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Perspectivas da Cincia e Tecnologia, v.3, n.
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CAPTURA DE DIOXIDO DE CARBONO PELA TCNICA DE ABSORO REATIVA COM AMINAS

Carbon dioxide capture by reactive absorption with amines Rarine Flix de Vasconcelos1; Cludia Ferreira da S. Lirio1; Roseantony Rodrigues Bouhid2
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Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia do Rio de Janeiro (IFRJ), campus Paracambi. Rua
Sebastio Lacerda, s/n, centro, Paracambi, RJ. CEP: 26.600-000. 2Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia do Rio de Janeiro (IFRJ), campus Rio de Janeiro. Rua Senador Furtado,121/125, Maracan, Rio de Janeiro, RJ. CEP: 20.270-021. E-mail:claudia.silva@ifrj.edu.br
Palavras-Chave: captura de CO2, aquecimento global, absoro reativa. Keywords: CO2 capture, global warming, reactive absorption. INTRODUO O elevado volume de dixido de carbono (CO2) na atmosfera, um dos principais Gases do Efeito Estufa (GEE), tem como uma das principais causas, o fato da matriz energtica mundial estar baseada no consumo de combustveis fsseis. Consequentemente, ele tambm aponta para um dos maiores desafios da sociedade moderna: diminuir as emisses dos GEE sem deixar de atender a crescente demanda por energia. Nesse sentido, alm da substituio das tecnologias de gerao de energia convencionais, por outras classificadas como mais limpas, os processos de captura atravs de reaes com aminas e posterior armazenamento de CO 2 surgem como uma forma de mitigar os efeitos desse gs na atmosfera. Segundo YAMASAKI (2003), a recuperao de CO2 utilizando a tcnica com a monoetanolamina (MEA) como reagente pode chegar a 98%. O processo de captura de CO2 a partir do gs de queima dividido em duas etapas. A primeira acontece na Torre de Absoro, na qual o gs borbulhado em contracorrente a uma soluo aquosa de amina, possibilitando a reao direta e reversvel entre esta e o dixido de carbono, formando como produto um composto intermedirio. A soluo obtida nesta etapa passa por um trocador de calor e na sequncia enviada para a Torre de Dessoro ou Stripper. Nesta segunda etapa, a soluo aquecida, favorecendo a recuperao de CO 2 e da amina saturada na etapa anterior. Esta retorna ao processo, sendo reaproveitada at que seja degradada, enquanto que o CO2 separado dos demais componentes do gs de queima seguir para o armazenamento geolgico. O fluxograma deste processo industrial pode ser visto atravs da Figura 1. Embora a tecnologia de absoro reativa seja utilizada h algumas dcadas pela indstria do gs natural, para remoo de seus gases cidos, a sua aplicao recente para a obteno de CO 2 a partir de correntes industriais denominadas por gs de queima. Assim, com caractersticas totalmente diferentes, a tcnica ainda apresenta alguns desafios relacionados, em especial, a estabilidade das aminas e ao consumo de energia, que repercutem diretamente no custo do processo industrial. 17
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Amina recuperada CO2
Torre de Absoro
Torre de Dessoro/ Stripper
Gs de queima (CO2)
Corrente rica em amina
Figura 1: Fluxograma de processo para captura de CO2 a partir de gs de queima usando absoro reativa com aminas. Desta forma, este trabalho tem por objetivo investigar os parmetros de maior influncia para o processo de captura de dixido de carbono atravs da absoro reativa utilizando aminas. Para isto, foram adotadas duas metodologias para o estudo. A primeira consistiu na utilizao de um kit didtico e a segunda na projeo de uma coluna de borbulhamento. O kit desenvolvido pelo mesmo grupo de pesquisa em um trabalho anterior de transposio didtica mais bem detalhado em MARTINS & MIRANDA (2007) e BOUHID et al. (2010). RESULTADOS E DISCUSSO Neste trabalho, foram comparados os valores de presso de vapor das trs principais aminas estudadas para este processo: monoetanolamina (MEA), dietanolamina (DEA) e metildietanolamiona (MDEA). Os valores de presso de vapor para as possveis temperaturas operacionais (298,15; 333,15; 338,15 e 343,15 K) foram obtidos atravs da equao (1). Os parmetros A, B, C, D e E so apresentados atravs da tabela 1. As Figuras 2 e 3 exibem as curvas de presso de vapor em funo da temperatura. B P vapor = exp A + +C . ln ( T ) +D . T E T (1) A sequncia obtida, em ordem crescente, dos valores calculados para a presso de vapor em funo da temperatura so DEA, MDEA e MEA. Como uma das caractersticas de um bom solvente para este tipo de processo apresentar uma baixa presso de vapor, pode-se concluir que a mesma sequncia seria a indicada para seleo do solvente visando evitar perdas por evaporao durante o processo. Vale ressaltar, entretanto, que outras caractersticas que dependem da composio da corrente gasosa a ser tratada devem ser consideradas no momento da escolha do solvente. Talvez seja por este motivo que, mesmo a MEA apresentando maiores valores para a presso de vapor seja amplamente utilizada neste tipo de processo, j que ela facilmente recupervel, enquanto que a DEA exige destilao a vcuo para sua recuperao. A MDEA, por sua vez, menos seletiva ao CO2 sendo mais indicada ao uso de remoo de H2S em correntes gasosas que tambm contenham CO2; o que no foco do nosso estudo.
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Tabela 1: Parmetros da equao (1) para o clculo da presso de vapor. Fonte: DIPPR - Information and Data Evaluation Manager.
Parmetros A B C D E Validade/K MEA 92,624 -10367 -9,4699 1,90E-18 6 283,65-678,2 DEA 106,38 -13714 -11,06 3,26E-18 6 301,15-736,6 MDEA 253,07 -18378 -33,972 2,33E-05 2 252,15-675,15
1400 1200 1000 Pvap (Pa) 800 600 400 200 0 290 300 310 320 T(K) 330 340 350 MEA
Figura 2: Curva de presso de vapor em funo da temperatura para MEA.

60 50 40 Pvap(Pa) 30 20 10 0 290 DEA MDEA
300
310
320
330
340
350
Figura 3: Curvas de presso de vapor em funo da temperatura para DEA e MDEA.
Desta forma, a fim de avaliar a capacidade de absoro das aminas, iniciou-se o estudo com a utilizao do kit didtico para solues de MEA e DEA a 10%. O CO 2 utilizado no processo foi gerado a partir da reao expressa atravs da equao (2). (2) O CO2 proveniente da reao entre HCl e CaCO3 foi conduzido atravs de uma mangueira para uma proveta com a soluo aquosa de amina. A proveta tambm continha timolftalena que foi utilizada como indicador para a percepo do trmino da reao. Assim que a soluo aquosa atingiu a sua saturao o processo foi interrompido. Numa segunda fase, a soluo saturada de amina foi transferida para um balo volumtrico e com o auxlio de uma manta de aquecimento foi promovida a regenerao, que consistiu na liberao do CO 2 capturado e no reaproveitamento da amina utilizada. O uso do kit permitiu a avaliao qualitativa do processo e a percepo de que o processo sofre grande influncia da temperatura e vazo do gs alimentado, j que este repercute diretamente no tempo de contato entre os reagentes. Como o kit no permite o controle da vazo, nem da concentrao do gs gerado in situ foi projetada uma coluna de borbulhamento. 19 CaCO 3 ( s ) +2 HCl (aq ) CaCl 2 (aq ) +H 2 O+CO 2 ( g )
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A coluna de borbulhamento composta por 2 tubos cilndricos concntricos, perfazendo um encamisamento para que seja utilizada a circulao de fluido com vistas ao controle de temperatura. Ela apresenta ainda um sparger posicionado no centro da coluna formado por um prato com orifcios para permitirem a distribuio do gs atravs do borbulhamento. A coluna de vidro tem como dimenses: 1,0 metro de altura, 0,50 m de dimetro interno e 0,53 m de dimetro externo. O projeto da coluna foi executado a partir de informaes da literatura com projetos similares, porm a partir de materiais diferentes. As prximas etapas deste trabalho consistiro na montagem da coluna e execuo dos ensaios para avaliar quantitativamente a influncia da vazo de gs e da temperatura no processo de captura. CONCLUSES Os parmetros de maior influncia num processo de captura de dixido de carbono a partir do borbulhamento de gs de queima em solues de aminas so aqueles atrelados as caractersticas do solvente/reagente e da corrente gasosa. Embora a presso de vapor no seja a nica caracterstica a ser considerada, no que diz respeito ao solvente, a avaliao desta de real significncia j que valores mais altos para esta propriedade significam maiores perdas do solvente por evaporao. Percebeu-se que a MEA possui maior presso de vapor, embora seja a mais comumente usada pelas indstrias para esse processo de absoro, provavelmente devido ao fato de ser mais reativa, j que uma amina primria. A DEA apresentou menor presso de vapor, e em seguida a MDEA, ento elas so mais vantajosas nesse aspecto, pois geraro menores perdas por evaporao. A utilizao do kit didtico para captura de CO 2 atravs de solues aquosas de aminas permitiu a avaliao qualitativa das etapas de absoro e dessoro. Foi possvel observar o ponto de saturao da soluo de amina e identificar os pontos mais relevantes para a execuo do projeto da coluna de borbulhamento em escala piloto. Esta ser utilizada para a avaliao, em termos quantitativos, quanto a influncia da vazo do gs e da temperatura, j que a partir desta ser possvel o controle destes parmetros; o que no foi possvel com o uso do kit didtico. AGRADECIMENTOS Ao IFRJ/CNPq/FAPERJ e FINEP pelo apoio financeiro. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
BOUHID, RR; MIRANDA, JL; MOURA, LC; SILVA, CF, PERROTA, D; KAUFFMAN, M; MARTINS, RC. Contextualizando a captura de gs carbnico por aminas com alunos de nvel mdio/tcnico da rede federal de ensino tecnolgico. In: XV Encontro Nacional de Ensino de Qumica - A formao do professor de Qumica e os desafios da sala de aula. ISSN - 2179-5355, 2010. MARTINS, C; MIRANDA, JL. Contextualizao do aquecimento global e da captura de CO 2 no Ensino de Qumica. Monografia de Concluso do Curso de licenciatura em Qumica. Rio de Janeiro, RJ: Instituto de Qumica, UFRJ, 2007. YAMASAKI A. An overview of CO 2 mitigation options for global warming Emphasizing CO 2 sequestration options. Journal of Chemical Engineering of Japan, 36(4), p.361-375, 2003.
