MICROBIOLOGA APLICADA

ALUMNO

GUA DEL

SECRETARA DE EDUCACIN PBLICA SUBSECRETARA DE EDUCACIN SUPERIOR E INVESTIGACIN CIENTFICA SUBSISTEMA DE UNIVERSIDADES TECNOLGICAS COORDINACIN GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLGICAS
GRUPO DE DIRECTORES DE LA CARRERA DE PROCESOS AGROINDUSTRIALES COORDINACIN GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLGICAS COMISIN ACADMICA NACIONAL DEL REA AGROINDUSTRIALALIMENTARA

ELABOR:

REVIS: FECHA DE ENTRADA EN VIGOR:

APROB:

Revisin No. 0

Fecha de revisin:

Pag. 1 de 133

I.

DIRECTORIO

DR. REYES TAMES GUERRA SECRETARIO DE EDUCACIN PBLICA DR. JULIO RUBIO OCA SUBSECRETARIO DE CIENTFICA EDUCACIN SUPERIOR E INVESTIGACIN

DR. ARTURO NAVA JAIMES COORDINADOR GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLGICAS RECONOCIMIENTOS LIC. EN BIOL. FRANCISCA LAGUNES OLIVARES I.Q.I. ISRAEL ESTRADA GARCIA II. PROFESORES DE LA CARRERA DE TECNOLOGA DE

ALIMENTOS
UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE LA HUASTECA HIDALGUENSE.

MICROBIOLOGA APLICADA ESTA OBRA, SUS CARACTERSTICAS Y DERECHOS SON PROPIEDAD DE LA COORDINACIN GENERAL DE UNIVERSIDADES TECNOLGICAS (CGUT) FRANCISCO PETRARCA No.321, COL. CHAPULTEPEC MORALES, MXICO D. F. LOS DERECHOS DE PUBLICACIN PERTENEEN A LA CGUT. QUEDA PROHIBIDA SU REPRODUCCIN PARCIAL O TOTAL POR CUALQUIER MEDIO, SIN AUTORIZACIN PREVIA Y POR ESCRITO DEL TITULAR DE LOS DERECHOS. ISBN (EN TRAMITE)

IMPRESO EN MXICO ii. INDICE CONTENIDO I. II. III. IV. V. DIRECTORIO Y RECONOCIMIENTOS NDICE INTRODUCCIN DE LA ASIGNATURA DIAGNOSTICO DE CONOCIMIENTOS UNIDADES TEMTICAS Unidad 1. Fermentacin, mtodos de cultivo y cintica. Unidad 2. Cultivos industriales. Unidad 3. Fermentacin alcohlica. Unidad 4. Fermentacin actica. Unidad 5. Vinificacin. Unidad 6. Fermentacin lctica. Unidad 7. Produccin de biomasa. Unidad 8. Enzimas microbianas y produccin de aminocidos. ANEXOS Prcticas de laboratorio. 1 2 3 4 8 10 22 31 44 74 83 94 PGINA

VII

INTRODUCCIN A LA ASIGNATURA Los alimentos elaborados a base de fermentaciones han existido desde hace miles de aos. Por ejemplo, la mayora de las dietas incluyen vinagre, fruto de la fermentacin mixta del vino mediante levaduras y, posteriormente, acetobacter (fermentos acticos). El acetobacter aparece espontneamente cuando el vino est expuesto al aire, aunque la produccin comercial conlleva el uso de tanques de vinagre. La palabra "VINAGRE" proviene de vinagre (del francs, vino agrio). Aunque no slo se elabora a partir del vino, cualquier otra bebida alcohlica puede emplearse como base, como por ejemplo la cerveza para producir vinagre de malta; y tambin algunas frutas (frambuesas, manzanas)o verduras y almbares. Tambin desde hace siglos en Oriente se produce la salsa de soja, el miso y el tempeh. En la elaboracin de la salsa de soja se utiliza el hongo Aspergillus oryzae y otros microorganismos para fermentar una mezcla compuesta de soja y trigo. De ah proviene su fuerte aroma y su color marrn rojizo oscuro. El proceso est dividido en dos etapas y puede durar entre 2 y 12 meses. Durante este tiempo, las protenas y los azcares se descomponen y los productos de la mezcla inicial dan lugar a una gran variedad de componentes de diversos sabores y aromas. En la produccin del tempeh tambin se usa un hongo, el Rhizopus oligosporus. El tempeh es un alimento muy importante de la dieta de pases como Indonesia, donde se utiliza como fuente principal de protenas y otros nutrientes esenciales. El miso, fruto de la fermentacin de la pasta de soja que se utiliza como base de sopas y salsas, se obtiene a partir de un cctel de microorganismos similar. Se pueden producir diferentes variedades, todo depende de la cantidad de sal utilizada, los edulcorantes y el tiempo de fermentacin. La fermentacin y, por consiguiente, los microorganismos tambin se utilizan para elaborar aditivos. La propiedad del cido glutmico (un aminocido usado para obtener glutamato monosdico) de potenciar el sabor fue descubierta en Japn a principios del siglo XX. Adems de dar sabor, los aminocidos son nutrientes esenciales, ya que son componentes bsicos de las protenas. Algunos alimentos, como los cereales, contienen protenas con un contenido del aminocido lisina relativamente bajo. Puede aadirse lisina para mejorar la calidad nutricional de las protenas. Las fermentaciones en las que intervienen las bacterias Corynebacterium glutamicum y Brevibacterium flavum producen tanto cido glutmico como lisina. Cabe mencionar tambin que el cido ctrico se aade a refrescos, productos de confitera y medicinas. En el pasado, se extraa de los ctricos; sin embargo, hoy en da, alrededor del 99% de la produccin mundial (ms de 300.000 toneladas) proviene de la fermentacin de un hongo, el Aspergillus niger. Los microorganismos tambin se utilizan para elaborar aditivos que dan consistencia a los alimentos. Muchas gomas producidas por microorganismos se utilizan en la industria alimentaria como espesantes, emulgentes y excipientes. stas pueden estabilizar la estructura del alimento y hacerlo ms agradable tanto a la vista como al paladar. Las gomas ms comunes son la xantina y la dextrina, producidas por cepas de las bacterias Xanthomonas y Leuconostoc respectivamente.

III.- DIAGNSTICO DE CONOCIMIENTOS NOMBRE:_____________________________________________________________ A.- CONTESTA CORRECTAMENTE LO QUE A CONTINUACIN SE TE PIDE (2.1). 1. Qu es una fermentacin? 2. Cuntos tipos de fermentacin conoces? 3. Qu es un mtodo de cultivo? 4. Qu tipos de microorganismos intervienen en una fermentacin? 5. De qu forma es benfica para nosotros la fermentacin? 6. Cmo actan las enzimas en una fermentacin? 7. Qu productos podemos obtener por medio de la fermentacin?

IV.- UNIDADES TEMTICAS

UNIDAD 1.- FERMENTACIN, MTODOS DE CULTIVO Y CINTICA. DEFINICIN DE FERMENTACIN: o o o Proceso metablico llevado acabo por microorganismos, bacterias y levaduras bajo condiciones aerbicas y anaerobias obteniendo energa y teniendo caractersticas fsico-qumicas controladas. Es un proceso en el que se potencia deliberadamente el crecimiento de los microorganismos que consumen una cantidad de sustrato y enriquecen, por medio del cultivo los productos de su metabolismo. El proceso de fermentacin es producido por accin de las enzimas cambios qumicos en las sustancias orgnica.

TIPOS DE FERMENTACIN: Fermentacin actica Fermentacin alcohlica Fermentacin butrica Fermentacin ctrica Fermentacin lctica Para llevar acabo la fermentacin se requiere conocer el sustrato idneo y microorganismos idneo y conocer las caractersticas fsico-qumicas del sustrato. QUE ES UN MEDIO DE CULTIVO? Un medio de cultivo es el sustrato que proporciona todos los requerimientos necesarios para el crecimiento de los microorganismos. CARACTERSTICAS IDONEAS QUE NECESITAN LOS MICROORGANISMOS PARA LLEVAR A CABO UNA FERMENTACIN. Ser genticamente estable en el medio de cultivo. Poseer clulas vegetativas, esporas algunas u otras unidades de reproduccin. Tener un crecimiento rpido y vigoroso despus de la inoculacin (sembrar microorganismos en el sustrato). Ser un cultivo puro. Reproducirse en un tiempo respectivamente corto. Que no produzcan sustancias txicas . Tiempo de conservacin debe de ser considerado (que el microorganismo no se muera rpido). El microorganismo debe ser industrialmente rentable . Que crezca o se desarrolle en condiciones relativamente sencilla.

CULTIVO DE MICROORGANISMOS. Los cultivos de microorganismos pueden prepararse de diferentes maneras, segn el proceso de produccin se clasifican desde el punto de vista industrial dependiendo del tipo de cambio que provocan en propiedades y transporte de las sustancias presentes en el proceso. FERMENTACIN POLIFSICO DISCONTINUO. Estos mtodos se utilizan para el cultivo de bacterias, levaduras y mohos, se aplica sobre todo en la fermentacin a gran escala recomendndose en la industria farmacutica y en la produccin de alimentos. Este tipo de fermentacin industrial anaerobios facultativos se practica en donde se requiere grandes cantidades de grmenes vivos para su posterior concentracin (por ejemplo la obtencin de biomasa, preparacin continua de yogurt, crema, etc.). Las diversas etapas de la fermentacin polifsica discontinua pasa por las etapas de preparacin y cultivos de las cepas que por lo general se realiza en el laboratorio. En cambio en las etapas de la fermentacin, en los fermentadores se suele acondicionar al proceso directo de produccin. De acuerdo al tamao de los fermentadores y a la cantidad de inculo necesario se precisa un numero variable de etapas sucesivas de cultivo. ETAPAS DE FERMENTACION INDUSTRIAL Mtodo polifsico de fermentacin en superficie Este tipo de fermentar es muy til en la microbiologa de los alimentos. En un espacio de fermentacin cerrada se colocan placas horizontales en una jaula que se llenan de medio nutricio liquido que llega por un producto central de alimentacin. La siembra se realiza mediante inyeccin al primer medio nutricio con materia de inoculacin de cepa a utilizar.

Siembra en jeringa

Asa de nicromio n

Caja petri

Cepa conservada liofilizada

Cultivo

Primer recultivo

Tanque fermentador a nivel industrial. Segundo recultivo Etapa fermentativa Envasado y envo

Dosificador Solucin

Termmetro Fermentador

Representacin esquemtica de una instalacin polifsica.

MTODO MONOFSICO DE FERMENTACIN DE SUPERFICIE. En este tipo de fermentacin las necesidades del material son escasos. El principio consiste en tomar con ayuda de asas o ganchos material de un cultivo madre, para sembrarlo directamente en los medios nutricios slidos. Siembra en jeringa

Asa de nicromio n

Caja petri

UNIDAD 2.- CULTIVOS MICROBIANOS INDUSTRIALES IMPORTANCIA DE LOS CULTIVOS DE MICROORGANISMOS. Los microorganismos tienen importancia en la industria farmacutica, alimenticia y la de agricultura, esto con una visin a la disgregacin de las materias primas, as como una compleja y proteccin ambiental. El cultivo industrial necesario para la produccin de determinados productos es materia de la microbiologa (tecnologa microbiana) o microbiologa industrial.

Factores con influencia sobre el crecimiento de los microorganismos. Influencia de la temperatura sobre el curso de la fermentacin: Las temperaturas muy elevadas provocan la muerte de los microorganismos; y las temperaturas muy bajas inhiben el desarrollo de estos. Las temperaturas de crecimiento se clasifican en: Mnimas, ptimas y Mximas. Temperatura mnima de crecimiento: es aqulla con la cual pueden evidenciarse toda va, en las bacterias proceso de desarrollo y divisin. Temperatura ptima de crecimiento: es aquella en la cual es mnimo el tiempo que tardan los grmenes en dividirse en la fase logartmica. Temperatura mxima de crecimiento: se estima la mayor temperatura con la que independientemente del tiempo de actuacin, toda va tiene lugar de crecimiento y multiplicacin. ptimo Mnimo Logaritmo No. de M.O Logaritmo No. de M.O Logaritmo No. de M.O Mximo

Tiempo Horas

Tiempo Horas

Tiempo Horas

10

Influencia de conservacin de iones de hidrgeno sobre procesos de fermentacin. En todos los procesos fermentativos, constituyen la concentracin de iones de hidrgeno un parmetro esencial para el crecimiento de los microorganismos. La clasificacin de los valores de pH para el desarrollo de los microorganismos, pH Mnimo, pH ptimo y pH Mximo. En la zona de pH ptima que depende de la especie del microorganismo, del medio, etc. El tiempo que tardan los grmenes en multiplicarse en la fase logartmica es mnimo. Para lograr una adecuada fermentacin industrial, resulta imprescindible efectuar ensayos para determinar el pH ptimo.

11

UNIDAD 3.- FERMENTACIN ALCOHLICA FERMENTACIN ALCOHLICA INTRODUCCIN.La produccin de bebidas alcohlicas ha sido una actividad ligada a la mayora de las culturas durante miles de aos. Existen evidencias arqueolgicas de ms de 7000 aos de antigedad que en forma emprica los humanos aprendimos a encausar las fermentaciones alcohlicas de diversos sustratos. Probablemente las primeras bebidas se hicieron a partir de sustratos azucarados como los jugos de frutas, ya que stos slamente requieren poner en contacto el jugo con la levadura silvestre presente en la superficie de la propia fruta. Desde pocas remotas diferentes civilizaciones aprendieron a fermentar diversos sustratos a fin de producir sus bebidas alcohlicas autctonas ,pero fue hasta el siglo XV cuando empieza a popularizarse el arte de la destilacin y de esta forma aparecen las bebidas con mayor contenido alcohlico. Las bebidas alcohlicas son compaeras constantes de el hombre en su historia, pero bien es cierto que su exceso es capaz de reducir nuestras sensibilidades y tambin es verdad que tiene la virtud de animar el espritu y de establecer atmsferas propicias para la convivencia y conversacin, esto cuando se consume con la justa medida y con la prudencia que caracteriza a quienes saben disfrutar de las cosas de la vida. Debido a al gran importancia de estos productos la investigacin cientfica y tecnolgica generan industrias las cuales son de mayor importancia econmica en el mundo. BEBIDAS ALCOHOLICAS. Son soluciones acuosas que contienen adems de agua alcohol sustancias orgnicas que ejercen influencia sobre los aromas y el sabor segn Francisco Rico Benitez. Son bebidas obtenidas a partir de cualquier jugo vegetal que no sea de uva y que tienen propiedades organolpticas nuevas y atractivas para una prueba estadstica significativa de consumidores segn Colin y Emilion. De acuerdo a su contenido alcohlico las bebidas alcohlicas se clasifican en: Fermentados.............................( 2-18% alcohol/volumen) Destilados................................ ( 30-60% alcohol/volumen) Generosas................................ (15-20% alcohol/volumen) Licores..................................... (15-90% alcohol/volumen) Ejemplo de un proceso para una bebida alcohlica jugo vegetal 80 y 230 g/l de azcares fermentables pH: 3.6 y 4.3 antes de sulfatarlo.

12

Clarificacin Microfiltracin. Inculo cultivo puro. Fermentacin 20 y 28C bajo una atmsfera de CO2.

Como se obtiene el alcohol ? glucosa levadura alcohol + CO2

DESTILACIN. Es la separacin de dos o ms mezclas de sustancias con puntos de ebullicin muy diferentes de una mezcla a otra (agua, alcohol) La temperatura de ebullicin del alcohol es de 78oC. A partir de la glucosa, fructosa o sacarosa a travs de las levaduras y temperaturas obtendremos alcohol (bebida fermentada) (2-18%) porque contiene agua y el agua diluye la concentracin de alcohol y por eso es menos el porcentaje. Y as, aplicamos el proceso de destilacin se separa el agua y obtendremos una bebida destilada de (30-60%) que es alcohol ms puro porque se separa agua. FERMENTACIN ALCOHLICA. Es un proceso bioqumico provocado por la accin de las levaduras y consiste en la formacin de los azcares en etanol y bixido de carbono que es un subproducto del proceso. Es la formacin de etanol producida por la fermentacin anaerobia de la glucosa. La fermentacin alcohlica no solo la sufren los azcares fermentables (glucosa o fructosa). La sacarosa o azcar de caa se desdobla en glucosa y fructosa por accin de la enzima invertasa y pentasa producida por las levaduras. Adems los productos alcohol (anhdrido carbnico ), se forma tambin glicerina, cido sucanco, cido subvoltiles, butiliglicol, alcoholes superiores (esencia de fusel ), acetaldehdo, cido lctico y esteres. La formacin de los carbohidratos o azcares a etanol mas bixido de carbono se realiza en condiciones anaerobiosis mediante la ruta de la gliclisis, que consiste en la escisicin de la glucosa para obtener energa (ATP). La transferencia de un fosforilo de ATP a la glucosa esta catalizada por hexoquinasa, los siguientes intermediarios de esta va metablica la dihidroxiacetona fosfato, gliceraldehido- 3-fosfato son azucares fosforilados, de hecho una de las estrategias de la gliclisis es formar intermediarios de 3 carbonos capaces de intransferir subgrupos fosfatos al ADP, y as obtener una sntesis neta de ATP. Desdoblamiento de la sacarosa a fructosa y glucosa por medio de la enzima invertasa Es un proceso que genera ATP en el cual las sustancias orgnicas actan como ganadores y aceptores de electrones, la fermentacin puede producirse en ausencia de O. Fue descubierto por Pasteur, que la describi como la va sansiair (la vida sin aire). Enzima : trmino propuesto en 1878 por Friedrich Wilhem Kuhne para designar a las sustancias catalticamente activas, a las que previamente se les haba llamado fermento. Derivado de las palabras griegas en (en) y zumos (levaduras).

13

ETAPAS Y RECCIONES QUMICAS DE LA FERMENTACIN ALCOHOLICA. GLICLISIS. Derivado del griego glycos = azcar (dulce), Lysis = disolucin que quiere decir azcar en disolucin. La gluclisis es la secuencia de reacciones que convierte a la glucosa en piruvato con la produccin convidante de ATP. La gliclisis es una de las diversas rutas catablicas , conocidos generalmente como fermentaciones anaerobias, mediante muchos organismos , obtienen energa qumica de varios combustibles orgnicos en ausencia de oxgeno molecular. Dado en que los organismos vivos sugieren inicialmente en una atmsfera que careci de oxigeno. La gliclisis es la secuencia de las reacciones que invierten la fructosa en piruvato con la produccin conocidamente en ATP . En los organismos aerbicos la gliclisis sirve de prembulo al ciclo del cido ctrico y a la cadena de transporte electrnica , las cuales recolectan la mayor parte de la energa de la glucosa en condiciones aerbicas , el piruvato entra a la mitocondria en donde es completamente oxidasa hasta CO2 y H2 O. Si el suministro es insuficiente como el msculo en contraccin del piruvato se convierten en lactano. En algunos organismos anaerbicos como las levaduras del piruvato se convierten en etanol : La formacin del etanol y lactano a partir de glucosa son ejemplo de fermentacin.

14

RUTA GENERAL DE LA GLICLISIS

GLUCOSA

ATP
GLUCOSA 6 FOSFATO

ADP ADP

ATP

FRUCTOSA 6 FOSFATO

FRUCTOSA 1, 6 FOSFATO

ESCISIN

GLICERALDEHIDO 3 FOSFATO

DIHIDROXICETONA FOSFATO GLICERALDEHIDO 3 FOSFATO

H2PO4

H2PO4

H2O

1, 3 BIFOSFOGLICERATO

ADP

H2O

ATP
3 FOSFOGLICERATO 2 FOFOGLICERATO n

H2O
FOSFOENOL PIRUVATO

ADP

ATP

PIRUVATO ACETALDEHDO

ETANOL + H2O l

15

RUTA DE LA GLICLISIS
CH2OPO-23 H CH2OH H H OH OH H H + ATP OH OH HEXOQUINASA OH OH H H H OH OH

GLUCOSA FOSFATO

GLUCOSA 6

La hexoquinasa entonces es una enzima que transfiere un grupo fosforilo desde el ATP a un grupo de azucares de 6 carbonos (hexosas) como la glucosa y la manosa. La hexoquinasa al igual que otras quinasas requieren para su actividad Mg u otro ion bivalente como el Mn el ion metlico bivalente forma un complejo con el ATP. La etapa siguiente de la gliclisis es la isomerizacin de la glucosa 6 fosfato a fructuosa 6 fosfato, como se ve en la siguiente reaccin:

H OH

CH2OPO-23 H

H + ATP OH OH

FOSFOGLUCOSA ISOMERASA

CH2OH OPO-23 H OH H OH OH H

OH

GLUCOSA 6 FOSFATO

FRUCTUOSA 6 FOSFATO

El siguiente paso es convertir la glucosa 6 fosfato a fructuosa 6 fosfato que lo hace la encima fosfato isomerasa es un rompimiento entre el enlace del carbono 1 y 2 haciendo as una isomerizacin que es como un recorrido de partculas.
OPO-23 H CH2OH FOSFOFRUCTOQUINASA OH OH OH + ATP H OH OH OH OPO-23 CH2OPO-2

FRUCTUOSA 6 FOSFATO

FRUCTUOSA 1, 6 DIFOSFATO + ADP + H

16

Lo que sucede en esta reaccin es que la enzima fosfofructoquinasa hace que reaccione el ATP para que este sede un grupo fosfato a la posicin 1 convirtindose el ATP en ADP pero tambin en esta reaccin se va un H para que la transferencia del fosfato se ha exacta pasando de fructuosa 6 fosfato a fructuosa 1,6 difosfato.

CH 2OPO3 C=O O H- C-H H-C-OH H- C-OH CH2OPO3 FRUCTOSA 1, 6 FOSFATO ALDOLASA

H H-C-OH C=O CH2OPO3

H C=O H- C-OH CH2OPO3

DIHIDROXIACETONA

GLICERALDEIDO 3 FOSFATO

La andolaza parte a la mitad a la fructuosa 1,6 difosfato formando 2 molculas que son la dihidroxiacetona fosfato y el gliceraldehido 3 fosfato y tambin existe un reacomodo de molculas o partculas.
H TRIOFOSFATO H

H-C-OH C=O CH2OPO3 DIHIDROXIACETONA

ISOMERAZA

C H -C-OH CH2OPO3 GLICERALDEHIDO 3 FOSFATO

En este caso la dihidroxiacetona fosfato se sede de la ruta y la tenemos que volver a reintegrar a la ruta convirtindola en gliceraldehido 3 fosfato con ayuda de la triofosfato baja 2 H a la posicin 2 quitando la doble ligadura que existe en el O pero como en la posicin uno quedan solamente 3 enlaces para que se estabilice se le agrega una doble ligadura ya que el carbono soporta 4 enlaces.
H 2 H C C OH H O NAD++PI + FOSFATO DESHIDROGENASA O C C OH OPO-23

CH2OPO3 CH2OPO3

17

GLICERALDEHIDO 3 FOSFATO

1,3 DIFOSFATO

La isomerizacin de los azcares fosforilados de 3 carbonos esta catalizada por la triofosfato isomerasa. Esta reaccin es muy rpida y reversible. As pues, se forma dos molculas de gliceraldehido 3 fosfato a partir de una molcula de fructosa 1, 6 difosfato por la accin secuencial de la aldolasa y triofosfato isomerasa. La reaccin inicial de esta secuencia es la conversin de gliceraldehido 3 fosfato. En 1,3 difosfato, reaccin catalizada por el gliceraldehido 3 fosfato de deshidrogenasa.

O= C O =C H C H C
2OPO3

OPO-23
FOSFOGLICERATO

O OH + ATP
QUINASA

CH2OPO3 CH

1, 3 DIFOSFOGLICERATO 3 FOSFOGLICERATO

18

FORMACIN DEL PIRUVATO Y PRODUCCIN DE UN SEGUNDO ATP La posicin del grupo fosforilo se desplaza en la conversin de 3 difosfoglicerato en 2 fosfoglicerato reaccin canalizada por la fosfogliceromutasa.
2 H C C O OH + ADP FOSFOGLICERATO QUINASA C - O C - OPO-23 CH2OH 2 FOSFOGLICERATO

CH2OPO3 3 FOSFOGLICERATO

O O C C-OPO3 H C H
FOSFOENOL PIRUVICO

H C C=O CH3
PIRUVATO H

PIRUVATO QUINASA

O C C=O CH2 PIRUVATO

PIRUVATO CARBOXILASA

C C=O CH2 ACETALDEHIDO

H C C=O CH2 ACETALDEHIDO ALCOHOL DESHIDROGENASA H H C OH CH3 ETANOL +CO2

19

PRODUCTOS DE LA FERMENTACIN ALCOHLICA. La fermentacin alcohlica no slo la sufren los azcares fermentables (glucosa y fructosa). La sacarosa o azcar de caa se desdobla en glucosa y fructosa; por la accin de la enzima inversaza producida por las levaduras, adems de los productos principales como alcohol y bixido de carbono, se forma glicerina, cido succnico, cidos voltiles, butilenglicol , alcoholes superiores(esencia fusen), acetaldehdo, cido lctico y esteres. 1.- ALCOHOL (ETANOL). Es el producto ms importante de la fermentacin (etanol) espritu de vino C2H5 (OH)3 cuya calidad (40-140g/l). Est sometido a grandes fluctuaciones segn sea el contenido de azcar del jugo de frutas. Es incoloro, muy fluido de agradable color que arde con llama azulada con formacin de agua y del anhdrido carbnico a 20C tiene un peso especifico del 0.7894, hierve a 78.37C y se congela a 114C. Se mezcla con el agua en todas las proporciones desprendiendo calor y provocando una disminucin de volumen prximo al 4%. Cuando se encuentra sin diluir el alcohol tiene un penetrante olor a ardiente. 2.- GLICERINA Es un alcohol trivalente C3H5(OH)3 en estado puro tiene aspecto liquido espeso incoloro, de sabor dulce y no venenoso. Se mezcla con el agua y el alcohol en todas las proporciones, reduciendo considerablemente, el punto de congelacin del agua. La glicerina pura tiene a 20C un peso especifico de 1.2613, la glicerina se diluye en los productos de fermentacin valiosos del vino, ya que este presta cuerpo y consistencia. 3.- ALCOHOLES SUPERIORES En 1910 fue emitido por f ehrlich que los alcoholes superiores, (alcohol proplico, isopropilico, amlico, isoamilico e isobutilico), se originan de los aminocidos correspondientes (cido amino butrico, valina leucina, isoleucina) mediante capacitacin de agua y desprendiendo dixido de carbono y amoniaco. Efectivamente en experiencias modelo puede comprobarse que agregando aminocidos al medio que vaya a fermentar se estimula la formacin de alcoholes superiores por levaduras.

20

Azcar

cido pirvico

valina

productos intermedios cetoivaleriato

productor intermedio

alcohol isobutilico

productos intermedios leucina celoisacaprato productos intermedios alcohol isoamilico

Esquema simplificado de la formacin de los alcoholes superiores (isobutil e isoamilico) y de los aminocidos valina y leucina por levaduras. Los alcoholes superiores solo se encuentran en el vino en escasa cantidad ( 0.1 a 0.3 g/l ). cido succnico ( COOH-CH2-CH2-COOH ) se origina tambin en la fermentacin. Ya Pasteur haba determinado en el vino una cantidad de 0.6 gr. de sete producto para cada 100gr de azcar fermentado. El cido succnico cristaliza en placas o columnas monoclnicas, se disuelve en agua y alcohol y tiene sabor limpiante cido. La pequea cantidad resulta de la fermentacin (0.6 a 2 gr./l) compensa en parte la disminucin de acidez que supone la merma de Cartrato Potasio. 4.- CIDO ACTICO Lo explicaremos con ms detalle en la siguiente unidad temtica. 5.- SUSTANCIAS AROMTICAS El aroma de un vino obedece a varios cientos de componentes diferentes y est formado por sustancias de distintas clases (aldehdos, cetonas, alcoholes, esteres, cido terpenos). Estas mltiples sustancias olorosas inspidas proporcionan en conjunto la intencin total de dar un vino. En la constitucin de los aromas y sabores peculiares de las uvas (bouquet) parece participar un nmero relativamente pequeo de compuestos el bouquet del vino depende fundamentalmente de nmeros componentes generados en curso de la fermentacin, conocidos con el nombre de esencia de fusel. Estos compuestos fundamentales del extracto de fusel no se originaron en la fermentacin en cantidades constantes. Diversas cepas de levaduras forman distintas cantidades de estos compuestos.

21

Existen varios sabores: primarios, secundarios, tanto para olores como colores. Sabores secundarios: son la mezcla de los sabores primarios (1, 2 o ms). Existen 4 sabores primarios: dulce, salado, agrio, amargo. Sabor dulce: Los compuestos que lo presentan son: los azcares que son los carbohidratos: mono y disacrido. Los carbohidratos que son ms complejos no presentan sabor (almidn, celulosa, hemicelulosa). Compuestos qumicos que presentan sabor: GLICOLIS, GLICEROL, SORVITOL LIGERAMENTE DULCE (SABOR) SABOR DULCE SABOR DULCE

CLOROFORMO NITRATO DE ETILO

6.- ANHDRIDO CARBNICO. Es el gas desprendido de la fermentacin (gas carbnico ), es el bixido de carbono (cco2) a partir del cual se forma el cido carbnico. Este ltimo no se presenta libre si no nicamente en sus sales (carbonatos ). El anhdrido carbnico es un gas inodoro e incoloro que es 1.52 ms pesado que el aire y no hace combustin (no arde), el anhdrido carbnico no permite la respiracin por lo que ejerce accin asfixiante, de un 3 a 4 % del CO2 en el aire y no hace combustin (no arde) . El anhdrido carbnico no permite la respiracin por lo que ejerce accin asfixiante. El CO2 en el aire dificulta ya la respiracin y desarrolla accin sofocante por liberarse el la fermentacin de grandes cantidades de CO2 deben instalarse dispositivos de ventilacin que aseguren su eliminacin, de aqu que la entrada de las bodegas durante la etapa de fermentacin suponga un evidente peligro de muerte . En los vinos para embotellar es muy conveniente que exista un cierto contenido de CO2 , el cual, hace al vino ms espumoso.

Clasificacin de bebidas alcohlicas de acuerdo con el sustrato del que proceden.

22

SUSTRATO

DESTILADAS FORTIFICADAS Brandy, coac, Vino, chapage, vinos Jere, oporto, vermut, Uva armaac, pisco y espumosos madeira y moscatel Groppa Sidra y sidra Manzana Calvados espumosa Pera Perry Cereza Kirsch Otros Vinos de frutas Cereales, cebada cerveza Whisky Burbon, whisky de Maz Tesguino maz, whisky de tennese Varios (incluyendo Vodka, ginebra y pan.) akvait Arroz Sake Sorgo Cerveza africana Cachazo, pinga, Caa, melazas o charanda Ron, jugos aguardiente. Agaves Pulque Tequila, Mezcal. Fue en la edad media cuando se descubrieron los principios fsicos de la destilacin, lo que permiti a los alquimistas la poca de destilar por primera vez, es decir, llevar acabo una separacin de los componentes voltiles (alcohlicos) y las no voltiles (stractiles del vino). El proceso de destilacin del vino lo descubri un sabio de Salerno (una de las ms antiguas universidades del mundo occidental) llamado Magster Salernos. En 1867 algunos escritores deducen que la destilacin se usaba para la obtencin de nuevos medicamentos. Siglos despus de su descubrimiento el aguardiente constitua, an en la mayora de las culturas, un medicamento. En el ao de 1530 la ciudad de Nvemberg puso a punto los primeros carros destinados al transporte de los borrachos. En esta poca apareci el trmino alcohol para denominar el espritu que contena el vino. Theophrastus, Bombastus Von Hohemhein paracel y mdico, obtuvo el trmino de alcohol copiando del rabe en este idioma, la palabra alcohol alko hul designa algo esencialmente delicado y puro, la ms til de cada cosa . El nuevo trmino acab sustituyndolo a todos los utilizados hasta entonces de origen latino como agua vitae que quiere decir agua de vida o agua ordens por citar slo algunos. Durante el siglo XVI el aguardiente pas definitivamente de ser una medicina a convertirse en una bebida habitual. La produccin de aguardiente constituye uno de los hallazgos que mayor trascendencia ha tenido comparacin a la invencin de la estructura, el dinero, la plvora, la brjula, la imprenta, y ha dado lugar a medicinas y tambin a exquisitas bebidas bajo el seductor nombre de agua de vida.

