mantenido en nitrgeno lquido se puede realizar un descongelamiento rpido en bao de agua (generalmente 1-2 min. a 30-40 C) o en forma lenta, sometiendo al explante a la temperatura del laboratorio o a una corriente de aire en el flujo laminar de aire estril. Tests de viabilidad Nos permiten comprobar las zonas del tejido que a muerto y cual a sobrevivido al fro. La evaluacin de la viabilidad puede llevarse a cabo en forma visual, realizando el re-cultivo y determinando la capacidad de regeneracin, utilizando TTC (cloruro de 2,3,5Trifenil- Tetrazolio) que colorea el tejido que ha sobrevivido a la crioconservacin o midiendo la conductividad elctrica, que permite estimar el dao producido en las membranas celulares. Tcnicas de almacenamiento del material a preservar - Encapsulacin-deshidratacin: un explante es recubierto por una matriz de alginato de calcio; La deshidratacin puede llevarse a cabo sometiendo las cpsulas de alginato (conteniendo a los explantes) a una corriente de aire en el flujo laminar o exponindolas en cmaras hermticamente cerradas con silica gel. Las cpsulas, as deshidratadas, pueden sumergirse directamente en nitrgeno lquido o bien pueden ser llevadas a un descenso lento de temperatura. - Vitrificacin: pretratamiento de las muestras con soluciones de vitrificacin, como el PVS2 o una solucin de 40% de etilenglicol, 15% de sorbitol y 6% de albmina srica bovina. Luego de la exposicin las muestras pueden ser sumergidas directamente en nitrgeno lquido o a travs de un descenso lento de la temperatura. - Encapsulacin-vitrificacin: es una combinacin de las dos anteriores. - Desecacin: consiste en someter al explante a una corriente de aire en un flujo laminar o en cmaras hermticamente cerradas, que contienen silica gel, luego de lo cual se realiza un enfriado rpido sumergiendo el material directamente en nitrgeno lquido. - Precultivo: involucra la incorporacin de crioprotectores (durante distintos tiempos que dependen del explante) antes del congelamiento. - Precultivo-desecacin: es una combinacin de las dos anteriores. - Gotita congelada: consiste en pretratar el material con DMSO por 2-3 h. en medio lquido y formar una microgota (2.5 ml), la cual se suspende sobre papel de aluminio y luego se sumerge directamente en nitrgeno lquido.