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PRODUO DE EXOGLUCANASES EM FERMENTAO EM ESTADO SLIDO UTILIZANDO O P DA CASCA DO COCO VERDE EM DIFERENTES FONTES DE CARBONO E NITROGNIO.
Exoglucanasis production in solid state fermentation using coconut green powder in different sources of carbon and nitrogen
Caroline Teixeira do Nascimento; Edmir Fernandes Ferreira; Gustavo Saavedra; Ivanilton Almeida Nery; Rosngela da Costa Teixeira*
*Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia do Rio de Janeiro, campus Nilpolis, RJ. Rua Lcio Tavares, 1045, Nova Cidade, Nilpolis. CEP: 26530-060. E-mail: edmirf@gmail.com
Palavras-chave: celulase, cco verde, fermentao,Thichoderma harzianium. Keywords: celulasis, green coconut, fermentation, Thichoderma harzianium. INTRODUO A gua de coco traz consigo o apelo do produto natural e saudvel. Sua composio rica em carboidratos e sais minerais, o que a torna bastante apreciada, alm de ser considerada um reservatrio eletrlitos. O resduo vem sendo disposto em aterros e lixes, o que vem provocando um enorme problema aos servios municipais de coleta de lixo, em funo, principalmente, do grande volume. O desenvolvimento de alternativas de aproveitamento da casca de coco verde possibilita a reduo da disposio de resduos slidos em aterros sanitrios e proporciona uma nova opo de rendimento junto aos stios de produo. Uma das idias utilizar a sua casca em estudos para a utilizao do mesmo em pesquisas biotecnolgicas de interesse industrial, como a produo enzimtica. A definio de enzima foi dada pro KHUNE em 1878, que significa em leveduras em grego, enzimas so protenas de alto peso molecular, com uma estrutura qumica especial e slida capaz de catalisar reaes bioqumicas (BOBBIO & BOBBIO, 1992). Algumas das caractersticas notveis das enzimas quando comparadas com catalisadores qumicos so: a sua alta especificidade na ao cataltica, alta eficincia em moderadas condies de temperatura, presso e pH e minimizao de problemas toxicolgicos e ambientais (WISEMAN, 1975). A fermentao em estado slido definida como um processo onde o crescimento microbiano e a formao de produtos ocorrem sobre uma matriz slida, insolvel em gua, com ausncia de molculas de gua livres, ou seja, a gua, necessria ao crescimento microbiano, deve estar associada aos compostos polimricos da matriz. O substrato das enzimas celulolticas a celulose, que o principal constituinte da parede celular dos vegetais superiores, associada com lignina e hemicelulose. A celulose o polissacardeo mais frequentemente encontrado na natureza, sendo uma estrutura polimrica sob arranjo linear de glicose unida por ligao glicosdica--1,4. Admite-se a existncia de cinco tipos de celulases, das quais ao menos trs formam um complexo sinrgico, responsvel pela hidrlise da celulose: (1) endocelulase responsvel pelo rompimento de ligaes intercadeias polimricas que conferem estrutura cristalina celulose; (2) exocelulase, cliva segmentos das cadeias expostas pela endocelulase, gerando celobiose (dissacardio) ou celotetrose (tetrassacardio); (3) beta-glicosidase, hidrolisa celobiose e celodextrinas, gerando monmeros de glicose. 21
A hidrlise da celulose por celulases resulta na produo final de glicose. A celulose, porm, por serem protenas, no conseguem penetrar com facilidade a barreira de lignina das clulas vegetais e, dessa forma, o difcil acesso destas enzimas s fibras de celulose constitui o principal problema para desencadeamento desse processo de degradao. Reconhecidamente, as clulas microbianas produzidas pelo processo de fermentao so fontes potenciais de enzimas, oferecendo uma serie de vantagens: a produo de clulas microbianas pode ser aumentada facilmente, permitindo um aumento na produo em menor tempo, ditado pelo mercado; as clulas microbianas tm natureza diversificada, permitindo a produo de um complexo enzimtico; facilidade de cultivo em ambiente controlado e sensibilidade a alteraes genticas, o que permite obteno de linhagens melhoradas em relao a produo e qualidade da enzima requerida. Este trabalho tem como objetivo apresentar as melhores condies na produo de exoglucanase a partir do p da fibra do coco verde em meio de fermentao semi-slido. Para se avaliar a produo de exoglucanases foi necessrio produzir um sistemas de fermentao composto de p da fibra de coco verde associado a solues umidificadoras, contendo diferentes fontes de nitrognio e carbono, e uma suspenso de Trichoderma harzianium com crescimento de 7 dias e numero de esporos igual a 5x107 esporos/mL, aps perodo de incubao procedeu-se a verificao da produo enzimtica e obtendo as melhores fontes de nutrientes bem como os melhores inibidores do crescimento fngico. Realizou-se este mesmo procedimento para uma linhagem de cepas de Aspergillus niger. As solues umidificadoras utilizadas com concentrao 0,1% (p/v) foram: glicose, glicose com nitrato, glicose com sulfato, glicose com peptona, glicose com extrato de levedura, sacarose, sacarose com nitrato, sacarose com sulfato, sacarose com peptona, sacarose com extrato de levedura, maltose, maltose com nitrato, maltose com sulfato, maltose com peptona, maltose com extrato de levedura e gua (branco da anlise). Aps a obteno dos extratos enzimticos, realizou-se a filtrao dos mesmos e em seguida fez-se a tcnica do DNS (3,5-Dinitrosalicilico) para a dosagem de acares redutores e por fim a leitura em espectrofotmetro a 570nm.
Figura 1. Fluxograma dos procedimentos realizados.
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RESULTADOS E DISCUSSO As propriedades da fibra de coco conferem ao seu substrato caractersticas de boa qualidade. A grande percentagem de lignina (35-45%) e de celulose (23-43%) e a pequena quantidade de hemicelulose (3-12%), que a frao prontamente atacada por microorganismos, conferem ao substrato de fibra de coco uma grande durabilidade (NOGUEIRA et al., 1998). Aps o processo para obteno da enzima o resduo slido descartado como adubo, j que este recomendvel para cultivos ornamentais e de hortalias sem o uso do solo, pois no sofre o processo de degradao acelerado causado pela intensa aplicao de gua e fertilizantes. Portanto, a utilizao da casca do coco verde processada, alm da importncia econmica e social, tambm importante do ponto de vista ambiental, j que esta um material de difcil decomposio levando mais de 8 anos para se decompor. De todos os organismos, os microrganismos so os os mais versteis e diversificados em suas exigncias nutricionais. Para crescer, todos os organismos necessitam de uma variedade de elementos qumicos como nutrientes. Estes elementos so necessrios tanto para a sntese como para as funes normais dos comportamentos celulares. Eles existem na natureza em grande variedade de compostos, que so inorgnicos ou orgnicos. Os meios de cultura simulam as condies naturais para que o microrganismo possa crescer e os principais elementos qumicos para o crescimento das clulas incluem carbono, nitrognio, hidrognio, oxignio, enxofre e fsforo. O carbono um dos elementos qumicos mais importantes necessrios para o crescimento microbiano, j que o carbono forma o esqueleto das trs maiores classes de nutrientes orgnicos: carboidratos, lipdeos e protenas, tais compostos fornecem energia para o crescimento da clula e servem como unidade bsica do material celular. Todos os organismos tambm necessitam de nitrognio em alguma forma, o elemento uma parte essencial dos aminocidos que juntos formam as protenas. Outros elementos essenciais para todos os organismos so o hidrognio, oxignio, enxofre e fsforo. O hidrognio e o oxignio fazem parte de muitos compostos orgnicos. O enxofre necessrio para a biossntese dos aminocidos cistena, cistina e metionina. O fsforo essencial para a sntese de cidos nucleicos e adenosina trifosfato, um composto que extremamente importante para o armazenamento e a transferncia de energia. A utilizao da fermentao em estado semi-slido (FES) devido referir-se a cultura de microrganismos sobre ou dentro de partculas em matriz slida (substrato ou material inerte), onde o contedo liquido (meio umidificante) ligado a ela est a um nvel de atividade de gua que, por um lado, assegura o crescimento e metabolismo das clulas e, por outro, no exceda mxima capacidade de ligao da gua com a matriz slida. A fermentao em estado semi-slido apresenta algumas vantagens, como por exemplo, h uma acelerao na taxa de reao devido ao contato direto entre o substrato e o microrganismo; as condies de crescimento empregadas so, em geral, similares s condies naturais de crescimento dos fungos filamentosos; o produto final encontra-se mais concentrado; entre outros. As enzimas so protenas que apresentam atividade cataltica. A complexa estrutura molecular enzimtica majoritariamente consituda por uma parte proteica, porm a ela podem estar integradas outras molculas, como carboidratos e lipdeos. A ao cataltica das enzimas se faz, como a dos catalisadores inorgnicos, atravs da reduo de energia de ativao da reao, sem alterao do seu equilbrio termodinmico. Alm de reduzirem significativamente a energia de ativao , incrementando a velocidade da reao, as enzimas apresentam elevada especificidade. Essa especificidade pode se expressar quanto ao tipo de reao ou de substrato. 23
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A primeira etapa na purificao de uma enzima para posteriormente ser medida a sua atividade enzimtica, a obteno de um extrato (extrato bruto) contendo a enzima na forma solvel. Para uma enzima extracelular, ou seja, secretada no meio de fermentao, qualquer outra partcula como as prprias clulas devem ser removidas para as etapas subsequentes. Para isso utilizada uma filtrao e, neste caso, deve-se tomar o cuidado para no haver lise celular, o que poderia causar uma contaminao desnecessria. As clulas obtidas por fermentao devem ser concentradas para um rompimento eficiente, sendo realizada atravs de mixers. A biodegradao de celulose um tpico bem elucidado do ponto de vista bioqumico. A biodegradao do polmero feita pela ao de trs grupos de enzimas que atuam sinergicamente. Esses grupos de enzimas compreendem as endo-1,4--glucanases, as exo-1,4--glucanases e as 1,4-glucosidases. Os diferentes grupos de enzimas atuam atuam de forma cooperativa, causando a hidrlise completa da celulose at a glicose. As endo-glucanases rompem a molcula de elulose ao acaso e liberam fragmentos menores, que servem de substrato para as exo-glucanases. As exo-glucanases hidrolisam, pelas pontas, os fragmentos de menor massa molar. As -glucosidases hidrolisam a celobiose at glicose. O grau de sinergismo das celulases bastante grande e a atividade relativa de cada grupo de enzimas atuando de maneira isolada mais baixa quanto aos trs grupos em conjunto, para a hidrlise total da celulose. Aps a fermentao h a formao de glicose, atravs da celulose, e esta detetada atravs da tcnica de DNS para acares redutores. Os monossacardeos (glicose e frutose) so acares redutores por possurem grupo carbonlico e cetnico livres, capazes de se oxidarem na presena de agentes oxidantes em solues alcalinas. Os dissacardeos que no possuem essa caracterstica sem sofrerem hidrlise da ligao glicosdica so denominados de acares no redutores. Diversos reativos so utilizados para demonstrar a presena de grupos redutores, em acares. De fato, os monossacardeos podem ser oxidados por agentes oxidantes relativamente suaves tais como os ons frricos (Fe3+) e cprico (Cu2+). A qumica da reao do DNS com acares redutores est elucidada em parte. O DNS reduzido para cido 3-amino-5-nitrossaliclico, enquanto que, no caso mais simples o grupamento aldedo parece ser oxidado a cido aldnico. Entretanto a equivalncia entre o cido aminonitrossaliclico produzido e a quantidade do acar no exata e diferentes acares produzem diferente intensidade na cor desenvolvida. Isso sugere que a qumica da reao deva ser mais complexa que a apresentada, podendo estar relacionada com as reaes de decomposio de acares em soluo alcalina. Com os valores obtidos no espectrofotmetro de cada fermentador pde-se calcular a atividade enzimtica do T. harzianium e A. niger nas diferentes solues umidificadoras e verificou-se assim o comportamento deste podendo analisar o melhor meio para o crescimento quanto para sua inibio.