NO DESTILADAS

23

UNIDAD 4.- FERMENTACIN ACTICA INTRODUCCIN.El vinagre es el producto de la fermentacin del vino o de alcohol , debido a la reaccin de Mycoderma aceti que oxida al etanol hasta cido actico . El cido actico es un cido que se encuentra en el vinagre, y que es el principal responsable de su sabor y olor agrios. Su frmula es CH3-COOH y, de acuerdo con la IUPAC se denomina sistemticamente cido etanoico. H O \ // H-C-C / \ H OH Es el segundo de los cidos carboxlicos, despus del cido frmico o metanoico, que slo tiene un carbono, y antes del cido propanoico, que ya tiene una cadena de tres carbonos. En estado puro el cido actico es un lquido incoloro, de olor y de sabor penetrante a cido, hierve a 118C y posee una densidad de 1.0492 a 20 C en la fermentacin se origina en cantidades muy pequeas a partir del acetaldehdo. El punto de fusin es 16.6 C y el punto de ebullicin es 117.9 C. En disolucin acuosa, el cido actico puede perder el protn del grupo carboxilo para dar su base conjugada, el acetato. Su pKa es de 4.8 a 25 C, lo cual significa, que al pH moderadamente cido de 4.8, aproximadamente la mitad de sus molculas se habrn desprendido del protn. Esto hace que sea un cido dbil y que, en concentraciones adecuadas, pueda formar disoluciones tampn con su base conjugada. HISTORIA.La historia del vinagre est ntimamente ligada a la historia del vino, como su mismo nombre demuestra. El nombre castellano del vinagre proviene del latn vinum acre o vino agrio y as ocurre en la mayora de lenguas, con la excepcin del italiano, que toma el nombre de su principal componente, el cido actico, y lo llaman ACETO. No obstante el vinagre ese regalo que Dios nos dio, se puede obtener de muchas otras frutas, plantas y cereales. Las primeras noticias, sobre un tipo de vinagre, que se obtena de la palma, provienen de Oriente y son del ao 5.000 antes de Cristo (El salvador del mundo). Autores griegos y romanos nos hablan tambin del vinagre, en este caso procedente del vino, que no slo utilizaban como condimento, sino como conservante de alimentos, muchas veces mezclado con sal y miel.

24

Al principio el vinagre se consideraba como una alteracin natural del vino. Hasta el siglo VIII no se conoci la purificacin del vinagre por destilacin que fue dada a conocer por Geber en, lo que se puede llamar, el primer tratado sobre la elaboracin del vinagre. El vinagre se preparaba de una manera casera, permitiendo que el vino u otros lquidos alcohlicos sufrieran, el contacto con el aire, una oxidacin. Despus se descubri que en este proceso intervenan unas bacterias, denominadas acticas, que eran las generadoras del proceso. Hasta la Edad Media no aparecieron los primeros artesanos elaboradores de vinagre. En Francia, durante el reinado de Carlos VI, se agruparon convirtindose en cofrada. Tenan unas seversimas normas para entrar en la orden y participar en los secretos de la elaboracin del vinagre. Segn ellos Era ms difcil hacer un discreto vinagre que un buen vino. Aunque, en realidad, sus frmulas secretas consistan en la utilizacin de algunas sustancias de fuerte sabor, como la pimienta o el jengibre, que daban al vinagre el sabor caracterstico. Como en tantas otras cosas fue necesario el grito de libertad de la Revolucin Francesa para que s dejara libre la elaboracin de vinagre en Francia. Si se ha hecho referencia a Francia es porque en este pas es donde se inici la produccin industrial del vinagre con el mtodo Orleans. Se utilizaban, barriles en serie de 200 a 400 litros de cabida y, partiendo de una cantidad de vinagre al que se le aada vino, por medio de una adecuada ventilacin y unas condiciones idneas de temperatura, este vino se trasformaba en vinagre. Y fue tambin en Francia, en el siglo XVIII, cuando Lavoisier empez a dar una explicacin cientfica al proceso de elaboracin del vinagre. Su teora consista en decir que el espritu del vino produca el vinagre al fijar el oxgeno del aire. Y lo que antes era un hecho que se produca sin saber bien sus causas, se convirti en algo explicable al conocerse los agentes de la fermentacin actica. Fue Pasteur el que explic con ms detalle y exactitud el proceso, consistente en la fermentacin que una bacteria, el Mycoderma aceti, realiza en el alcohol vnico para obtener el cido actico. Pero, si para Pasteur la formacin del vinagre se deba considerar como un proceso fisiolgico, ya que es una fermentacin, para Liebig la transformacin del alcohol etlico en vinagre por accin de las bacterias, no es otra cosa que un proceso de oxidacin. En medio de este proceso de teoras el vinagre se segua produciendo. Todos los pases utilizaban las materias primas que tenan ms a mano y elaboraban diferentes tipos de vinagre. Si en la cuenca mediterrnea la base del vinagre era el vino, en Inglaterra del norte, donde la cerveza era la bebida nacional, predominaba el vinagre de malta y en el sur de Inglaterra, donde se cultivaban las manzanas, el vinagre era de sidra. En cada regin, de acuerdo con su clima y los cultivos propios, se encontr una materia prima para producir vinagre.

25

MICROORGANISMOS PARTICIPANTES. La especie de bacteria empleada es importante, cuanto ms activa sea, ms rpida y completa ser la fermentacin. Se sabe que los vinos utilizados para la obtencin de vinagre no deben tener ms de un 20% de agua y el alcohol en una concentracin comprendida entre el 5 - 11% del volumen en ningn caso por encima del 15%. De no ser as, las bacterias acticas mermaran su actividad prolongando el tiempo de fermentacin. Clasificacin de las cepas: Las bacterias acticas, para cumplir su cometido necesitan, adems, cantidades constantes de oxgeno y estar protegidas de la luz ultravioleta. sta, al tener accin germicida, puede destruir la clula o retardar su desarrollo. La temperatura ideal del proceso de fermentacin actica est entre los 28 y los 30 C. A mayor temperatura la enzima alcoholdeshidrogenasa se destruye. Existen dos tipos de bacterias generadoras de cido actico: El gnero Gluconobacter y el gnero Acetobacter. El genero Gluconobacter oxida los azcares o alcoholes hasta cetonas y cidos, pero no pueden continuar degradndolo hasta CO2 y H2O se trata de bacterias denominadas: sub oxidantes. Se diferencia de acetobacter con sus flagelos situados exclusivamente en posicin aplical ( polares ) y por su capacidad para seguir degradando al cido actico y lctico, oxidan al etanol hasta cido actico con una rapidez alta. El genero Acetobacter representantes del otro grupo por lo contrario pueden seguir degradando las cetonas y los cidos hasta bixido de carbono y agua y se les conoce como bacterias: superoxidantes. Dentro del genero Acetobacter encontramos a los sper oxidantes que se diferencias de tres especies con distintas subespecies. La especie ms importante desde el punto de vista industrial es acetobacter aceti a ella pertenece como cepas de cultivo las de: ssp. Orlaense y ssp. Xylinum. Ssp. Orlaense. Son las bacterias del vinagre del vino y de la acidificacin rpida que tiene las tasas mximas de conversin de etanol a cido actico. Es la ms eficaz porque produce un cido muy concentrado. Ssp. Xylinum Se encuentra en las heces del vinagre (vinagre madre) conformando una capa slida correosa en los depsitos del vinagre tiene una eficacia limitada y resulta indeseable porque forma colores y olores desagradables. Las otras dos especies Acetobacter Pasterianus y Peroxidans, no tienen elaboracin de vinagre. La primera pertenece tambin a las bacterias perjudiciales vinagre de cerveza y forma sustancia musilaginosas durante la obtencin del mosto. Mycoderma aceti La bacteria llamada Mycoderma aceti realiza la fermentacin actica del alcohol, que contiene el vino, para transformarlo en cido actico. Por esta razn, para la produccin de un buen vinagre se debe tratar con sumo cuidado esta bacteria. Adems la bacteria requiere unas condiciones especiales de trabajo. Su temperatura ideal para el

26

trabajo es de 25% a 30%, un exceso de temperatura causara su muerte y con una temperatura muy baja su ritmo de trabajo es muy lento, se retarda el proceso y por lo tanto se incrementan los costos. Para su existencia y para su trabajo de oxidacin necesita tambin abundancia de oxgeno por lo que durante el proceso se deber mantener una buena oxigenacin del vino. MATERIAS PRIMAS. En la elaboracin de vinagre es importantsima la seleccin de la materia prima. Cuando el vino es de mejor calidad, mejor ser el vinagre. La composicin del vino debe ser la adecuada para ser transformado en un excelente vinagre. El Control de laboratorio en esta primera fase es indispensable. Con el fin de que el vino que se va a utilizar est totalmente limpio, por medio del centrifugado, se procede a su limpieza y se almacena en grandes depsitos, de donde se alimentaran los generadores del vinagre, su grado alcohlico debe ser como mnimo de 11 y no debe tener ningn tipo de sabor y olor extrao.

La materia prima para obtener vinagre es el alcohol etlico, que sufre un proceso aerbico denominado Oxidacin, debido a la presencia de bacterias del tipo Acetobacter. Se trata de un gnero microbiano caracterizado por tener clulas de formas elipsoidal y esfrica, sueltas o unidas en cadenas, por lo general inmviles, aunque algunas son mviles por ayuda de flagelos. Segn su funcin pueden clasificarse en dos grupos: los que oxidan el cido actico y lo transforman en dixido de carbono y agua y los que carecen de esta propiedad. Teniendo en cuenta la materia prima de la cual ha sido fabricado, los vinagres se pueden clasificar en:

1. Vinagres de jugo de fruta manzana, uva, pera, bayas, etc. Un ejemplo es el

vinagre de vino o de uva, se obtiene exclusivamente por fermentacin de la uva y del vino. Es el tipo de vinagre ms usado en la gastronoma de distintos pases de Europa, en particular en Francia e Italia. Segn el vino que se utilice se obtienen vinagres distintos a los que se les da diferentes aplicaciones; el vinagre de vino tinto realza el sabor de las carnes rojas; el de vino blanco resulta ideal para elaborar ciertas salsas (mayonesa, holandesa). El vinagre de cerezas en Espaa, balsmico en Italia, vino tinto en Francia, etc. Muy apreciado por su ligero sabor acaramelado es el vinagre de Jerez, y el vinagre de vino Rioja, que se caracteriza por su tono teja brillante y un sabor muy definido. Excelente para el paladar es el vinagre balsmico de Mdena, un vinagre de origen italiano de consistencia espesa y un bouquet muy apreciado. Se elabora con mosto fresco de uva que se hierve para concentrar el contenido de azcar y el sabor y se deja envejecer de 6 a 12 aos. Otro ejemplo es el vinagre de manzana o de sidra es muy consumido por su suave y delicado sabor. Se puede elaborar a partir de la pulpa de manzana o su zumo, cuyo azcar se convierte primero en alcohol y posteriormente en cido actico, o a partir de la sidra o mosto de manzana fermentado. A las ensaladas les

27

proporciona un toque a manzana y combina muy bien con pescados, carnes blancas y salsas suaves.

2. Vinagres fabricados por hortalizas y amilasas, como son los vinagres de papatas,
cuyo almidn debe ser previamente hidrolizado a azucares. Como ejemplo esta el vinagre de arroz es tpico de pases asiticos como China o Japn donde se incluye en la mayora de platos populares de la gastronoma propia de estos pases. Se trata de un vinagre con sabor suave y algo dulce y con un color que oscila entre el blanco, dorado plido o rojizo, segn se elabore solo con arroz o se combine con otros cereales como el trigo, el sorgo o el mijo.

3. Vinagres fabricados por cereales malteados, Vinagre de cebada, vinagre de

centeno, vinagre de trigo y vinagre de maz. El vinagre blanco destilado es el ms usado en el hogar. Este vinagre, de un tono casi transparente, se destila antes de que todo el alcohol se haya convertido en cido actico. Este proceso aumenta mucho el contenido en cido actico, y a esto se debe el sabor fuerte y pronunciado de estos vinagres. Se elaboran generalmente a partir de la caa de azcar, el maz o la melaza, y son los ms empleados en la elaboracin de encurtidos, salsas envasadas, etc. 4. Vinagres fabricados por productos azucarados. 5. Vinagres que se fabrican con espritu de vino a alcohol, como el que se fabrica con el lquido que queda despus de preparar las levaduras de cerveza. Como el que se fabrica con el alcohol desnaturalizado o diluido. 6. Sabores y aromas.- Cualquier vinagre se puede aromatizar o condimentar con hierbas aromticas (romero, tomillo, estragn, albahaca...), especias (ajo, pimienta, chiles...), frutas (frambuesa, manzana, pltano, naranja, pia, zarzamoras, limn...) u otros condimentos como azcar o miel. El resultado es un vinagre aromatizado que dan un toque especial a los alimentos o a los platos a los que se aade. 7. Color.- El vinagre se encuentra con una gran variedad de tonos de colores, desde un casi transparente vinagre blanco destilado a las diferentes tonalidades de rojo de los vinagres de vino, amarillentos de los vinagres de sidra y color chocolate de los vinagres de malta. El color del vinagre se deriva bsicamente de los ingredientes usados para su elaboracin. Es tambin de esperar que el color vare entre los mismos tipos de vinagre, por ejemplo cambios naturales en la coloracin de las manzanas varan de cosecha en cosecha, y los tipos de manzanas utilizados. Aunque tambin se puede utilizar color caramelo para darle un tono caf al vinagre.

PROCESO FERMENTATIVO.

28

La fabricacin de vinagre a partir de materias primas que contienen azcar comprenden dos pasos: 1. La fermentacin de azcar a alcohol etlico. 2. La oxidacin del alcohol a cido actico. El primer paso es un proceso anaerobio llevado acabo por levaduras saccharomyce cereviseae var. Ellipsodeus. El segundo paso es la oxidacin del alcohol a cido actico, es una reaccin aerobia llevado acabo por bacterias acticas como son los del grupo acetobacter. La enzima catalizadora (alcoholdeshidrogenasa) que posee Acetobacter es la encargada de producir la oxidacin del alcohol por retirada del hidrgeno. Condiciones del proceso fermentativo. No obstante, no solamente la presencia de Acetobacter hace posible la produccin de vinagre ya que existen mltiples factores que intervienen en la fermentacin actica como son la especie empleada y la pureza de la cepa, la concentracin acuosa y alcohlica del vino utilizado, la luz, el oxigeno, el agua, el pH, las sales nutritivas y la temperatura. Si se cumplen todas estas condiciones, las fermentaciones se desarrollarn de manera perfecta. Las acetobacterias catalizan la oxidacin de alcohol en cido actico segn la siguiente frmula: C2H5OH + O2 ==> CH3COOH + H2O Siguiendo un proceso que se repite continuamente. En el ramo industrial se fabrica el cido mediante oxidacin de lquidos alcohlicos diluidos por bacteria acticas. Tambin se efecta mediante la siguiente reaccin: 2CH3 CHO + H2O ----------------------- C2H5 OH ACETALDEHIDO AGUA ETANOL + CH3 C00H AC. ACETICO

En general el proceso de fermentacin actica sigue la ruta de la gliclisis, la cual se explica con ms detalle en la unidad denominada Fermentacin alcohlica.

IMPORTANCIA INDUSTRIAL DEL CIDO ACTICO. El vinagre puede ser usado en muchas formas. Existen mas de 300 aplicaciones de cmo usarlo. A veces se piensa que slo es utilizado en la cocina como acompaante de las ensaladas mezclndolo con aceite y/o pimienta y sal. Sin embargo, el vinagre tiene usos que van desde ser un ingrediente verstil de sus comidas como resaltador del sabor

29

o condimento, un ablandador de las carnes, un preservante natural de alimentos, un agente medicinal y un elemento de gran utilidad en la limpieza del hogar y los equipos utilizados en la industria de alimentos. En fin, el vinagre se utiliza en cualquier medio donde se requiera de un acidulante natural. Algunas aplicaciones se muestran a continuacin: Acidulante.- Al igual que los ctricos, el vinagre es un excelente ingrediente para marinar ya que es un ablandador natural porque desdobla las fibras y protenas de las carnes. Por ejemplo, es ampliamente utilizado para ablandar el bistec de cinta (Flank Steak). Solo una nota de precaucin, debido a que el vinagre puede por si solo cocinar la carne se recomienda mezclarlo con aceite vegetal o de oliva cuando se use para marinar. Resaltador del sabor.- Puede agregarse a la salsa que vaya a utilizar para cocinar. Cuando se cocina su plato, el agua se evapora dejando el exquisito aroma y sabor del vinagre. En el caso de los mariscos, es mejor agregar el toque de vinagre luego de cocinados para mejorar as el sabor de los mismos. Conservador natural.- La mayonesa, salsa picante, mostaza, el ketchup, salsa de tomate y los encurtidos son preservados con vinagre. El vinagre es ampliamente utilizado en la industria alimenticia por tener la propiedad de reducir el pH de los alimentos para evitar el crecimiento de bacterias. Su sabor tambin ayuda a mejorar el de los alimentos que se preservan. Evita el crecimiento de hongos, desinfecta los equipos que se utilizan para procesar alimentos y neutraliza los malos olores caractersticos de ciertos alimentos. Higiene personal.- En los Estados Unidos un gran porcentaje de la produccin de vinagre destilado es utilizado por la industria farmacutica para la elaboracin de duchas femeninas. Limpieza de materiales.- La industria qumica lo usa por ejemplo como ingrediente para elaborar limpiadores lquidos de vidrio.

30

UNIDAD 5.- VINIFICACIN CARACTERSTICAS GENERALES, ETAPAS Y REACCIONES QUMICAS DEL PROCESO DE VINIFICACIN. INTRODUCCIN. El vino es una bebida que se obtiene mediante fermentacin alcohlica del sumo de la uva fresca. Los <vinos> preparados a partir de otros frutos , como manzanas y grosellas, no deben llamarse solamente vinos, sino que debe aludirse a los productos vegetales de que proceden. El vino debe prepararse a partir de uva fresca. Resulta esencial que el vino se obtenga mediante fermentacin y que contenga alcohol.

Una actividad que ha estado ligada a la mayora de las culturas durante miles de aos ha sido la produccin de bebidas alcohlicas. Evidencias arqueolgicas que demuestran que desde hace mas de 7000 aos de antigedad los humanos aprendimos a encausar las fermentaciones alcohlicas de diversos sustratos en forma emprica. Quiz las primeras bebidas se hicieron con base a sustratos azucarados como jugos de fruta, ya que stos slo requieren ponerse en contacto el jugo con la levadura silvestre presente en la superficie de la propia fruta. Fue hasta el siglo XV cuando empez a popularizarse el arte de la destilacin y de esta forma aparecen las bebidas con mayor contenido alcohlico. Debido a la gran importancia de estos productos la investigacin cientfica y tecnolgica generan industrias, las cuales son de mayor importancia econmica en el mundo. HISTORIA. En todas las etapas marcadas en la historia y an antes de la prehistoria el vino a acompaado al hombre. Se extendi por los imperios y su elaboracin cuidadosa cayo en el olvido durante unos siglos. El vino cruzo el ocano hasta Amrica buscando otras tierras. El vino y el hombre son compaeros de ms de 4000 aos de antigedad. En este tiempo esta bebida de los dioses a estado presente en mitos y ritos, en leyendas y en el arte, como parte de la cultura de los pueblos. La produccin de bebidas alcohlicas ha sido una actividad ligada a la mayora de las culturas durante milenios. Existen evidencias arqueolgicas de ms de 7000 aos de antigedad. Se dice que los egipcios descubrieron las bebidas alcohlicas fermentadas en forma accidental ya que un rey egipcio mandaba a sus sirvientes a recolectar uvas y ellos depositaban el apreciado fruto en recipientes de cermica. Las mozas daban al rey en la boca este apreciado fruto y nos relata la historia que uno de los recipientes de cermica en donde se encontraban las uvas (almacenadas durante un largo tiempo) desprendan
31

un olor extrao y que adems se observaba dentro del recipiente un lquido azulado. Al darse cuenta sobre esto el rey, prohibi que el recipiente fuera tocado y que no se consumieran esas uvas, ya que el deca que se trataba de un veneno. En una ocasin, una de sus mozas que se encontraba ms tiempo al lado del rey fue desplazada por otra de sus mozas mas joven y bella. La moza al darse cuenta del desplazamiento que la nueva y bella joven haba logrado, toma la decisin de quitarse la vida bebiendo de dicho veneno. Todos se quedaron sorprendidos esperando la muerte de esta mujer decepcionada, pero grande fue la sorpresa al ver que ella no agonizaba y lo nico que observaron en ella fue una inmensa alegra y una actitud fuera de control. A partir de ese momento todos los que conformaban el reino de Egipto, probaron de esa misteriosa sustancia y descubrieron las grandes virtudes que esta posea. En forma emprica los humanos aprendimos a encauzar las fermentaciones alcohlicas de diversos sustratos. (Garca Gariba y Col. Biotecnologa Alimentaria, 1993). Probablemente las primeras bebidas se hicieron a partir de sustratos azucarados como los jugos de frutas, ya que stos slamente requieren poner en contacto al jugo con la levadura silvestre presente en la superficie de la propia fruta (Wacher y Col., 1990). Las bebidas alcohlicas son compaeras constantes del hombre en su historia, pero bien es cierto que su exceso es capaz de reducir nuestras sensibilidades, tambin es verdad que tienen la virtud de animar el espritu y de establecer atmsferas propicias para la convivencia y la conversacin, esto cuando se consume en la justa medida y con la prudencia que caracteriza a quienes saben disfrutar de las cosas buenas de la vida. CARACTERSTICAS GENERALES. Las uvas que se utilizan para fabricar vinos son de origen Europeo debido a que contiene eninas. Las eninas son compuestos qumicos colorantes que se encuentran en la mayora de las uvas, por lo tanto juega un papel primordial el la coloracin del vino. ( las semillas le dan la coloracin al vino). Un ejemplo del porque no todas las uvas, del mundo se pueden utilizar para hacer vinos son las que proceden de Chile. Las uvas de Chile no tienen la misma composicin qumica que las Europeas, debido a que estas uvas contienen enidinas en lugar de eninas. Las enidinas es un compuesto qumico que transfiere un sabor amargo, esto se debe a los factores ambientales como son: el clima, la temperatura, composicin del suelo, la presin atmosfrica y la altitud. Del tipo de uva recibe el ttulo el vino, por ejemplo: TTULO Gabinete Cosecha tarda Cosecha selecta Cosecha especial Uvas pasas TIPO DE UVA Uvas maduras. Uva recolectada tardamente y en estado de completa madurez. Slo se utilizan uvas completamente maduras eliminando grados enfermos e inmaduros. Empleo nicamente de granos sobre maduros o con putridez Generosa. Slo se utilizan granos arrugados con putridez generosa o bien granos sobre maduros y tambin arrugados.
32

Vino Helado

Las uvas deben estar congeladas en el momento de la vendimia y por lo general se efecta una prendimia y una vendimia tarda.

Dependiendo de la zona vitivincola que nos encontremos, es lo que determina el tipo de vino que se pretende elaborar e ir condicionado por una serie de factores sociales que predisponen los gustos del consumidor, por lo que demanda el mercado diferentes formas de presentar el producto para poder llegar a ms pblico de edades distintas y gustos variados. Los tipos de vinos son extremadamente amplios. Pueden ser: o o o o o -Aromticos o de aroma discreto. -Secos, semisecos, dulces o licorosos. -Tranquilos o espumosos. -Frescos y afrutado. -Rancios y maderizados.

Existen una serie de caractersticas que determinan el tipo de vino del que se trata. Veamos: o o o -Envejecidos en madera o conservados jvenes en envases hermticos. -Segn las uvas: si estn poco maduras, muy maduras o sobre maduras. -Segn su estado sanitario y nivel de podredumbre.

En la actualidad conocemos la incidencia que sobre los compuestos voltiles de un vino tienen los tratamientos que se realizan sobre la uva y el mosto. Dicho tratamiento no slo condiciona el resultado aromtico final del vino elaborado sino que adems, repercuten en el desarrollo de la fermentacin y en las posibles desviaciones o ralentizaciones de la misma. LEVADURAS UTILIZADAS.Otro factor importante son las levaduras, de composicin muy sencilla, son clulas redondas ovaladas y elpticas envueltas en una membrana muy fina elstica cuyo dimetro es de 0.014 mm. El interior de dicha clula es incolora y a veces presenta un aspecto granular, el protoplasma se encuentra situado junto a la pared celular y en su interior aparece una o varas vacuolas que contienen el jugo celular. Esta demostrado que las distintas levaduras difieren entre s y que no todas las especies de levaduras producen el mismo tipo de fermentacin, presentando cada una de ellas caractersticas propias, las levaduras ms importantes para la fabricacin de vino son las comprendidas dentro del gnero saccharomyce y dentro de stas encontraremos a la Saccharomyce cereviseae var. Ellipsodeus. Por otra parte la fermentacin producida por levadura de uva origina valiosas sustancias aromticas que son las responsables del bouquet. Las levaduras autnticas se encuentran en cualquier lugar de la naturaleza y abundan en las regiones vitcolas. Persisten en formas de esporas en las capas superiores de la tierra de los vieros hasta que la lluvia y el viento y los insectos las transportan a fines de verano y en otoo y despus de ah al mosto.

33

Las uvas que an antes de haber madurado por completo han sido picadas y estropeados por avispas y pjaros, constituyen autnticas incubadoras de grmenes fermentativos. Muchas de estas clulas de levadura crecen a travs de la tierra y forman ah nuevas esporas que persistirn a lo largo del invierno. La formacin de alcohol y el desplazamiento de aire por medio del bixido de carbono que se est formando impide el desarrollo de los hongos formadores de micelios, las levaduras superficiales y a la mayora de las bacterias, triunfando as las levaduras autnticas. Las levaduras autnticas se producen por gemacin, en condiciones favorables formndose a un lado de las clulas de las levaduras, uno o varios brotes que al cabo de pocas horas alcanzan la dimensin de la clula madre y se desprenden de ellas. Existen diversos tipos de microorganismos de inters industrial, que vara de acuerdo al tipo de fermentacin que se quiera realizar, como son los siguientes: Tipo de fermentacin. Fermentacin actica Fermentacin alcohlica Fermentacin butlica Fermentacin ctrica Fermentacin lctica Microorganismos que intervienen Acetobacterias Saccharomyce cerevisae Clostridium s.p.p. Aspergillus s.p.p Lactobacillus s.p.p. PIE DE CUBA. El proceso de vinificacin consiste desde la recoleccin de las uvas conocidos como vendimia hasta el producto terminado (vino). La vendimia se conoce como la recoleccin de las uvas. La vinificacin es la serie de operaciones fsicas enzimticas que transforman el jugo de las frutas en vino. La vinificacin comienza con la trituracin del vino (hollaje) y continua con el despalillado (eliminacin de escobajo). A continuacin se describen la etapas generales. La Vendimia.- El perodo de recoleccin se prolonga, en el Peneds, de agosto a octubre, segn la poca de madurez de las distintas variedades que se cosechan. La vendimiadora mecnica se utiliza hoy en algunos viedos para acelerar las labores de recoleccin y transportar las uvas al lagar en el momento ptimo de madurez. Las vendimias se acarrean en tolvas o en pequeas cajas, evitando siempre la oxidacin de los mostos. Estrujado, escurrido y prensado.- Cuando las vendimias llegan a la bodega se procede al estrujado de la uva, liberando as el primer mosto. El escurrido puede realizarse de dos formas: 1.- Esttica: deslizando el mosto, por gravedad, entre los partes slidas (hollejos, pepitas, escobajos) de la vendimia. 2.- Dinmica: haciendo circular toda la masa de vendimia por un tornillo sin fin que extrae el mosto.

34

La utilizacin de modernas prensas horizontales -movidas incluso por leve presin neumtica e hidroneumtica- permiten exprimir delicadamente los mostos. Clarificado.- Los mostos turbios deben ser clarificados para obtener vinos limpios y de la mxima finura aromtica. Las burbas o impurezas se eliminan por decantacin, dejando reposar los mostos en los depsitos. Pero las tcnicas ms perfectas y modernas permiten la utilizacin de filtros y mquinas centrifugadoras que eliminan los slidos por medios estrictamente fsicos y naturales, sin utilizar ningn aditivo. La fermentacin de los Vinos Blancos.- Las levaduras depositadas en la piel de la uva provocarn la fermentacin alcohlica, o sea, la transformacin del azcar en alcohol y anhdrido carbnico. Las levaduras seleccionadas pueden garantizar el desarrollo ms natural y completo de este proceso. La fermentacin aromtica de los delicados mostos se realiza, generalmente, en depsitos, eliminando as las las sedimentadas en el proceso anterior. La fermentacin y maceracin de los Vinos Rosados.- Las vendimias tintas deben ser despalilladas y estrujadas para que los hollejos puedan macerarse en los mostos, extrayendo as el color y los aromas. Los vinos rosados permanecen slo unas horas en contacto con sus hollejos, hasta que se ha extrado la coloracin deseada, luego, prosiguen su fermentacin en los depsitos de acero inoxidable sometidos a estricto control de temperatura. La fermentacin y maceracin de los Vinos Tintos.- Las vendimias tintas, despalilladas y estrujadas, fermentan en los depsitos de acero inoxidable, a temperatura controlada. La perfecta maceracin de los hollejos en el mosto permite la extraccin del color y de los aromas. Al terminar la fermentacin alcohlica y la maceracin, los tintos se someten a la fermentacin malolctica que afina el paladar de los vinos mediante la transformacin del duro cido mlico en suave cido lctico. El vino de prensa se obtiene mediante el prensado de los hollejos y se aade luego al "assemblage", en mayor o menor proporcin, segn las caractersticas de la cosecha. Se utilizan hoy delicadsimas tcnicas para elaborar vinos tintos ms finos y genuinos: maceraciones carbnicas, utilizacin de depsitos autovaciantes, vinificacin de cada variedad por separado. Crianza de los Vinos.- La mayor parte de los vinos blancos son vinos jvenes, embotellados en pleno esplendor frutal. Todos ellos exhiben en su etiqueta o en su collarn la aada. Se elaboran tambin algunos excelentes blancos de crianza, aejados en barrica de roble aromtico y nuevo.

35

Algunos tintos jvenes y frutales reciben una ligera crianza en roble nuevo que no se prolonga ms del tiempo justo para redondear sus taninos y ceir su cuerpo, sin castigar su expresin varietal. Los tintos aejos tradicionales y las nobles reservas permanecen un mnimo de 15 meses en barrica de roble y botella. Pero el carcter distintivo de la moderna enologa del Peneds estriba, precisamente, en la flexibilidad y veracidad de las normas. Teniendo como nico objetivo la garanta de calidad, muchos tintos del Peneds no se limitan hoy a pregonar los records de su permanencia en madera; sino que declaran sus credenciales fiables de crianza, beneficindose del aporte aromtico del roble nuevo y de las maderas ms selectas (Limousin, Ailier, Trongais, etc.); y prolongando luego su maduracin en barrica de roble de 3 o 4 ao y en botella. PROCESO DE INDUSTRIALIZACIN. En la elaboracin de vinos intervienen numerosas variables, no slo en lo que se refiere a la variedad, siendo muy importante realizar las tcnicas adecuadas para la obtencin de un buen cultivo, sino tambin el estado sanitario de la uva. Por eso, es conveniente realizar una serie de pasos que les avanzamos a continuacin y que trataremos a lo largo de esta unidad. 1. -Control de la Maduracin. 2. -Transporte de la vendimia. 3. -Recepcin en bodega y toma de muestras. 4. -Extraccin del Mosto. 5. -Maceraciones prefermentativas. 6. -Correccin del Mosto. 7. -Separacin de Fangos. 8. -Comportamiento Fermentativo. 9. -Fermentacin en Barrica. 10. -Acabado de la fermentacin Alcohlica . 1.- Control de la maduracin.- Se realiza un control de maduracin en via para conocer el momento ptimo de maduracin fnolica en la uva. Los anlisis de grado Brix que determinan el azcar contenido en la uva ,(la concentracin de los azcares superiores a 200mg/l pueden originar problemas para desdoblar los ltimos gramos de azcar con el riesgo que repercute en la fermentacin), y los anlisis de taninos-antocianos, que determinan el equilibrio y estabilidad posterior de los vinos, y cuando estos parmetros son los adecuados para la recoleccin. Tambin se examina la evolucin del pH y la acidez total. Los parmetros ptimos son muy difciles de conseguir al mismo tiempo, pero haciendo un seguimiento exhaustivo podremos determinar con gran exactitud el momento adecuado de recoleccin en nuestro viedo. Sirve de gran ayuda el control de la materia nitrogenada. En un inicio de fermentacin alcohlica para la formacin de las estructuras celulares las levaduras, que son las responsables de la transformacin del azcar contenido en el mosto, el alcohol, necesitamos al menos de 180 mg/l de nitrgeno fcilmente asimilable,(sales amoniacales y aminocidos, fundamentalmente la arginina).

36

La falta de dichos nutrientes puede originar ralentizaciones e incluso paradas en la fermentacin. Es recomendable, en estos casos, el uso de activadores amoniacales justo al inicio de la fermentacin. 2. - Transporte de la vendimia.-Para potenciar la calidad de los vinos, el procesado de la vendimia debe realizarse lo ms rpido posible, llegando los racimos casi intactos para evitar maceraciones incontroladas e inicios de fermentaciones. Lo ideal son cajas de 20 Kgs. Si el transporte se realiza en remolque, se recomienda no llenarlos demasiado para que el peso de las uvas no sea capaz de aplastar las que se encuentran debajo. En la actualidad, domina un concepto ya implantado en todas las bodegas; se prefiere tratar los mostos para no tener que tratar los vinos. Cada vez se van acondicionando las bodegas para la recepcin de la uva en un proceso rpido y aplicando la tecnologa adecuada a las necesidades de la uva en ese ao, como por ejemplo, el enfriar las uvas. Sin embargo, la tcnica ms adecuada es escoger el momento del da o de la noche en que la temperatura es ms baja, sobre todo, en la vendimia mecnica. Si no es posible se puede recurrir a sistemas como gas inerte o productos estabilizantes con el fin de que la uva llegue sin contaminacin microbiana a la bodega para su posterior inicio de fermentacin en los depsitos. 3.- Recepcin en bodega y toma de muestras.- Al llegar a la bodega se extraer una muestra representativa del conjunto de cajas o del remolque para cada entrada de uvas. El enlogo o tcnico responsable ser quien determine, despus de analizar la uva, al depsito que va a ir destinado para su fermentacin, ya que puede desviar dependiendo del estado sanitario de la uva u otros criterios a distintos depsitos de fermentacin. 4. La extraccin del mosto.- El sistema ideal de obtencin del mosto sera someter a la uva a presiones moderadas y pequeas durante tiempos determinados y en funcin de los rendimientos de la uva en ese ao. Adems, con el menor roce posible entre las partes slidas del racimo (hollejos, orujos, raspn,) con las superficies de presin. Para obtener el mosto se ha de trabajar en un equilibrio que nos permita conseguir los aromas agradables, sin extraer los herbceos (hexanol y aldehdos C6). Es decir, disponer de sistemas que favorezcan nicamente los intercambios positivos entre zumo y partes slidas. La mejor obtencin del mosto se consigue combinando la rotura mecnica de la pared celular con la degradacin enzimtica. Para respetar la calidad de la primera fraccin del "mosto flor" se han de vinificar por separado, ya que los mostos obtenidos de las ltimas fracciones del prensado originarn vinos ms bastos, con ms polifenoles, mayores notas herbceas, as como un contenido ms bajo de acidez total. Esta vinificacin se har por salificacin parcial del tartrico con el potasio del escobajo y un aumento en coloides (polisacridos y protenas). El sistema mecnico para obtener el mosto flor se consigue a travs de una estrujadora de rodillos de caucho o de prensas neumticas de membranas. Estas ltimas consiguen mejores resultados en la calidad del mosto.

37

5. Esquema del sistema de obtencin del mosto .- Veamos los pasos a seguir para la obtencin del mosto. A) Tolva de recepcin: las hay en acero inoxidable, asimtricas, con dimetro y paso de sinfn grande o con motovariador de velocidad. Es aconsejable poca longitud del sinfn ya que a menor vueltas y longitud, menor rozamiento y por tanto mayor calidad. B) Despalilladoras Horizontales: las hay en acero inoxidable con rotacin del tambor y eje en sentido contrario. stos con el menor nmero de aristas posible (superficie redonda). Preparadas con motovariador de velocidad, con el fin de poder regular el menor nmero de vueltas, en el cual el raspn sale limpio, lo que lleva consigo una menor lesin al raspn, hollejos, etc. Tienen que estar preparadas para despalillar en el porcentaje deseado. C) Estrujado: el estrujado tiene como fin romper los hollejos y desprender la pulpa. El estrujado debe ser el suficiente como para facilitar la separacin del zumo, pero no debe ser violento con el fin de no desgarrar y dilacerar las partes slidas. Las estrujadoras de rodillos de caucho son las ms recomendadas. La ventaja del no estrujado es la de producir un mosto que contiene pocos fangos ya que elimina toda trituracin de la vendimia y es menos sensible a la oxidacin porque es menos rico en polifenoloxidasas. Esta ventaja slo se manifiesta cuando el prensado se hace correctamente, es decir, lentamente y con presin progresiva. D) Bomba de vendimia: se recomiendan dos tipos de bombas por el comportamiento respecto al buen trato que dan a la pasta y son: -Peristticas: tienen bastante capacidad (dan altura o presin); la pasta no tiene ningn rozamiento. Sin embargo, su mantenimiento es muy costoso. -De leva excntrica: menor altura manomtrica, rozamiento tangencial, no eleva lquidos, pero necesita poco mantenimiento y tiene un menor precio. E) Escurridores o Patines: su misin es separar el zumo liberado por el estrujado e interviene inmediatamente despus de esta operacin. Se distinguen dos escurridos: -Esttico: se efecta por simple reposo de la vendimia estrujada. -Mecnico: es el ms rpido. Cuando se trabaja con grandes volmenes de vendimia este sistema permite obtener mostos sin excesivo fango y facilita el prensado por la hidrlisis de las pectinas. Sin embargo, provoca un aumento de la oxidacin de los mostos, por los que es ms conveniente utilizar el sistema esttico. Los hay con cilindro giratorio y con sinfn inclinado que conduce la vendimia estrujada por una especie de canaln perforado. En estas instalaciones el escurridor se coloca bajo la estrujadora y se alimenta directamente por gravedad. F) Prensado: su misin es extraer el mosto por medio de la presin ejercida sobre la vendimia una vez estrujada y escurrida. Con ello se consigue la desecacin del hollejo. Para este trabajo se pueden utilizar diferentes mquinas prensadoras: - Prensas horizontales: trabajan por rotacin y acercamiento de dos platos mviles. Tiene unos programadores que modifican la velocidad del prensado y lo detienen

38

cuando alcanzan una determinada desmenuzado de los orujos.

presin,

procediendo

automticamente

al

- Prensas neumticas: trabajan por medio de inflamiento de una bolsa axial interior de caucho grueso. La bolsa oprime la vendimia contra la jaula cilndrica de acero inoxidable. El inflamiento se efecta por medio de un compresor de aire. El prensado se consigue por los presin que libera el pastel de los orujos y por la rotacin de la jaula de acero. Son las ms utilizadas para la obtencin de mostos de calidad. - Prensas continuas: trabajan a travs de un sinfn helicoidal o tornillo de Arqumedes que empuja a los orujos formando un espeso tapn contra un obturador mvil provisto de contrapesos. Las prensas continuas poseen un husillo de gran dimetro que tiene rotacin lenta y un sistema de regulacin automtica de presin. Disponen de distintas salidas de mosto que aseguran el fraccionamiento segn la calidad. Aunque la extraccin del mosto es muy rpida, es un prensado violento y hace una trituracin excesiva de los orujos. La mejor cadena de trabajo es siempre la ms corta, aquella que trasforma la uva en mosto en un tiempo mnimo, la que proporciona un mosto menos turbio y menos sensible a la oxidacin. 6. Maceraciones prefermentarias.- La maceracin prefermentaria, tambin conocida con el nombre ms comn de maceracin pelicular, es un sistema utilizado en algunas regiones vitivincolas como prctica de elaboracin de caldos en un sistema tradicional. Pero, paralelamente a la extraccin de aromas, el mosto se enriquece en sustancias astringentes y desagradables, potencialmente peligrosas para la evolucin del vino, como polifenoles que aceleran el pardeamiento. Una prctica muy utilizada es la maceracin a baja temperatura durante un tiempo corto, en funcin de las caractersticas varietales. Cuando se realiza una maceracin pelicular podemos obtener unos resultados muy satisfactorios que son:

- En mosto macerado aumenta la densidad y el grado Brix.- La acidez total se mantiene o eleva ligeramente, mientras que el pH aumenta conforme lo hacen los tiempos de maceracin. Los tiempos de maceracin breves ( 4 y 6 horas ) presentan un efecto poco significativo con respecto a los no macerados, por lo que es conveniente alargar los tiempos de maceracin de 9 a 12 horas para obtener un aumento de componentes aromticos y tener mejor estructura en boca. - Cuando no hay posibilidad de bajar las temperaturas y se quiere realizar una maceracin pelicular se puede recurrir al empleo de preparados enzimticos de calidad que acortan los tiempos de maceracin. 7. Correccin del mosto.- Una vez obtenido el mosto, haya o no maceracin prefermentativas, hemos de adicionar anhdrido sulfuroso lo antes posible. En cuanto el mosto se separa, por escurrido o prensado, aumenta la acidez con la adicin de cido tartrico hasta niveles de 5 - 5, 5 gr/l (expresado en cido tartrico), lo que confiere al mosto y despus al vino una cierta estabilidad biolgica. Esta operacin es ms aconsejable realizarla tras el desfangado. El anhdrido sulfuroso ejerce una serie de acciones importantes; como son: - Antimicrobiana frente a levaduras y bacterias. - Solubilizante de antocianos (en elaboracin de vinos tintos). - Accin antioxidante. - Antioxidsica, inactivando enzimas polifenolixidsicas.
39

Antiguamente el sulfatado de la vendimia era determinado en funcin del estado sanitario de las uvas, de la temperatura y del pH de los mostos. En la actualidad se tiende a disminuir la dosis de SO2 en vendimia, ya que se controla la obtencin de uvas sanas, y una rigurosa higiene en todo el proceso y materiales utilizados. Por el contrario, nunca se debe de sulfatar la vendimia ya estrujada puesto que es una operacin menos eficaz, ya que al anhdrido sulfuroso forma combinaciones estables con los compuestos con grupos carbonlicos C=O que se generan durante la fermentacin: Etanal, cido pirvico, cido 2-cetoglutrico, cido glioxlico, cido oxalactico, con lo cual disminuye notablemente el SO2 libre que es el que ejerce la funcin de proteccin en el mosto. Controlando la adiccin de sulfuroso al mosto se podr utilizar una cantidad mucho menor en el vino para conseguir la mismo cantidad de sulfuroso libre. La dosis necesaria de anhdrido sulfuroso puede variar de 6 a 12 g por Hl. Estas consideraciones son para vinos de calidad obtenidos a partir de mosto flor, ya que en vinos de prensa exigen por su distinta composicin mayor cantidad de sulfuroso. 8. Separacin de fangos.- Los fangos estn constituidos por residuos terrosos, fragmentos de raspones y hollejos, sustancias ppticas y mucilaginosas, en fin, protenas precipitadas por contactos establecidos con sustancias localizadas en puntos diferentes de los granos de las uvas. La cantidad y naturaleza de los fangos depende de la uva, de su estado de maduracin y podredumbre, y de la tcnica de obtencin del mosto. 9. Comportamiento fermentativo.- Como se ha explicado anteriormente la clarificacin de los mostos blancos es imprescindible para la obtencin de buenos vinos, pero el desfangado puede originar una serie de riesgos que el enlogo puede solventar con ayuda de coadyuvantes de fermentacin especficos para cada proceso. Una vez ajustada la dosis de activadores al mosto, realizamos una siembra de levaduras seleccionadas, lo cual nos encontramos en las ltimas operaciones prefermentativas. En los "Estudios sobre el vino " PASTEUR escribi que "Las cualidades del vino dependen en gran parte de la naturaleza especfica de las levaduras que se desarrollan durante la fermentacin de los mostos". As, podemos pensar que, al someter a un mismo mosto a la accin de levaduras distintas se lograrn vinos de distinta naturaleza. La garanta que tiene el enlogo al utilizar las levaduras secas seleccionadas es que le permite un buen manejo, tienen dificultad para su contaminacin y la inoculacin de una alta poblacin viable. Una vez trascurridos estos procesos, lo ponemos a fermentar en tanque o depsitos de acero inoxidable que pueden variar en su capacidad de volumen, pero siendo ms aconsejable depsitos con capacidades ms reducidas, es decir, 5000 l a 50.000 l. Estos depsitos tienen que estar preparados con camisas de fro a diferentes alturas para que as el depsito est uniformemente repartido en las frigoras . Tambin se pueden utilizar camisas interiores para depsitos que no hay posibilidad de acondicionar exteriormente. La temperatura de fermentacin ser variable en funcin de las distintas variedades, pero siempre es aconsejable una temperatura entre 15-20 C. Si bajamos la temperatura de fermentacin se repentizar varios das ms su terminacin, pero siempre obtendremos mejores aromas a bajas temperaturas. Este proceso durar aproximadamente unos 15 a 20 das hasta en final de la fermentacin alcohlica.

40

10. La fermentacin en la barrica.- La funcin principal de la fermentacin de mostos en barrica es la obtencin de vinos ms estructurados y elegantes con matices de madera que armonizan en boca su cata. Se realiza el llenado de las barricas con mosto blanco sin terminar su llenado para evitar que se derrame en la fermentacin ms tumultuosa. En algunas regiones vitivincolas el llenado de las barricas se realiza cuando el mosto ha descendido su densidad entre 1000-1010, fermentado en una primera fase en depsito para evitar que se produzcan derrames en las barricas. Por ello, una vez que ha pasado esta fase se termina su fermentacin en barrica y su posterior crianza sobre las finas. Existen otras alternativas a las barricas, que ya se estn utilizando en algunos pases con una reducida tradicin vitivincola, y se conoce con el nombre de Inserstave. Este sistema utiliza en el interior del depsito de acero inoxidable unas tablas de madera de roble francs o americano que tienen el mismo tratamiento que la madera utilizada para la construccin de barricas, y que se colocan con una estructura de acero inoxidable dentro del depsito, realizando las mismas condiciones que aporta la barrica con ayuda de un aparato microoxigenador. Con la utilizacin de este sistema podemos fermentar el mosto desde el inicio hasta el final de la fermentacin alcohlica, controlando la temperatura y su posterior crianza sobre las finas. En la regin vitivincola de La Borgoa tienen mucha tradicin los vinos blancos fermentados en barricas de roble francs. 11. Acabado de la fermentacin alcohlica.- Si la marcha de la fermentacin alcohlica est bien definida por la toma de densidad, el densmetro no basta para decidir sobre el final de la transformacin de todo el azcar contenido en el mosto en alcohol. Para ello, hay que recurrir a anlisis qumicos y averiguar los azcares reductores que hay en el medio. En algunas bodegas realizan la prctica de interrumpir la fermentacin alcohlica al final de su proceso para as, obtener vinos dulces o semidulces, es decir, con 15 20 gramos de azcares reductores en el medio. Una vez terminada la fermentacin alcohlica se proceder a una segunda fermentacin, si es necesaria, llamada fermentacin malolctica, que se realiza sobre todo en vinos con un contenido cido mlico muy alto. Esta fermentacin se realiza para conseguir la transformacin del cido mlico en lctico. El resultado de estos vinos es muy bueno ya que los suaviza de esa acidez tan marcada que tenan los vinos al trmino de la fermentacin alcohlica. Si el vino no es apto para la fermentacin malolctica se proceder a un trasiego inmediato con un aporte de sulfuroso de 4 a 6 gr/ Hl, de tal manera que la dosis de anhdrido sulfuroso libre despus de la combinacin sea del orden de 20 a 30 mg por litro. Si el contacto con la la en depsitos grandes es muy prolongado aparecern los olores a sulfhdrico (a huevo podrido).

41

Clarificacin del vino.El gusto de los consumidores del vino se ha ido desplazando cada vez mas hacia los vinos jvenes y frescos. En la actualidad se prefieren vinos brillosos y claros, completamente resistentes al aire. El enturbiamiento del vino se puede eliminar por: clarificacin, filtracin y centrifugacin. Los tres procedimiento son eficaces proporcionando buenos resultados si se utilizan correctamente. El vino se puede clarificar con tierra de Espaa o caoln. Estas se utilizan para clarificar los vinos dulces y para el tratamiento del vino viscoso en dosis de 100 a 4000 gr., por hectolitro ( 100-400 gr / Hl). La tierra de Espaa o Caoln es el silicato de aluminio hidratado y es un producto que se obtiene de las ricas feldespatiferas. A).- Bentonita. Clarifica los enturbiamientos por precipitacin de albminas con materias de tipo de Caoln, la bentonita es un complejo de silicato de aluminio, Mg, Ca, , de origen volcnico. De acuerdo a la intensidad del enturbiamiento las necesidades del bentonita son: Enturbiamiento dbil, igual de 50 a 100 gr./Hl . Enturbiamiento medio de 100 200 gr / Hl Enturbiamiento intenso de 200 400 gr de bentonita /Hl B).- Carbn Activado.Es el carbn vegetal ( de madera) y carbn animal (de hueso). El carbn activo se utiliza para decolorar los vinos y baja la concentracin del sabor y color. El vino de matiz amarillento obscuros se utiliza una cantidad de 10 a 15 gr/Hl para decolorar vinos pardos se emplea de 15 a 30 gr/Hl . Composicin del zumo de uva.-

a) H2O 750-850 g/l

b) Contenido de azcar 120g/l (glucosa, fructosa y sacarosa). c) cidos: -cido tartrico. - cido mlico. cido ctrico. d) sustancias minerales. Fosfato de potasio, calcio, magnesio, cloruros, sulfatos y silicatos. e) Sustancias nitrogenadas. - Protenas (albminas y globulina) pentosas y aminocidos. f) Taninos y minerales colorantes. - antocianonas, enina. g) aceites, grasas y ceras - Vitina. h) fermentos. -(enzima) oxidasas. i) Sustancias responsables del color, sabor y aroma, aceites especiales.

42

ESPECIFICACIONES DEL VINO MXIMO Grado alcohlico GL real a 15 C Extracto seco reducido Cenizas g/l Acidez total (como cido tartarico g/l) (Como cido actico ) acidez fija (como cido tartarico g/l) metanol mg/100 ml de alcohol 100 % bixido de azufre total mg/l

MINIMO 9.0 15 1.0 4.5 4.0 300 300 14 10 1.2

Caractersticas fisicoqumicas de los vinos de acuerdo a las normas mexicanas NOM.1991.

43

UNIDAD 6.- FERMENTACIN LCTICA CARACTERSTICAS GENERALES, ETAPAS Y REACCIONES QUMICAS DE LA FERMENTACIN LCTICA. INTRODUCCIN. Los lactobacillus, son bacterias que utilizan la fermentacin lctica para obtener energa; estos organismos transforman la lactosa de la leche en glucosa y posteriormente en cido lctico. Este proceso tiene importancia industrial ya que se utiliza en la fabricacin de yogurt. El cido lctico tambin lo podemos producir en nuestro cuerpo. Un ejemplo es la acumulacin de cido lctico en tejidos humanos, lo podemos apreciar despus de un ejercicio intenso, el cido lctico se acumula en las clulas musculares provocando dolor, el cual va desapareciendo poco a poco, conforme el cido lctico pasa a la circulacin sangunea y llega al hgado donde se transforma nuevamente en cido pirvico. El cido lctico se produce en muchas bacterias (bacterias lcticas), tambin en algunos protozoos y en el msculo esqueltico humano. Es responsable de la produccin de productos lcteos acidificados ---> yoghurt, quesos, cuajada, crema cida, etc. El cido lctico tiene excelentes propiedades conservantes de los alimentos. Historia.El alcohol lctico fue descubierto por Schell en 1780. Despus de haber examinado muy detalladamente los resultados de anteriores investigadores y sus deducciones, Luis Pasteur lleg a conclusiones completamente diferentes. Sus ltimos trabajos le permitieron establecer que existe una levadura lctica que est siempre presente cuando hay transformacin de azcar en cido lctico, especialmente en una materia azoada, elemento indispensable para el desarrollo de una fermentacin. Pasteur observaba que en la fermentacin lctica se poda ver a menudo, en la parte superior, un depsito de cal y materia azoada, formado por unas manchas de sustancia gris en suspensin que se distingua perfectamente del resto. Pensaba que esa materia gris desempeaba un papel importante, lo que le llev a separar la levadura de su parte soluble, mantenindola en el punto de ebullicin con aproximadamente 1/5 de su peso en agua. Luego, disolvi nuevamente en esa solucin unos cien gramos de azcar por litro, filtrndolo con mucho cuidado. La solucin se mantena en una estufa a una temperatura de 30 a 35 grados. Hizo pasar una corriente de cido carbnico por el frasco para eliminar el aire y aproximadamente 24 horas despus se produjo un cambio: el lquido se agit y la cal desapareci, formndose un depsito que aumentaba sin cesar.

44

Segn los trabajos de Pasteur, es evidente que la levadura lctica proviene de la atmsfera. Si se suprime todo contacto con el aire o se pone en ebullicin el medio sinttico (creado por el cientfico y donde haba azcar, sal de amoniaco, fosfato y cal), dejando entrar aire que atraviesa un conductor calentado al rojo vivo, no se desarrolla ninguna levadura ni organismo vivo. Para este experimento, Pasteur haba creado un medio artificial que poda ser reproducido en su totalidad, eliminando de ese modo numerosas causas de errores. Hoy en da, la diferencia de medios -medios controlados-, todava se utilizan de forma habitual en todos los laboratorios de biologa, qumica-biologa y microbiologa. De 1857 a 1862, Luis Pasteur estudi las fermentaciones lctica y alcohlica demostrando que: 1.-Toda fermentacin es debida a la presencia de un microorganismo; a cada fermentacin le corresponde un fermento particular. 2.- De igual modo, constat que para estudiar una fermentacin haba que preparar un medio de cultivo apropiado al fermento y estril; sembrar ese medio con una traza de fermento puro. La fermentacin lctica es utilizada por numerosos microorganismos, as como por organismos superiores cuando el oxgeno est limitado (por ejemplo en el msculo, durante una actividad intensa). Conduce a la formacin del cido lctico, interviniendo en la produccin de quesos, yogures, etc. MICROORGANISMOS CIDO LCTICOS. Las bacterias lcticas son cocos y bacilos de longitud variable y de un grosor de 0,5-0,8 micrmetros. Se trata de un grupo de bacteria fisiolgicamente uniforme, de pared Gram-positiva, que slo utilizan sus substratos, predominantemente azcares, de manera fermentativa con formacin de cido lctico. Carecen de actividad respiratoria porque les falta una enzima (citocromo catalasa) que contenga un grupo hemina, que les permita poner en marcha cadena respiratorias con el oxgeno como aceptor de electrones A pesar de su metabolismo anaerobio, son aerotolerantes, en los medios de cultivo slidos forman colonias en presencia aire Otra caracterstica importante son sus complejas necesidades de nutrientes. Ninguna bacteria lctica crece en un medio constituido exclusivamente por sales minerales, azcar y sales amnicas como nica fuente de nitrgeno. La mayora necesita distintas vitaminas del grupo B (lactoflavina, tiamina, biotina, cido nicotnico, cido pantotnico, cido flico) y varios aminocidos. Como su crecimiento disminuye linealmente en condiciones estndar en funcin de la concentracin del nutriente presente en concentraciones subptimas, desde hace tiempo se cultivan para realizar ensayos microbianos especficos y sensibles a la presencia de pequeas cantidades de vitaminas o aminocidos en los alimentos. Por ello se cultivan en medios complejos con abundante extracto de levadura, zumo de tomate o lactosuero.

45

Debido a sus requerimientos nutricionales complejos y a su metabolismo anaerobio se encuentran de manera espontnea principalmente en tres lugares: En la leche y productos lcteos, en plantas intactas o trasplantadas y tambin en el intestino y mucosas de los animales y del hombre, donde se encuentran como: simbiontes, adventicias o patgenas. Debido a que sintetizan intensamente cido lctico y a su tolerancia a la acidez (pH 4-5), en medios adecuados se imponen rpidamente a otros microorganismos con lo que se consigue fcilmente su enriquecimiento. Para conseguir un mejor crecimiento durante su cultivo conviene detener la produccin de cido aadiendo carbonato calcio. Hay un gran grupo de bacterias que incluyen las que fermentan los azcares a cido lctico preferentemente, es decir, un 90 % o ms. Estas bacterias lcticas que en la fermentacin originan un nico producto se engloban bajo el nombre de homofermentativas Existe, adems otro grupo fisiolgico formado principalmente por especies de Lactobacillus que como productos de la fermentacin originan un 50 % de cido lctico y un 30 % de cido actico o etanol y un 17 % de CO2 estas especies productoras de gas se denominan bacterias lcticas heterofermentativas. Como consecuencia de sus caractersticas morfolgicas ya no se incluyen todas las bacterias lcticas en la familia Lactobacillaceae. Los cocos constituyen su propia familia la de estreptococaceae, mientras que la especie Sporolactobacillus inulinus que forma endospora termorresistentes, al igual que las especies del gnero Bacillus se encuadra en la familia Bacillaceae Las bacterias lcticas homofermentativas, es decir, las especies del gnero Streptolactobacillus y una parte de las especies de los gneros lactobacilus y Sporolactobacillus degradan la glucosa cido pirvico por la ruta de la fructosa bifosfato, de manera anloga a las levaduras del vino y la cerveza. RUTAS METABLICAS. En la unidad denominada Fermentacin Alcohlica, hemos detallado la ruta de la gliclisis. El piruvato (o molculas derivadas del piruvato) se encuentra disponible luego del proceso de gliclisis. Glucosa + 2ADP cido piruvico + NADH + H+ cido lctico + NAD+

46

Como no poseen piruvato descarboxilasa, transfieren el hidrgeno formado por accin de la fosfotriosa-deshidrogenasa a cido pirvico con ayuda de nicotinamida-adenin dinucletido (NAD) y lo transforman as en cido lctico.

Rendimiento energtico de la fermentacin lctica.Si comparamos el rendimiento de la fermentacin lctica con respecto a la alcohlica, observamos que la fermentacin lctica es mucho ms eficiente a condiciones estndares. Debido a que se requiere mecho menor energa para la formacin de cido lctico. FERMENTACIN LCTICA C6H1206 + 2ADP + 2Pi FERMENTACIN ALCOHLICA C6H1206 + 2ADP + 2Pi

2C3H603 + 2ATP + 2H2O DG0' = - 47 kcal/mol Rendimiento energtico (cond. estndar): (14.6/47.0)x100 = 31%

2C2H50H + 2ATP + 2CO2 DG0' = - 56.3 kcal/mol Rendimiento energtico (cond. estndar): (14.6/56)x100 = 26%

La enzima lactato-deshidrogenasa, que reduce el cido pirvico a cido, tiene una estereoespecificidad distinta segn la especie bacteriana. Por ello algunas bacterias slo forman cido lctico dextrorrotatorio [D-(-)] y otras, por el contrario, levorrotatorio[L-(+)]. Hay bacterias que sintetizan adems la enzima lactato-racemasa que lleva a cabo la interconversin de las dos formas pticamente activas. En presencia de oxgeno, tambin en las bacterias homofermentativas una pequea parte del cido pirvico (menos del 10 %) se descarboxila con liberacin de C02, transformndose en cido actico, etanol o acetona dependiendo de la especie. Como las especies heterofermentativas de Laciobacillus no sintetizan ni aldolasa ni triosafosfatoisomerasa no pueden llevar a cabo la degradacin preliminar de los azcares
47

siguiendo la ruta de la fructosa bisfosfato, como hacen las bacterias hornofermentativas. Se realiza, por el contrario, por la ruta de las pentosas-fosfato (PP), que es comn a la mayora de las bacterias. En ella, la glucosa se transforma en pentosa, que se escinde a acetato y fosfogliceraldehdo.

Esquema de la heterofermentacin cido lctica. La glucosa se transforma en glucosa-6-fosfato con la ayuda del ATP y se oxida a cido fosfoglucnico gracias a la glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa. La 6-fosfogluconatodeshidrogesa hidroliza el C, del grupo carboxlico del cido 6-fosfogliicnico, formndose ribulosa-5-fosfato Y C02, el primer producto de la fermentacin. Una epimerasa transpone los ligandos -H y -OH del C3 de la ribulosa, formndose xilulosa-5-fosfato. Este azcar ser escindido a acetilfosfato y gliceraldehdo-3-fosfato por la fosfopentosacetolasa con ayuda del coenzima tiaminopirofosfato (TPP) por adicin de un anin fosfato (Pi). El enlace fosfato rico en energa del acetilfosfato se transfiere al adenosindifosfato con formacin de ATP. Se libera as cido actico como segundo producto de la
48

fermentacin, que, a su vez, puede ser reducido a etanol por distintas especies gracias a una aldehdo alcohol-deshidrogenasa con la ayuda del NADH2- Como en las bacterias homofermentativas, el gliceraldehdo-3-fosfato se transforma por el contrario, siguiendo la ruta de la fructosabisfosifato, en cido pirvico, por deshidrogenacin y con formacin de 2 moles de ATP va 1,3-difosfoglicerato y fosfoenolpiruvato El cido pirvco por accin de una lactato deshidrogenasa y del NADH2 se reduce tambin a cido lctico. De este modo, algunas bacterias lcticas heterofermentativas pueden reducir a glicerina parte del gliceraldehdo formado durante la degradacin del azcar. Las cepas que fermentan la fructosa reducen tambien as en parte la fructosa con formacin de manita . por ello muchas bacterias lcticas pueden formar 5 6 productos de fermentacin: cido lctico, etanol, cido actico, CO2, glicerina y manita.-. Para obtener cido lctico puro por un proceso microbiolgico, que es mas rentable que la sntesis qumica se emplean nicamente bacterias homofermentativas porque al no producir metabolitos secundarios, permiten unos rendimientos mayores. Leches y hortalizas fermentadas. Diferentes tipo de productos elaboradas a base de leche fermentada.La acidificacin de la nata es uno de los procesos ms importantes para la elaboracin de mantequilla de nata cida. La crema se incula por cultivos constituidos por una mezcla de :

45 % Streptococcus cremoris y S.lactis. 10% Leuconostoc cremoris.

Adems de los productos de la fermentacin del cido lctico, cuando se utilizan los dos ltimos microorganismos en la acidificacin de la nata de forma diacetilo, que confiere el deseado aroma a mantequilla. Se origina va cido pirvico, metabolito intermediario de la fermentacin. O OH CO2 H2O

H3C C CH3

H3C-C-COCH3

H3C-CO-CO-

HOOC CH3CHO cido Pirvico

COOH cido a-acetil-lctico

O2

diacetilo

49

Con Leuconostic cremoris se degrada tambin el cido ctrico de la leche, va cido oxalactico, a cido pirvico y este a diacetilo: Los iniciadores acidificantes.Se obtienen por acidificacin natural de la leche sin Pasteurizar. La leche fresca sin pasteurizar se inocula con leche acidificada espontneamente. Despus de repetir varas veces este proceso, se habr desarrollado por enriquecimiento especfico en bacterias lcticas un cultivo iniciador cuya composicin es la ya citada. Su crecimiento posterior en leche que haya sido pasteurizada durante 1 hora a 85 'C tiene lugar en unas 18 horas si la temperatura es de 21 C ,hasta que la cantidad de cido formada sea equivalente a un hidrxido sdico 0,1 M. Despus de eliminar la capa de nata, esta leche se emplea para acidificar cantidades mayores y finalmente se aade en una proporcin que suponga el 3-4 % del volumen total del tanque de crema una vez llenado con crema fresca. Estos tanques de maduracin de la crema son rectangulares y tienen doble pared y fondo hemiesfrico para recoger el lquido. La acidificacin de la crema tarda de 16 a 30 horas. Los tanques de maduracin se mantienen a 18-20 C durante 3-4 horas hasta el espesamiento de la crema, es decir, hasta la coagulacin de las protenas de la leche. Despus se deja que prosiga la acidificacin a 12-14 C, hasta que se consigue un pH de 5.0 aproximadamente. Durante el proceso se agita la crema con frecuencia con el fin de proporcionar el oxgeno necesario para la sntesis del diacetilo. A temperaturas ms altas, la formacin de aroma es insuficiente y la grasa demasiado fluida como para hacer mantequilla. La crema madurada se pasa a la batidora donde se bate hasta que se forma la mantequilla. Adems de grasa, puesto que se trata de una emulsin plstica, la mantequilla contiene un 13-16 % de agua y tambin las sales, protenas lcteas y productos del metabolismo de las bacterias lcticas. El residuo lquido que separa es la mazada. Contiene casi la totalidad de las bacterias de los gneros Estreptococos y Leuconostoc. El Yogur. Obtenido originariamente en los Balcanes a partir de leche de oveja o de cabra, se elabora hoy sobre todo a partir de leche de vaca. Esta leche se pasteuriza a 85 'C, se enfra a 50 'C y se inocula con un cultivo mixto de Lactobacillus bulgaricus Streptococcus thermophilus. Ambas especies bacterianas necesitan calor, se desarrollan ptimamente a 40 'C y no crecen por debajo de 15 'C. La leche inoculada se pasa a los envases en los que vaya a ser comercializada y se incuba a 40 'C durante 9-12 horas hasta su coagulacin y hasta que tenga un contenido de cido lctico del 1.0 1.5 %. Despus se enfra inmediatamente y se conserva en sitio fro hasta el momento de su venta, para

50

impedir una acidificacin excesiva. L. bulgaricus proporciona el aroma caracterstico, S. thermophilus el sabor fresco y cido de este tipo de leche cuajada. El Kefir. Es una bebida de leche cida de origen caucsico, que tambin se encuentra a la venta frecuentemente, el kefir adems de las bacterias lcticas contiene levaduras que fermentan el azcar, en una menor proporcin, a alcohol Y C02. Esta acidificacin y fermentacin alcohlica simultneas tienen lugar a 20 'C y duran unas 24 horas. El kefir, ya fabricado contendr 1,0-1,5 % de cido, 0,25 % de alcohol y C02 disuelto. El inoculo lo constituyen los granos de kefir, que se emplean tambin para uso domstico. Estn formados por protenas lcteas coaguladas, slidas, que contienen un cultivo mixto de las siguientes bacterias y levaduras: Lactobacillus (caucasicus), L. caseina, L. plantarum Leuconostoc cremoris y algunas levaduras fermentadoras de la lactosa (Torulopsis spp., Saccharomyces fragilis). Los granos de kefir pueden conservarse secos durante muchos aos. Antes de su utilizacin hay que reactivarlos por maceracin. Al final de la fermentacin se extraen los granos, que habrn crecido como consecuencia de la coagulacin de ms protenas, y podrn volver a emplearse inmediatamente o ms tarde, despus de su desecacin. El Queso. Se obtiene por degradacin microbiana ms o menos intensa de los componentes de la leche . Se coagula la Casena por fermentacin lctica y dependiendo de si la casena sufra o no una maduracin microbiana se diferencian los quesos en: Madurados y Frescos. La consistencia y sabor de los madurados estn influenciados por : El contenido graso. Tipo de coagulacin de la casena. Aditivos. Tratamiento con bacterias y mohos y especie a la que pertenezcan.