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CONCLUSES Os resultados mostram que houve atividade enzimtica utilizando o p da casca do coco verde umedecido com gua, em cultivo de Trichoderma harzianium, porm nos meios com glicose e maltose observamos maior atividade. Em relao s fontes de nitrognio ocorreu maior atividade se comparar ao controle. J no caso do Aspergillus niger a maior atividade enzimtica tambm dse no meio com maltose, logo em ambos os microorganismos houve maior atividade quando o meio est enriquecido com maltose. Entretanto, foi verificado que com fontes de carbono e nitrognio combinadas ocorreu uma diminuio da atividade e tambm foi observado que o pH e a temperatura influenciam muito na produo de celulase. Tendo a casca do coco verde um potencial de recursos ociosos, o estudo de sua utilizao como matria-prima para produo de enzimas torna-se interessante por deixar de ser resduo para tornar-se recurso para obteno de produtos de alto valor agregado. AGRADECIMENTOS Ao IFRJ/CNPq/Embrapa pelo apoio financeiro e disponibilizao de material e instrumentos para a realizao da pesquisa.
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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
KMPF, AN; FERMINO, MH. Substratos para plantas: a base da produo vegetal em recipientes. In: ENCONTRO NACIONAL SOBRE SUBSTRATO PARA PLANTAS, 2000, Porto Alegre. Anais ... Porto Alegre: Genesis, 2000. 312p. NOGUERA, P; ABAD, M; NOGUERA, V; PURCHADES, R; MAQUIERA, A. Coconut coir waste, a new and viable ecologically-friendly peat substitute. Acta Horticulturae, 517: 279-286. 2000. MICHAEL J; PELCZAR JR., ECS; CHAN, NRK. Microbiologia: conceitos e aplicaes, volume I, 2 ed.; traduo YAMANDA, SF; NAKAMURA, TU; DIAS-FILHO, BP. So Paulo, SP: Makron Books, 1996. VERMELHO, AB; PEREIRA, AF; COELHO, RRR; PADN, TCBSS. Prticas de Microbiologia; Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006.
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LEVANTAMENTO DOS PONTOS DE COLETA DO RIBEIRO CACHIMBAL E SEUS PRINCIPAIS AFLUENTES

Survey of Cachimbal river sampling points and its main affluents. Harison da Silva Ventura; Rayla Dias Gaspar; Allana de Souza Izidrio; Thiago Andrade Bernini; Daniele Gonalves Nunes; Jos Arimatha Oliveira*
*Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia do Rio de Janeiro, campus Nilo Peanha. Rua Jos Breves, 550, Centro, Pinheiral/RJ. CEP:27197-000. E-mail: daniele.nunes@ifrj.edu.br
Palavras-chave: Ribeiro cachimbal, diagnstico, levantamento. Keywords: Cachimbal river, diagnosis, survey. INTRODUO As preocupaes ambientais crescentes colocam a gua em foco nas questes mundiais. Os recursos hdricos atualmente sofrem com a deteriorao da sua qualidade e com o aumento da escassez que j atinge inmeras regies ao redor do planeta. O lanamento de efluentes sem tratamento, disposio inadequada de resduos, uso irracional da gua, manejo inadequado de bacias hidrogrficas e a falta de adoo de prticas de conservao do solo, so causas para a poluio de mananciais que j vm ocorrendo a centenas de anos, sendo o homem, o maior agente causador dessas alteraes. As interferncias antrpicas, associadas aos fenmenos naturais, alteram a qualidade da gua, resultado tambm das aes de uso e ocupao das bacias hidrogrficas. Em meio aos fundamentos da Poltica Nacional de Recursos Hdricos (PNRH), instituda pela Lei no 9.433/97, encontra-se a bacia hidrogrfica, definida como unidade territorial de planejamento, onde todas as aes do quadro normativo, assim como as aes de manejo devero ser implementadas respeitando o limite natural e suas caractersticas. Isso se torna importante para o reconhecimento da gua como fator de ordenamento territorial, sendo elemento fundamental para a garantia de qualidade de vida e fator restritivo de desenvolvimento econmico e social. O presente projeto foi desenvolvido na microbacia do ribeiro Cachimbal, sendo este, afluente do rio Paraba do Sul, na regio do Mdio Vale Paraba, sul do estado do Rio de Janeiro. Esta microbacia de importncia estratgica para o abastecimento pblico de algumas cidades, como Pinheiral, pois em caso de problemas com a qualidade e o fornecimento da gua oriunda do rio Paraba do Sul, passa a ser a nica fonte de abastecimento. Alm disso, essencial a preservao e conservao dos afluentes de cursos de gua como o rio Paraba do Sul, j que grande parte da carga orgnica afluente a esses rios originada da degradao das bacias hidrogrficas afluentes. A rea analisada no presente estudo contempla a microbacia do ribeiro Cachimbal, constituinte da bacia do rio Paraba do Sul, situada na regio do Mdio Paraba Fluminense, abrangendo os municpios de Pinheiral, Pira e Volta Redonda no estado do Rio de Janeiro, como mostra a figura 1. O ribeiro Cachimbal situa-se entre as coordenadas geogrficas 2233 e 2238 de latitude sul e 4357e 4405 oeste (OLIVEIRA, 1998). 27
Este estudo teve como objetivos: seleo dos principais afluentes do ribeiro Cachimbal e dos pontos de coleta no rio principal (ribeiro Cachimbal); mapeamento das nascentes dos principais afluentes e do rio principal; medies de vazo e anlises dos parmetros de qualidade nos pontos selecionados. Este ltimo ter seus resultados apresentados posteriormente, pois aindafaltam as resultados referentes ao perodo de estiagem das chuvas. Desse modo, neste resumo sero apresentados resultados parciais. RESULTADOS E DISCUSSO Levantamento dos principais pontos de coleta O reconhecimento da rea da bacia hidrogrfica do ribeiro Cachimbal foi realizado atravs de pesquisa de campo, utilizando-se um equipamento receptor GPS (Global Positioning System). Foram coletados dados de coordenadas UTM (Universal Transverse Mercator). Pode-se observar, atravs das visitas de campo, a predominncia de pastagens degradadas, alm de pontos de poluio por despejo de dejetos, como na regio de Arrozal, no ponto prximo Praa Anita Abreu. Foram observados 21 pontos importantes dentro da bacia, entre pontos dentro do ribeiro Cachimbal e pontos relacionados aos seus afluentes, sendo demarcados at o presente momento 12 destes pontos. Sero utilizados como pontos de coleta 10 pontos. Isto devido logstica de anlises de qualidade de gua e medies de vazo. Os quadros 1 e 2 mostram os dados coletados dos 12 pontos j demarcados.
Figura 1 Mapa poltico do estado do Rio de Janeiro, destacando-se os municpios de Volta Redonda, Pinheiral e Pira. (Fonte: Adaptado de Fundao CIDE e IBGE Projeto RADAM 1983)
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Quadro 1 Descrio dos pontos da bacia hidrogrfica do ribeiro Cachimbal.

Pontos N1 FGrama N2 Arrozal N3 Cachimb P1 FGrama P2 Afl Cac P3 Cachimb P4 Pedreir P5 Cachimb P6 JRO P7 Unio Coordenadas UTM (m)* Coordenadas L Coordenadas N Nascente crrego Pau dalho 598745 7496259 Descrio Nascente Nascente Cachimbal Crrego Pau dalho (ponte) Afluente Sitio do Angico Prximo a Pa Anita Abreu Crrego da Pedreira 596917 597274 599064 598026 598411 598405 7498935 7499324 7498585 7499748 7500663 7500670 7500925 7501601 7503526 Altitude (m) 456 424 398 444 396 397 395 396 394 388
Cachimbal Sitio do Mrcio 598569 Crrego Pau dalho (Varjo) 601054 Confluncia Pau dalho e600554 Cachimbal
*Zona 23K Quadro 2 Descrio dos pontos da bacia hidrogrfica do ribeiro Cachimbal (continuao).