Por combinacin de estos factores pueden obtenerse numerosos tipos distintos de queso. Ajustando el contenido graso de la leche de partida se obtendrn quesos que en base a esto se clasifican en:

QUESOS

CONTENIDO EN GRASA

51

Doble crema Crema Super graso Graso Semigraso Poco graso Magros

60 % 50 % 45% 40 % 20 % 10 % menos del 10 %.

Para la coagulacin se emplea Quimosina o Renina que se obtiene del estomago de los terneros como proenzima inactiva y se activa con cido clorhdrico a pH 5.3. Enzima inactiva HCl Enzima activada

Casena lctea (Solucin coloidal paracaseinato insoluble) Quesos Frescos.

Paracasenato clcico

En estos no hay maduracin despus de la coagulacin de la casena o la hay en muy pequea proporcin (ver fig. 11). Todos tiene un sabor suave, dbilmente cido por que todava no hay degradacin microbiana de las protenas y de los lpidos. A. Queso blanco B. Queso en capas y C. Queso crema fresco. A.- Queso blanco.- Se obtiene como cuajada cida por precipitacin a partir de Leche cida y cuajada enzimtica ( fermento lab.) mayoritariamente. B.- Queso en capas.- Contiene una capa intermedia algo ms grasa. C.- Queso Crema y doble crema.- A partir de leche entera a la que se le aade crema. Quesos madurados.- se obtienen por: 1) Fermentacin cido lctica de cuajada cida 2) Precipitacin con Fermento lab. De cuajada enzimtica . Quesos de leche cida.- Son quesos magros que se obtienen por degradacin microbiana progresiva de la cuajada cida. Entre estos se encuentran los tipos:

52

Haserkse Karbkse Stangekise Quesos de hierbas Quesos con mohos. Fuente C (c.lctico)

MADURACIN c.grasos y compuestos voltiles

PARACASENA

Albumosa , a.a., aminas peptonas,

Degradacin Bacteriana Bacterias lcticas: Lactobacillus casei, L.helveticus, Streptococcus lactis y S:cremoris y participan a dems Micrococcus caseolyticus y Arthrobacter sp. Los quesos de leche cida, se condimentan, salan y conforman de acuerdo con el tipo al que pertenezcan y se almacenan en un lugar hmedo durante la maduracin. Quesos con fermento lab.- Se realizan con leche acidificada dbilmente y sin cuajar, se le aaden de 1-2 % ( en volumen ) de cultivo de bacterias lcticas y fermento Lab en forma de polvo o liquido. La coagulacin de la leche va ha ser mayor cuanto ms elevada sea la temperatura. Quesos blandos Coagulan 18 22 C. Quesos duros Coagulan 31 33 C.

Si la coagulacin es lenta por la ausencia de calcio, se le puede CaCl2 a la leche. Despus de la cuajada el queso s e calienta varias horas hasta alcanzar los 54 55 C. Para eliminar las levaduras y mohos de la leche . En el suero quedan : Lactato, albmina, lactosa y sales minerales. Quesos blandos . Despus de la coagulacin se les da forma prensndolos nicamente entre tablas ajustables, en estos hay una degradacin de la masa del interior y exterior hacia el centro, determinando especialmente la maduracin externas el carcter del queso (ver fig. 11). Los quesos blandos pueden ser:

53

1) Madurados con mohos. 2) Madurados sin hongos. Dentro de los madurados con mohos se encuentran los madurados con: Camembert y Brie que son madurados con Moho blanco, se inoculan con Penicillium camemberti y Endomyces sp. Roquefort, Bavaro azul que son madurados con moho azul , y se inoculan con Penicillium roqueforti. La maduracin del queso fresco se realiza espolvorendolo con migas de pan invadido por el moho. Quesos Duros. Se prensan envueltos en paos a presiones hasta de 20 bar. hay una maduracin homognea de toda la masa , dentro de los ms importantes estn: Tilsit.- Es semiduro , flexible, 4-5 kg., con ojos repartidos y recubierto de una capa pegajosa amarilla rojiza. Edam .- Grande redondo amarillo dorado, graso, semiduro, ojos escasos pequeos y redondos, corteza roja recubierta de parafina. Emmental o suizos.- Son duros, grandes hasta de unos 100 cm. de dimetro y unos 40 kg. de peso, grasos con grandes ojos y aroma caracterstico. Cheddar.- La cuajada debe de acidificarse antes de proseguir su elaboracin. Chester.- Son elaborados a partir de leche dulce y estn recubiertos con cera. Parmesano.- Tambin se acidifica la leche, con textura granulosa y dura y ojos pequeos y escasos. La maduracin se lleva a cabo en dos etapas , premaduracin y maduracin principal (ver fig.).

PREMADURACIN A).- Leche cida.Lactosa residual cido lctico, cido actico acetona y diacetilo Bacterias lcticas y Estreptococos proteolisis.

B).- Fermentacin enzimtica.-

54

Lactosa y Lactato clcico .

glucosa

cido + cido + CO2 propionico actico

Propionibacterium freudenreichii P. cidi- propionici P. jensennii El CO2 liberado forma los agujeros caractersticos de los quesos duros, los ojos. Maduracin principal.Adems de la fermentacin a cido propionico termina la degradacin de la Casena y el desarrollo del aroma. Su degradacin y transformacin conducen ala formacin de : Cetoacidos Oxiacidos Ac. Grasos sencillos Esteres de cidos grasos

Existen otros muchos productos tradicionales de leche cida originarios del medio y lejano Oriente, a los que no podemos referirnos aqu con ms detalle (por ejemplo dahi, kumiss, leben, kurunga). Se obtienen a partir de la leche de distintos animales domsticos y de inculos de diversa composicin.

55

56

Elaboracin de queso de fermentacin lctica (queso de untar).

Objetivo.- Que el alumno aprenda la elaboracin de queso de fermentacin lctica

(queso de untar).
Introduccin. Este tipo de queso est directamente relacionado con el queso ms sencillo que existe que es el que se elabora aadiendo un agente acidificante a la leche (cido clorhdrico, limn o vinagre) ya que la base es la misma pero en el caso del uso de las bacterias cido lcticas se tiene la gran ventaja de que es la lactosa (azcar de la leche) la que se metaboliza produciendo un sabor, una textura y una digestibilidad muy superior que el producto obtenido por la simple acidificacin.

La coagulacin de las protenas lcticas (conocidas como casenas) por medio del un descenso en la acidez de la leche origina la unin de las protenas unas cono otras, formando estructuras de mayor tamao. Cada molcula de cido acta como un cemento que se encargara de unir las protenas de la leche que actuaran como ladrillos siendo as muy fciles de separar de la parte acuosa de la leche (suero) constituyendo lo que se denomina la cuajada. Como curiosidad conviene apuntar que este es un proceso qumico reversible, es decir que si se le aade a la leche coagulada por la accin de un cido un lcali (sustancia qumica con un pH alto como por ejemplo la leja) la cuajada volvera a ser lquida otra vez (cuidado ya no sera leche que se pudiera beber aunque su aspecto sera igual que el de la leche fresca). El queso que se obtiene tiene un sabor marcadamente cido y es magnfico para condimentar con finas hierbas, ajo y perejil, pimienta, nueces, etc. Su estructura es muy blanda ya que la accin cementante del cido es dbil por ello no se pueden hacer quesos con una determinada forma por medio de este tipo de fermentacin. Su consistencia va desde una pasta muy densa hasta una crema ligera que se puede usar para hacer repostera como base de deliciosos bizcochos, etc. Material y equipo necesario:

57

1. 1 litro de leche. 2. Olla grande para el bao Mara si la temperatura es inferior a 22 C. 3. Recipiente para la coagulacin puede ser de plstico, acero inoxidable o vidrio. No se recomienda la porcelana, ni el aluminio, ni cualquier recipiente que pueda ser alterado por la accin del cido o no se pueda limpiar con facilidad. 4. Termmetro 5. Gasa 6. Fermento iniciador 7. Cazo de sopa o cucharn 8. Colador 9. Cuchillo de punta 10. Cuchara sopera Proceso de elaboracin: Pasteurizar la leche si se trabaja con leche no comercial : calentar la leche hasta 70C al bao Mara nunca directamente y mantener esta temperatura de 1 a 3 minutos. Enfriar rpidamente introduciendo el recipiente de la leche en agua fra. Bajar la temperatura hasta los 30 C . Si se trabaja con leche de cabra actuar siempre por debajo de 29 C despus de pasterizar.

Tomar la punta de un de fermento Tomar 1 litro de leche cuchillo iniciador y depositarla en la Diluir el fermento en una pasteurizada y calentarla al cucharada de leche a 30 C. cuchara sopera. bao Mara hasta 30. La cuajada est lista para desuerar cuando al introducir el cuchillo y levantar la punta hacia arriba se produzca una grieta en la superficie. Esto significar que la leche se ha coagulado o solidificado y por lo tanto la cuajada est a punto.

Diluir la cucharada de leche con el fermento en el litro Dejar reposar la mezcla sin de leche revolviendo molestar en un sitio suavemente. caldeado a temperatura nunca inferior de 20 ni superior a 35 durante 8 a 24 horas dependiendo de la temperatura ambiente. Es conveniente cubrir con una

58

tela o trapo para evitar que se ensucie la leche pero que se airee.

y forrar con ella el colador.

Humedecer con agua la gasa de quesera Sacar con cuidado la cuajada y depositarla sobre la tela. Si se desea recuperar el suero para utilizarlo posteriormente poner debajo del colador un recipiente limpio y vaciarlo de vez en cuando. El tiempo de desuerado es muy variable y depende de cmo de consistente queramos dejar el queso y la temperatura ambiente, como orientacin entre 4 y 8 horas.

Si fuera necesario tomar la tela por sus extremos y levantarla ligeramente para destaponar la parte de la gasa que est en contacto con la cuajada y deje salir el suero.

Y se envasa en un recipiente hermtico para meterlo en la nevera donde se conservar hasta 10 das. Al enfriarse su consistencia se endurece.

Cuando tenga el queso la consistencia deseada es el momento de aadirle los condimentos que queramos: sal, pimienta, nueces molidas, ajo, perejil, organo, finas hierbas, azcar, etc.

59

Para obtener un queso ms cremoso se puede aadir nata comercial a la leche antes de empezar el proceso y se pueden variar los tiempos de fermentacin y desuerado, as como la cantidad de fermento; para obtener texturas y sabores diferentes. Es ideal como ingrediente de repostera en vez de la nata o mezclado con los condimentos como aperitivo. Problemas ms comunes y cmo resolverlos Queso muy acuoso:

Ha tenido poco tiempo de fermentacin o se ha realizado en ambiente muy fro y se ha desuerado antes de tener la cuajada la consistencia del corte limpio. Se ha desuerado poco tiempo o en ambiente muy fro.

Sabor excesivamente cido:

Se le ha aadido demasiado fermento iniciador y lo tanto hay que reducir la dosis. Conservar el fermento correctamente porque puede que haya perdido fuerza.

Hortalizas fermentadas. Los encurtidos son aquellos productos vegetales hortcolas que, tras ser sometidos a diversas transformaciones, tienen en comn su aderezo con vinagre. Entre las especies hortcolas cultivadas para encurtir destacan: pepinos, zanahorias, remolachas (hervirlas diez minutos antes); repollo colorado, col crespo. Algunas combinaciones posibles: pepinos o chauchas con borraja, eneldo y menta; repollo colorado con zanahorias, granos de mostaza, kummel y coriandro; pimientos con zapallitos (probar que no sean amargos), cebollas, oregano y ajo. Remolachas con manzanas, kren (rbano blanco picante), cscaras de limn, granos de mostaza y jengibre. Tallos de apio, manzana con kren o jengibre. Cada cultura ha desarrollado diferentes variantes para encurtir hortalizas a partir de esta tcnica. La materia prima puede someterse a fermentacin cido-lctica o bien no fermentarse. Tambin pueden elaborarse numerosos tipos de encurtidos mediante adiciones de azcares, especias, esencias y aromas, pero siempre con presencia de vinagre, pues es la caracterstica fundamental del encurtido. Los encurtidos , independientemente de que se fermenten o no, pueden pasteurizarse para mejorar su conservacin. El proceso de fabricacin de encurtidos comprende dos fases:

Fase de fermentacin: tiene lugar la fermentacin cido-lctica de la materia prima debido a la flora microbiana presente de forma natural en los frutos. Esta fase va acompaada de una serie de operaciones previas preparatorias. Esta fase puede no realizarse, pasando de las operaciones previas a la fase siguiente. o Fase de elaboracin: a partir de la materia prima fermentada y conservada en salmuera o bien partiendo de productos en fresco son elaborados los distintos tipos de encurtidos. El diagrama general que se sigue es el siguiente.60

Materia prima. La materia prima est constituida por los frutos inmaduros de las especies anteriormente citadas. La textura de los frutos destinados a encurtir debe ser firme y stos debern estar exentos de sabores extraos y amargos, as como de malos olores. El tipo de recoleccin es un factor muy importante para determinar la distribucin de tamaos de los frutos recogidos. Mientras que la recoleccin manual produce mayor porcentaje de frutos pequeos, muy apreciados comercialmente y de mayor precio, la recoleccin mecanizada tiende a frutos de mayor tamao, poco apreciados. Seleccin. Este apartado comprende diferentes operaciones, destinadas a incrementar la calidad de la materia prima que se dispone a fermentar. Debern ser eliminadas las hojas y las flores que permanecen adheridos al fruto. Esta operacin se realiza mecnicamente con una mquina compuesta por una cinta transportadora de rodillos vulcanizados en caucho que giran por pares en sentidos opuestos. Los rodillos atrapan las flores y restos de materia vegetal, mientras que los frutos continan avanzando por la cinta. El objetivo de esta operacin reside en la eliminacin de las partes de la planta, que contienen de forma natural poblaciones de hongos que son fuente de enzimas responsables del reblandecimiento de estos frutos fermentados comercialmente. Se ha comprobado que aquellos depsitos que contienen un porcentaje muy elevado de restos vegetales muestran una gran actividad enzimtica, y por lo general, el producto final fermentado es blando o de poca firmeza.

61

Calibrado. Los frutos se clasifican segn su dimetro. Esta caracterstica es muy importante debido a la fuerte demanda comercial de tamaos pequeos. No existe uniformidad internacional en la clasificacin teniendo cada pas su propia norma. El calibre va a ser un factor muy importante, que determinar la aparicin de ciertas alteraciones que deprecian el valor del encurtido en salmuera y del producto elaborado. Este es el caso de la formacin de huecos durante la fermentacin, que est directamente relacionada con el tamao de los frutos. Se recomienda evitar fermentar en el mismo depsito frutos de tamaos extremos, puesto que los pequeos fermentan con mayor rapidez que los grandes. La clasificacin se realiza mecnicamente mediante calibradoras que constan de varios canales de calibrado, formados por cordones de caucho o nylon en forma divergente. Regulando la divergencia de los cordones se consiguen los distintos calibres que se recogen en tolvas. Lavado. Esta operacin se realiza previa a la fermentacin, cuyo objetivo es disminuir la suciedad y los restos de tierra que los frutos llevan adheridos. Esta operacin no se realiza en la industria encurtidora, pues los fabricantes depositan los frutos en los depsitos de fermentacin tal y como los reciben del campo. Como la fermentacin cidolctica es un proceso microbiolgico, la higiene en el manejo de la materia prima es fundamental. El reblandecimiento de los frutos se debe a la presencia de enzimas pectinolticas y celulolticas. El lavado constituye uno de los procesos ms importantes en la fabricacin de encurtidos, pues la suciedad de los frutos y la presencia de hojas y frutos descompuestos, dificulta el normal desarrollo de la fermentacin natural. El lavado se realiza simplemente con agua, la maquinaria empleada suele ser lavadoras de tipo rotativo compuestas por cilindro de chapa perforada semisumergido en agua y cintas transportadoras, tambin perforadas, con duchas a presin. Fermentacin. Es la operacin ms importante en todo el proceso de fabricacin. De forma general esta operacin consiste en colocar las especies hortcolas en solucin salina (salmuera) y dejar que la flora microbiana, realice la fermentacin natural. La fermentacin cido-lctica se consigue mediante la combinacin de dos factores: la concentracin de sal y el descenso del pH de la salmuera debido a la produccin de cido lctico por las bacterias fermentativas. La fermentacin tiene lugar en depsitos de plstico con diferentes capacidades, pudiendo oscilar stas entre 120-14.000 litros, dependiendo del lugar de emplazamiento y de las facilidades operativas. Estos depsitos se suelen instalar en naves industriales

62

cubiertas, aunque en algunas zonas clidas los depsitos se colocan abiertos y al aire libre. Los depsitos han de ser limpiados antes y despus de su uso. En la preparacin de la salmuera se utilizar agua potable, que est exenta de materia orgnica en suspensin; las aguas duras no se emplearn. La sal empleada debe contener menos del 1% de carbonatos o bicarbonatos de sodio, calcio y magnesio, debido a que estas sales pueden neutralizar el cido producido por las bacterias que realizan la fermentacin. Transcurridas 24 horas de la recoleccin; una vez llevadas a cabo las operaciones de seleccin, calibrado y lavado, se introduce la materia prima en los bidones y se adiciona una salmuera que contenga 10% de sal. En estas condiciones se mantiene durante la primera semana. A continuacin semanalmente, se aade sal en cantidad suficiente para elevar la concentracin de la salmuera en 1% de sal, hasta alcanzar 16% de sal. Se tendrn en cuenta que las natas sobrenadantes presentes en la superficie de la salmuera, constituidas por levaduras oxidativas y mohos, se deben eliminar con periodicidad. Esta prctica evita el el consumo por dichos microorganismos del cido lctico producido en la fermentacin. Durante la fermentacin se producen numerosos cambios fsicos, qumicos y microbiolgicos, que se describen a continuacin: Cambios fsicos. En las primeras 48-72 horas el agua, los azcares, protenas, minerales y otras sustancias contenidas en los frutos se difunden por smosis a la salmuera. En la salmuera estas sustancias constituirn el alimento de las bacterias productoras de cido lctico y otros microorganismos. Como consecuencia, el producto pierde peso y se produce en l un arrugamiento. Transcurrido este periodo, la sal comienza a penetrar en los tejidos y con ella se produce la entrada de agua, con la que los frutos ganan peso y vuelven a su situacin normal. El cambio de textura de los productos durante la fermentacin es el aspecto fsico ms importante, sta va a determinar las diferencias cualitativas entre los encurtidos procedentes de producto fermentado y fresco. Cambios qumicos. El principal cambio qumico consiste en la transformacin de los azcares contenidos en los frutos en cido lctico debido a la accin microbiana. Aunque el principal producto de la fermentacin es el cido lctico, tambin producen cantidades inferiores de cido actico. Otros compuestos que aparecen en menores proporciones son alcoholes y steres. En ocasiones, durante la fermentacin cido-lctica se originan cantidades importantes de anhdrido carbnico e hidrgeno. Cambios microbiolgicos.

63

Los microorganismos ms importantes que intervienen en la fermentacin son: bacterias productoras de cido lctico, bacterias productoras de gases y levaduras. Estos microorganismos estn presentes de forma natural en los frutos. Las bacterias productoras de cido lctico, aunque presentan variaciones estacinales y de distribucin, son siempre las responsables de los mayores cambios en los frutos. Dentro de este grupo se encuentran Leunostoc mesenteroides, que en los primeros momentos de la fermentacin predomina sobre el resto, esta bacteria se cultiva sobre medios hipersacarosados produciendo voluminosas cpsulas (dextrano), esta produccin se ha empleado en la produccin de alimentos de textura ms o menos filante o espesa. Tambin estn presentes las siguientes especies: Streptococcus faecalis (bacteria homofermentativa, pues su fermentacin es de tipo homolctico, transformando la lactosa en cido lctico), Pediococcus cerevisiae, un coco muy productor de cido, cuya actividad microbiolgica se incrementa en proporcin al tiempo transcurrido, y Lactobacillus brevis, que puede contribuir a la formacin de cido lctico y a su vez es productora de gas. Lactobacillus plantarum es la bacteria ms importante a la hora de producir cido lctico. Dentro del grupo de bacterias productoras de gases tenemos las especies coliformes del gnero Aerobacter, que se caracterizan por la produccin de anhdrido carbnico e hidrgeno. Tambin dentro de este grupo se encuentra Lactobacillus brevis, que es un bacilo productor de gas, pero que en determinadas ocasiones ayuda a la formacin de cido lctico, se trata de una bacteria heterofermentativa que no puede desarrollarse en anaerobiosis con glucosa, porque no es capaz de reducir el acetil-fosfato a etanol. Almacenamiento. Los frutos fermentados pueden ser almacenados si no van a elaborarse inmediatamente. Para ello la concentracin de la salmuera se eleva al 20%. La acidez total de la salmuera, expresada en cido lctico, debe estar por encima del 1%, para lo cual si fuera necesario se aadira cido lctico comercial. De esta forma se impide el desarrollo de levaduras que podran deteriorar el producto fermentado. Fase de produccin y envasado. La planta de envasado recibe la materia prima, calibrada y fermentada, para llevar a cabo su procesado. El procedimiento seguido durante esta fase se muestra en el siguiente esquema:

64

Recepcin y control de la materia prima. La materia prima es transportada en camiones hasta la planta de envasado, donde se procede al pesado de todos y cada uno de los barriles de plstico que contienen los diferentes productos. A continuacin se proceder a la toma de muestras de los productos para determinar si alcanzan o no la calidad requerida por la industria. Tambin se determina el contenido en sal de la salmuera, el pH y la acidez total. Desalado. Los frutos almacenados en salmuera no pueden consumirse directamente. Para poder procesar el producto almacenado, ste debe ser previamente desalado, reduciendo su contenido salino a un nivel aceptable por los consumidores. Se trata de un proceso inverso al de salazn, que consiste en eliminar la sal con agua.

65

Mediante escurrido se elimina la salmuera inicial de los bidones. A continuacin se vuelven a llenar de agua y al cabo de unos minutos se escurren nuevamente, alcanzando as los productos una concentracin aproximada del 2% de sal. En cada lavado se consumen 25 litros de agua para 100 kg de producto. Lavado. Una vez desalado el producto, se realiza un ltimo y ligero lavado del mismo con agua corriente. Para esta operacin se emplea una cinta transportadora, provista en su mitad inicial, de un sistema de aspersores o duchas de baja presin. La segunda parte de la cinta, sin aspersores, completa el escurrido, con objeto de eliminar el exceso de agua de la superficie del producto. Llenado de los envases. Se emplear como nico material de envasado el vidrio. Su eleccin se debe a las siguientes ventajas:

Son impermeables al agua, gases, olores, etc. Son inertes. Se pueden someter a tratamientos trmicos. Son transparentes. Realzan el contenido que contienen.

Previamente al llenado, el envase debe ser lavado, lo cual se lleva a cabo en una lavadora de frascos dispuesta para tal fin. En primer lugar se vierte el envase y, a continuacin, se lanza un chorro de agua caliente, mantenindose los frascos invertidos para evitar contaminaciones y facilitar el escurrido antes del llenado. Una vez preparada la materia prima para su envasado, es enviada por medio de una banda transportadora a la llenadora-dosificadora, que realiza el llenado de los frascos de manera precisa sin derramar el producto, ni contaminar la zona de cierre. Este hecho es de gran importancia ya que la presencia de pequeas partculas de producto entre el borde de la tapa y el envase, puede producir problemas en el cierre y, como consecuencia, tener lugar posibles alteraciones de oxidacin o de reinfeccin por microorganismos, con la consiguiente putrefaccin. Adicin del lquido. La adicin del lquido de gobierno cumple entre otros los siguientes objetivos:

Mejorar la transferencia de calor a las porciones slidas del alimento. Desplazar el aire de los envases. Mejorar el sabor y la aceptabilidad del alimento, as como contribuir a su conservacin. Actuar como medio de distribucin para otros componentes (especias, aditivos, etc.).

66

El preparado consistir en una disolucin al 10% de vinagre puro de vino en agua. Su aadido, a los envases con el producto, se realizar por medio de una dosificadora volumtrica que se alimenta de un depsito en el cual se formula el lquido de gobierno. La mquina permite variar de forma automtica e independiente el volumen a dosificar. La temperatura del lquido en el momento de su incorporacin ser de unos 85 C. Cerrado. Si los envases se cerraran a presin atmosfrica, difcilmente resistiran la presin interna producida durante el tratamiento trmico. Por tanto, es necesario expulsar el aire del espacio de cabeza reservado y producir un vaco parcial. Esto se consigue con una temperatura elevada del lquido de gobierno. De esta forma, tambin se reduce la cantidad de oxgeno disponible que acarreara la corrosin, la destruccin de vitaminas y la decoloracin del producto. Para esta operacin se emplear una cerradora de tapas de rosca. Tratamiento trmico. El pH influye considerablemente en la temperatura y el tiempo de tratamiento, condiciones que definen el procesado trmico, para obtener un producto aceptable. Los cidos ejercen un efecto inhibidor sobre los microorganismos. Por tanto, en productos muy cidos con pH < 3.7 no se multiplican las bacterias, solo los hongos y bastara con un tratamiento trmico consistente en un proceso de pasteurizacin. El tratamiento trmico se llevar a cabo en un tnel de pasteurizado, con duchas de agua caliente a la entrada y fra a la salida, para evitar roturas en los envases. Una vez concluido el proceso de pasteurizacin, se enfran los envases paulatinamente, evitando un cambio trmico brusco que pueda aumentar la fatiga de los envases por sobrepresiones. La temperatura final de enfriamiento ser de unos 38 C, para que el calor residual ayude a secar los envases, con lo que se evita la corrosin y se contribuye a evitar la recontaminacin. A continuacin del tnel de pasteurizado y como una extensin del mismo, se instalar un tnel de secado por chorros de aire. Su funcin ser eliminar completamente las gotas de agua existentes en los envases, elemento antiesttico de cara a su posterior comercializacin. Etiquetado. El etiquetado se realizar una vez llevado a cabo el marcado de las tapas de los envases. Para esta operacin se emplear una etiquetadora lineal automtica autoadhesiva, dotada de dos cabezales para practicar, segn las circunstancias, etiquetado simple o doble. Embalaje. A la salida de la etiquetadora una mesa de acumulacin recoge los envases marcados y etiquetados listos para su embalado y expedicin. Como consecuencia de las diversas formas de embalaje demandadas, as como los distintos destinos de produccin se llevar a cabo el embalado de dos maneras diferentes. Desde la mesa de acumulacin

67

se instalarn dos lneas de embalado, una en cajas de cartn y otra en bandejas, tambin de cartn, retractiladas. Embalado en cajas de cartn. En una mesa empaquetadora con plegadora de solapas inferiores, un operario forma la parte inferior de la caja, para posteriormente proceder al llenado de la misma con los envases de la mesa de acumulacin. Finalizada esta operacin, la caja es introducida manualmente en la precintadora, ubicada a continuacin, que lleva a cabo el precintado simultneo por la parte superior e inferior con un mecanismo de cerrado automtico de solapas superiores. Embalado en bandejas de cartn retractiladas. Una vez formada la bandeja, se procede al llenado de la misma en una mesa de embalaje, situada junto a la mesa de acumulacin de los envases procedentes de la etiquetadora. Seguidamente la bandeja es conducida por medio de un transportador de rodillos a la retractiladora. A la entrada del tnel de retractilado, una empaquetadora realiza el estuche del film plstico que envuelve la bandeja, que es empujada automticamente al tnel para su termoretraccin. Paletizado. Se trata de la ltima operacin de todo el proceso, a partir de la cual el producto est preparado para su expedicin. El paletizado se realizar de forma manual con las cajas o bandejas procedentes de las respectivas lneas de embalado. Despus de situar aquellas en el palet, se practicar un enfardado como elemento de seguridad, que en el caso de ser insuficiente se reforzar mediante flejes a ambos lados. Almacenamiento. Las dependencias para el almacenamiento de los encurtidos elaborados, por sus especiales caractersticas, no precisan de un importante acondicionamiento. Para mantener los elaborados durante el periodo de almacenamiento en condiciones adecuadas que garanticen su calidad, se llevarn a cabo las siguientes recomendaciones: o Evitar la exposicin prolongada de los productos a la luz solar directa, principal causa de la aparicin de decoloraciones. o Mantener la temperatura ambiental por debajo de los 25 C, evitando as el efecto de cocido y de ablandamiento del producto y, por tanto, la aceleracin de la oxidacin. o Almacenar los palets colocando unos junto a otros, sin realizar ningn tipo de apilado que pueda dar lugar a la rotura de envases, deformaciones en las tapas, etc. o Realizar controles peridicos del tiempo y de la temperatura de almacenamiento, de la evolucin de la calidad, estado de los palets, etc.

68

La adopcin de estas medidas es imprescindible para una buena conservacin de los encurtidos. Se trata de productos de duracin media superior a dieciocho meses, que en condiciones adecuadas pueden permanecer varios aos en perfecto estado de consumo. La produccin procesada al cabo de una semana deber permanecer en almacn hasta su distribucin, operacin que se realizar, generalmente con periodicidad semanal. Elaboracin de repollo fermentado. De las hortalizas fermentadas, el chucrut es la que ms est en boca de todos. Si bien se lo asocia con los alemanes (curiosamente junto a las salchichas de Viena, que deberan ser austracas) a tal punto que en muchas regiones se los apoda con este nombre, la tcnica de elaboracin se remonta prcticamente al origen de la horticultura, o al menos, al origen de la domesticacin de los repollos. Plino, quien describe los hbitos de vida del Imperio Romano, ya narra el procedimiento mediante el cual se mantena fresco el repollo en los largos viajes. Se utilizaban coles de las costas de la pennsula itlica que se compriman con el agregado de sal en vasijas (limpias y secas). Tambin cita la costumbre romana de conservar olivas en salmuera. Este proceso, en el que se agregaban especias, se denominaba "compositus". Bajo este nombre se difundi la elaboracin del chucrut en Europa central en el siglo 11. El tiempo traslad el nombre de compositus a compost y composta, dos trminos relacionados con la huerta pero con significados bien distintos.

Sin embargo, haban sido los chinos los primeros en hacer fermentar el repollo (como tambin el arroz y la soja). La fermentacin lctica (ahora redescubierta por la industria alimenticia en las leches cultivadas y otros brebajes del rubro, con rimbombantes nombres cientficos y un apoyo publicitario espectacular), es de todos los procesos de fermentacin en los que intervienen cidos orgnicos, el que ms inhibe el desarrollo de microorganismos. Esta propiedad, junto a su capacidad de facilitar el acceso a nutrientes de alto valor biolgico en pocas de escasez, justifican la importancia que ha tenido en la cultura alimentaria de casi todo el mundo. Sigue siendo hoy da una tcnica sencilla para producir y conservar alimentos nutracuticos que son la principal fuente de vitamina C, y encimas de muchos pueblos. El proceso de conserva no es muy diferente al de los modernos silos hmedos (esos chorizos grandotes de plstico blanco que se ven por doquier en el campo) en los

69

que se conserva, enriquece y predigiere el forraje almacenado para vacas u otros animales. La versin "Fast food" de picar un poquito de repollo y agregarle limn o vinagre antes de hervirlo, puede ser una rpida solucin culinaria pero no puede ser considerada ni siquiera un sustituto del proceso de fermentacin natural.

Ilustracin: Chucrutera Dr. Kuhl: pesa adaptada al recipiente, canaleta superiror que se llena con agua hervida y en la que calza la tapa para un cierre hermtico. Con esta tcnica se puede reducir el uso de sal a 3 g. por Kg. de hortaliza fresca. La sal es un componente fundamental para el buen desarrollo de la conserva. El contenido de protenas de las hortalizas favorece su descomposicin, sobre todo en contacto con el aire. El agregado de sal inhibe este proceso, hasta que la fermentacin genere el suficiente cido lctico que acta luego como un conservante natural. Se sugiere el uso de sal natural o marina (asegrese que realmente lo sea, busque un proveedor confiable) ya que la sal de mesa puede tener aditivos que enturbien el "Compositus", si bien no lo harn indigesto. Los romanos no se medan la presin sangunea y los alemanes del medioevo tal vez hayan vivido con menos stress, por lo que utilizaban 10 gramos de sal por kg. de hortaliza. As como muchos horticultores abusan de los agroqumicos para asegurarse una buena cosecha, estos conservadores queran estar seguros de su produccin. Hoy da se usan unos 5 g. por Kg. de hortaliza fresca, y si se tiene especial cuidado en la higiene y la "cancha" necesaria, se puede llegar a 3 g. por Kg. para acelerar el inicio de la fermentacin, sobre todo en clima fro, puede agregarse un poco de suero de manteca, que se obtiene batiendo un pote de crema hasta que se corte la misma y se separa en suero y manteca. Tambin podra agregarse algo del jugo de chucrut de una fermentacin anterior. Material y equipo utilizado. Utilizamos un jarro, balde, vasija o barril, pudiendo ser de vidrio, cermica o madera de una capacidad mnima de cinco litros. Si va a utilizar plstico, asegrese de que est apto para alimentos y en especial para cidos, y que no est contaminado con ningn tipo de residuos txicos. Jams utilice envases metlicos o que hayan contenido detergentes, agrotxicos u otro tipo de sustancias qumicas de uso industrial, ni envases plsticos de baja calidad. La limpieza es fundamental. Llenamos el recipiente el da anterior con agua para remojarlo. Luego lo lavamos con jabn neutro y enjuagamos
70

reiteradas veces con agua caliente. Finalmente lo llenamos con agua y un veinte porciento de vinagre comn, para desinfectarlo. Lavamos muy bien un repasador o un pao de tela natural cruda (sin teir), un plato de loza o madera y una piedra que calcen en el envase y sirvan como pesa. Los colocamos en el recipiente para que tambin entren en contacto con el agua con vinagre. Recuerde que en toda preparacin de alimentos, nuestro lugar de elaboracin y los utensilios estarn perfectamente limpios y secos, al igual que nuestras ropas y manos. El cuchillo, bien afilado. Procedimiento. Para llenar un recipiente de 5 litros, necesitamos unos 3,5 kg. de repollo. Elegimos piezas bien armadas y jugosas. Las lavamos bien con agua potable y le recortamos las partes daadas. Partimos el repollo en dos para extraer el corazn, que suele demasiado duro (si llegara a estar sobremaduro o feo, descarte la planta). Con la cuchilla y sobre tabla cortamos el repollo en tiritas finas. Se puede utilizar una multiprocesadora o la cuchilla de un rallador, aunque los trozos no queden tan elegantes. A medida que vamos cortando, colocamos las tiritas en una palangana y les agregamos unos 3 a 5 gr. de sal por Kg de repollo. Condimentamos a gusto (tenga presente que la fermentacin resalta el sabor de algunas especias, sese con moderacin): laurel, trocitos de cebolla, rebanaditas de zanahoria, gajos de manzana (sin semillas), semillas de eneldo y alcarabea (Kmmel). Es conveniente hervir las cebollas diez minutos, antes de utilizarlas. Mezclamos bien todo y apisonamos con la ayuda de un pisn de madera (bien limpio) del tipo que se utilizan en morteros, u otra herramienta similar. Vaciamos el recipiente (el agua con vinagre se descarta) y colocamos una capa de unos cinco centmetros del repollo picado y sazonado. Apretamos bien el repollo dentro del envase con el pisn (o con el puo limpio), para que comience a soltar el jugo. Agregamos otra capa y repetimos la operacin, hasta llenar el envase unos diez centmetros debajo de su borde. Es fundamental comprimir bien el repollo. Estrujamos bien el pao o repasador y lo colocamos sobre la boca del recipiente. Luego ponemos el plato en el centro y finalmente la piedra (un adoqun por ejemplo). Tapamos el envase lo mejor posible, por ejemplo con una bolsa plstica apta para alimentos, para que no entren impurezas y lo depositamos en un lugar limpio. Fermentacin: Las levaduras y los bacilos que producen la fermentacin lctica estn presentes en el ambiente. Si no, no se cortara la leche. La velocidad del proceso de fermentacin depender de la temperatura ambiente. a 16 grados centgrados demorar unas seis semanas, a 18 grados, cinco, a 21, cuatro y a 24 grados, lo que se considera la temperatura ideal, unas tres semanas. A mayor temperatura se corre el riesgo de que se descomponga antes de acumular suficiente acidez que conserve el alimento. A temperatura muy baja, el proceso es demasiado lento y puede producir el mismo resultado. En ambos extremos es conveniente agregar un poco de suero de manteca, como ya se describi.

71

La temperatura ambiente de su lugar de depsito, adems de la disponibilidad de hortalizas, sern entonces los condicionantes para la elaboracin de hortalizas cidas. En el Sur de la Argentina, esto se realizar en verano, en el Norte en invierno y en regiones moderadas, al inicio de la primavera o otoo. Unas seis horas despus de rellenado el recipiente, el repollo debe haber liberado suficiente jugo como para quedar cubierto de lquido al menos un centmetro. Si no hay lquido suficiente, hervir agua con sal (15 g. de sal por litro de agua), dejarla enfriar y agregar hasta llevar al nivel indicado. Agregar tambin un poco de suero de manteca, para favorecer la fermentacin. Para evitar esto, la seleccin de repollos con alto contenido de humedad y el buen machacado inicial son fundamentales. Mientras las hortalizas fermentan, va ascendiendo espuma en el recipiente. Este proceso dura entre una y dos semanas. Deber quitar la espuma con una espumadera bien limpia a diario. Cuando termina la fermentacin (ya no se forma ms espuma), se sacan todos los pedacitos turbios con la espumadera, hasta que el repollo quede cubierto slo por el jugo transparente. Almacenado: Las hortalizas fermentadas deben almacenarse en un lugar fresco, sin calefaccin ni excesiva temperatura. Si no poseemos un lugar con estas condiciones, esperamos el tiempo de elaboracin necesario como se indic ms arriba y se prueba el preparado. Si ya tiene un grado de acidez intenso, se procede a remover toda la capa superior (si sta est turbia o "babosa"). Se envasa el chucrut (u otras hortalizas) junto con el jugo en vasos de vidrio para conserva, se cierran bien, se colocan en una cacerola con agua (que los tape completamente 5 cm.) y se cocinan durante 30 minutos a 85 grados centgrados. Luego se sacan y se dejan enfriar y se guardan como cualquier otra conserva, en un lugar oscuro. Es conveniente envasar en recipientes del tamao de la porcin que se emplear en una sola comida. Si se conserva en el envase original, para utilizar una porcin, sta se saca con una pinza de acero inoxidable u otra herramienta bien limpia. Ni bien se forma una baba (levaduras) en el pao que recubre el encurtido, se debe quitar, lavar bien, lavar bien el plato y la piedra, hervir el pao en agua con vinagre y volver a colocar todo en su lugar. Notas. Algunas hortalizas, en particular las chauchas, deben hervirse ya que poseen alcaloides que se transforman en cianuros txicos y slo se destruyen al hervirlos antes de su consumo. Recuerde siempre recubrir a las hortalizas con agua hervida con sal y suero de manteca, si luego de unas horas de preparado, no liberaron suficiente jugo, para asegurarse la acidez necesaria, sobre todo en hortalizas como los pimientos y las cebollas. El sabor de estos alimentos deber ser siempre cido, lo cual es un indicador de su buen estado de conservacin. Si el lquido se tornara turbio y perdiera su acidez, el alimento puede deteriorarse y no debe ser utilizado. En su conservacin en el envase

72

original, las hortalizas nunca deben quedar fuera del jugo. En contacto con el aire del ambiente, pueden contaminarse con hongos y levaduras que iniciarn un proceso de alcalinizacin, con el consiguiente riesgo de intoxicacin por salmonelas. Por este motivo, se descarta generalmente la capa superior y se utiliza el plato con el pao y la pesa.

73

UNIDAD 7 B I O M A S A INTRODUCCIN. La vegetacin empleada para energa puede llegar a ser uno de los combustibles ms importantes en el futuro. En los prximos veinte aos podra suministrar un octavo del presupuesto energtico mundial. Una gran variedad de desechos agrcolas y madereros y de cultivos energticos, simbolizados por el campo de maz, pueden transformarse para suministrar una gama de combustibles para el transporte, o pueden ser quemados para generar electricidad. Un ejemplo de esto es la conversin de las astillas de madera en un gas rico en metano. Al igual que los combustibles fsiles, este gas puede quemarse en centrales elctricas eficientes que maximicen el contenido energtico del combustible, generando electricidad al mismo tiempo que utilizan el calor sobrante. La utilizacin de la biomasa es tan antigua como el descubrimiento y el empleo del fuego para calentarse y preparar alimentos, utilizando la lea. An hoy, la biomasa es la principal fuente de energa para usos domsticos empleada por ms de 2.500 millones de personas en el Tercer Mundo. La combustin de la biomasa es contaminante. En el caso de la incineracin de basuras, tal y como se viene haciendo con los residuos urbanos en la mayora de las ciudades europeas y norteamericanas, la combustin emite a la atmsfera contaminantes, algunos de ellos cancergenos, como las dioxinas. El reciclaje y la reutilizacin de los residuos permitir mejorar el medio ambiente, ahorrando importantes cantidades de energa y de materias primas, a la vez que se trata de suprimir la generacin de residuos txicos y de reducir los envases. Biomasa es la abreviatura de masa biolgica, cantidad de materia viva producida en un rea determinada de la superficie terrestre, o por organismos de un tipo especfico. El trmino es utilizado con mayor frecuencia en las discusiones relativas a la energa de biomasa, es decir, al combustible energtico que se obtiene directa o indirectamente de recursos biolgicos. La energa de biomasa que procede de la madera, residuos agrcolas y estircol, contina siendo la fuente principal de energa de las zonas en desarrollo. En algunos casos tambin es el recurso econmico ms importante, como en Brasil, donde la caa de azcar se transforma en etanol, y en la provincia de Sichun, en China, donde se obtiene gas a partir de estircol. Existen varios proyectos de investigacin que pretenden conseguir un desarrollo mayor de la energa de biomasa, sin embargo, la rivalidad econmica que plantea con el petrleo es responsable de que dichos esfuerzos se hallen an en una fase temprana de desarrollo. Los combustibles derivados de la biomasa abarcan varias formas diferentes, entre ellas los combustibles de alcohol (mencionados antes en este artculo), el estircol y la lea. La lea y el estircol siguen siendo combustibles importantes en algunos pases en vas de desarrollo, y los elevados precios del petrleo han hecho que los pases industrializados vuelvan a interesarse por la lea. Por ejemplo, se calcula que casi la mitad de las viviendas de Vermont (Estados Unidos) se calientan parcialmente con lea.

74

Los cientficos estn dedicando cada vez ms atencin a la explotacin de plantas energticas, aunque existe cierta preocupacin de que si se recurre a gran escala a la agricultura para obtener energa podran subir los precios de los alimentos. En Espaa actualmente el potencial energtico de la biomasa asciende a 37 Mtep, pero tal cifra incluye 19,6 Mtep de cultivos energticos y 3,8 Mtep de residuos forestales y agrcolas. La produccin de biocombustibles y un uso energtico excesivo de los residuos forestales y agrcolas no es deseable, dadas sus repercusiones sobre la diversidad biolgica, los suelos y el ciclo hidrolgico, sin olvidar que lo ms importante es producir alimentos, y no biocombustibles para los automviles privados. El objetivo de alcanzar las 4,2Mtep en el 2.005 en la prctica supone duplicar el consumo oficial de biomasa. La obtencin de biogs en digestores a partir de residuos ganaderos reducir las emisiones de metano, y debe ser promocionada, con el fin de reducir la contaminacin, obtener fertilizantes y producir energa.

BIOMASA ( MASA CELULAR) . Produccin microbiana bruta obtenida por fermentacin a partir de levaduras, bacterias, mohos y algas. En algunos casos puede ingerirse directamente y en otras debe ser sometida a una purificacin mas o menos intensa. Este concepto sta prximo al de protenas unicelulares SIGLE CELL PROTEINS . Los microorganismos como alimento del hombre y de los animales. En instalaciones biotecnolgicas a gran escala y mediante numerosos procesos pueden cultivarse grandes cantidades de microorganismos. Sirven como alimento de alto valor proteico, por ejemplo, el cultivo de hongos (principalmente championes), como complemento en la alimentacin o como material de partida para la obtencin de grasas o de otras sustancias celulares tiles. Los microorganismos se emplean tambin para la obtencin de enzimas y saborizantes para la industria alimentara. Por ejemplo, se utilizan amilasas e invertasas en las industrias de panadera y pastelera y cido glutmico y nuclesidos como sustancias aromatizantes en la industria conservera. Utilidad en la alimentacin animal y humana. La principal demanda actual y sobre todo futura de protena rnicrobiana single cefl protein, S.C.P., Proviene del sector de la industria de los piensos. Las fuentes principales de protenas vegetales son las tortas de soja con un 45 % de protenas y las tortas de semillas oleaginosas de algodn y girasol con cerca del 41 % de protenas. Tambin se emplean como suplemento proteico harinas de pescado y de carne y leche desnatada en polvo con contenidos de protena del 66,50 y 3 5 % respectivamente.
75

Pero en la calidad nutritiva de los microorganismos no slo son decisivos el contenido de protena y la composicin de aminocidos sino tambin la digestibilidad y la tolerancia. Mientras que la digestibilidad depende, entre otros factores, del grosor y composicin d la pared celular, en la tolerancia es especialmente importante el contenido de sustancias txicas o nocivas para el metabolismo. Las posibilidades de utilizar las protenas monocelulares se ven reducidas en primer lugar por el contenido de cidos nucleicos (cidos ribo y desoxirribonucleico), puesto que si ste es alto se produce un gran acmulo de metabolitos finales como bases pricas y pirimidnicas y cido rico. Dado que ni los mamferos ni el hombre son capaces de sintetizar por s mismos ocho aminocidos a partir de los alimentos, se ven obligados a ingerir ciertas cantidades mnimas de dichos aminocidos esenciales. En la siguiente Tabla se muestran algunos de los aminocidos ms importantes. Tabla.- Composicin de los piensos concentrados microbianos , animales y vegetales y necesidades humanas de aminoacidos esenciales.
Levaduras a partir de parafinas Protena bruta Grasa bruta Minerales Aminocidos esenciales Leucina Lisina Valina Fenilalanina Y tirosina Isoleucina Treonina Metionina Y cistina Triptfano 66.2 9.0 6.0 Bacterias a partir de metanol 78.1 4.9 11.5 Harina de Pescado 66.2 8.1 15.5 Triturados de soja Necesidades humanas g.

45.0 1.0 5.7

70 - 90

4.2 4.2 3.2 4.7 2.7 2.9 1.8 0.8

4.9 4.3 3.8 4.8 3.0 3.3 2.4 0.6

5.0 4.9 3.7 5.2 3.0 3.0 2.6 0.9

3.4 2.8 2.3 3.8 2.2 1.9 1.3 0.6

7.2 4.9 4.6 4.2 3.9 3.3 2.7 1.1

Los microorganismos, por ser clulas de crecimiento rpido, tienen un mayor contenido de cidos nucleicos que las clulas animales y vegetales de los alimentos. Para las necesidades humanas slo se contempla la posibilidad de utilizar como alimento las levaduras en forma de suspensin, pasta o polvo seco. Su alto contenido de vitaminas (coenzimas) del complejo B las hace especialmente apropiadas para la teraputica diettica de convalecientes con una gran necesidad de vitaminas.

76

MATERIAS PRIMAS Y MTODOS DE PRODUCCIN. Cultivo de biomasa bacteriana en metanol. El metanol tiene ventajas decisivas como sustrato si se le compara con los hidrocarburos gaseosos y lquidos. Es hidrosoluble y evita los problemas de reparto que se presentan cuando existe una fase insoluble en agua y los de formacin de mezclas gaseosas explosivas. Adems, su obtencin a partir de muchas materias primas, sobre todo carbn, gas natural y petrleo es fcil quimiotcnicamente y econmicamente posible. Es fcil de purificar, su degradacin microbiana tiene un calor de reaccin bajo y necesita por ello una menor refrigeracin que los hidrocarburos. Los compuestos C, metanol y formaldehdo son txicos para la mayora de los organismos con excepcin de algunas levaduras como Candida spp. y bacterias como algunas especies del gnero Methylomonas y algunas Pseudomonas spp. Los organismos citados disponen de dos rutas especiales para incorporarlos compuestos C, como metano, metanol, formaldehdo y formiato a su metabolismo y utilizarlos como sustrato: adicionarlos a la ribulosamonofosfato o a la glicina ( reacciones). Para obtener protenas a partir de metanol se seleccion una cepa de Pseudomonas methylotropha de crecimiento rpido y buena calidad proteica y se ensay a gran escala. Su ventaja sobre las levaduras radica en su mayor contenido de protena (85 %), un tiempo de generacin menor, de dos horas, as como una concentracin de producto de 30 g L. de peso celular seco. El elevado aporte de oxgeno necesario se consigui con un fermentador cclico que funciona por aire a presin distribuido homogneamente. El cultivo bacteriano, colocado en un tubo ascendente ancho que se estrecha hacia arriba, se airea intensamente con aire estril a presin distribuido homogneamente que se introduce por la parte inferior y que se mezcla con burbujas que ocupan un 50 % del volumen, con lo que el cultivo se ve empujado hacia arriba. Un filtro para la espuma situado en la parte superior facilita la separacin del aire y del medio de cultivo. Al tiempo que se elimina el aire efluente, el cultivo fluye por un tubo horizontal hacia un tubo descendente, donde es impelido nuevamente por aire a presin y transportado hacia abajo. Por el extremo superior del tubo ascendente se extrae el cultivo bacteriano que se haya desarrollado.

77

Diagrama. Fermentador continuo con aire a presin para la obtencin de biomasa. LEVADURA: PANIFICACIN. Cultivo de Levaduras. Las levaduras pueden cultivarse biotecnolgicamente en sustratos que contengan hidratos de carbono de muy distinta procedencia, en alcoholes y en n-parafinas. Los sustratos que contienen almidn y celulosa se degradan primero por hidrlisis qumica en mono y disacridos utilizables, mientras que otros sustratos como melazas, pulpas de ctricos y distintas aguas residuales pueden emplearse sin hidrlisis previa. Muchos sustratos, como los hidrolizados de madera, los residuos de lejas sulfticas y otros residuos vegetales tratados contienen, adems de hexosas, pentosas, que no pueden ser utilizadas por Saccharomyces pero si por Candida y Torula, Sobre todo las cepas de Candida tienen mltiples aplicaciones porque pueden utilizar la mayora de los sustratos. El rendimiento celular por kg. de sustrato empleado depende del contenido energtico y de la concentracin del sustrato, as como de su coeficiente de asimilacin, es decir, la parte de l asimilada como nutriente. Esta se ve influenciada a su vez por las condiciones del cultivo, especialmente la temperatura, la intensidad de la aireacin, la concentracin de nutriente y l pH y adems por la presencia de sustancias inhibidoras del crecimiento.
78

Cuando la aireacin de los fermentadores con sustratos azucarados no se lleva a cabo con la suficiente intensidad, parte del azcar fermenta a alcohol, es decir, no se oxida totalmente. Pero como los rendimientos mximos slo son posibles cuando la oxidacin es completa, hay que suprimir la fermentacin con una aireacin intensiva. Esta desviacin del metabolismo dependiendo de la disponibilidad de oxgeno de la fermentacin hacia la respiracin ya haba sido observada por Louis Pasteur y se conoce como efecto Pasteur. La mayora de las veces se trabaja en proceso continuo. A 30 C y pH 5.0 el consumo de oxgeno asciende en un tiempo de generacin de 5 horas a 2,2 kg. por kg. de levadura. Pero hay que airear ms intensamente porque slo se utiliza un 30 % del oxgeno disponible para la produccin de biomasa. Adems, la adicin de pequeas cantidades de ozono de hasta un 1,5 % en volumen estimula la respiracin y el crecimiento de la levadura y es a la vez letal para posibles bacterias y virus contaminantes. Las n-parafinas que van llegando al sistema se transforman totalmente en C02, H20, calor y masa celular, de manera que no es necesario ningn tipo de purificacin especial del Cultivo efluente.. Las clulas se separan por centrifugacin y se desecan. Levadura en la panificacin. La levadura que hemos aadido a la masa debe mantenerse viva para hacer su funcin. La energa necesaria para la actividad celular la obtiene a partir de los azcares libres presentes en la masa, preferiblemente glucosa. Se consumen primero los que ya aporta la harina y que provienen del grano de trigo. Despus, debe ponerse en marcha una compleja maquinaria bioqumica: la amilolisis. Teniendo en cuenta los niveles de temperatura a los que se realizan las distintas operaciones de la panificacin, podemos distinguir tres fases: 1. Amasado y fermentacin. 2. Coccin. 3. Enfriamiento y almacenamiento. Maltosa formada y fermentacin de la masa La maltosa es la fraccin ms importante de la fraccin de bajo peso molecular, producto de la amilolisis. Una vez transportada al interior de las clulas de levadura, puede ser desdoblada en dos molculas de glucosa, materia prima bsica para la fermentacin alcohlica que produce el dixido de carbono o gas carbnico, necesario para el desarrollo de la masa. Su comportamiento qumico es ste: C12H22O11 + H2O > 2 C6H12O6 Maltosa Agua Glucosa C6H12O6 > 2 CH3 CH2 OH + 2 CO2 Glucosa Etanol Dixido de carbono

79

C12H22O11 + H2O > 2 C6H12O6 Maltosa Agua Glucosa C6H12O6 > 2 CH3 CH2 OH + 2 CO2 Glucosa Etanol Dixido de carbono La produccin de CO2 es, pues, proporcional a la velocidad de formacin de maltosa por las amilasas. La coccin del pan se produce a una temperatura de unos 250 C y en presencia de vapor de agua, siendo una etapa tan importante como la fermentacin. El aumento de temperatura de la masa se produce de manera gradual desde el exterior hacia el interior de la pieza. Como en toda reaccin qumica, el aumento de la temperatura supone una aceleracin de las diferentes reacciones que constituyen la amilolisis. La existencia de un gradiente de temperatura entre la superficie y el corazn de la pieza aade un efecto de progresividad de los fenmenos que ocurren con el incremento de la temperatura. Primero se forma una fina pelcula en la superficie, que se mantienen flexible gracias al vapor de agua condensado sobre la misma. Por dilatacin de los gases que contiene, aumenta mucho el crecimiento de la masa . Adems, las actividades vitales de la levadura sufren tambin el efecto del aumento de temperatura, acelerndose la produccin de carbnico y alcohol. Cuando el interior de la pieza alcanza los 65 C, los grnulos de almidn sufren un violento hinchamiento acompaado de una salida de amilosa, precisamente cuando la actividad de las amilasas es mxima. Sin embargo, las enzimas, como cualquier protena, son sensibles al calor. Cuando se alcanzan los 70 C, la beta-amilasa y la amilasa fngica aadida, quedan inactivadas. La alfa-amilasa natural resiste hasta los 80 C. El efecto final de la amilolisis en esta fase, est directamente ligado a la cintica trmica interior de la pieza la velocidad con que aumenta la temperatura en su interior, y al tipo de alfa-amilasa (natural o aadida; entre stas, fngica o bacteriana). La alfa-amilasas fngicas se inactivan antes de la gelificacin total del almidn, con lo que su efecto en la coccin es mucho menor que el de las naturales o las microbianas. Los mejores resultados tecnolgicos se obtienen cuando existe un equilibrio ente alfa y beta amilasa. APLICACIONES. Cultivo de Bacterias. Debido a las dificultades para separar las pequeas clulas bacterianas del medio de cultivo y por su alto contenido en cidos nucleicos, hasta ahora se ha empleado poco la biornasa bacteriana como suplemento proteico.

80

Un mtodo de aprovechamiento de residuos vegetales que contengan celulosa para la obtencin de protenas, consiste en degradar dichos residuo con un cultivo mixto de bacterias y levaduras. Obtencin y aprovechamiento de grasas microbianas. Muchas levaduras, mohos, bacterias y algas sintetizan y almacenan, en condiciones adecuadas de cultivo, entre el 25 y el 70 % de su peso celular seco en forma de grasas. Las necesidades nutricionales humanas se cubren actualmente de manera exclusiva con las grasas animales y vegetales, ms baratas. Adems, las grasas y cidos grasos tcnicos, que se obtienen de los vegetales por ejemplo para fabricacin de detergentes estar tambin al alcance de la sntesis biotecnolgicas con microorganismos. Adems de las parafinas tambin son adecuados para la obtencin de grasas los sustratos azucarados principalmente. De las levaduras son especialmente adecuadas las especies de Rhodotorula, Candida, Lipomyces y Endomyces; de los mohos las especies de Mucor, Rhizopus, Penicillium, Aspergillus y Fusarium Entre las bacterias son buenas formadoras de grasas algunas cepas de Streptococcus, Enterobacter, Bacillus y Mycobacterium. Adems de la seleccin de las cepas adecuadas, son importantes sobre todo los sustratos pobres en nitrgeno y fsforo para que haya un almacenamiento importante de grasas en la clula microbiana. Por ello en muchas levaduras la mejor sntesis de grasas se consigue cuando el medio de cultivo tiene un contenido de nitrgeno de un 50 70 % por debajo del contenido ptimo. Tambin en este caso los medios de cultivo tienen que ser ricos en azcares pero pobres en nitrgeno y fsforo. Se ha comprobado que resulta ventajoso que la relacin C:N en el medio de cultivo sea 66:1. Las algas unicelulares fotosintticas tambin pueden llevar a cabo una gran produccin de grasas s se les suministra slo una pequea parte de sales nutritivas nitrogenadas (como mxirno 1 % del medio de cultivo). Especialmente el alga verde Chlorella pyrenodosa pueden almacenar un mximo de 70-80 % de su peso seco como grasa respectivamente. Cultivo del Champin. Se empezaron a cultivar sobre todo Agaricus bisporus y A. bitorquis Ambos estn estrechamente emparentados con el champin silvestre, A. campestris. A modo de experimento se cultiv tambin A. arvensis que forma un cuerpo fructfero de mayor tamao.

A. bitoquis crece en todos los climas bajo el asfalto de las calles atravesndolo al
formar el cuerpo fructfero por lo que se denomina champin de calle

81

Las especies de Agaricus crecen sobretodo en los suelos de prados y bosques descomponindolos y aprovechando los componentes del humus. Para los cultivos sean productivos necesitan compost o estircol en descomposicin ricos en nitrgeno. Vitaminas. Algunas vitaminas se obtienen por medio de la biomasa, la mayora de estas vitaminas son necesarias para la actuacin de determinados enzimas, ya que funcionan como coenzimas que intervienen en distintas rutas metablicas y , por ello, una deficiencia en una vitamina puede originar importantes defectos metablicos, como puede verse en la tabla adjunta: VITAMINAS C (cido ascrbico) B1 (tiamina) FUNCIONES Coenzima de algunas peptidasas. Interviene en la sntesis de colgeno Coenzima de las descarboxilasas y de las enzima que transfieren grupos aldehdos Enfermedades carenciales Escorbuto Beriberi Dermatitis y lesiones en las mucosas Fatiga y trastornos del sueqo Pelagra Depresisn, anemia Anemia perniciosa Fatiga, dermatitis...

B2 (riboflavina) Constituyente de los coenzimas FAD y FMN B3 (cido pantotinico) B5 (niacina) Constituyente de la CoA

Constituyente de las coenzimas NAD y NADP Interviene en las reacciones de transferencia de B6 ( piridoxina) grupos aminos. B12 Coenzima en la transferencia de grupos metilo. (cobalamina) Coenzima de las enzimas que transfieren grupos Biotina carboxilo, en metabolismo de aminocidos.

UNIDAD VIII. ENZIMAS MICROBIANAS Y PRODUCCIN DE AMINOCIDOS.

82

INTRODUCCIN. Las enzimas, en griego in ferment, son biocatalizadores compuestos por una parte proteica llamada apoenzima y una no proteica llamada coenzima. Las enzimas, tambin denominadas fermentos, son sustancias capaces de acelerar las reacciones bioqumicas del organismo. Estn formadas por una protena unida a una coenzima, sustancia de naturaleza no orgnica que es, a veces, un oligoelemento, imprescindible para el funcionamiento de la enzima, y que suele ser el centro activo de la misma. Casi todas las reacciones qumicas de las clulas son catalizadas por enzimas, con la particularidad de que cada enzima slo cataliza una reaccin, por lo que existiran tantas enzimas como reacciones, y no se consumen en el proceso. Los catalizadores no biolgicos son inespecficos. En una reaccin catalizada por enzima (E), los reactivos se denomina sustratos (S), es decir, la sustancia sobre la que acta la enzima. El sustrato es modificado qumicamente y se convierte en uno o ms productos (P). Como esta reaccin es reversible se expresa de la siguiente manera:

La enzima libre se encuentra en la misma forma qumica al comienzo y al final de la reaccin. Especificidad. Las molculas del sustrato se unen a un sitio particular en la superficie de la enzima, denominado sitio activo, donde, tiene lugar la catlisis. La estructura tridimensional de este sitio activo, donde solo puede entrar un determinado sustrato (ni siquiera sus ismeros) es lo que determina la especificidad de las enzimas. El acoplamiento es tal que E. Fisher (1894) enunci: "El sustrato se adapta al centro activo o cataltico de una enzima como una llave a una cerradura". Clases de enzima. El nombre de las enzimas es el del sustrato + el sufijo: -asa. Los nombres de las enzimas revelan la especificidad de su funcin: xido-reductasas: catalizan reacciones de xido-reduccin, las que implican la ganancia (o reduccin) o prdida de electrones (u oxidacin). Las ms importantes son las deshidrogenasas y las oxidasas Transferasas: transfieren grupos funcionales de una molcula a otra. Ej.: quinasas; transfieren fosfatos del ATP a otra molcula. Hidrolasas: rompen varios tipos de enlaces introduciendo radicales -H y -OH. Liasas: adicionan grupos funcionales a los dobles enlaces. Isomerasas: convierten los sustratos ismeros unos en otros. Ligasas o Sintasas: forman diversos tipos de enlaces aprovechando la energa de la

83

ruptura del ATP. Ej: polimerasas Mecanismo de accin de una enzima. Una enzima, por s misma, no puede llevar a cabo una reaccin, su funcin es modificar la velocidad de la reaccin, entendindose como tal la cantidad de producto formado por unidad de tiempo. Tal variacin se debe a la disminucin de la energa de activacin Ea; en una reaccin qumica, la Ea es la energa necesaria para convertir los reactivos en formas moleculares inestables denominadas especies en estado de transicin, que poseen mayor energa libre que los reactivos y los productos. Una enzima efecta estas acciones mediante los siguientes pasos: 1. Orienta a los sustratos: parte de la energa de activacin se utiliza para que los sustratos roten y se enfrenten con los tomos correctos para formar los enlaces. 2. Agregan cargas a los sustratos: las cadenas laterales (R) de los aminocidos de las enzimas pueden participar directamente haciendo a los sustratos qumicamente ms reactivos. 3. Inducen la deformacin en el sustrato: cuando una sustancia se une al sitio activo, la enzima puede causar que los enlaces se estiren, ponindolo en un estado de transicin inestable. 4. Cambio de forma de la enzima al unirse al sustrato: el modelo de llave- cerradura de Fisher fue actualizado cuando se descubri que las enzimas son flexibles y sus sitios activos pueden cambiar (expandirse) para acomodarse a sus sustratos. Este cambio de forma causado por la unin al sustrato se denomina ajuste inducido. 5. En la Hexoquinasa puede observarse este ajuste inducido, con el sustrato (glucosa) y sin l. El ajuste inducido alinea las cadenas laterales reactivas del sitio activo de la enzima con los sustratos. Acompaantes no proteicos de las enzimas. Ya sea que consistan en una nica cadena polipeptdica plegada o en varias unidades, muchas enzimas requieren otras molculas no proteicas para funcionar. COFACTORES: son iones inorgnicos que se unen temporariamente a las enzimas molcula Hierro Fe 2+ o Fe 3+ Cobre, Cu + o Cu 2+ Cinc, Zn2+ papel en la reaccin catalizada Oxidacin / reduccin Oxidacin / reduccin Ayuda a unir el NAD

COENZIMAS: molculas pequeas que tiene carbono, interaccionan dbilmente durante la catlisis. La mayor parte de las coenzimas son vitaminas, muchas de las cuales deben ser incorporadas con la dieta. molcula papel en la reaccin catalizada Biotina transporta -COOCoenzima A transporta -CH2-CH3

84

NAD y FAD

transportan electrones

GRUPOS PROSTETICOS: estn permanentemente unidos a las enzimas molcula papel en la reaccin catalizada une iones O2 y electrones, contiene Hemo cofactor hierro Flavina Une electrones Retinal Cofactor en la absorcin de la luz

el

Las coenzimas reaccionan con la enzima de igual modo que el sustrato, unindose al sitio activo. Se mueven de una enzima a otra agregando o quitando grupos qumicos del sustrato.