Pontos P6 Cachimb P7 FNader P8 Afl Cac P9 Curva P10 Cachimb P11 Cachimb P12 Cachim *Zona 23K Descrio Ponte (pista reta) Ponte Ponte (curva) Confluencia com afl Apicultura Ponte (piscicultura) Ponte (ETA) Coordenadas UTM (m) Coordenadas L 602307 601946 602864 602908 604120 604012 603905 Coordenadas N 7505830 7505896 7507040 7507046 7509242 7509102 7508826 Altitude (m)
CONCLUSES Pode-se concluir que de fundamental importncia o reconhecimento da rea da bacia hidrogrfica para a pesquisa e que todas as aes realizadas sobre essa rea influenciam nas caractersticas e dinmicas da bacia.
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AGRADECIMENTOS Ao IFRJ pelo apoio financeiro.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS OLIVEIRA, J.A. Caracterizao fsica da bacia do ribeiro Cachimbal Pinheiral, RJ e de suas principais paisagens degradadas. 154p. Dissertao (Mestrado em Cincias Ambientais) Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropdica, RJ, 1998. FUNDAO CIDE. Centro de Informaes e Dados do Rio de Janeiro [on line]. disponvel via URL. http://www.zonu.com/brasil_mapas_esp/Mapa_Division_Politica_Administrativa_do_Rio_Janeiro_Brasil.ht m (capturado em 22 de out. 2010).
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ANLISE DE MUTANTES DE Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5 DEFICIENTES EM GENES RELACIONADOS COM MECANISMOS DE QUIMIOTAXIA BACTERIANA
Study of Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5 mutants, deficient in genes related with bacterial chemotaxis mechanisms N.C. Maia1, J.C.S. Santos1, V.L.M. Pdua2, S.H. Seabra2, A.S. Hemerly3, J.I. Baldani4, A. Coelho3 , M.M. Loureiro1*
Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia do Rio de Janeiro (IFRJ), campus Duque de Caxias, RJ. Av. Repblica do Paraguai, 120, Bairro Sarapu, Duque de Caxias, RJ. CEP 25050-100. E-mail: marcio.loureiro@ifrj.edu.br. 2Centro Universitrio da Zona Oeste (UEZO). 3Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). 4Embrapa Agrobiologia, Seropdica, RJ.
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Palavras-chave: Gluconacetobacter diazotrophicus; Quimiotaxia; Interao plantabactriaKeywords: Gluconacetobacter diazotrophicus;Chemotaxis, Plant-bacteria interaction
INTRODUO Gluconacetobacter diazotrophicus uma bactria Gram negativa, endofitica, microaerbica, que apresenta clulas em forma de basto com extremidades arredondadas. considerada um modelo pioneiro de bactria fixadora de nitrognio capaz de associar-se com variedades de cana-deacar, inclusive as estirpes utilizadas para produo de etanol, sendo encontrada nos espaos intercelulares do vegetal, realizando associaes benficas com todas as suas estruturas. G. diazotrophicus PAL5 apresenta grande potencial biotecnolgico, relacionado a sua alta capacidade de fixao biolgica de nitrognio, onde mais de 60% do nitrognio incorporado biomassa vegetal pode ser adquirido por este mecanismo em variedades de cana de acar, o que refora sua importncia para a agricultura sustentvel no Brasil, onde baixas quantidades de fertilizantes nitrogenados so aplicadas nos cultivares. Este endfito apresenta outros potenciais biotecnolgicos, pois pode ser utilizado industrialmente para produo de cido glucnico a partir de glicose, alm de produzir e secretar fitormnios (auxina e giberilina) durante a associao endoftica, o que contribui para o desenvolvimento vegetal, e produzirem peptdeos com efeito bactericida (bacteriocinas) (Bertalan et al., 2009) O objetivo deste estudo selecionar e analisar mutantes deficientes em genes de protenas relacionados a mecanismo de quimiotaxia bacteriana, que so importantes para motilidade celular, transduo de sinais, diviso celular e interaes planta-bactria, com finalidade de verificarmos os efeitos fisiolgicos dos nocautes executados nestes genes e em suas respectivas vias metablicas.
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Neste sentido, estamos utilizando uma biblioteca de mutantes de Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5 construda na Embrapa-Agrobiologia Seropdica RJ, criada a partir de inseres randmicas, geradas a partir de uma verso do elemento de transposio Tn5 no cromossomo deste endfito, com o kit de mutagnese randmica EZ-Tn5TM <KAN-2>Tnp TransposomeTM (Epicentre), os quais foram submetidos a reaes de sequenciamento bidirecional de DNA genmico com primers transposon especficos, reagente BigDye terminator e seqenciador capilar ABI3130 (Applied Biosystems). Para caracterizao fenotpica, foram realizados testes de motilidade celular, microscopias eletrnicas de varredura e anlises protemicas em espectrmetro de massas Maldi Q-Tof. RESULTADOS E DISCUSSO Atravs da metodologia de seleo proposta, pudemos realizar o mapeamento das mutaes em 63 mutantes. Dentre estes, foram selecionados 02 mutantes de interesse, que tiveram inseres ocorridas em genes que codificam protenas relacionadas com mecanismos de quimiotaxia bacteriana, (protena de quimiotaxia CheW e protena de quimiotaxia MotB) (Figura 1).
Figura 1. Exemplo de representao esquemtica do alinhamento de sequncias de DNA, geradas atravs de sequenciamento bi-direcional, a partir do DNA genmico purificado de um mutante nocauteado no gene da protena de quimiotaxia MotB.
Visto que a motilidade celular consiste em um dos mecanismos associados com a quimiotaxia bacteriana, resolvemos realizar testes de motilidade celular, em meio de cultura Agar Motility, com finalidade de comparar a cepa selvagem com os mutantes CheW, MotB selecionados neste estudo e um mutante flagelar de G. diazotrophicus PAL5 (mutante FlgA), descrito por Rouws et al. 2008, o qual foi cordialmente cedido ao grupo. 32
Figura 2. Testes de Motilidade Celular realizados com a cepa selvagem e os mutantes (MotB, CheW e FlgA) de Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5, em meio de cultura Agar Motility.
Nestes experimentos verificamos que o mutante MotB e CheW apresentaram motilidade, mesmo sendo mutantes deficientes em genes relacionados com biossntese, montagem e funcionamento de flagelos. Como controle deste experimento, pudemos verificar que o mutante FlgA apresentou crescimento apenas nos locais de inculo, como anteriormente descrito na literatura (Rouws et al, 2008) (Figura 2). Cabe ressaltar que o motor flagelar bacteriano, uma nanomquina rotativa natural, que transforma filamentos helicoidais, criando uma fora propulsora para que as bactrias nadem, e que este motor formado por protenas de membrana MotB e MotA, que se associam em complexos dispostas circunferencialmente em torno do rotor, onde o domnio periplasmtico de MotB, liga-se zona de stress de suporte altamente reticulada de peptideoglicano de parede celular, o qual imobiliza o anel do estator do motor flagelar bacteriano. Neste sentido, acreditamos que o fato destes mutantes terem apresentado motilidade, esteja associado com complementao da via de biossntese de flagelos, por outros genes presentes no genoma de G. diazotrophicus PAL, ou ainda que estes mutantes possam ter tido o seu nmero de flagelos reduzidos, visto que crescimento em meio de cultura Agar Motility apenas um teste qualitativo. Para testagem da segunda hiptese, atualmente estamos submetendo tais mutantes a anlises atravs de microscopias eletrnicas de transmisso. Tendo conhecimento de que os genes de protena MotB e CheW so envolvidos com a formao de flagelos bacterianos, bem como transduo de sinais, e que o mutante flagelar FlgA deficiente para produo de biofilme, submetemos os mutantes a um teste colorimtrico de quantificao de produo de biofilme, baseado na utilizao do corante cristal violeta, em comparao com a cepa selvagem de Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5 (Figura 3).
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Figura 3. Teste Colorimtrico de Formao de Biofilme obtidos com as cepas selvagem, em comparao com os mutantes MotB, CheW e FlgA de Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5.
Nestes experimentos, verificamos diferenas expressivas na produo de biofilme, quando comparamos a cepa selvagem e os mutantes, onde os mutantes produziram uma quantidade muito menor de biofilme, o que sugere a possibilidade dos genes das protenas de quimiotaxia CheW e MotB, estarem direta ou indiretamente associados a este mecanismo. Devido aos resultados obtidos nos testes de motilidade, resolvemos realizar a anlise ao microscpio eletrnico de varredura, com o objetivo de verificarmos a ocorrncia de qualquer anormalidade na superfcie celular bacteriana. Os resultados revelaram que os mutantes apresentavam clulas alongadas, quando comparadas com a cepa selvagem, sendo que as alteraes morfolgicas mais drsticas, foram observadas no mutante MotB, que exibiu clulas muito longas, que formavam aglomeraes com ramificaes em diversas direes, similar a observaes microscpicas obtidas com fungos filamentosos, o que sugere o envolvimento destes genes no mecanismos de diviso celular de G. diazotrophicus PAL5. Como os resultados de microscopia eletrnica de varredura sugeriram o envolvimento dos genes das protenas de quimiotaxia MotB e CheW no mecanismo de diviso celular, resolvemos realizar curva de crescimento destes mutantes, do mutante FlgA e da cepa selvagem, num intervalo de tempo variando de 0 a 78 horas, onde foram realizadas medies de D.O 600 nm e contagens de colnias, com finalidade de observarmos alteraes nas taxas de crescimento bacteriano de forma temporal (Figura 4 e Tabela 1). Alm disso, coletamos fraes das culturas com 24, 36, 48, 60 e 70 horas de crescimento bacteriano da cepa selvagem e mutantes, para procedermos novas anlises em microscopia eletrnica de varredura (dados no exibidos).
Curva de Crescimento
2,000 1,800 1,600 1,400 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 0h 6h 12h 24h 30h 36h 48h 54h 60h 72h 78h
GD FLGA MOTB CHEW
Figura 4. Curva de crescimento da cepa selvagem e dos mutantes CheW, MotB e FlgA de Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5.
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Tabela 1. Contagem de colnias da cepa selvagem e dos mutantes CheW, MotB e FlgA de Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5.
Com os resultados obtidos ao longo da curva de crescimento (D.O 600nm e contagem de colnias), pudemos observar que os mutantes FlgA e MotB s comearam a apresentar crescimentos expressivos a partir de 30 horas de cultura, e que com 36 horas, o mutante CheW, apresentava elevadas taxas de crescimento celular, o que novamente sugere o envolvimento dos genes das protenas de quimiotaxia Chew e MotB, no mecanismo de diviso celular de G. diazotrophicus PAL5. Paralelamente, foram realizadas anlises protemicas da cepa selvagem de G. diazotrophicus PAL5 e dos mutantes CheW e MotB, atravs da metodologia de SDS Page (Figura 5), onde pudemos excisar 05 bandas do mutante CheW e 02 Bandas do mutante MotB, as quais foram tripsinizadas e analisadas em espectrmetro de massas Maldi Q-Tof, com finalidade de identificarmos protenas diferencialmente expressas entre os perfis proticos obtidos, a partir de extratos proticos totais, purificados de amostras cultivadas em condies timas de crescimento bacteriano.
Figura 5. Gel de SDS Page de extrato total de protenas de Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5 e mutantes Tn5 dos genes das protenas de quimiotaxia CheW e MotB. Os quadrados em vermelho sinalizam as bandas submetidas a analises protemicas em espectrmetro de massas Maldi Q-Tof. L- Marcador de peso molecular. GD- Cepa Selvagem de G. diazotrophicus PAL5. C- Mutante Tn5 com insero no gene da protena de quimiotaxia CheW. M- Mutante Tn5 com insero no gene da protena de quimiotaxia MotB.Nas anlises protemicas realizadas, foram identificadas 30 e 51 protenas diferencialmente expressas nos mutantes MotB e CheW, respectivamente (Dados no exibidos). Dentre as protenas identificadas no mutante MotB, podemos destacar a protena FtsZ, a qual geralmente encontra-se relacionada diviso celular bacteriana, a qual orquestrada por este peptdeo que apresenta estrutura em forma de um anel contrtil conhecido como o anel Z, o qual atua como uma espcie de andaime para a montagem de uma protena multi-complexo chamada divisomo.
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O fato da protena FtsZ ser detectada nas anlises protemicas associados com os dados de microscopia eletrnica de varredura, sugere a participao da protena MotB no mecanismo de diviso celular de G. diazotrophicus PAL5. CONCLUSES Com os experimentos conduzidos at o presente momento, pudemos verificar alteraes morfolgicas nos mutantes analisados, as quais so sugestivas do envolvimento dos genes nocauteados, com o mecanismo de diviso celular. Cabe ressaltar que no caso do mutante do gene da protena de quimiotaxia MotB, este resultado bastante expressivo, pois este gene normalmente associado com mecanismos de locomoo celular, portanto, no existem relatos na literatura, descrevendo a associao do mesmo com mecanismos de diviso celular. Tendo conhecimento da importncia desse mecanismo para o processo de colonizao vegetal, pretendemos submeter esses mutantes a interao com plntulas de cana de acar, para estimarmos as taxas de colonizao vegetal, bem como analisarmos tecidos vegetais colonizados, atravs de microscopias eletrnicas de transmisso e varredura. Paralelamente, iremos iniciar os experimentos de complementao dos mutantes em anlise, com finalidade de revertermos as mutaes produzidas. AGRADECIMENTOS Apoio Financeiro: IFRJ, Finep-MCT, Faperj, Capes e CNPq. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
ADAMS, DW; WU, LJ; CZAPLEWSKI, LG et al. Multiple effects of benzamide antibiotics on FtsZ function. Molecular Microbiology, doi:10.1111/j, 1365-2958. 2011. BERTALAN M. et al. Complete genome sequence of the sugarcane nitrogen-fixing endophyte Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5. BMC Genomics. 10: 450-459, 2009. MOHAMMADI, T; VAN DAM, V; SIJBRANDI, R et al. Identification of FtsW as a transporter of lipidlinked cell wall precursors across the membrane. EMBO Journal, 2011. Disponvel em: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/. ROUJEINIKOVA, A. Crystal structure of the cell wall anchor domain of MotB, a stator component of the bacterial flagellar motor: Implications for peptidoglycan recognition. PNAS, 30(105): 10348-10353, 2008.
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Perspectivas da Cincia e Tecnologia, v.3, n. 1/2 (2011)
EFEITO DE COMPOSTOS PURIFICADOS DE PRPOLIS BRASILEIRO NA ATIVIDADE DA PDR5P DE MEMBRANAS PLASMTICAS DE LEVEDURAS
Gabriellen M. M. de Castro1,2, Beatriz dos Anjos F.S. da Silva1,2, Antonio Ferreira-Pereira2, Ana Claudia Tessis1; Leandro F. Reis de S2; Cinzia Lotti3; Anna Lisa Piccinelli ; Luca Rastrelli
Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia do Rio de Janeiro (IFRJ), campus Rio de Janeiro. Rua Senador Furtado,121/125, Maracan, Rio de Janeiro, RJ. CEP: 20.270-021. E-mail: ana.tessis@ifrj.edu.br; 2 Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), 3Universit degli Studi di Salerno, Itlia.
Palavras-chave: MDR, Prpolis, Pdr5p. Keywords: MDR, Propolis, Pdr5p. INTRODUO A resistncia a mltiplas drogas (MDR) encontrada tanto em clulas cancerosas quanto em microrganismos patognicos, sendo a principal responsvel pela falha na quimioterapia, devido a super expresso de bombas de efluxo pertencentes a super famlia dos transportadores ABC. Em S. cerevisiae, o gene PDR5 codifica o transportador Pdr5p, um membro da super famlia dos transportadores ABC. Esta protena homloga a glicoprotena-P e a transportadores presentes em fungos, como CDR1p e CDR2p de Candida albicans, tornando-a um modelo de estudo do processo de MDR. Uma das estratgias usadas para reverter este fenmeno consiste na utilizao de inibidores especficos, porm as drogas existentes apresentam alta toxicidade, dificultando seu uso na clnica. Estratgias mais recentes buscam em fontes naturais, como extratos de plantas, novos compostos capazes de inibir tais transportadores relacionados com efluxo de drogas. Neste estudo, avaliamos o efeito de uma srie de compostos isolados a partir de prpolis vermelho do Brasil, sobre a atividade ATPsica da Pdr5p e o acmulo de rodamina 6G. RESULTADOS E DISCUSSO Aps a solubilizao em dimetilsulfxido (DMSO) de todos os compostos obtidos a partir da purificao dos extratos de prpolis vermelho, coletado no Brasil, os mesmos foram testados frente atividade ATPsica da Pdr5p de leveduras, em uma concentrao final de 100 M. Como pode ser observado na Figura 1, dentre os cinco compostos testados, apenas o CZ-01 foi capaz de abolir completamente a atividade da enzima. O IC50 do composto de 1,35 M, calculado a partir da curva dose resposta para a atividade ATPsica, com concentraes at 20 M (Figura 2).
37
400
Atividade ATPsica (% do controle)
300
200
100
0 Control CZ 01 CZ 02 CZ 03 CZ 04 CZ 05
Figura 1: Efeito dos compostos, com concentrao final de 100 M, na atividade da Pdr5p.
100
Atividade ATPsica (% do controle)
80
60
40
20
0 0 5 10 15 20
CZ 01 (M)
Figura 2: Curva de inibio da atividade ATPsica da Pdr5p na presena do composto CZ-01.
Verificamos, a partir do dado da inibio da atividade, a capacidade do CZ-01 em inibir o transporte de Rodamina 6G (R6G) atravs do bloqueio do transportador Pdr5p. O resultado obtido mostra que o CZ-01 (na concentrao de 100 M) foi capaz de impedir o efluxo da R6G, quando comparado com a clula que superexpressa o transportador Pdr5p, mostrando assim a capacidade de bloquear por completo a ao de extruso de compostos, do interior da clula, promovida pelo mesmo (Figura 3). Como sabido que o prprolis pode ser muito txico para bactrias e clulas humanas, foi testado a toxicidade do composto frente levedura. A Figura 4 mostra que mesmo na presena de alta concentrao de CZ-01 (100 M), no foi observado nenhum efeito txico nas clulas de S. cerevisae.
Figura 3: Efeito do composto CZ-01 na captao de Rodamina 6G.
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120
100
80
Crescimento relativo ao controle (%)
60
40
20
0 25 0,39 6,25 1,562 0,195 0,781 CONTROL 3,125 12,5 50
Concentraes (M)
Figura 4: Avaliao da toxicidade do composto CZ-01.
CONCLUSES Conclumos, com base nos resultados obtidos, que o composto CZ01 obtido dos extratos de prpolis, originados do Brasil, capaz de inibir o transportador Pdr5p, que promove o fentipo de resistncia mltipla em leveduras e fungos, sem causar danos estes. Os dados so bastante promissores pois demonstram que o composto pode servir, no futuro, como possvel medicamento para reverso da resistncia mltipla em infeces fngicas. AGRADECIMENTOS Ao IFRJ/CNPq/FAPERJ/CAPES pelo apoio financeiro. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
CANNON et al. Efflux-Mediated Antifungal Drug Resistance. Clinical Microbiology Rewies. 22(2), 291321, 2009. LAMPING et al. Fungal PDR transporters: Phylogeny, topology, motifs and function. Fungal genetics and biology, 47, 127-142, 2010.
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IDENTIFICAO E CARACTERIZAO DE UM TRANSPORTADOR DA FAMLIA ABC EM Oncopeltus fasciatus E O SEU ENVOLVIMENTO NA RESISTNCIA A INSETICIDAS
Identification and characterization of an ABC family transporter in Oncopeltus fasciatus and its envolvement in the inseticides resistence. Beatriz dos Anjos F.S. da Silva,; Gabriellen M.M. de Castro1,2; Jlia Arajo de Freitas; Ana Claudia Tessis1*; Antnio Ferreira-Pereira
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Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia do Rio de Janeiro (IFRJ), campus Rio de Janeiro, RJ. Rua Senador Furtado,121/125, Maracan, Rio de Janeiro, RJ. CEP: 20.270-021. E-mail: ana.tessis@ifrj.edu.2Laboratrio de Bioqumica Microbiana, Dept. Microbiologia Geral, IMPPG/CCS, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), RJ.