ENZIMAS MICROBIANAS. El Hongo Pleurotus ostreatus. El hongo Pleurotus ostreatus es un basidiomiceto que produce cuerpos fructferos con forma de concha. Se cultiva a nivel industrial para emplearlo como consumo humano, ya que es un hongo comestible de excelente sabor rico en protenas y vitaminas. Para el cultivo industrial de Pleurotus ostreatus, se utilizan substratos lignocelulsicos o paja de cereales. El hongo P. ostreatus posee una maquinaria enzimtica muy compleja que le permite degradar los grandes polmeros (lignina y celulosa) que componen el substrato. Sin embargo, la forma de nutricin de los hongos implica que la capacidad del hongo para producir enzimas hidrolticas especficas debido a la presencia de genes especficos, no es suficiente para la eficiente degradacin del substrato. Dado que los hongos filamentosos presentan una pared celular rgida exterior a la membrana plasmtica, las enzimas hidrolticas adems deben ser secretadas al exterior de la clula, donde degradan los polmeros (lignina y celulosa) para dar lugar a compuestos de bajo peso molecular que puedan ser absorbidos. La secrecin de enzimas por hongos filamentosos es un proceso muy relacionado con el crecimiento. Y al igual que ste, la secrecin est localizada exclusivamente en los pices de las hifas. Se han detectado importantes diferencias en la velocidad de crecimiento entre diferentes monocariontes de P. ostreatus, pero se desconoce qu estructuras o procesos son responsables de estas diferencias. Xilanasas. La produccin de cultivos de hongos para la produccin de celulasas y de hemicelulasas (xilanasas) especialmente para su aplicacin en la industria papelera y de la celulosa as como tambin para la modificacin y produccin de lignocelulosa. Se obtiene a partir de cultivos de hongo Trichoderma reesei modificados genticamente que producen mas celulasa que el cultivo original (15 mg celulasa / g micelio/ hora). Amilasas.
85

De un correcto equilibrio en la accin de las alfa y beta amilasas en las harinas y en el proceso de panificacin depende el resultado de un pan con una miga bien esponjosa y una corteja rojiza. En este artculo, su autor estudia la forma en que las amilasas actan en el proceso panario y su interrelacin entre ellas. Esta interrelacin pone en marcha una compleja maquinaria bioqumica: la amilolisis, que acta durante el amasado, fermentacin y coccin de los productos panarios. Nosotros molemos el grano para aprovechar su harina, y parte de las amilasas quedan en ella. Se distinguen dos tipos de amilasas, que se denominan alfa (a) y beta (b), y cuya accin combinada permite liberar unidades de maltosa, azcar que se forma por la unin de dos unidades de glucosa. Pero las molculas de almidn, sistema de reserva de energa de muchos vegetales, en su estado natural se encuentran empaquetadas en unas estructuras denominadas grnulos, cuya forma y tamao es caracterstica de la especie (trigo, maz, patata...). La accesibilidad de las amilasas al interior de los grnulos de almidn est limitada, salvo que tengan fisuras por donde penetre el agua. En estos grnulos, muchos de los cuales han sido daados en la propia molienda, cuando han llegado a un cierto nivel de hidratacin, entran las amilasas y empiezan a actuar. Aunque la proporcin de grnulos daados suele ser baja, el efecto combinado de humedad y temperatura produce cambios drsticos en la estructura de los grnulos daados, que favorecen la amilolisis. Teniendo en cuenta los niveles de temperatura a los que se realizan las distintas operaciones de la panificacin, podemos distinguir tres fases: 1. 2. 3. Amasado y fermentacin. Coccin. Enfriamiento y almacenamiento.

Durante el amasado y la preparacin de las piezas, la temperatura se mantiene en torno a 25 C, por lo que la actividad amiloltica es moderada y prcticamente constante. El almidn no sufre mayor alteracin fsica que la hidratacin de los grnulos daados, sobre los que se produce la rpida accin de las amilasas. Sin embargo, los grnulos intactos, son totalmente impermeables a la beta-amilasa, y slo la alfa-amilasa provocar una hidrlisis lenta. Podemos simplificar el balance de la amilolisis en esta fase: Almidn daado + Agua + Amilasas >Dextrinas + Maltosa + Glucosa La maltosa es la fraccin ms importante de la fraccin de bajo peso molecular, producto de la amilolisis. Una vez transportada al interior de las clulas de levadura, puede ser desdoblada en dos molculas de glucosa, materia prima bsica para la fermentacin alcohlica que produce el dixido de carbono o gas carbnico, necesario para el desarrollo de la masa. Su comportamiento qumico es ste: C12H22O11 + H2O > 2 C6H12O6 Maltosa Agua Glucosa C6H12O6 > 2 CH3 CH2 OH + 2 CO2

86

Glucosa

Etanol

Dixido de carbono

C12H22O11 + H2O > 2 C6H12O6 Maltosa Agua Glucosa C6H12O6 > 2 CH3 CH2 OH + 2 CO2 Glucosa Etanol Dixido de carbono La produccin de CO2 es, pues, proporcional a la velocidad de formacin de maltosa por las amilasas. La produccin de maltosa es responsabilidad de la beta-amilasa, bien directamente de las cadenas de amilosa y amilopectina, o a partir de las dextrinas liberadas por las alfa-amilasas. El nivel de beta-amilasa de las harinas es ms que suficiente, por lo que su actividad la intensidad de la produccin de maltosa est, pues, parcialmente condicionada por el nivel de alfa-amilasa existente en la masa. As, cuando el contenido en amilasa natural de la harina es bajo, se mejora la velocidad de formacin de maltosa al aadir amilasa fngica al inicio del amasado, lo que es prctica habitual ya que la contienen los mejorantes panarios. Las dextrinas no transformadas en maltosa juegan un papel relevante en la retencin de agua y en la esponjosidad de la miga. Conforme se va degradando el almidn daado, parte del agua absorbida por estos grnulos pasa de nuevo a la masa, reducindose la consistencia de la misma. Un exceso de dextrinas contribuye a hacer pegajosa la masa. La actividad de las amilasas depende de la temperatura y de la acidez del medio. La coccin del pan se produce a una temperatura de unos 250 C y en presencia de vapor de agua, siendo una etapa tan importante como la fermentacin. El aumento de temperatura de la masa se produce de manera gradual desde el exterior hacia el interior de la pieza. Como en toda reaccin qumica, el aumento de la temperatura supone una aceleracin de las diferentes reacciones que constituyen la amilolisis. La existencia de un gradiente de temperatura entre la superficie y el corazn de la pieza aade un efecto de progresividad de los fenmenos que ocurren con el incremento de la temperatura. Primero se forma una fina pelcula en la superficie, que se mantienen flexible gracias al vapor de agua condensado sobre la misma. Por dilatacin de los gases que contiene, aumenta mucho el crecimiento de la masa . Adems, las actividades vitales de la levadura sufren tambin el efecto del aumento de temperatura, acelerndose la produccin de carbnico y alcohol. Cuando el interior de la pieza alcanza los 65 C, los grnulos de almidn sufren un violento hinchamiento acompaado de una salida de amilosa, precisamente cuando la actividad de las amilasas es mxima. Sin embargo, las enzimas, como cualquier protena, son sensibles al calor. Cuando se alcanzan los 70 C, la beta-amilasa y la amilasa fngica aadida, quedan inactivadas. La alfa-amilasa natural resiste hasta los 80 C. El efecto final de la amilolisis en esta fase, est directamente ligado a la cintica trmica interior de la pieza la velocidad con que aumenta la temperatura en su interior,

87

y al tipo de alfa-amilasa (natural o aadida; entre stas, fngica o bacteriana). La alfaamilasas fngicas se inactivan antes de la gelificacin total del almidn, con lo que su efecto en la coccin es mucho menor que el de las naturales o las microbianas. Los mejores resultados tecnolgicos se obtienen cuando existe un equilibrio ente alfa y beta amilasa. As, en una harina hiperdiastsica, la actividad de la beta-amilasa es insuficiente para transformar todas las dextrinas presentes, quedando parte que produce pegajosidad de la miga y corteza de color rojizas. Proceso de produccin de enzimas y aminocidos. Introduccin. Muchos grupos de investigacin en biotecnologa alimentara, han creado tecnologas que permiten el desarrollo de nuevos iniciadores, aminocidos, enzimas o herramientas de diagnstico con potencial aplicacin en la industria agroalimentaria. Una planta piloto de biotecnologa se ha diseado para generar, a escala piloto, la cantidad suficiente de productos. Algunos de estos se detallan a continuacin: o Microorganismos (bacterias, levaduras y hongos) para iniciadores en la industria agroalimentaria. o Aditivos alimentarios especficos (enzimas, colorantes, aromas). o Herramientas de diagnstico molecular para la deteccin de contaminantes microbianos o fraudes en alimentos. o Microorganismos probiticos (de utilizacin en salud, nutricin del consumidor, etc.). o Productos farmacuticos microbianos. o Insecticidas microbianos, productos fitosanitarios. o Validacin de procesos (biosensores). o Manejo de los distintos microorganismos usados como iniciadores en la industria alimentara (bacterias lcticas, levaduras y hongos filamentosos). o Produccin por va microbiana de aditivos.

o Diseo de mtodos de purificacin de protenas a partir de caldos de fermentacin.

o Adaptacin de tcnicas moleculares en alimentos. o Crecimiento de microorganismos en fermentadores de hasta 50 litros. o Optimizacin de procesos a partir de fermentadores de laboratorio. o Manipulacin de los caldos de cultivo tanto para la recuperacin de clulas como para la separacin de componentes de alto valor aadido. Descripcin de una planta productora de enzimas. Vista parcial de una planta piloto: fermentadores de 50 y 25 litros.

88

Se distinguen cinco zonas con funciones bien diferenciadas: 1.- Almacn: Se efecta la recepcin de materias primas, previa cuarentena de aquellas que la precisen. 2.- Laboratorio: Se realizan los controles de calidad de materia prima de acuerdo con la normativa vigente y se preparan las muestras para su tratamiento posterior considerando aspectos microbiolgicos, de reproducibilidad de muestras y de seguridad para evitar las contaminaciones. 3.- Zona de produccin: En esta zona se realizan los procesos de fermentacin y la preparacin de las muestras.

Fermentadores de 5 y 2 litros

89

4.- Sala de separacin: En esta etapa se realiza la recuperacin del producto de valor aadido o de inters, biomasa, protenas, aromas, etc.., mediante la utilizacin de tcnicas de: A. B. C. Separacin por filtracin tangencial Liofilizacin y secado Cromatografa lquida

5.- Sistema fermentador: El biorreactor dispone de sensores especficos que permiten la medida y el control "in situ" de las variables de una forma precisa y reproducible.

6.- Cepario: Se permite almacenar los productos obtenidos para garantizar la futura produccin y la seguridad. Se realiza la conservacin en ultra congelacin a - 80 C, mediante liofilizacin. 7.- Controles de calidad: En todas y cada una de las fases del proceso, y al finalizar el mismo, se realizan controles de calidad Variables implicadas: Los microorganismos crecern a una velocidad caracterstica que depende tanto de la composicin del medio de cultivo como de la temperatura, pH, oxgeno suministrado y condiciones de la mezcla. Por este motivo, durante el proceso de produccin se controlan mediante los oportunos sensores las siguientes variables:
o o o

pH temperatura presin parcial de oxgeno

90

o o

produccin de espumas

nivel.

AMINOCIDOS. Los aminocidos son molculas hidrocarbonadas de bajo peso molecular. nitrogenadas simples con cadenas

Todos los aminocidos, a excepcin de la glicina, tienen dos formas estructurales o estereoismeros: L y D. En las protenas animales todos los aminocidos presentes pertenecen a la serie L. Sin embargo, en ciertos casos el animal dispone de la capacidad enzimtica precisa para aprovechar la forma D, previa transformacin a la forma L correspondiente. As, por ejemplo, para la metionina ambas formas son totalmente disponibles. Para el triptfano la equivalencia est en torno al 90-100% en porcino pero slo es del 55 al 85% en aves. Los ismeros D de lisina y treonina no son biolgicamente activos por lo que no tienen valor para el animal. Lisina, metionina, treonina y triptfano son los aminocidos actualmente disponibles a precios competitivos para la fabricacin de piensos. Como hemos visto, la produccin de enzimas y aminocidos se efecta a travs de un proceso de fermentadores perfectamente controlados, existen diverso tipos de aminocidos y enzimas que pueden ser sintetizados por este proceso, entre ellos destacan los siguientes: La lisina. La L-Lisina es un aminocido esencial o constructor la protenas, que no se puede producir por el cuerpo y se debe obtener de otros alimentos. Ayuda a asegurar la absorcin adecuada del calcio y la formacin del colgeno para el hueso, el cartlago y el tejido conectivo. La lisina colabora en la produccin de anticuerpos, hormonas y enzimas. La lisina fortalece el sistema circulatorio y ayuda al sistema inmune a fabricar anticuerpos. Tambin colabora en el control el equilibrio cido - alcalino del cuerpo, tiene influencia sobre las glndulas pineal y mamarias as como en la vescula biliar. Es necesaria para la asimilacin de los aminocidos. Una deficiencia puede dar lugar a sensacin de fatiga, falta de concentracin , irritabilidad, los ojos rojos, crecimiento retardado, prdida del pelo, anemia y problemas reproductivos. La lisina libre o pura es altamente higroscpica lo que limita su uso directo en la fabricacin de piensos. La forma comercial ms frecuente es el monoclorhidrato de Llisina, que se obtiene mediante fermentacin oxidativa utilizando una fuente de carbono (azcar, almidn, melazas, etc) y una fuente de nitrgeno (sales amnicas, amonaco, hidrolizados proteicos, etc) como sustrato de los microorganismos. Tambin puede obtenerse mediante procesos qumicos enzimticos a partir del a-amino-e-caprolactama. Los productos comerciales actuales tienen una pureza mnima del 98% que se corresponde con un valor en lisina del 78% y un contenido en cloro cercano al 19-20%. Recientemente, se ha iniciado la comercializacin de la lisina lquida al 50% obtenida por un proceso similar al del clorhidrato. La diferencia ms notable con respecto a la L-lisina, aparte de la presentacin y de la riqueza en el aminocido, es que no aporta cloro. La ventaja prctica ms importante es la facilidad de manejo y de almacenamiento.

91

La metionina. La metionina se comercializa actualmente en dos formas: DL-metionina y DLmetionina hidroxianlogo (DL-2 hidroxi-4 metiltiobutanoico o HMB). La DL-metionina se obtiene por sntesis qumica a partir del propileno, metiltiol, metano y amonaco. El producto slido comercial tiene una riqueza superior al 99%, mientras que la presentacin lquida (sal sdica), menos utilizada por la industria, tiene una riqueza en metionina del 40%. Por su naturaleza qumica su contenido en Na y S es alto (6,2 y 8,6%, respectivamente). El hidroxianlogo est disponible en forma lquida, con un 88% de riqueza en el producto original, o en forma slida, como sal con un 12% de calcio. Se obtiene por sntesis qumica a partir del xido de calcio y del cido 2-hidroxi 3metiltiobutanoico. La equivalencia en metionina del precursor ha sido objeto de profundas discusiones en los ltimos 20 aos. Valores entre el 60 y el 100% han sido publicados en la literatura, con las cifras ms bajas obtenidas normalmente con dietas semisintticas. En las presentes tablas hemos adoptado el valor equivalente del 100% (880 g de metionina por cada Kg. de producto comercial) que es el valor recomendado por los proveedores del producto comercial. Adems, es un producto ligeramente cido, lo que potencia en cierta medida el control de hongos por antifngicos. La L-treonina. La L-treonina se obtiene preferentemente mediante un proceso fermentativo por microorganismos. Tambin puede obtenerse por aislamiento a partir de hidrolizados de protena para uso farmacutico. El producto comercial en fabricacin de piensos tiene una riqueza mnima del 98% y un equivalente en protena bruta en torno al 73-74%. El triptfano. El L-triptfano se obtiene mediante fermentacin a partir de la glucosa u otras productos carbonados como el indol. El producto comercial tiene un mnimo del 98% de riqueza y un equivalente en protena bruta del 85-86%. La sntesis qumica a partir del ster acetaminomalnico y fenilhidracina produce DL-triptfano, de menor disponibilidad en monogstricos y de escaso uso en la industria. Recientemente ha aparecido en el mercado una combinacin de triptfano y lisina sinttica excipientada en solubles de fermentacin. El producto contiene 55,3% de lisina y 15% de triptfano totalmente disponibles y su equivalente en protena es del 95%. El cido glutmico. El cido glutmico juega un papel importante en la funcin neuronal ya que es el principal neurotransmisor excitador del sistema nervioso central, participando en fenmenos tan importantes como el aprendizaje, la memorizacin y la plasticidad neuronal durante el desarrollo del cerebro. La fermentacin y, por consiguiente, los microorganismos tambin se utilizan para elaborar aditivos. La propiedad del cido glutmico (un aminocido usado para obtener glutamato monosdico) de potenciar el sabor fue descubierta en Japn a principios del siglo XX. Adems de dar sabor, los aminocidos son nutrientes esenciales, ya que son

92

componentes bsicos de las protenas. Algunos alimentos, como los cereales, contienen protenas con un contenido del aminocido lisina relativamente bajo. Puede aadirse lisina para mejorar la calidad nutricional de las protenas. Las fermentaciones en las que intervienen las bacterias Corynebacterium glutamicum y Brevibacterium flavum producen tanto cido glutmico como lisina. Sus funciones :

Es capaz de controlar el exceso de amonaco en el cerebro evitando as los daos que ste pueda causar. Participa en los procesos de produccin de energa para el cerebro. Junto con la vitamina B6 es precursor de un importante neurotransmisor, el cido gamma aminobutrico (GABA), con una importante accin sedante sobre el sistema nervioso. Ayuda a la produccin de cido clorhdrico. Ayuda a controlar el alcoholismo. Ayuda a la cicatrizacin de lceras. Alivia la fatiga, la depresin y la impotencia. Se usa en el tratamiento de la esquizofrenia y la demencia senil. Excelente en el tratamiento de las funciones normales de la prstata. Interviene especficamente en la utilizacin de la glucosa por las clulas del cerebro. Funciona como sistema de transporte de aminocidos y de nitrgeno desde tejidos perifricos hacia el hgado. Precursor en la biosntesis de las bases purnicas y primidnicas.

93

VI.- ANEXOS. PRACTICAS DE LABORATORIO PRACTICA N 1

ELABORACIN DE VINO OBJETIVO: El alumno obtendr una bebida tipo vino de frutas, a partir de un sustrato de frutas inoculando con levaduras mediante un proceso de fermentacin. INTRODUCCIN El vino es una bebida que se obtiene mediante fermentacin alcohlica del sumo de la uva fresca. Los <vinos> preparados a partir de otros frutos , como manzanas y grosellas, no deben llamarse vinos sin ms de ms, sino que debe aludirse a los productos vegetales de que proceden. El vino debe prepararse a partir de uva fresca. Resulta esencial que el vino se obtenga mediante fermentacin y que contenga alcohol. Una actividad que ha estado ligada a la mayora de las culturas durante miles de aos ha sido la produccin de bebidas alcohlicas. Evidencias arqueolgicas que demuestran que desde hace mas de 7000 aos de antigedad los humanos aprendimos a encausar las fermentaciones alcohlicas de diversos sustratos en forma emprica. Quiz las primeras bebidas se hicieron en base a sustratos azucarados como jugos de fruta, ya que estos solo requieren ponerse en contacto el jugo con la levadura silvestre presente en la superficie de la propia fruta. Fue hasta el siglo XV cuando empez a popularizarse el arte de la destilacin y de esta forma aparecen las bebidas con mayor contenido alcohlico. Debido a la gran importancia de estos productos la investigacin cientfica y tecnolgica generan industrias, las cuales son de mayor importancia econmica en el mundo.

III.

Bebidas Alcohlicas

Son soluciones acuosas que contienen adems de agua y alcohol sustancias orgnicas que ejercen influencia sobre los aromas y el sabor . Son bebidas obtenidas a partir de cualquier jugo vegetal que no sea de uva y que tienen propiedades organolpticas nuevas y atractivas para una prueba estadstica significativa de consumidores. HISTORIA DEL VINO Los hallazgos fsiles, que se remontaron hasta la Era Terciaria, y los descubrimientos hechos en construcciones lacustres (palafitos), permiten sacar la conclusin de que las formas primitivas de nuestra vid estaban difundidas por toda Europa, Norteamrica y Japn. Plantas absolutamente semejantes a las vides actuales aparecen slo en los sedimentos superiores de la Era Terciaria, habindose hallado hasta el presente nicamente en Grecia e Italia (Toscana y Piamonte). La obtencin del vino y las prcticas de viticultura tienen evidentemente su origen en los valles fluviales ricos en vides silvestres de Asia Menor. All habitaban pueblo indogermnicos que

94

deben que deben considerarse antecesores inmediatos del cultivo de la vid y de las prcticas viticultoras. Los colonizadores griegos se encargaron de extender el cultivo de la vid a Italia y sur de Francia (Marsella). Los griegos llamaron al sur de Italia pas del vino (Oinotria). iii. COMPOSICIN QUMICA DEL VINO. La composicin de un vino y sus caractersticas dependen de la clase de uva, de la localizacin y suelo de la via, del tiempo atmosfrico reinante durante el desarrollo y maduracin, del grado de madurez de los racimos y del estado sanitario de los mismos. Tambin influyen sobre la composicin y calidad de un vino el tratamiento del mosto, tipo fermentacin, levaduras actuantes y los cuidados prestados al vino durante su maduracin. De acuerdo con su parentesco qumico y desde el punto de vista analtico, las sustancias que componen el vino se clasifican en los siguientes grupos: alcoholes, cidos, hidratos de carbono, tanino y pigmentos, compuestos nitrogenados y sales minerales. A dems contienen el vino pequeas cantidades de pectina, polisacridos, aldehdos, steres, terpenos y por lo comn tambin algo de cido carbnico y cido sulfuroso. Todas estas sustancias estn disueltas en agua, que constituye el 85 90 % del total del vino. Los compuestos no voltiles de los citados se renen en Qumica Enolgica bajo la denominacin de extracto. El valor de la calidad de un vino depende de manera muy particular de su contenido de alcohol etlico (etanol), extracto, azcar, cidos y sustancias del buqu. MATERIALES Y REACTIVOS. 4 matraces erlenmeyer redondos de fondo plano de 500 ml. 1 refrigerante 1 matraz erlenmeyer de 250 ml. 1 probeta de 100 ml. 1 tina para bao Maria 1 soporte universal 1 pinza de tres dedos 1 anillo metlico 1 tela de asbesto 1 mechero bunsen 1 parrilla de calentamiento 1 estufa para incubacin 1 alcoholmetro 1 termmetro 1 bureta automtica 1 pipeta de 10 ml. 1 potencimetro 1 refractmetro 0-30 1 bureta de 50 ml pinzas para bureta

95

1 embudo de filtracin 1 cuchillo 1 campana de flujo laminar 3 matracez erlenmeyer de 125 ml. 1 baso de precipitado de 1000 ml 2 vasos de precipitado de 250 ml 1 baso de precipitado de 1000 ml 1 matraz volumtrico de 1000 ml 1 matraz volumtrico de 100 ml 3 matracez de 500 ml 1 licuadora 1 extractor de jugos Centrifuga Balanza analtica Etiquetas Gasas Algodn Papel estraza Mangueras ltex Hielo Fenolftaleina NaOH 0.1 N Solucin Buffer PH 4, 7, 10. Azul de metileno Felhing A y B Sacarosa Na Cl TCNICA: a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) l) m) n) o) Se selecciona la materia prima (fruta). Se desinfecta la fruta. Mondar y picar la fruta. Licuar para obtener la pulpa (sin agregarle agua). Determinar la humedad de la pulpa. Cuando se tenga lista la pulpa, este se vaca 100 ml en un matraz volumtrico ( 1000 ml), se le agrega la cantidad de azcar calculada y agua hasta aforar. Esto se realiza en dos matraces. Homogenizarlo y determinar los Brix, que debe dar un valor de 18B. Determinar azcares reductores totales del jugo. Determinar acidez del jugo. Una vez que el jugo est bien homogenizado y se haya obtenido los B, verter 50 ml de jugo en cada matraz erlenmeyer de 500 ml. Esto se realiza en 4 matraces de 500 ml. Tapar los matraces con un tapn de algodn y con un caperucho de papel estraza. Poner a hervirlos en la parrilla de calentamiento. Dejarlos de enfriar En 2 matraces se le agrega 0.5 g de levadura y en los otros 2 matraces se le agrega 1.5 g de levadura. Meter los matraces a la estufa que se encuentra a 28C.

96

p) q) r) s) t) u) v)

2 matraces salen a las 25 hrs. que contiene 0.5g de levadura. 2 35 hrs. que contiene 1.5g de levadura. 2 45 hrs. que contiene 1.5g de levadura. 2 a las 55 hrs. que contiene 2.5g de levadura. Filtrar el jugo en algodn o con papel estraza. Centrifugar. Realizar determinacin de pH, Acidez, concentracin de alcohol y la prueba de evaluacin sensorial.

DETERMINACIN DE ACIDEZ: Verter 20 ml de vino en un vaso de precipitado. Agregarle carbn activado hasta que desaparezca el color del vino. Se pone a hervir. Se deja enfriar un poco y enseguida se filtra. Agregarle 3 gotas de fenolftalena y despus titular con hidrxido de sodio hasta obtener un color rosa. Se realiza el mismo procedimiento para los siguientes matraces que contienen vino de diferentes hrs. Y diferente cantidad de levadura.

CONCENTRACIN DE ALCOHOL: Colocar el refrigerante en el soporte universal. Verter 50 mL de vino y 50 ml de agua en un matraz erlenmeyer (500ml). Tapar el matraz con un tapn y colocar el termmetro dentro del matraz. Conectar con el refrigerante de modo que no se escape el vapor cuando este empiece a hervir. A un extremo del refrigerante se coloca la parrilla para poner a hervir dicha solucin. Cuando empiece a hervir, en el otro extremo del refrigerante se coloca un vaso de precipitado para recolectar 50 ml del destilado (alcohol). Se determina el alcohol con el alcoholmetro. Se realiza el mismo procedimiento para los dems matraces que contienen vino de diferentes horas y diferente cantidad de levadura.

97

PRACTICA 2 Cerveza Negra Clsica OBJETIVO: El alumno obtendr una bebida denominada Cerveza Negra Clsica , a partir de un sustrato de cebada inoculando con levaduras mediante un proceso de fermentacin. INTRODUCCIN Vieja amiga del hombre, era ya conocida por egipcios y babilonios 4.000 aos a.C., el espaol Pizarro cuando conquista los Andes descubri que los Incas la fabricaban a partir del maz fermentado (chicha). Bebida caracterstica de los pueblos del norte europeo, se elabora a partir del malteado de varios cereales como el maz y la avena, aunque generalmente se utiliza cebada. Para su produccin se debe partir del malteado de la cebada que se transforma en malta, para ello se humedece la cebada y se la deja una semana para que germine, se corta el proceso y se procede a secarla, si se quiere obtener cerveza negra se la debe tostar. El paso siguiente es el molido de la malta, paso siguiente es el braceado que consiste en mezclar la malta con agua caliente hasta obtener una pasta espesa. El almidn de la malta se transforma en azcares fermentados; se filtra el lquido pasndolo a otro recipiente en donde se calentara hasta el punto de ebullicin, antes de que hierba se le incorpora un poco de lpulo que le dar ese sabor amargo caracterstico y exquisito. Se la pasa a las cubas de fermentacin en donde se baja la temperatura y se agrega una seleccin de levaduras, elemento muy importante para obtener una buena cerveza, al igual que el agua que debe ser de la mejor calidad y en lo posible de manantial natural y con poca dureza y acidez, en s, debe ser neutra y con excelentes caractersticas. Para la fermentacin existen dos tcnicas, una es la que se realiza en fro, a 5, y dura una semana o dos, luego se la lleva a una fermentacin secundaria o maduracin a una temperatura de 1 a 2 grados, durante 4 a 5 semanas. La otra fermentacin es en caliente, o de modo natural, a temperaturas ms altas y el periodo de maduracin fermentacin secundaria- se realiza en pocos das. Las cervezas comerciales se pasteurizan para estabilizarlas, sobre todo cuando son destinadas a la exportacin, cosa que no ocurre con las artesanales, que no pueden perder su cadena de fro, ya que se trata de un producto perecedero, se la debe consumir en corto tiempo. Otro detalle es que se debe conservar en recipientes de vidrio oscuro o cermica ya que se deteriora rpidamente con la luz. Ingredientes: 2 kgs. Extracto de Malta lquido 1 oz. Bittering Lpulo 1 oz. Lpulo Final 1 cucharadita de t Irish moss taza Priming Sugar 50 unidades y Tapas para botellas 1 cucharadita de Levadura Nottingham Ale Equipo: 1 cacerola de 10 litros aprox. 1 batidor 1 cuchara larga 1 espumadera 1 fermentador (5 galones) 1 hidrmetro 1 termmetro 1 embotelladora 1 Airlock (trampa de aire) 1paq. De solucin blanqueadora para esterilizar (One Step No-Rinse Cleaner) 1 tubo para embotellar 1 sifn 1 bottling bucket 1 grifo

98

1 colador Procedimiento:

50 botellas de 250 cm3

Cheque los ingredientes y equipamiento para asegurarse de tener todo antes de comenzar. Esterilice TODOS los instrumentos y el lugar de trabajo. Utilice barbijo y guantes de goma para mantener las condiciones de asepsia. Ponga 2 a 2 galones de agua en una cacerola y lleve al fuego. Cuando sta hierva, squela e introduzca los dos paquetes de extracto de malta y bata vigorosamente. Nota: el extracto de malta se mezclar ms fcilmente si la deja reposar en agua caliente por 10 minutos. Agregue el bittering lpulo directamente en la cacerola. Ponga al fuego nuevamente hasta que alcance el hervor. Deje esta mezcla (mosto) hierva por 45 minutos batiendo ocasionalmente. Agregue al mosto el lpulo final junto con el Irish moss y deje hervir por 15 minutos ms. Saque la cacerola del fuego; usando una espumadera remueva el lpulo de la superficie y deschelo. Introduzca la cacerola en una pileta de agua fra y recambie el agua hasta que el mosto alcance una temperatura por debajo de los 100 F, preferentemente 80/85 F. En el fermentador esterilizado ponga 2 galones de agua a 55/60 F y agregue el mosto enfriado. Mezcle bien y agregue agua hasta alcanzar la marca de los cinco galones y la temperatura sea de 70 F; revuelva. Usando el hidrmetro, mida la gravedad especfica, el porcentaje de azcar y el de alcohol y vuelque la informacin obtenida en la bitcora. En una taza esterilizada, hidrate la levadura no ms de 15 minutos en 4 a 6 onzas de agua a una temperatura de 90 F. Luego, agrguelo al mosto. Finalmente, introduzca en la boca del fermentador la trampa de aire esterilizada y llene esta misma con agua hasta alcanzar la marca intermedia. Site el fermentador en un lugar con una temperatura ideal de 68 a 72 F y fuera del alcance de la luz solar. En 12 a 72 horas ver burbujas en la trampa de aire. Eso indicar que el proceso de fermentacin ya ha comenzado y la levadura est comiendo el azcar para producir alcohol y dixido de carbono. De 3 a 7 das despus las burbujas comenzarn a desaparecer. Utilice el hidrmetro para chequear la gravedad especfica. Si obtiene la misma lectura en los siguientes 3 das, la cerveza estar lista para embotellar. La gravedad final es usualmente un 25 % mayor que la inicial. Por ejemplo: Inicial 1,044 ; Final 1,011. Use botellas retornables nicamente. No utilice botellas a rosca. Limpie y esterilice las botellas con la solucin blanqueadora y cbralas con un plstico para evitar la contaminacin area. Caliente 1 taza de agua en una cacerola y disuelva en ella taza de priming sugar. Enfre y vuelque el azcar en el bottling bucket. Utilizando un sifn esterilizado, transfiera la cerveza del primer fermentador al bottling bucket. NO SALPIQUE! Esterilice las tapas. Embotelle la cerveza dejando 1 cm. de espacio entre la tapa y el lquido. El priming sugar proveer en la segunda fermentacin la carbonatacin. Almacene las botellas a temperatura ambiente en un lugar oscuro por al menos 10 das. La cerveza estar lista para consumir. Disfrtela!

99

PRCTICA No. 3 CURVAS DE CRECIMIENTO MICROBIANO OBJETIVO. Utilizar algunos mtodos para evaluar el crecimiento de los microorganismos. INTRODUCCIN. El crecimiento celular se define como un aumento ordenado de la cantidad de los constituyentes y las estructuras celulares. Este crecimiento lleva a un incremento en el tamao y peso de las clulas lo que, en la mayora de los microorganismos, conduce a la divisin celular, dando por resultado el aumento en el numero de clulas (crecimiento poblacional). Es importante no confundir este concepto con el de crecimiento individual que implica solamente el aumento de tamao, volumen y diferenciacin dentro de un mismo individuo. En general cuando se habla de crecimiento en bacterias se refiere a crecimiento poblacional. En la mayora de las bacterias, el crecimiento se lleva a cabo por un proceso que se conoce como fisin binaria, durante el cual todos los componentes estructurales de la clula se duplican. El producto de la divisin celular genera el ciclo celular que en bacterias puede ser muy sencillo como el de Escherichia coli (fig. 1).