Palavras-chave: Transportador ABC, MDR, Inseticidas Keywords: Transporter, ABC, MDR, Inseticides INTRODUO Os inseticidas qumicos so um importante mecanismo de controle dos vetores transmissores de doenas humanas e de agropecuria. Em geral, so drogas capazes de agir no sistema nervoso central dos insetos. O seu uso contnuo, indiscriminado e no-seletivo tem levado ao aparecimento de linhagens de insetos resistentes a vrias classes de inseticidas. A resistncia pode surgir por muitos mecanismos, um deles denominado de resistncia metablica, sendo causado pelo aumento de enzimas detoxificantes, tais como: glutationa-S-transferase, esterases e oxidases de funo mista. Um mecanismo adicional a resistncia a mltiplas drogas (MDR). Neste trabalho utilizaremos a espcie Oncopeltus fasciatus (Figura 1) como modelo de MDR em insetos. 1. Manuteno dos insetos Os insetos so mantidos em potes plsticos a temperatura ambiente, e alimentados com gua filtrada e sementes de girassol descascadas, as quais foram mantidas previamente a -18 C por 48 horas, com objetivo de matar ovos de carunchos. 2. Induo de resistncia A partir da colnia original so separados ovos no mesmo estgio de maturao para a formao de uma nova colnia (colnia controle). Desta colnia so separados, sempre que necessrio, insetos no quinto estgio de ninfa para o tratamento com o inseticida Deltametrin. A colnia controle mantida at o fim do trabalho. Diferentes concentraes do inseticida sero aplicadas na regio dorsal do abdome de cada inseto. O primeiro grupo tratado (F0) ser mantido at a fase adulta, para que possam copular e produzir ovos, que sero separados e daro origem a uma nova colnia (F1). As ninfas F1 sero tratadas com uma concentrao maior da droga, para a obteno da F2. As prximas geraes sero tratadas com concentraes crescentes do inseticida, at a obteno da F5 resistente ao Deltametrin.
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3. Identificao de trasportadores ABC Os insetos resistentes (F5) e sensveis (Controle) sero submetidos a dissecao para retirada de tubo digestrio e corpos gordurosos, os quais sero solubilizados em SDS. A concentrao de protenas dos extratos ser analisada pela metodologia descrita por Bradford e col. (1976). As protenas dos extratos sero separadas em SDS-PAGE 10% e transferidas para membrana de nitrocelulose para posterior imunoblotting com anticorpo JSB1. 4. Expresso diferencial de protenas de resistncia a mltiplas drogas A avalio da expresso diferencial das protenas relacionados ao fentipo de MDR ser realizada pela anlise da diferena da densitometria das bandas marcadas no filme fotogrfico aps a marcao com anticorpo.
Figura 1: Oncopeltus fasciatus. (a) Adulto e (b) ninfa de estgio 5.
RESULTADOS E DISCUSSO Nos insetos submetidos a tratamentos com concentraes crescentes de um organofosforado, ser avaliada a expresso de protenas relacionadas ao processo de MDR em seu trato digestivo e corpos gordurosos. Em trabalhos anteriores de nosso grupo, j foi evidenciada a ocorrncia de uma expresso diferencial dessas protenas relacionadas MDR nos extratos da cabea, trax e abdmen dos insetos resistentes. (Figura 2).
Figura 2. Western blot utilizando anticorpos JSB1 contra protenas do extrato proteicos total de cabea, trax e abdomen de insetos controle (lanes 1, 2 e 3, respectivamente) e do extrato proteico total de cabea, trax e abdome de insetos resistentes (lanes 4, 5 e 6, respectivamente). A massa molecular das protenas padres esto indicadas em quilodaltons, esquerda das figuras.
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CONCLUSES A avaliao da expresso de protenas relacionadas ao fentipo de MDR nos diferentes rgos isolados do inseto, assim como a caracterizao desse processo, so objetivos do projeto. AGRADECIMENTOS Ao IFRJ/CNPq/CAPES/FAPERJ pelo apoio financeiro. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
BRADFORD, MM. A Rapid and sensitive method for the quantitation of micrograms quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72, 248-254, 1976.
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PRODUO DE MINIMILHO COMO ESTRATGIA PARA INSERO DA ADUBAO VERDE EM UNIDADES ORGNICAS DE PRODUO DE HORTALIAS
Minicorn production like a strategy to inserption of the green fertilization in organic unities of vegetables production Aramis Paes Pena Barcellos1, Walace Rodrigues de Oliveira1, Shaiene Costa Moreno2, Ana Amlia dos Santos Cordeiro3, Ednaldo da Silva Arajo3, Jos Guilherme Marinho Guerra3
Estudante do curso Tcnico em Agropecuria do Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia do Rio de Janeiro, campus Nilo Peanha (IFRJ). Rua Jos Breves, 550, Centro, Pinheiral/RJ. CEP: 27197-000. bolsista PIBIC Jr-CNPq-IFRJ. E-mail: shaiene.moreno@ifrj.edu.br. 2Professora do IFRJ, campus Nilo Peanha, Pinheiral, RJ. 3Pesquisador da Embrapa Agrobiologia, Seropdica, RJ.
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Palavras-chave: milho, fixao biolgica de nitrognio, sustentabilidade, agricultura familiar. Keywords: corn, Nitrogen biological fixation, sustaintability, familiar agriculture. INTRODUO O cultivo de hortalias, principalmente no sistema de produo orgnico, bastante dependente do aporte de adubos orgnicos. Todavia, face s dimenses reduzidas das unidades familiares de produo orgnica, o emprego de adubos orgnicos de origem animal um fator limitante quando a integrao pecuria-lavoura no possvel em nvel de propriedade. Nesse sentido, a adubao verde com leguminosas torna-se particularmente importante, visto que o cultivo de plantas para tal fim confere ao agricultor certa autonomia em relao disponibilidade de matria orgnica, alm de auxiliar no controle da eroso hdrica e da vegetao espontnea (ESPNDOLA et al., 2005). A introduo da tcnica da adubao verde no cultivo de hortalias pode proporcionar expressivos benefcios relacionados tanto melhoria das caractersticas do solo, quanto nutrio e desempenho agronmico dos cultivos comerciais. Apesar disso, a adoo desta tcnica ainda bastante restrita nas unidades agrcolas dedicadas ao cultivo de hortalias. Uma das razes mais relevantes a dificuldade que o agricultor encontra para compatibilizar, no tempo e no espao, a presena de adubos verdes e dos cultivos comerciais. Nesse contexto, o uso de leguminosas adubos verdes consorciadas com o milho pode resultar em gerao de renda para o produtor, atravs da produo de minimilho, e tambm em produo de biomassa de qualidade para adubao verde, minimizando a problemtica da adubao orgnica no cultivo de hortalias em pequenas propriedades familiares. O minimilho o nome dado inflorescncia feminina do milho (Zea mays L.) antes da polinizao da espigueta da planta de milho a inflorescncia do milho em desenvolvimento e no fertilizada. O minimilho um produto industrializado na forma de conservas e encontrado em mercados destinados culinria oriental, supermercados e em restaurantes, sendo usado principalmente como elemento decorativo em saladas vegetais, possuindo grande valor comercial (PEREIRA-FILHO et al., 1998) Diante do exposto, o presente trabalho tem como objetivo avaliar estratgias de manejo da cultura do milho para produo de minimilho, consorciado com leguminosas adubos verdes como uma estratgia para insero da adubao verde em sistemas de produo de hortalias. 43
MATERIAL E MTODOS O experimento de avaliao de tcnicas de manejo de adubao verde associada produo de mimimilho foi instalado no Mdulo Agroecolgico do Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia, campus Nilo Peanha em Pinheiral-RJ. Inicialmente a rea foi dividida em blocos em funo da homogeneidade e foram colhidas amostras de solo para caracterizao qumica da rea experimental. Os resultados da anlise esto apresentados na Tabela 1. Aps realizao da amostragem de solo, a rea experimental foi preparada e o experimento foi implantado em blocos casualizados com cinco tratamentos e cinco repeties. A leguminosa estudada foi a mucuna verde (Mucuna pruriens). Os tratamentos foram: monocultivo de milho; monocultivo de mucuna; consrcio de milho e mucuna semeados simultaneamente; consrcio de milho e mucuna, com semeadura da mucuna 15 dias aps semeadura do milho; e consrcio de milho e mucuna, com semeadura da mucuna 30 dias aps semeadura do milho. A semeadura do milho foi feita de forma a atingir densidades de 200.000 e 100.000 plantas ha -1, respectivamente, no monocultivo e no consrcio com mucuna. As densidades de mucuna foram de 100.000 e 50.000 plantas ha-1, respectivamente, no monocultivo e no consrcio com milho. A colheita das espigas foi feita aos trs dias aps a emisso da inflorescncia feminina. Foram colhidas espigas em uma rea til de 10 m2 por parcela. As espigas colhidas foram contadas e pesadas a cada colheita. Aps colheita do minimilho, por ocasio do pleno florescimento da mucuna, as plantas foram roadas para o plantio do brcolis, hortalia utilizada para mensurar o benefcio da adubao verde. A colheita do brcolis foi realizada logo aps a formao completa das cabeas. Foram colhidas e pesadas 10 plantas de cada parcela. Os dados experimentais submetidos anlise de varincia e as mdias comparadas pelo teste de agrupamento de Scott-Knott (P>0,05) (Scott & Knott, 1974). Tabela 1. Caracterizao qumica do solo (0-20 e 20-40 cm) da rea experimental em diferentes blocos (subreas que contm todos os tratamentos).
Subrea Bloco 1 Bloco 2 Bloco 3 Bloco 4 Bloco 5 Bloco 1 Bloco 2 Bloco 3 Bloco 4 Bloco 5 pH 6,1 6,2 6,1 6,1 6,1 6,1 6,2 6,2 6,2 6,2 Al3+ H+ + Al3 Ca2+ + Mg2+ Ca2+ Mg2+ --------------------- cmolc dm-3 ---------------------0-20 cm 0,0 2,72 1,5 0,7 0,9 0,0 2,03 2,3 1,1 1,2 0,0 1,35 2,5 1,4 1,1 0,0 2,56 2,0 1,0 1,0 2,05 1,2 0,0 2,1 1,5 20-40 cm 0,0 1,96 1,5 0,6 0,9 0,0 1,86 2,1 1,1 1,0 0,0 3,10 1,0 0,4 0,7 0,0 1,98 1,8 0,9 0,9 0,0 1,75 2,0 0,8 1,0 P K+ mg kg-1 140,0 82,0 88,0 84,0 88,0 220,0 96,0 88,0 52,0 86,0 C MO % 0,07 0,55 0,35 0,54 0,45 0,83 0,11 0,16 0,15 0,16 0,12 0,94 0,60 0,93 0,83 1,42 0,19 0,28 0,25 0,26 0,07 0,15 1,06 0,12 0,20 0,095 0,094 0,089 1,161 0,098 N
260,9 272,1 232,1 172,4 184,2 295,7 163,9 112,4 112,8 111,4
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RESULTADOS E DISCUSSO O tratamento que apresentou maior resposta na produo de minimilho foi o milho solteiro, o que j era esperado em funo da densidade de plantio ser maior neste tratamento. A densidade de plantio do milho solteiro o dobro do consrcio, entretanto, quando comparamos a produtividade do milho solteiro com a do conscio milho + mucuna 30 dias, que foi o segundo melhor tratamento, o consrcio (com metade da densidade do milho solteiro) produziu bem mais que a metade da produo apresentada pelo milho solteiro, o que mostra um ganho proporcionado pela presena do adubo verde (Tabela 2). Esta resposta pode ser explicada pelo processo de fixao de nitrognio realizado pelo adubo verde, o que pode ter beneficiado as plantas de milho. O conscio milho+mucuna 0 dias e 15 dias, apresentaram baixa produtividade. Foi observado visualmente que a competio da mucuna com o milho foi muito alta no perodo inicial de desenvolvimento da cultura e que as plantas de milho foram muito prejudicadas por esta competio, o que pode justificar esse resultado. Nesses dois casos, as plantas de mucuna se sobressaram sobre as plantas de milho, o que aconteceu em maior intensidade no consrcio de 0 dias, ou seja, de plantio simultneo, onde a mucuna interferiu inclusive na operao de colheita, no sendo este portanto, um sistema a ser recomendado para adoo por produtores rurais. Tabela 2. Produo de minimilho (espigas comercializveis) em 10 metros quadrados de rea, plantados com milho solteiro e milho em consrcio com mucuna com densidades de 200.000 e 100.000 plantas ha-1, respectivamente.
ESPIGAS COMERCIALIZVEIS TRATAMENTO NMERO (EPM) 1 Mucuna solteira Milho solteiro Milho + Mucuna 0 dias Milho + Mucuna 15 dias Milho + Mucuna 30 dias
1
PESO (EPM) 1
EM
GRAMAS
00c 220,2 11,56 a 102,8 7,28 b 112,8 10,72 b 136,2 11,14 b
00c 3.394,63 189,78 a 1.734,85 40,71 c 1.659,63 68,12 c 2.080,56 115,59 b
Mdias seguidas pela mesma letra minscula na coluna no diferem entre si pelo teste de ScottKnott (P>0,05). De acordo com os resultados obtidos, o sistema mais adequado, considerando apenas o cultivo de minimilho, o sistema de conscio de milho + mucuna 30 dias, ou seja, com o plantio da mucuna 30 dias aps o plantio do milho, uma vez o milho se desenvolve inicialmente livre da competio com mucuna e se beneficia posteriormente da fixao de nitrognio, com reflexo positivo na produtividade. O tratamento que proporcionou a maior produtividade de brcolis foi a mucuna solteira. Tal resultado se deve ao fato deste ser o tratamento controle de abubao verde, ou seja, de mucuna solteira. O segundo melhor resultado foi observado com o conscio milho + mucuna 0 dias e em seguida temos o tratamento milho + mucuna 15 dias (Tabela 3). Esse resultado pode ser justificado pelo fato de nestes tratamentos a mucuna ter se desenvolvido muito bem, em detrimento do milho, que perdeu a competio com a mucuna no incio do desenvolvimento. 45
Este fato fez com que tenha se produzido nestes tratamentos um alto teor de massa verde da leguminosa, beneficiando a hortalia. Tal fato no ocorreu no consrcio milho + mucuna 30 dias (Tabela 3), onde houve uma pequena produo de biomassa de adubao verde e consequentemente, menor aporte de nitrognio no solo, resultando em menor produo de brcolis. Tabela 3. Produo de brcolis (peso de 10 cabeas) aps plantio de milho solteiro, adubao verde com mucuna solteira e com mucuna consorciada com milho em diferentes sistemas de plantio.
TRATAMENTO Mucuna solteira Milho solteiro Milho + Mucuna 0 dias Milho + Mucuna 15 dias Milho + Mucuna 30 dias
1
PESO EM GRAMAS (EPM) 1 5.21 0,27 a 2.56 0,16 d 4.07 0,17 b 3.42 0,03 c 2.24 0,15 d
Mdias seguidas pela mesma letra minscula na coluna no diferem entre si pelo teste de ScottKnott (P>0,05). CONCLUSES O consrcio de milho com mucuna verde para produo de minimilho se mostrou uma tcnica eficiente para introduo da adubao verde em pequenas unidades de produo orgnica de hortalias. O brcolis, hortalia testada neste trabalho, apresentou resposta positiva adubao verde que antecedeu ao plantio, com aumento significativo na produtividade, atestando o benefcio da adubao verde para a produo agrcola. O sistema de consrcio que melhor contribuiu para o desenvolvimento das hortalias foi o consrcio em que a mucuna foi plantada simultaneamente com o milho. Entretanto, como tal sistema proporciona dificuldades colheita devido ao elevado crescimento da mucuna, o consrcio milho + mucuna 15 dias pode ser, na prtica, o sistema mais adequado. O consrcio milho + mucuna 30 dias, apesar de apresentar boa produo de minimilho quando comparado aos outros sistemas de consrcio, no apresentou benefcios para a produo de brcolis, sendo estatisticamente igual ao tratamento milho solteiro e portanto no indicado caso o interesse seja a adubao verde visando a produo da hortalia.
AGRADECIMENTOS Ao IFRJ a ao CNPq pelas bolsas concedidas. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ESPINDOLA, JAA.; GUERRA, JGM.; ALMEIDA, DL de. Uso de Leguminosas Herbceas para Adubao Verde. In: Adriana Maria de Aquino; Renato Linhares de Assis. (Org.). Agroecologia: princpios e tcnicas para uma agricultura orgnica sustentvel. Braslia: Embrapa Informao Tecnolgica, 2: 435-451, 2005. PEREIRA-FILHO, IA; GAMA, EEG; FURTADO, AAL. A produo do minimilho. EMBRAPA CNPMS (Sete Lagoas, MG: Embrapa Milho e Sorgo). Comunicado Tcnico, 7: 1-4, 1998.
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PREPARAO E AVALIAO DE BIOFILMES PREPARADOS A PARTIR DE AMIDO

Preparation and evaluation of biofilms prepared by starch Juliana de Carvalho do Couto1; Paula de Miranda Costa Maciel1; Maria Ins Bruno Tavares2
Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia do Rio de Janeiro, Campus Realengo,. R. Carlos Wenceslau, 343, Realengo, Rio de Janeiro, RJ. CEP: 21.715-000. 2Instituto de Macromolculas Professora Eloisa Mano (IMA/UFRJ). E-mail: paula.maciel@ifrj.edu.br
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Palavras-chave: Biofilme, amido, anlise sensorial, biodegradao. Keywords: Biofilm, starch, sensorial analysis, biodegradation. INTRODUO No incio do sculo XXI, a sociedade se deparou com um problema ainda inexistente que era a poluio ambiental. Este grande problema, que perdura at os dias de hoje pode ser atribudo a duas causas principais: o contnuo aumento da populao e o vertiginoso desenvolvimento industrial. Dentre os causadores desta poluio ambiental esto os resduos slidos onde podem ser citados: metais, vidros, papel, plstico, entre outros (MANO et al., 2005). A intensidade desta poluio foi observada e sentida pela sociedade quando comearam a constituir problema os imensos volumes de objetos plsticos utilizados e descartados aleatoriamente. Para se ter uma ideia a produo mundial de plsticos estimada em 70 milhes de toneladas por ano, das quais um tero lanado no lixo municipal. Os plsticos ocupam o seu lugar no mercado de embalagens, representando aproximadamente 40% de todo plstico consumido atualmente no Brasil. A preocupao com a poluio ambiental ento, aumentou muito devido ao fato destes resduos de polmeros sintticos apresentarem elevada resistncia destruio pelas intempries (MANO et al., 2005). Uma forma de amenizar a produo de novos resduos plsticos no meio ambiente seria a criao de alternativas que viessem a substituir este tipo de material. Muitos estudos tm sido realizados nos ltimos anos em relao aos filmes biodegradveis, principalmente quando se considera o desenvolvimento de novos produtos que provoquem menor impacto ambiental (ROSA et al., 2001; FRANCHETTI & MARCONATO, 2006). No entanto, para a maioria das empresas, a utilizao destes materiais ainda invivel, devido tanto s perdas de propriedades quanto ao seu alto custo quando comparados aos polmeros sintticos convencionais (ROSA et al., 2001). Os filmes biodegradveis podem ser produzidos a partir de polissacardeos e protenas cujas cadeias so longas e capazes de produzir matrizes contnuas que do estrutura ao filme. Os principais polissacardeos de interesse comercial so celulose e amido (FRANCHETTI & MARCONATO, 2006). 47