En el crecimiento bacteriano se involucran aproximadamente 2000 reacciones qumicas como son: Reacciones de transformacin de energa. Biosntesis de molculas pequeas. Biosntesis de cofactores y coenzimas. Reacciones de polimerizacin, como la sntesis de RNA, DNA y protenas. El tiempo requerido para que se lleve a cabo la fisin binaria se conoce como tiempo de generacin que es el intervalo necesario para que se formen dos clulas a partir de una. Los tiempos de generacin varan entre los diferentes microorganismos y dependen del medio y condiciones de cultivo o hbitat en el que se encuentran (tabla1).

100

Las poblaciones microbianas muestran un patrn de crecimiento caracterstico donde el nmero de clulas se duplica por unidad de tiempo, al que se llama Crecimiento exponencial. Experimentalmente esto se puede observar mejor si se hace una grfica del nmero de clulas a diferentes tiempos, obtenindose una lnea recta (fig. 2). Esta grfica se puede utilizar para calcular el tiempo de generacin de una bacteria determinada (en el ejemplo es de 2 horas).

101

Los datos presentados en la figura anterior reflejan slo una parte del ciclo de crecimiento de una poblacin bacteriana. La curva completa de crecimiento de cualquier poblacin bacteriana (fig. 2), la cual se puede dividir en las siguientes fases:

a) Fase Lag o de adaptacin: la cual puede ser corta o larga dependiendo de el medio del que proviene la cepa, las condiciones del medio y del estado de desarrollo de la poblacin microbiana. As, por ejemplo, si tomamos un inculo de un cultivo bacteriano que est creciendo activamente y lo ponemos en un recipiente con un medio de cultivo igual y lo incubamos en las mismas condiciones ambientales, la fase lag puede ser muy corta o no presentarse. Por el contrario, si tomamos un inculo de un cultivo viejo al ponerlo en otro matraz con el mismo medio, la fase lag se presenta, debido a que las clulas necesitan de un determinado tiempo para inducir y volver a sintetizar los constituyentes que se requieren para su crecimiento. En esta fase, aunque no se presente un incremento en el tamao y en la actividad celular, provocando con esto un aumento en la sntesis de macromolculas. En primer lugar aumenta el RNA y poco tiempo despus la sntesis del DNA y de protenas. Esta diferencia en la sntesis de macromolculas durante el periodo inicial de cambio o fase lag se conoce como crecimiento desbalanceado. b) Fase Exponencial: En esta etapa las clulas se duplican en nmero y en masa cada vez que transcurre un cierto tiempo. La velocidad del crecimiento exponencial depende de las caractersticas genticas del microorganismo, de las condiciones y medio de cultivo. En cualquier caso, la velocidad de crecimiento se mantiene constante durante esta fase. Aqu se producen los llamados metabolitos primarios (por ejemplo, aminocidos). Mientras menor sea la pendiente de esta fase, mayor ser el tiempo de generacin. Debido a que durante el crecimiento exponencial, todos los constituyentes bioqumicos se estn sintetizando ms o menos a la misma velocidad se conoce como crecimiento balanceado. Aunque la fase exponencial no se puede mantener por mucho tiempo en un sistema o cultivo cerrado, si es posible mantenerla indefinidamente en un sistema de cultivo continuo diseado para proveer nutrientes frescos y eliminar continuamente los desechos metablicos del cultivo. Existen dos tipos principales de cultivo continuo: el quimiostato y el turbidostato.
En el quimiostato, se va adicionando medio fresco al cultivo microbiano a la mismo velocidad que se va eliminando parte del medio que contiene microorganismos. El medio de cultivo de un quimiostato generalmente posee un nutriente esencial (como un aminocido) en cantidades limitadas y debido a esto, la velocidad del crecimiento est determinada por la velocidad a la cual se est adicionando el medio fresco al cultivo microbiano, La velocidad de este intercambio de nutrientes se expresa como la velocidad de dilucin, la cual relaciona la velocidad del flujo del medio fresco con el volumen total del cultivo microbiano. As, cuando la velocidad de dilucin aumenta, el tiempo de generacin del microorganismo disminuye, es decir la velocidad de crecimiento se incrementa; pero se tiene que controlar muy bien la velocidad de dilucin ya que si esta ltima es muy alta, los microorganismos pueden ser completamente eliminados del cultivo donde estn creciendo (cuando la velocidad de crecimiento). El turbidostato posee una fotocelda que mide la absorbancia o la turbidez del crecimiento microbiano dentro del reservorio; as, la velocidad de flujo del medio fresco hacia el cultivo microbiano se regula automticamente y de esta forma se mantiene una determinada turbidez o densidad celular. El medio de cultivo de un turbidostato no posee

102

ningn nutriente limitante y mientras que el quimiostato es ms efectivo a velocidades de dilucin bajas, el turbidostato trabaja mejor a velocidades de dilucin altas.

c) Fase Estacionaria: Esta etapa se presenta en un sistema cerrado y es debida principalmente a que un nutriente esencial del medio de cultivo se termin o a que un producto de desecho del microorganismo en crecimiento es inhibitorio para l mismo. Tambin se puede producir porque la poblacin microbiana no puede seguir creciendo debido a que en el medio ya no existe espacio fsico para que esto ocurra. En esta fase el nmero de microorganismos se mantiene ms o menos constante en un estado al que se conoce como crecimiento crptico. Al mismo tiempo, se producen cierto metabolitos celulares llamados metabolitos secundarios como los antibiticos, pigmentos. En las bacterias esporuladas, las esporas se producen precisamente en esta fase de desarrollo. Cuando existen dos fuentes de carbono en concentracin limitantes pueden desarrollarse dos fases exponenciales y dos estacionarias dando forma a una curva de crecimiento diaxico (fig. 3)

d) Fase de Muerte: En esta fase la cuenta total de microorganismos puede permanecer constante, medida por cuenta directa al microscopio o absorbancia, pero la cuenta viable disminuye. En algunos casos, la muerte se acompaa de destruccin o lisis celular con la subsecuente disminucin en la turbidez del cultivo o en la cuenta microscpica directa. Generalmente la muerte de una poblacin microbiana ocurre en forma logartmica.
Existen muchas formas de aplicar los conocimientos adquiridos acerca de una curva de crecimiento en las diferentes reas de la Microbiologa; as por ejemplo, el microbilogo industrial involucrado en la produccin de alcohol intentar disminuir el tiempo de la fase lag e incrementar el de la fase exponencial de su cultivo y de esta manera obtener una produccin mxima de alcohol en un tiempo mnimo. Por otro lado, el microbilogo clnico determinar la reaccin de Gram de los cultivos que se encuentren en la fase exponencial de crecimiento ya que se sabe que durante la fase estacionaria la pared celular puede no sintetizarse en forma ptica dando variabilidad a esta tcnica de tincin. Al contrario, en la produccin de levadura para alimento, el microbilogo obtendr el cultivo de inters durante la fase estacionaria, ya que es en sta donde la masa celular llega a su mximo nivel. Es muy importante para un microbilogo conocer y estudiar el crecimiento microbiano durante la fase exponencial, ya que esto contribuye a la investigacin bsica

103

en fisiologa y ecologa microbianas y a la solucin de varios problemas que se presentan en el rea de la microbiologa industrial. As, cuando un medio de cultivo se incula con una sola clula que se divide cada 20 minutos, la poblacin total ser de dos clulas despus de transcurridos los primeros 20 minutos, de cuatro clulas despus de 40 minutos y as sucesivamente. Debido a que la poblacin se est duplicando cada vez que las clulas se dividen, podemos expresar con base de 2 el crecimiento exponencial de la siguiente forma: 21 ----- 22 ----- 23 ----- 24 2n (1)

donde n representa el nmero de generaciones. De esta forma, empezando con una clula, la poblacin total o final Nf despus de n generaciones ser: Nf=1 x 2n (2)

Si la poblacin original o inicial no es una sino cientos o miles de clulas, expresamos la poblacin final como: Nf = No x 2n (3)

Donde No representa el tamao de la poblacin original al tiempo cero. Para determinar el valor de n se transforma la ecuacin anterior a logaritmos con base 10, obtenindose: Log Nf = log No + n log 2 Si de aqu despejamos n n = logNf-logNo Log2 Para simplificar la ecuacin, substituimos el valor del log de 2: N = logNf-logNo 0.301 (6) (4) (5)

As, conociendo la poblacin inicial No y la poblacin final Nf, se puede calcular el nmero de generaciones n que se han producido despus de un tiempo de incubacin t. Por otro lado, el tiempo de generacin o duplicacin T de una poblacin microbiana es igual a tiempo de incubacin t dividido entre el nmero de generaciones n: T= t n Despejando n, tenemos que: N= t T (8) (7)

104

Substituyendo la ecuacin (8) en la (6): t T = Log Nf- log No Tx0.3010 (9)

En algunos casos se requiere conocer el comportamiento de una poblacin microbiana dentro de una curva de crecimiento que presenta una determinada fase lag, en estos casos, la ecuacin (9) se modifica y tenemos que: t-L = T log Nf logNo T x 0.3010 (10)

Donde L es el tiempo de duracin de la fase lag y t, T, Nf y No tienen los significados establecidos anteriormente. Otra de las formas matemticas de considerar el crecimiento exponencial es mediante el uso del clculo diferencial, el cual toma como base que dentro de una poblacin heterognea (poblacin donde existe una mezcla de clulas que se encuentran en un estadio diferente del ciclo celular) una pequea fraccin de esta poblacin est dividindose en un tiempo dado y est contribuyendo con esto a un aumento infinitesimal en el tamao de la poblacin. Por lo tanto, si consideramos una poblacin inicial No a un tiempo t=0, entonces despus de un intervalo pequeo de tiempo dt, una pequea fraccin de los organismos presentes en No completar su ciclo celular, dividindose y aumentando el tamao de la poblacin en dN. Considerando que la magnitud de dN depende del tamao de No a un dt constante, la velocidad del cambio celular o ms comnmente conocida como la velocidad de crecimiento de la poblacin ser directamente proporcional al tamao de la poblacin inicial. Lo anterior lo podemos expresar como: dN No dt substituyendo la proporcionalidad por una constante: dN = No dt donde es una constante de proporcionalidad conocida como la velocidad especfica de crecimiento y cuyas unidades son: t -1 o bien, h 1 o 1 h (12) (11)

105

dichas unidades se obtienen si despejamos de la ecuacin (12): g = dN 1 dt No = l h 1 g = 1 = h h -1

tiene un significado biolgico muy preciso, es la medida del nmero de individuos nuevos producido por un nmero dado de individuos ya existentes en un tiempo fijo de crecimiento. Ahora bien, con este tipo de planteamiento matemtico podemos calcular tanto la velocidad especfica de crecimiento como el tiempo de generacin de un microorganismo determinado. Por lo que si integramos la ecuacin (12), obtenemos: dN = No dt Nt = Noe
t

(13) (14)

Si transformamos la ecuacin anterior con logaritmos naturales: In Nt = In No + t

En este modelo, el tiempo en que se duplica la poblacin ser: t= 1n2 Por lo tanto, con estas dos ecuaciones (14 y 15) podemos calcular las variables que se mencionaron en prrafos anteriores. El crecimiento poblacional puede obedecer a un modelo exponencial slo bajo circunstancias especiales (de laboratorio generalmente) y por periodos cortos, pues ninguna especie exhibe en realidad un patrn de incremento indefinido debido a que algn factor limita su crecimiento. (15)

106

En general, conforme aumenta la cantidad de clulas en un medio dado, la tasa de incremento dN/dt disminuye gradualmente hasta que alcanza un valor de cero, en donde la densidad de la poblacin llega a un mximo; esta mediante una curva como la que se muestra en la Fig. 4b, que en general puede ser descrita adecuadamente por la ecuacin logstica de crecimiento de Verhulst-Pearl y que se expresa de la siguiente forma: dN = N (K-N) = N(1 N) k k (16)

En esta ecuacin, la letra K se conoce como la capacidad portadora del medio y representa la densidad de poblacin mxima que de manera estable puede soportar un ambiente dado y en la que por definicin = 0, y, dN = C dt dN La disminucin en la tasa de crecimiento dt se logra mediante una retroalimentacin negativa de la densidad, haciendo que cada clula que se agregue a la poblacin produzca una reduccin en la velocidad de crecimiento; dicho mecanismo retroalimentador queda manifiesto mediante el trmino 1-N K En el caso del crecimiento exponencial la velocidad especfica de crecimiento se mantiene constante, pero en el modelo logstico sta va disminuyendo a medida que N, el nmero de individuos, tiende al valor de K, lo cual expresa se expresa de la siguiente manera: dN1 = (1 N ) dt N K N Conforme N aumenta, la razn K se aproxima cada vez ms a la unidad y el trmino entre parntesis finalmente llega a hacerse igual a cero, indicando que cuando N=K, la poblacin se mantiene estable y el crecimiento efectivo es nulo. Si efectuamos una modificacin a la ecuacin (17), obtenemos: N = (1 N) = - (N) d Ndt K K (18) (17)

Esta expresin representa la ecuacin de una recta con una ordenada al origen igual a , una pendiente negativa igual a y que corta al eje de las abscisas cuando N = K (y cuando dN = 0 (ver Fig. 5).

107

En el modelo logstico del crecimiento existen dos densidades en las que dN=0 dt , una que corresponde a los inicios del desarrollo cuando N es muy pequea y representa una poblacin crtica por debajo de la cual la poblacin no se desarrollar y la otra corresponde a la densidad mxima en la que semantiene una poblacin estable. As conforme N aumenta, tambin lo har dN hasta que se alcanza un incremento mximo cuando el tamao de la dt poblacin es igual a k , que es donde se presenta el punto de inflexin de la curva de crecimiento (fig. 2). A densidades mayores, cuando N tiende al valor de K, dN empieza a dt disminuir asintticamente hasta que en N = K alcanza un valor de cero y en donde no hay un crecimiento efectivo, sino de reposicin de clulas, es decir, las clulas muertas se substituyen por las que se estn dividiendo, mantenindose un nmero estable de organismos. Si se construye una grfica de dN con respecto al tiempo se obtiene una curva en forma de campana como dt la mostrada en la Fig. 2, la cual representa la grfica tpica de la expresin diferencial de la ecuacin Verhulst-Pearl; sin embargo , para el ajuste de datos experimentales se emplea la forma integrada de la ecuacin (16), que se expresa de la siguiente manera: Nt = K (1+e
a-f

(19) )

108

en donde Nt es el tamao de la poblacin al tiempo t, ; K, y t tienen los significados ya mencionados y a es una constante surgida de la integracin de (16), la cual se define como: a= Iv (K-No) No En la que No es la poblacin inicial. La grfica descrita por la ecuacin (19) es una curva sigmoidal como la mostrada en la Fig.6

109

Para el clculo de las constantes de la ecuacin (19), trabajando con datos experimentales, sta se transforma para obtener: 1v (K-N) = a - t (20) N Que de acuerdo al modelo de crecimiento logstico representa la ecuacin de una recta que tiene una pendiente negativa (fig. 5). Para efectuar el clculo de la pendiente y de la ordenada al origen a se tiene que utilizar la ecuacin (20) y se requiere de una estimacin inicial de K que junto con las observaciones de N a los correspondientes ts obtenidos en el desarrollo de la poblacin nos permite, a su vez, efectuar una regresin lineal de 1 n K-N N Contra t mediante el mtodo de los mnimos cuadrados. Para determinar el crecimiento bacteriano se pueden utilizar diferentes mtodos, ya sean directos o indirectos. Entre los tres principales mtodos directos se encuentran: A) La cuenta directa al microscopio: donde se utiliza la cmara de PetroffHausser y se cuentan directamente las bacterias presente en una muestra dada, posteriormente esta cuenta se multiplica por un factor para finalmente determinar el nmero de bacterias/ml. B) La cuenta viable: en la cual se realizan diluciones de la muestra original y una alcuota de stas se siembra en el medio de cultivo adecuado, expresndose el resultado como el nmero de bacterias o unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) segn sea el caso. C) La medicin de la turbidez: la cual puede efectuarse debido a que las bacterias absorben y desvan cierta cantidad de luz, permitiendo de esta forma medir el grado de turbidez del cultivo. Esto ltimo se realiza con la ayuda de un fotocolormetro con un filtro rojo o azul o un espectrofotmetro y la lectura se expresa en unidades de absorbancia. Para organismos unicelulares la absorbancia es proporcional al nmero de clulas. Dentro de los mtodos indirectos, podemos mencionar: A) La medicin de algn componente celular, como las protenas o el ATP. B) La medicin del consumo de la fuente de carbono del medio de cultivo. C) La medicin en el cambio de algunas variables fisicoqumicas como el pH. CRECIMIENTO DE HONGOS Cuando una espora germina, emite un filamento o hifa que se alarga y ramifica rpidamente a medida que va creciendo, formando as un conjunto de hifas llamado micelio. El crecimiento de los hongos se lleva a cabo en los pices de las hifas por lo que se le conoce como crecimiento apical. Este crecimiento se puede ver al microscopio de luz con un hongo de crecimiento rpido como Neurospora crassa el cual crece a una velocidad de 40 m/min. a 25C. Tambin se ha visto un movimiento neto del citoplasma hacia el pice de la hifa, por lo tanto, para que el pice de la hifa crezca tiene que utilizar el material citoplsmico que viene de atrs. Por otro lado, se sabe que el pice hifal tambin est rodeado por la pared celular, aunque sta es ms delgada y ms plstica que la que se Presenta en el resto de la hifa. Por lo tanto, en el crecimiento de la hifa deben intervenir tanto una degradacin como una sntesis de pared celular de una manera balanceada.

110

Hace tiempo se observaron en los pices hifales ciertas vesculas que aparecan cuando la hifa estaba creciendo y desaparecan cuando dejaba de crecer. Dichas vesculas no se han caracterizado completamente pero presentan varios precursores para la biosntesis de pared celular y algunas enzimas murolticas. En la Fig. 6 se observa una representacin hipottica de lo que sucede con las vesculas en la pared celular del pice hifal. No se sabe cual es el mecanismo del movimiento de estas vesculas hacia el pice, pero se ha sugerido que puede ser: a) por un gradiente electrognico a travs de la hifa, b) por un flujo electroosmtico de agua hacia el pice, o c) por un sistema de microtbulos o microfilamentos. Tambin se ha observado que cuando la espora germina existe una fase inicial de hinchazn donde aumenta de tamao debido a la entrada de agua y que, por lo tanto, dicha espora tiene que sintetizar pared celular nueva de una manera ms o menos uniforme. Posteriormente la hifa joven llamada tubo germinativo emerge de la espora y es en el pice de esta estructura donde la sntesis de pared celular empieza a ocurrir. (fig. 7) En otras palabras, la germinacin de la espora involucra una fase inicial donde la pared celular se sintetiza de forma no polar u homognea en la superficie de la espora seguida de una sntesis polar en el pice de tubo germinativo.

Cul es el mecanismo de ramificacin de las hifas una vez que la primera de ellas ha germinado y ha formado el tubo germinativo? 1.- Se sabe que los hongos muestran un crecimiento con dominancia apical aunque no se conoce el control de dicha dominancia. Las ramificaciones hifales van apareciendo slo un poco atrs de los pices. 2.- Las ramificaciones divergen unas de otras, es decir, crecen hacia direcciones opuestas, quiz respondiendo al gradiente de nutrientes del medio de cultivo o a la presencia de inhibidores producidos por la hifa ya existente (fig. 8). 3.- La densidad de una colonia fngica o el nmero de ramificaciones que forma est directamente relacionada con la cantidad de nutrientes en el medio. 4.- Se han observado los diferentes estadios de desarrollo de las colonias fngicas jvenes y se encontr que la unidad de crecimiento hifal G se puede expresar de la forma siguiente: G= Longitud total del micelio Nmero de pices hifales

111

Despus de fluctuaciones que se presentan al comienzo del crecimiento, el valor de G se mantiene constante conforme la colonia se desarrolla, siendo dicho valor caracterstico para cada hongo, por ejemplo, para Geotrichum es de 160 m y para Neurospora es de 120 m. Al mismo tiempo, se puede calcular la velocidad especfica de crecimiento se relaciona con la velocidad de crecimiento radial y el dimetro de la colonia W, como sigue: Velocidad de crecimiento radial = W El crecimiento de los hongos filamentos se puede poner de manifiesto por varios mtodos, como son la determinacin del crecimiento radial, del crecimiento longitudinal, del peso seco y del peso hmedo. REACTIVOS, MATERIALES Y EQUIPO. Tubos de ensaye de 16 x 150 c0n 4.5 ml de agua destilada estril Cajas de Petri con gelosa nutritiva Pipetas estriles de 1 y 10 ml Tubos de Ryan con gelosa Sabouraud Cajas de Petri con gelosa Sabouraud Matraces nefelomtricos con 25 ml de medio E +0.25% de glucosa Tubos para fotocolormetro Klett-Summerson Probeta de 200 ml limpia Matraces Erlenmeyer de 125 y 500 ml. Cepas: Escherichia coli, Penicillium sp., Aspergillis sp., Rhizopus sp., Fusarium sp. METODOLOGA. I.- Cuenta de bacterias por el mtodo nefelomtrico. 1.- Inocular un matraz nefelomtrico que contenga 25 ml de un cultivo de 12 horas de E. Coli. 2.- Homogeneizar el inculo en el medio y medir la turbidez del cultivo en fotocolormetro Klett-Summerson (tiempo cero). Incubar el matraz en un bao de 37C. El cero del fotocolormetro se ajusta con medio E sin inocular. 3.- Realizar lecturas como en el punto 2 cada 0.5 horas durante 7 horas, manteniendo el cultivo a 37C. II.- Cuenta viable del inculo bacteriano original. 1.- Marcar del 1 al 10 dos series de 10 tubos que contienen 4.5 ml de agua destilada estril. 2.- Agregar al primer tubo 0.5 ml del cultivo joven (12h) de E. Coli. 3.- Efectuar diluciones decimales hasta 10-10. 4.- Colocar o.1 ml de las diluciones 10-6 a 10.10 en la superficie de 5 placas de gelosa nutritiva marcadas previamente con la dilucin correspondiente (hacer lo anterior por duplicado). 5.- Extender con la varilla de vidrio previamente esterilizada. 6.- Incubar a 37C durante 24-48 horas. III.- Determinacin de la relacin de la turbidez como unidades KlettSummerson (U.K.) y la concentracin bacteriana. Esta determinacin no es necesario realizarla en condiciones de esterilidad, ni con material estril. 1.- Colocar 4.5 ml del cultivo original de E. Coli en un tubo para fotocolormetro Klett-Summerson y medir su turbidez.
112

2.- Realizar el siguiente esquema de diluciones al cultivo anterior, utilizando medio E como diluyente. Determinar la turbidez en el fotocolormetro a cada una de las diluciones. Diluir (ml) 4.5 5.5 6.5 7.5 8.5 10.5 13.5 18.5 25.5 38.5 63.5 medio E (ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 2.0 3.0 5.0 7.0 13.0 25.0 150.0 Medir U.K. * *

113

IV.- Crecimiento longitudinal de hongos. 1.- Sembrar en un extremo del tubo de Ryan con gelosa Sabouraud una porcin del crecimiento de la cepa del hongo proporcionada. Incubar a 28C. 2.- Medir la longitud del crecimiento en mm a las 24, 48, 72 y 96 horas de incubacin. V. Crecimiento radial de hongos. 1.- Sembrar por punto el centro de una caja de Petri con gelosa Sabouraud con una porcin del crecimiento de la cepa del hongo proporcionada. Incubar a 28C. 2.- Medir el dimetro en mm de la colonia a las 24, 48, 72 y 96 horas de incubacin. PRECAUCION: Mover lo menos posible los tubos de Ryan y las cajas de Petri una vez inoculadas para evitar la dispersin de las esporas. INFORME. 1.- Tabular los resultados de la curva de crecimiento por el mtodo nefelmetrico, como se indica en la siguiente tabla. Tiempo (horas) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 Unidades Klett

2.- Escribir en la tabla siguiente, el nmero de colonias encontradas en cada una de las diluciones que efectu del cultivo original de E. Coli. Dilucin UFC/0.1 ml UFC/ml

3.- Con base en los datos de la tabla anterior, cul es el nmero de bacterias

114

/ml del cultivo original de E. Coli. 4.- De acuerdo con el punto III de la seccin de Mtodos, tabule las unidades Klett que corresponden a cada una de las diluciones efectuadas y calcule la Concentracin de bacterias en cada dilucin de la muestra original de E. Coli. Dilucin Unidades Klett Bacterias/ml a) 1:1.22 b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) 5.- Hacer una grfica con los resultados de la tabla anterior. Interpolar en la grfica anterior cada uno de los valores de U.K. obtenidos en el punto 1 de esta seccin y tabularlos de la siguiente forma: Tiempo (horas) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 Unidades Klett-Summerson Bacterias/ml

7.- Hacer la grfica en papel milimtrico o en computadora con los resultados de la tabla anterior, colocando en el eje de las abscisas el tiempo de incubacin y en el de las ordenadas el nmero de bacterias/ml. 8.- Efectuar con los datos obtenidos en esta prctica, una regresin lineal por el mtodo de los mnimos cuadrados. 9.- Con base en todos los datos obtenidos en esta prctica, diga usted cul fue la densidad mxima de poblacin que se alcanz (K) y calcule cul fue la velocidad especfica de crecimiento () para E. Coli y cul su tiempo de
115

generacin. 10.- Tabular los resultados del crecimiento lineal y radial de los hongos, como se indica en la siguiente tabla. Tiempo (das) Radial Lineal 0 1 2 3 4 Cepa 11.- Hacer una grfica con los resultados de la tabla anterior, colocando el tiempo de incubacin en el eje de las abscisas y el crecimiento en centmetros en el de las ordenadas. CUESTIONARIO. 1.- De acuerdo con el modelo de crecimiento exponencial, resuelva el siguiente problema: usted inocul 106 clulas de E. Coli en 25 ml de medio de cultivo adicionado de glucosa, incub su matraz durante 4 horas. Sabiendo que el tiempo de generacin es de 20 min. Calcule el nmero de bacterias, toma 0.1 ml del matraz y lo inocula en medio de cultivo con manitol; incuba durante 4 horas, obteniendo al cabo de este tiempo 2.4 X 107 bacterias/ml. En este medio se present una fase lag de 20 min. Calcule usted el tiempo de generacin para este microorganismo en el medio con manitol. 2.- Si tenemos un cultivo que contiene 100 clulas de E. Coli, el cual presenta un tiempo de generacin de 30 min. a 35C, dibuje la curva de crecimiento de dicha bacteria cuando: a) las clulas se incuban a 35C durante 5 horas. b) despus de 5 horas, la temperatura se cambia a 20C durante 2 horas. c) despus de 5 horas a 35C la temperatura se cambia a 5C durante 2 horas, al trmino de las cuales se regresa a 35C durante 5 horas ms. REFERENCIAS. Campbell, R.C. 1974. Statistics for biologists. 2nd Ed. Cambridge University Press, London. P 385. Deacon, J.W. 1984. Introduction to modern mycology. 2nd. Ed. Blackwell Scientific Pub. Pp 42-56 Donachie, W:D: 1993. The cell cycle of Escherichia coli. Ann. Rev. Microbiol. 47: 199-230 Hutchinson, G.E. 1978. An introduction to population ecology. Yale University Pree. P 260 p. Kolter, R., D. A. Siegele y A: Tormo. 1993. The stationary phase of the bacterial life cycle. Ann. Rev. Microbiol. 47:855-874. Krebs, C.J. 1978. Ecology: the experimental analysis of distribution and
116

Abundance. 2nd. Ed. Harper and Row, Pub. P 678. Martnez Jernimo, F:F: 1983. Crecimiento poblacional. En: Comparacin De curvas de crecimiento poblacional de Ankistrodesmus falcatus (Chlorellales, Chlorolleceae) obtenidas al utilizar diferentes medios de cultivo. Aspectos ecolgicos y de nutricin mineral en el cultivos de algas microscpicas. Tesis profesional. Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas, IPN. Mxico, D.F. Poole, R.W. 1974. An introduction to quantitative ecology. Mc. Graw Hill Kogakusha, Ltd. P. 532.

117

PRCTICA No. 4 FERMENTACIN ACTICA EN UN REACTOR DE LECHO FIJO. OBJETIVOS. Producir vinagre de vino por un mtodo industrial a escala de laboratorio como es el caso del biorreactor con clulas inmovilizadas del tipo Frings determinando los parmetros de proceso: clculo de las mezclas vinagre-hidroalcohlicas para la alimentacin del biorreactor; clculo de oxigeno necesario para la oxidacin alcohlica; clculo de rendimientos de alcohol-vinagre; determinacin del intervalo de temperatura ptima de produccin y obtencin de vinagre al 4%, de tal manera que se amplen los criterios de aplicacin de la Ingeniera Bioqumica. INTRODUCCIN. Aunque hace miles de aos que se conoce el vinagre, no se determin la naturaleza microbiolgica de su produccin hasta hace poco m s de 160 aos, cuando Ktzing dio a conocer que la conversin del etanol en cido actico era llevada a cabo por microorganismos vivos. Quince aos antes, Peerson haba designado con el nombre de Mycoderma a la pelcula que se forma sobre los lquidos en los cuales tiene lugar una fermentacin actica. Pasteur (1868), confirm la opinin de Ktzing y demostr la naturaleza fisiolgica de la fermentacin actica, pero Pasteur crea que esta fermentacin era ocasionada por una sola especie de bacteria, Mycoderma aceti. En 1878, Hansen demostr que eran ms de una las especies de bacterias capaces de producir la acidez de la cerveza, es decir, la oxidacin del etanol a cido actico. Aisl y dio nombre a Bacterium aceti, y a Bacterium pasteurianum. Ms tarde aisl Bacterium kutzingianum, mientras que Brown describa una cuarta especie. Hacia el ao 1879. Hemberg estudi el grupo, lo reclasific y describi varias especies ms. La nomenclatura y clasificacin vigente es la adoptada en el Manual de Bergey. Actividades bioqumicas tic Acetobacter. Las actividades bioqumicas de Acetobacter consisten principalmente en procesos catablicos aerobios y anaerobios y en la sntesis de polisacridos. Desde el punto de vista industrial las m s importantes son las desasimilaciones aerobias que comprenden el catabolismo oxidante de azcares y alcoholes. De ellas la mejor conocida y ms antigua es la de produccin de cido actico o vinagre. bacterias CH3CH20H + 02 CH3COOH + H20 acticas El vinagre es el condimento hecho a partir de sustancias azucaradas o feculentas por fermentacin alcohlica seguida de fermentacin actica cuyo producto final no debe contener menos de 4 g de cido actico por cada 100ml de solucin a 20 grados centgrados. De acuerdo con lo anterior el proceso general quedara descrito por: levaduras C6H 12O6 + O2 CH3CH2OH + CO2 Bacterias acticas CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2o

118

Requisitos generales de la fabricacin: En la moderna fabricacin de vinagre hay que considerar varios factores: la seleccin de microorganismo, la naturaleza de la materia prima, las concentraciones del etanol empleado y del vinagre aadido al principio para acidificarlo, la cantidad de oxgeno suministrada, la naturaleza del medio de fermentacin, la temperatura de fermentacin, la maduracin y conservacin, la clarificacin, el embotellado y la pasteurizacin y finalmente el carcter y composicin de los depsitos, recipientes y materiales que se ponen en contacto con el vinagre durante el proceso de fabricacin. METODOLOGA. Aunque hace miles de aos que se conoce el vinagre, no se determin la naturaleza microbiolgica de su produccin hasta hace poco m s de 160 aos, cuando Ktzing dio a conocer que la conversin del etanol en cido actico era llevada a cabo por microorganismos vivos. Quince aos antes, Peerson haba designado con el nombre de Mycoderma a la pelcula que se forma sobre los lquidos en los cuales tiene lugar una fermentacin actica. Pasteur (1868), confirm la opinin de Ktzing y demostr la naturaleza fisiolgica de la fermentacin actica, pero Pasteur crea que esta fermentacin era ocasionada por una sola especie de bacteria, Mycoderma aceti. En 1878, Hansen demostr que eran ms de una las especies de bacterias capaces de producir la acidez de la cerveza, es decir, la oxidacin del etanol a cido actico. Aisl y dio nombre a Bacterium aceti, y a Bacterium pasteurianum. Ms tarde aisl Bacterium kutzingianum, mientras que Brown describa una cuarta especie. Hacia el ao 1879. Hemberg estudi el grupo, lo reclasific y describi varias especies ms. La nomenclatura y clasificacin vigente es la adoptada en el Manual de Bergey. Actividades bioqumicas tic Acetobacter. Las actividades bioqumicas de Acetobacter consisten principalmente en procesos catablicos aerobios y anaerobios y en la sntesis de polisacridos. Desde el punto de vista industrial las m s importantes son las desasimilaciones aerobias que comprenden el catabolismo oxidante de azcares y alcoholes. De ellas la mejor conocida y ms antigua es la de produccin de cido actico o vinagre. bacterias CH3CH20H + 02 CH3COOH + H20 acticas El vinagre es el condimento hecho a partir de sustancias azucaradas o feculentas por fermentacin alcohlica seguida de fermentacin actica cuyo producto final no debe contener menos de 4 g de cido actico por cada 100ml de solucin a 20 grados centgrados. De acuerdo con lo anterior el proceso general quedara descrito por: levaduras C6H 12O6 + O2 CH3CH2OH + CO2 Bacterias acticas CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2o Requisitos generales de la fabricacin: En la moderna fabricacin de vinagre hay que considerar varios factores: la seleccin de microorganismo, la naturaleza de la materia prima, las concentraciones del

119

etanol empleado y del vinagre aadido al principio para acidificarlo, la cantidad de oxgeno suministrada, la naturaleza del medio de fermentacin, la temperatura de fermentacin, la maduracin y conservacin, la clarificacin, el embotellado y la pasteurizacin y finalmente el carcter y composicin de los depsitos, recipientes y materiales que se ponen en contacto con el vinagre durante el proceso de fabricacin. RESULTADOS. Presentar en un cuadro los clculos para. el ajuste de la concentracin de la mezcla vino-vinagre y la aireacin necesaria. Presentar cuadro y grfica de la velocidad media de reaccin. Si la velocidad de reaccin es de primer orden, usando los valores experimentales, determinar: a) - la constante k de la reaccin b) - el tiempo ptimo de cosecha Proponga y establezca las condiciones de operacin de un biorreactor tipo Frings capaz de producir 500 1 de vinagre de vino cada 24 horas. REFERENCIAS. Amerine, M.A.1974. Anlisis de vinos y mostos. Ed. Acribia, Barcelona Pirt, S.J. 1975. Principles of microbial and cell cultivation. Blackwell Scientific Publications, London. Prescott, S.C. & Dunn, C.B. 1962.Microbiologa Industrial. 3a Edicin. Editorial Aguilar. Madrid Antonio Madrid, V. 1991. Vinos e industria vincola. Tecnologa del vino y bebidas derivadas. Mundi-Prensa Libros S.A.. Madrid Espaa 1991. Vinagre envasado para consumo pblico. Norma Oficial Mexicana DGN-F-1221968. Secretaria de Comercio y Fomento Industrial Nomura, Y., lwahara, M. & Hong, M. 1994. Production of acetic acid by Clostridium thermoaceticum in electrodialysis culture using a fermenter equipped with an alectrodialyser. World lournal of Microbiology and Biotechnology. 10 (4):427-432 Han, K, henry c. Lim, H.C. & Hon& J. 1992. Acetic acid formation in Escherichia col fermentation. Biotechnology and Bioengineering. 39:663-671 Hekmat, D. & Vortmeyer, D. 1992. Measurement, control, and modeling of submerged acetic acid fermentation. Journal of Fermentation and Bioengineering. 73:2630

120

PRCTICA No. 5 EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE ENZIMAS DE HONGOS OBJETIVOS. Realizar la extraccin y purificacin parcial de la invertasa de levaduras. INTRODUCCION. Los caldos de fermentacin son mezclas complejas, compuestas de clulas, productos solubles extracelulares, productos intracelulares y medio de cultivo sin convertir. Particularmente un bioproceso incluye los procesos de produccin de un metabolito especfico y su posterior recuperacin. La seleccin del proceso de recuperacin del producto se basa en los siguientes criterios: La localizacin del producto (intracelular o extracelular). La concentracin del producto en el caldo de fermentacin. Las propiedades fsicas y qumicas del producto (tamao, carga, solubilidad, etc.). El uso tentativo de] producto. Las impurezas del caldo de fermentacin. El precio del producto en el mercado. La secuencia de operaciones a travs de las cuales se somete el caldo de fermentacin para obtener el producto deseado con una alta pureza son generalmente las siguientes: Remocin de partculas insolubles. Las operaciones ms comnmente usadas en esta etapa son filtracin, centrifugacin, sedimentacin y decantacin. Aislamiento primario. La extraccin con disolventes, la adsorcin, precipitacin y ultrafiltracin son las operaciones m s usadas. Durante este aislamiento primario, la concentracin del producto deseado aumenta considerablemente. Purificacin. Con esta operacin se remueven las impurezas del producto concentrado, se utilizan entre otras operaciones la precipitacin fraccionada, diferentes tipos de cromatografa o la adsorcin. Obtencin del producto final. En esta ltima etapa se obtiene el producto con el nivel de pureza requerido. Los procesos que se incluyen aqu, son un secado al vaco, cristalizacin y liofilizacin. En la presente prctica se realizar la extraccin y parcial purificacin de la invertasa de levaduras La enzima invertasa y en especial la invertasa de levadura ha tenido un papel primordial en el desarrollo de la enzimologa. Gran parte de los conocimientos en cintica enzimtica se deben a esta enzima.

121

La invertasa es una enzima con especificidad de fructofuranosidasa que participa en la reaccin de hidrlisis de los oligosacridos con enlaces del tipo 21,fructofuranosos. Se obtiene comercialmente a partir de la levadura de Saccharomyces cerevisiae que es un subproducto de la industria cervecero. Sin embargo despus de un estudio cintico realizado, se encontr que en la levadura Candida utilis Y-900 bajo ciertas condiciones se presenta una mayor actividad especfica (U/g de clulas). Actualmente en Mxico no se produce invertasa y la que se utiliza en la industria es importada de Europa y los Estados Unidos. A pesar de que es una enzima extracelular, la mayor parte de ella est retenida en la pared celular, por lo que es necesario la desorganizacin de esta estructura para su liberacin. Se ha informado que compuestos con grupos sulfhidrilos son capaces de inducir la liberacin de enzimas que se encuentran de alguna forma unidas a la pared celular de levaduras. La adicin de cistena a altas densidades celulares de la levadura reduce el tiempo de liberacin de la enzima. Una vez que se tiene el extracto enzimtico, se seleccionan las tcnicas para la purificacin de la invertasa. En este caso el mejor mtodo fue la precipitacin con etanol, estableciendo las condiciones para precipitar selectivamente a la invertasa, dejando en solucin al resto. El etanol ha sido empleado por varias dcadas como un agente precipitante de protenas. La obtencin de protenas puras de una mezcla compleja se facilita por la influencia de factores como el pH, la fuerza inica, la temperatura y la concentracin de protena sobre la accin precipitante del etanol. Adems de interaccionar con otras variables, el etanol por s mismo causa precipitacin de protenas ya que disminuye significativamente la constante dielctrica de las soluciones acuosas. Finalmente se utiliza la centrifugacin para recuperar el precipitado. METODOLOGA. Se utilizar la biomasa generada en la prctica de Produccin de protenas unicelular mediante la tcnica de cultivo extendido como materia prima para la obtencin de la invertasa, o bien, se emplear S. cerevisiae de origen comercial. ACTIVIDADES POR SESIN. SESIN 1. EXTRACCIN DE LA ENZIMA UTILIZANDO CISTEINA. Se utilizar una concentracin celular de aproximadamente 200 g/, resuspendiendo el paquete celular en una solucin reguladora de fosfatos 0.1 M pH 7.2. Se adicionar cistena hasta una concentracin de 0.25% (p/v) y se incubar a temperatura ambiente por 24 horas. Despus de este tiempo la suspensin se colocar en el refrigerador hasta la siguiente sesin. Una hora despus de haberse iniciado la autolisis, se tomar una muestra a la que se le determinar la actividad enzimtica y la concentracin de protena. Se comparar con una muestra tomada al inicio de la incubacin para asegurarse de que est llevndose a cabo el proceso de autolisis. SESIN 2. RECUPERACIN PARCIAL Y PURIFICACIN DE LA ENZIMA.

122

Recuperacin de la enzima. Separar los residuos celulares por centrifugacin de la suspensin celular a 3500 rpm por 10 minutos Tomar una muestra del sobrenadante para su posterior anlisis de actividad y concentracin de protena. Purificacin parcial de la enzima. Al sobrenadante obtenido se le adicionan 4C volmenes de etanol muy lentamente y con agitacin en un bao de hielo. Se deja reposar por una hora a 40C para permitir la precipitacin de la enzima. Despus de este tiempo se recuperar el precipitado por centrifugacin a 3500 rpm por 10 minutos. El precipitado se resuspende en un volumen exacto de regulador de TRIS-HCI 50 mM y pH de 7.2. A este precipitado se le determinar la actividad de invertasa empleando el mtodo de glucosa-oxidasa-peroxidasa y la concentracin de protena por el mtodo de Lowry. METDOS ANALTICOS. DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE INVERTASA POR EL MTODO DE LA GLUCOSA-OXIDASA-PEROXIDASA. Reactivos: A. Solucin enzimtica: a un litro de regulador de fosfatos 0.1 M pH 7.0 se le adicionan 5 mg de peroxidasa (SIGMA) y 1 ml de la enzima glucosa oxidasa (SIGMA). B. Solucin de o-dianisidina: 300 mg de o-dianisidina en 50 mi de agua destilada. C. Mezcla enzimtica: 20 mi de reactivo A m s 1 mi de reactivo B (preparada al momento de usarse). D. Solucin de sacarosa 0.5 M. E. Solucin de HCI 6 N. F. Regulador de acetatos 0.1 M PH 4.5. Procedimiento: En un tubo de ensayo se colocan 100 microlitros del reactivo F y 50 microlitros del reactivo D. La mezcla se incuba 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se adicionan 2 mi del reactivo C y se deja a temperatura ambiente durante 8 minutos. Transcurrido este tiempo se detiene la reaccin adicionando 2 mi del reactivo E. El color desarrollado se mide a 540 nm en un espectrofotmetro. Para ajustar el espectrofotmetro se prepara un testigo de reactivos siguiendo el mismo procedimiento usando agua destilada en lugar de muestra. Tambin se utiliza un control de glucosa 2 mM. Una unidad de invertasa (U) se define como un micromol de glucosa liberada por un minuto en las condiciones de ensayo. DETERMINACIN DE PROTENA POR EL MTODO DE LOWRY. Reactivos: A. Solucin de tartrato de sodio y potasio al 1% en sulfato cprico al 0.5%. B. Solucin de carbonato de sodio al 2% en hidrxido de sodio 0.1 N. C. Se mezclan 50 mi de B con 1 mi de A (preparado al momento de usarse) D. Reactivo Folin-Ciocalteu diluido 1:2 con agua destilada. Procedimiento:

123

En un tubo de ensayo se adicionan 500 microlitros de muestra diluida y 5 ml del reactivo C, se dejan incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, pasado este tiempo se agregan 0.5 ni] del reactivo D, la mezcla se agita y se esperan 30 minutos para que se lleve a cabo la reaccin, transcurrido este tiempo, el color desarrollado se mide en un espectrofotmetro a 500 nm. De la misma manera se prepara un blanco de reactivos, sustituyendo la muestra por agua destilada, y un control utilizando una solucin de albmina de bovino de 0.5 mg/ml tratado en forma similar. RESULTADOS. 1. Elaborar un cuadro comparativo de la actividad enzimtica en el sobrenadante y el paquete celular antes y despus de la extraccin. 2. Determinar el % de liberacin de la enzima durante la extraccin. 3. Determinar la eficiencia de recuperacin de la enzima durante la purificacin. 4. Determinar el grado de purificacin relativo de la invertasa. 5. Discusin y conclusiones. REFERENCIAS. Ahuatzi C. D. Extraccin y purificacin de la invertasa de Cndida utilis Y-900. Tesis Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas. IPN. Mxico. Castro B.F. & Romero, F.F. 1984. Cintica de acumulacin de invertasa de levaduras cultivadas en distintos sistemas fermentativos. Tesis Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas. IPN. Mxico. De la Vega, G. M., & Paneque, A. 1990. Purification and properties of an extracellular invertase from Acetobacter chroococuni. Enzynic & Microbial Technol.13:267-271. Cascn, S & Lampen, 0. J. 1968. Purification of the internal invertase of yeast. J. Biol Chem. 243:1567-1572. Lam, K.S., & Grootwassink. W. D. 1985. Efficient, non-killing extraction of -fructofuranoside (an exo-inulase) form Kluyveroniyces fragilis at high density. Enzyme Microb. Technol. 7:239-242. Lowry, 0. H. Rosebrough, N. J. Farr, A.L. & Randall R. J. 1951. Protein measurement with the Folin-phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275.

124

PRCTICA No. 6 FERMENTACIN ALCOHLICA OBJETIVOS. Esta prctica tiene como objetivo que el participante conozca la importancia econmica y social que tiene la produccin de alcohol, permitiendo la integracin de conocimientos de microbiologa industrial, ingeniera bioqumica, operaciones unitarias, as como diversos mtodos analticos, para su elaboracin a escala de laboratorio, partiendo desde el acondicionamiento de la materia prima hasta la recuperacin de] producto, basados en una investigacin previa de los mtodos actuales de produccin de alcohol a nivel industrial. INTRODUCCIN. Una de las fermentaciones industriales de mayor importancia econmica y, quizs, la ms antigua producida por el hombre, es la fermentacin alcohlica, que es la base para la produccin del aguardiente, por destilacin de un mosto fermentado. El mosto fermentado se obtiene a partir de la accin de un microorganismo usualmente una levadura, sobre una solucin azucarada. La fuente ms comn para la produccin de alcohol, es la caa de azcar, utilizando principalmente en la industria las melazas. Otras son los frutos, los granos, tubrculos, y agaves. El uso de una u otra depender del producto que se desea y de un estudio econmico. A continuacin se presenta una tabla que relaciona el tipo de bebida alcohlica segn la materia prima que se utilice. MATERIA PRIMA I.Frutas Uvas. a) Vinos generosos. b) coac. c) Brandy. Manzana. Durazno, zarzamora, Naranja, etc. II. Caa de azcar Piloncillo. c) Alcohol Melazas.. a) Aguardiente. b) Ron. c)Alcohol a) Whisky. b) Alcohol Licores Vodka Ginebra Alcohol industrial Vodka. Ginebra. a)Sidra. b)Licores Licores (bebidas naturales con ingredientes y endulzadas). BEBIDAS NATATURALES BEBIDAS DERIVADAS

a) Aguardiente. b) Ron.

Licores Vodka, Ginebra.

III. Granos Maz glucosa

125

Cebada, maltosa, Y glucosa. Arroz. IV.Tubrculos Remolacha. Papa

a) Cerveza. b) Whisky. a) Sake. b) Whisky a) Aguardiente. b) alcohol. .a) Aguardiente. b) Whisky.

V.Agaves Agave atrovirens. a) Pulque. Agave azul. a) Tequila Agave esperrima Jacobi a) Mezcal Agave. a) sotol . REACTIVOS, MATERIALES Y EQUIPO. 1. Materias primas: Fuente de carbono (de acuerdo a la disponibilidad en el laboratorio, melazas, piloncillo, almidn y malta), sulfato de amonio dibsico, fosfato de amonio, sulfato de magnesio, cido sulfrico 1:1, levadura de panificacin seca o fresca, y agua. 2. Mosto: Preparar el mosto a partir de melazas, o piloncillo, continuar en el inciso 3. Si la materia prima es almidn y malta, continuar en el punto 7. 3. Determinar el contenido de azcares reductores y los grados Brix a las melazas (piloncillo). 4. Con el resultado anterior, y utilizando el diagrama de Pearson, estimar la cantidad de melazas que se requieren para 15 litros de mosto con una concentracin de 18 % de azcares reductores. 5. Enriquecer el mosto con: NH4)2SO4 0.300 g/l. NH4)2HP04 0.240 g/l. MgSO4 0.024 g/l. 6. Ajustar el pH entre 4.0 y 4.5 con cido sulfrico diluido 1:1 7. Almidn, en este caso se requiere como paso preliminar la transformacin del almidn en azcares fermentables por la levadura, este proceso se realiza utilizando enzimas procedentes de otras fuentes, que hidrolizan al almidn en maltosa y glucosa. El grano de trigo se somete a una molienda regular, para aumentar el rea de contacto del almidn con las enzimas, pesar y colocar la molienda en un recipiente y agregar dos veces su peso de agua, y calentar para gelatinizar el almidn. La temperatura de gelatinizacin vara con el tipo de almidn y tamao de los granos, por ejemplo el almidn de trigo gelatiniza a temperatura de 60 a 85C, el de papa entre 55 y 60C y el almidn de arroz entre 80 y 85C. el tiempo de gelatinizacin es de 15 a 20 minutos. Ya gelatinizado, se ajusta la temperatura a 70C y se le adiciona de un 20 a 30% de malta referido al peso de la molienda del grano de almidn, se mantiene a 70'C para que las enzimas que se encuentran en la malta acten hidrolizando el almidn, el tiempo de hidrolizado se determina con una prueba sencilla de tincin de almidn con una solucin de yodo al 1%,

126

cuando la prueba es negativa, habr terminado el proceso de gelatinizacin (el yodo ya no da color, ya que los almidones han sido hidrolizados). 8. Se procede como en los puntos 3, 4. y 6, y luego pasar al inciso 9 9. Fermentacin: Para iniciar la fermentacin primero se tiene que inocular adicionando 2 g de levadura fresca de panificacin por litro de mosto, o 1 g de levadura de panificacin seca por litro de mosto. Se recomienda activar la levadura 30 min. antes en 1.5 litros del mismo mosto con burbujeo de aire estril. Una vez realizado esto, se tapa el recipiente en que ha de efectuarse la fermentacin, del cual se tomar n muestras cada 6 horas para el control del proceso, iniciando con una muestra al tiempo cero.

CONTROL DEL PROCESO. A.R. (g/1) Bx pH CONC. (20*C) CELULAR Gl. TEMP. (150C) (*C)

materias primas x x mosto x x x x fermentacin x x x x x x Azcares: Tomar 5 ml de muestra en un matraz volumtrico de 100 mi, agregar 20 ml de agua y 1 mi de cido clorhdrico concentrado. Poner a ebullicin 5 minutos, enseguida agregar 20 ml de agua y 1.5 ml de hidrxido de amonio concentrado y llevar a 100 mi con agua destilada. Con esta solucin titular el reactivo de Fehling (5 ml de solucin "A" ms 5 mi de solucin "B" ms una gota de azul de metileno al 1%). Para cuantificar el azcar presente es necesario conocer el factor de la solucin de Fehling y las diluciones que se hayan hecho. Concentracin celular. En un tubo de ensayo colocar 5 ml de muestra y agregar agua destilada para lavar (el volumen de agua es de acuerdo al tamao del tubo), centrifugar 10 minutos a 3500 rpm. Desechar el sobrenadante y resuspender en agua destilada y repetir la centrifugacin, eliminar el sobrenadante y resuspender el paquete celular en un matraz volumtrico de 100 ml, con agua destilada hasta el aforo, leer la absorbancia. a 595 nm e interpolar la lectura de densidad ptica en la grfica tipo. El resultado multiplicarlo por 20 que es la dilucin. Grado alcohlico real: En un matraz baln de 500 ml, colocar 100 ml de muestra (15 o 20C), mas 60 ml de agua destilada. Destilar lentamente recibiendo el destilado en un matraz volumtrico de 100 m], ste se sumerge en un recipiente con hielo. Recoger el destilado hasta 2 ml antes del aforo, completar con agua destilada, homogeneizar y medir el grado alcohlico con un densmetro Ga -Lussac, y la temperatura (corregir por temperatura y referir la lectura Gay-Lussac a 15 C) METODOLOGA. La prctica se efectuar en cuatro sesiones, de acuerdo a. la programacin que le ser entregada por el coordinador del laboratorio, ms tiempo extraclase. En la primera sesin los participantes del equipo, presentarn en una sesin de Seminario los siguientes puntos que habr investigado con anticipacin a la fecha de la prctica programada. Ruta metablica a travs de la cual se verifica la fermentacin alcohlica y organismos que la llevan a cabo.

127

 Antecedentes histricos sobre la produccin de alcohol en el pas. Importancia econmica e impacto social. Uso del alcohol Fuentes de carbono susceptibles de ser usados como materia prima en la produccin de alcohol y su acondicionamiento. Produccin industrial de alcohol por va fermentativa, a) materias primas, b) condiciones del proceso, c) cintica de la fermentacin d) productos y subproductos,e) recuperacin del producto. Las siguientes tres sesiones se realizarn de acuerdo al plan de trabajo que el equipo participante y el profesor diseen. Para acreditar la prctica se consideran los siguientes puntos. Entrega de una memoria del seminario. El trabajo de laboratorio en equipo. Entrega de un informe de la prctica. RESULTADOS. El informe de la prctica incluir los siguientes puntos: Presentacin e introduccin. Cintica de produccin de etanol, consumo del sustrato y crecimiento microbiano. Comparar los rendimientos, terico y experimental de produccin de etanol. Calcular el rendimiento de la primera destilacin. Discusin y conclusiones. Bibliografa. REFERENCIAS. Amerine, M.A. 1974. Anlisis de vinos y mostos. Ed. Acribia Barcelona Palacios L. H. 1956. Fabricacin del alcohol. Salvat editores, S.A. Lehninger. 1981. Bioqumica, 4a edicin, Omega, Barcelona Pirt, S.J. 1975. Principles of microbial and cell cultivation. Blackweil Scientific Publications, London Prescott, S.C. & Dunn C.G. 1962. Microbiologa Industrial, 3a. edicin Aguilar, Madrid

128

PRCTICA No. 7 PRODUCCIN DE PROTENA UNICELULAR MEDIANTE LA TCNICA DEL CULTIVO EXTENDIDO OBJETIVOS. Realizar un proceso fermentativo de produccin de protena unicelular programando la alimentacin de sustrato a partir de la simulacin del proceso basada en los modelos, las constantes cinticas y estequiomtricas que rigen el crecimiento del microorganismo. INTRODUCCIN. Los cultivos por lote co - suministro de sustrato han recibido a lo largo de su historia diversas denominaciones; proceso "Zulauf - trmino introducido por investigadores daneses y alemanes a principios de este siglo -, proceso "batch fed", "Semibatch" y "fedbatch" en los pases de habla inglesa. Este ltimo trmino es actualmente el de uso ms generalizado y fue introducido por Yoshida en 1973. Existen otras denominaciones para casos particulares como son los de: "cultivo extendido" y el de "fed-batch exponencial" que se aplican para describir un cultivo alimentado en donde la concentracin de sustrato limitante del crecimiento es mantenida constante por manipulacin de la velocidad de suministro de nutrientes. Ocasionalmente, estos cultivos son referidos como fermentaciones de volumen variable.. La tcnica del cultivo extendido (CE) se ha venido utilizando desde hace por lo menos medio siglo. Su uso fue completamente emprico hasta bien entrada la dcada de los setenta en que coinciden; el desarrollo de modelos matemticos para este tipo de cultivos con el auge de la aplicacin de los microprocesadores en la tecnologa de fermentaciones, coincidiendo adems con el desarrollo de nuevos sensores y servomecanismos para el seguimiento y control de procesos. Para que un cultivo alimentado sea realmente productivo y en l se obtengan valores elevados de conversin de nutrientes a productos, se requiere de una exacta prediccin de los eventos que ocurrir n en el cultivo, tales como variacin en los indicadores cuantitativos de: crecimiento, produccin de metabolitos y consumo de nutrientes y de oxgeno, del microorganismo; as como de un estricto control de las variables ambientales que afectan al proceso fermentativo. Una inadecuada prediccin de eventos puede resultar en alteraciones ambientales que modifiquen de forma imprevista la fisiologa del microorganismo, provocando una desviacin en la fermentacin hacia la produccin de metabolitos indeseables, abatindose la productividad, el rendimiento o ambos. Dependiendo del objetivo de una fermentacin, la estrategia de alimentacin de nutrientes a un cultivo puede ser de dos tipos: velocidad de suministro constante o variable. En este ltimo caso, la velocidad de suministro se incremento paulatinamente con el fin de sostener un nivel constante del sustrato limitante en el cultivo. La variacin en este suministro puede programarse previamente para satisfacer la demanda creciente del cultivo por nutrientes o bien, puede introducirse un sistema de control capaz de estimar y satisfacer dicha demanda. Tal sistema tendra una serie de sensores que suministraran informacin a una unidad de procesamiento de datos, la cual enviara a servomecanismos perifricos especficos (vlvulas, bombas, motovariadores, etc.) para modificar velocidades de suministro de nutrientes o de oxgeno, cuando esto fuera necesario.

129

BASES TERICAS DEL CULTIVO EXTENDIDO. a) Ecuaciones de balaiwe. Consideremos un reactor con un volumen inicial [Vo] de medio de cultivo con una concentracin de sustrato limitante [s] y una densidad de poblacin celular [x] que se incremento con una velocidad especfica de crecimiento []. A un tiempo dado se comienza a suministrar al cultivo un flujo [F] de medio fresco que contiene al sustrato limitante del crecimiento a una concentracin [Sr]. No habiendo salida del mosto del reactor durante el proceso, el volumen de medio en el fermentador variar continuamente, a menos que la alimentacin se haga con sustrato puro (slido o lquido), en cuyo caso el volumen se mantendr constante. Se consideran las siguientes restricciones para el sistema: 1. La suspensin celular es homognea. 2. An cuando la poblacin consiste de un nmero de partculas discretas, su concentracin es o suficientemente alta y el tamao de partcula lo suficientemente pequeo para considerar como una variable continua a la densidad de poblacin [x]. Por otra parte, el volumen ocupado por las partculas representa slo una fraccin del volumen total del sistema y se considera despreciable. 3. Tan pronto como los nutrientes entran al cultivo son instantneamente dispersados en l. 4. Toda la poblacin celular permanece viable. 5. La velocidad especfica de crecimiento [] es una funcin de la concentracin de un solo sustrato limitante [s] y se asume la funcionalidad de Monod. =mxs/(Ks+s) 6. Si el sustrato que limita al crecimiento es la fuente de energa, la cantidad de biomasa producida por unidad de sustrato limitante utilizado no ser constante. Este rendimiento celular [Y] ser una funcin de la velocidad especfica de crecimiento y est dado por la ecuacin: Yxs = Yg/( + mYg) (2) Donde: Yg= Rendimiento celular m ximo para crecimiento. m = Coeficiente de mantenimiento celular. Si el sustrato que limita al crecimiento no es la fuente de energa, el valor de [Yxs] se asume constante. 7. Durante el proceso no existe inhibicin del crecimiento por los metabolitos producidos por el mismo microorganismo. Con base en las anteriores consideraciones, las ecuaciones de balance en el reactor sern las siguientes: Balance de biomasa: Acumulacin global Entrada - Salida + Crecimiento global [d(Vx)/dt]ac = 0 - 0 + [d(Vx)/dt]crec = (Vx) Haciendo (Vx = X): V(dx/dt)ac + x(dV/dt) = dX/dt = X (3) Pero (dV/dt = F); despejando de la ecuacin anterior a (dx/dt)ac y haciendo (F/V=D), se obtiene la velocidad de acumulacin volumtrica de biomasa: (dx/dt)ac = x( - D) (4) Siendo [D] la velocidad de dilucin del cultivo. Balance de sustrato: Acumulacin global = Entrada - Salida - Consumo global.

130

[d(Vs)/dt]ac = F(Sr) - 0 - qs(Vx) = F(Sr) - (/Yxs)(Vx) (5) Siendo (qs = /Yxs), donde [qs] es la velocidad especfica de consumo de sustrato. s(dV/dt) + V(ds/dt) = F(Sr) - (/Yxs)(Vx) Por lo tanto la velocidad volumtrica de acumulacin de sustrato estar dada por: (ds/dt)ac = D(Sr - s) - x/Yxs (6) Cuando interesa describir la acumulacin de algn producto en el reactor, se hace a partir de la ecuacin de balance para producto. Las ecuaciones de balance anteriores pueden considerarse como las fundamentales para el cultivo alimentado. b) Comportamiento de un cultivo extendido. Partiendo de la base de que el suministro de nutrientes se mantendr igual a la demanda del cultivo; se tendr un valor constante de la concentracin de sustrato limitante [s], y por lo tanto una velocidad especfica de crecimiento [m] constante. En estas condiciones tendremos que en la ecuacin de balance (6), el valor de la acumulacin volumtrica de sustrato ser cero. Por tanto: (F/V)(Sr - s) = (x/Yxs) De donde: F = [(xV)/Y(Sr - S)] (7) Sustituyendo el valor (xV = X) en la ecuacin de balance (3) e integrando entre los lmites (to = 0 -> t): X = Xo e( t) = xV (8) Sustituyendo esta expresin en la ecuacin (7), tendremos: F = [Xo/Yxs(Sr - s)] e( t) (9) Con base en las consideraciones iniciales planteadas (s= cte, = cte.) tendremos que de acuerdo a la ecuacin (2); el valor d [Y] ser tambin constante. Por lo tanto tendremos que el flujo variar exponencialmente de acuerdo a la ecuacin: F = a e( t) (10) Donde: a = [.Xo/Yxs(Sr - S)] = Constante. La variacin en volumen se obtiene sustituyendo el valor de [F] en la diferencial: dV/dt = F = a e( t) Integrando entre los lmites (to = 0 -> t), obtendremos: V=Vo + [Xo/ Yxs(Sr - s)] [e( t) 1] (11) Por sustitucin de las ecuaciones (2) y (11) en la ecuacin (8), obtendremos la trayectoria de la concentracin celular en un cultivo alimentado exponencialmente: x = [(XoVo) e( t)]/(Vo +[xoVo ( + mYg)/(Yg)(Sr - s)][e(t) 1]} (1,2) Para poder alimentar exponencialmente a un cultivo, manteniendo un nivel constante del sustrato limitante, se requiere de un control muy preciso de la velocidad de operacin de Ia bomba de suministro de nutrientes. Para efectuar tal control puede recurriese al uso de equipo relativamente sofisticado; bombas acopladas a un trazador automtico de curvas, con el objeto de alimentar nutrientes de acuerdo a un perfil grfico predeterminado o bien, alimentar bajo el control de una computadora. Cuando no se dispone de tal equipo, es posible hacer una aproximacin al suministro exponencial mediante la adicin (manual o autom tica) de volmenes discretos de medio de suministro a intervalos de tiempo programados, para mantener los niveles de sustrato limitante dentro de un intervalo de valores preestablecidos.
131

METODOLOGA. 1. Se realizar un cultivo por lote en donde se estimarn los siguientes valores: [mx] y [Yxsl. Estos, junto con otros valores obtenidos anteriormente (m, Yg y Ks), para Candida utilis Y-900 en cultivo continuo a 35'C, ser n utilizados para establecer el programa de alimentacin del cultivo. 2. El suministro de medio fresco ser exponencial y se iniciar cuando la concentracin de sustrato llegue a un valor mnimo preestablecido. La alimentacin programada a partir de la simulacin del comportamiento del cultivo, se har por medio de una bomba peristltica de velocidad variable para mantener un valor de [s] constante. 3. Durante el cultivo por lote y el cultivo extendido se tomar n muestras, a las que se les determinar inmediatamente la concentracin celular y la concentracin de glucosa. La concentracin celular se estimar por turbiedad y por peso seco, y la glucosa por ensayo enzimtico con glucosa oxidasa. RESULTADOS. Calcular [mx], y los valores de rendimiento y productividad celular media de Candida utilis Y-900 en el cultivo por lote. Para el cultivo extendido, construir curvas comparativas (tericas y experimentales) de: x = f(t) X = f(t) = f(t) s = f(t) Estimar los valores de productividad media y los de rendimiento celular medio en el cultivo extendido (tericos y experimentales). Discusin de resultados y conclusiones. REFERENCIAS. Araujo, M. D. 1980. Produccin de protena unicelular a partir de desechos de pltano mediante un proceso fermentativo de volumen variable con alimentacin programada. Tesis profesional. ENCB. Dunn, 1. J., y J. R. Mor. 1975. Variable-volume continuous cultivation. Biotechnol. Bioeng. 17.1805-1822. Edwards, V. H. 1970. Extended culture: the growth of Candida utilis at controlled acetate concentrations. Biotechnol. Bioeng. 15: 975-999. Lim, H. C., S. J. Che, y C. C. Creagan. 1.977. An analysis of extended and exponentially fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng. 19:425-433. Matin, A. 1981. Regulation of enzyme synthesis as studied in continuous culture en Continuous Culture of Cells. P. H. Calcott (Ed.), CRC Press, Vol. II:69-97. Ohno, H., E. Nakanishi, y T. Takematsu. 1978. Optimun operating mode of a class of fermentation. Biotechnol. Bioeng. 20:625-633.

132

Pirt, S. J. 1975. 'Principles of Microbial and Cell Cultivation. Blackweil ScientificPublications, London. Reed, G., y H. J. Peppler. 1973. Yeast Technology. AVI Publishing, Co., New York. Wang H. Y., C. L. Cooney, e 1. C. Wang. 1977. Computer aided Baker's yeast fermentations. Biotechnol. Bioeng. 19:69-86. Whitaker,-A. 1980. Fed-batch culture. Process. Bochem. 15: 10-15.

Yaman, T., y S. Hirano. 1977. Semibatch culture of microorganism with constant feed of substrate: A rnathematical simulation. J. Ferment. Technol. 55:156-165.

133