O amido um polmero natural, renovvel e biodegradvel, e armazenado pelas plantas na forma de pequenos grnulos, cujos tamanhos mdios variam entre 0,5 e 100 m de acordo com a fonte. O amido composto usualmente por dois tipos de macromolculas que se apresentam bem diferentes entre si, tanto em termos de estrutura quanto em termos de propriedades. Uma delas a amilose, que se apresenta como uma molcula essencialmente linear consistindo de unidades de anidroglicose que so interligadas por ligaes glicosdicas do tipo - (14). A amilopectina apresenta a mesma cadeia principal que a amilose, mas apresenta pontos de ramificao que so unidos a cadeia principal por ligaes glicosdicas do tipo - (16). O amido pode servir como base para a preparao de biofilmes, que seria uma alternativa bastante vivel, j que partiria de um componente totalmente biodegradvel. Uma possibilidade para a produo deste tipo de material pode advir do fato de no Brasil ocorrer um desperdcio de frutas bastante acentuado, e o amido proveniente destas frutas pode ser uma boa fonte para a produo dos biofilmes. Sendo assim, este estudo teve como objetivo a preparao e a avaliao de biofilmes. Na preparao foram utilizados dois tipos de amido, o de milho (obtido comercialmente) e o amido da semente de um fruto, conhecido como cumbaru (fruto abundante na regio do Mato Grosso). Para uma avaliao minuciosa destes filmes, alguns testes foram realizados, como: a anlise sensorial, testes de vida de prateleira, de conservao e de biodegradabilidade. RESULTADOS E DISCUSSO Na parte experimental deste trabalho, vrios biofilmes foram preparados variando-se o teor de amido e de gua destilada, at ser alcanada a concentrao ideal (o mtodo de obteno foi o mesmo para os dois tipos de amido). Os biofilmes obtidos esto sendo mostrados na Figura 1. Posteriormente, os filmes foram avaliados atravs da anlise sensorial, testes de vida de prateleira, de conservao e de biodegradabilidade. Estes resultados so apresentados a seguir: 1. Anlise sensorial: Nesta etapa os filmes foram avaliados atravs dos seguintes mtodos: - Descritivo: Os biofilmes preparados a partir do amido de milho se apresentaram transparentes e com ausncia de odor. J os que foram preparados a partir do amido do cumbaru apresentaram colorao amarelada e tambm no apresentaram odor. - Discriminativo: Os biofilmes preparados a partir do amido de milho se apresentaram mais transparentes, homogneos e resistentes quando comparados aos do amido do cumbaru. - Afetivo: Segundo os aspectos avaliados anteriormente, como os biofilmes preparados a partir do amido de milho apresentaram transparncia, ausncia de odor, homogeneidade e resistncia, eles tiverem maior aceitao frente aos filmes preparados a partir do amido de cumbaru. 48
(a)
(b)
Figura 1. Biofilmes preparados a partir do amido de milho(a) e de cumbaru (b)
2. Teste de biodegradabilidade Um problema que surge com o uso e a comercializao de polmeros biodegradveis a ausncia de mtodos padronizados que avaliem a biodegradao desse tipo de material e que sejam reconhecidos nos diversos pases e comunidades (ROSA, 2003). Para um polmero biodegradvel ser utilizado para certa aplicao, ele deve degradar no meio em que ter seu destino final, ou seja, aps o descarte (ROSA, 2003). Desse modo, o meio escolhido para avaliar a biodegradabilidade dos filmes de amido de milho e de cumbaru foi o composto orgnico (hmus). O solo (hmus) ficou em repouso por sessenta dias para que ocorresse fermentao aerbia, e durante este tempo, a temperatura do mesmo foi observada. Ao final do processo, a mesma estabilizou em aproximadamente 25C. O composto foi peneirado utilizando-se uma peneira com malha de 2,4mm. Aps a preparao, o solo foi analisado, atravs da determinao de pH, teor de umidade e porcentagem de matria orgnica. Em seguida, os filmes de amido, tanto de milho como de cumbaru foram inoculados no composto orgnico. Aps quarenta e oito horas os filmes foram retirados do solo para anlise e nenhuma alterao aparente foi observada. Porm, aps seis dias, os filmes foram novamente retirados do solo e observou-se que eles estavam totalmente degradados (Figura 2). Uma nova anlise do solo foi feita para comparar as caractersticas do mesmo antes e aps o processo de biodegradao. Esta anlise tem a finalidade de confirmar a presena de atividade microbiolgica responsvel pelo desgaste dos biofilmes. 3. Teste de vida de prateleira Neste teste, filmes de amido de milho e cumbaru foram preparados e deixados expostos em uma bancada, para avaliar seu comportamento sob condies ambientes. Aps sessenta dias nenhuma alterao foi observada.
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(a)
(b)
Figura 2. Biofilmes de amido de milho (a) e de cumbaru (b), aps o teste de biodegradabilidade
4. Teste de conservao em geladeira Neste teste, os dois tipos de biofilmes foram deixados em geladeira para avaliar o comportamento dos mesmos neste meio. Aps sessenta dias, os filmes no mostraram alterao aparente. CONCLUSES A metodologia foi empregada com xito sendo possvel preparar os biofilmes em diferentes teores de amido/gua e determinar a concentrao ideal. Os testes realizados permitiram uma avaliao minuciosa dos filmes. Pela anlise sensorial foi possvel fazer uma observao quanto colorao, o odor, a aceitao e preferncia acerca dos biofilmes. Os testes de vida de prateleira e de conservao permitiram analisar o comportamento dos filmes sob diferentes condies. Atravs do teste de biodegradabilidade observou-se o tempo de degradao destes filmes no solo. AGRADECIMENTOS Ao IFRJ, CNPq e FAPERJ pelo apoio financeiro e ao IMA/UFRJ pela colaborao na parte experimental do projeto. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
MANO, EB; PACHECO, EBAV; BONELLI, CMC. Meio ambiente, poluio e reciclagem. 1a edio. So Paulo: Editora Edgarg Blcher, 2005, 182 p. ROSA, DS; FRANCO, BLM; CALIL, MR. Biodegradabilidade e propriedades mecnicas de novas misturas polimricas. Polmeros: Cincia e Tecnologia, 11: 82-88, 2001. FRANCHETTI, SMM; MARCONATO, JC. Polmeros biodegradveis uma soluo parcial para diminuir a quantidade dos resduos plsticos. Qumica Nova, 29: 811-816, 2006. ROSA, DS. Biodegradao: um ensaio com polmeros. So Paulo, SP: Universidade So Francisco Editora, 2003. 61 p.
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ESTUDO DE MUTANTES DE Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5 DEFICIENTES EM GENES RELACIONADOS COM PRODUO DE BIOFILME
Study of Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5 mutants, deficient in genes related with biofilm production Santos, J.C.S1, Maia, N.C.1, Pdua, V.L.M.2, Seabra, S.H.2, Hemerly, A.S.3, Baldani, J.I.4, Coelho, A.3 & Loureiro MM1*
Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia do Rio de Janeiro, IFRJ, campus Duque de Caxias. Av. Repblica do Paraguai, 120, Bairro Sarapu, Duque de Caxias, RJ. CEP 25050-100; 2Centro Universitrio da Zona Oeste, UEZO; 3Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ; 4Embrapa-Agrobiologia-RJ. E-mail: marcio.loureiro@ifrj.edu.br
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Palavras-chave: Gluconacetobacter diazotrophicus; Biofilme; Interao Planta-Bactria. Keywords: Gluconacetobacter diazotrophicus; biofilm; plant-bacteria interaction.
INTRODUO Diversas cepas bacterianas so muito criativas em seus mecanismos regulatrios, especialmente os relacionados adaptao a mudanas sbitas na disponibilidade de nutrientes e a respostas de defesa secundrias do hospedeiro. Um exemplo particular de adaptao bacteriana a capacidade de crescer como biofilme formando uma matriz expolissacardica. A Gluconacetobacter diazotrophicus uma bactria endoftica que promove o crescimento vegetal e coloniza os espaos intercelulares da cana-de-acar sem proporcionar sintomas de doena. Cabe ressaltar que o vegetal favorece a interao com o microrganismo ao produzir glicoprotenas em suas razes, criando um ambiente favorvel a uma colonizao bacteriana inicial, para posteriormente vir a colonizar os espaos intercelulares do vegetal, com isso o Gluconacetobacter diazotrophicus considerado um modelo de interao plantabactria com a cana-de-acar. Adicionalmente, este endfito comumente detectado em associao com outras espcies de vegetais como: batata doce, caf e abacaxi, o que enfatiza sua importncia para outros hospedeiros vegetais, pois alm de fornecer nitrognio fixado biologicamente, tambm auxilia no desenvolvimento vegetal atravs da sntese de fitohormnios (auxina e giberilina), alm de possuir atividade antagonista a fitopatgenos atravs da produo de bacteriocinas (ROJAS et al. 2005). O sequenciamento completo do genoma do G. diazotrophicus PAL5 foi realizado pelo consrcio Riogene (BERTALAN et al. 2009), e paralelamente a este trabalho, foi gerada uma biblioteca de mutantes de G. diazotrophicus PAL5 na Embrapa-Agrobiologia, Seropdica, RJ, criada a partir de inseres randmicas, geradas com uma verso do elemento de transposio Tn5 no cromossomo deste endfito, utilizando o kit de mutagnese randmica EZ-Tn5 TM <KAN-2>Tnp TransposomeTM (Epicentre). 51
Este trabalho tem como base, a seleo e anlise de mutantes de G. diazotrophicus PAL5, com reduzida capacidade de formao de biofilme. Para seleo destes mutantes, utilizou-se culturas em placas de poliestireno de 96 poos, contendo 1 mL de meio LGIP suplementado com asuperfcie teste de l de vidro, os quais foram submetidos a ensaios colorimtricos com cristal violeta. Alm disso, para caracterizao das mutaes, tais mutantes selecionados foram submetidos a reaes de sequenciamento bi-direcional de DNA genmico com primers transposon especficos, reagente BigDye terminator e seqenciador capilar ABI3130 (Applied Biosystems). Adicionalmente, para caracterizaes fenotpicas, realizamos novos ensaios colorimtricos com cristal violeta e pelo mtodo Dubois (fenol sulfrico), assim como microscopia eletrnica de varredura e anlises protemicas em espectrmetros de massas Maldi Tof, Maldi Tof Tof e Maldi Q-tof. RESULTADOS E DISCUSSO Inicialmente, foram pr-selecionados 15 mutantes com baixa produo de biofilme, a partir de 02 placas da biblioteca de mutantes. Posteriormente, estes 15 mutantes foram submetidos a novos testes de quantificao de produo de biofilme (cristal violeta e mtodo Dubois) (Figura 1).
Figura 1. Ensaio comparativo atravs de espectrofometria para comparao quantitativa da produo de biofilme da cepa selvagem em relao a 15 mutantes Tn5 de G. diazotrophicus PAL5 selecionados de nossa biblioteca.
Dentre esses 15 mutantes foram selecionados dois como objeto de estudo. Um destes mutantes sofreu mutao em um gene de um regulador transcricional com domnio LacI. Enquanto no outro mutante, foi detectada uma insero no gene da protena diguanilato ciclase, a qual possui um domnio GGDEF, e geralmente encontra-se associada com regulao da sntese di-GMPc (Figura 2). Estes mutantes e a bactria selvagem foram submetidos microscopia eletrnica de varredura, onde pudemos observar expressivas alteraes do processo de produo de biofilme. O mutante com insero no gene da protena diguanilato ciclase (GGDEF) apresentou baixa produo de biofilme, enquanto que o mutante com insero no gene de um regulador transcricional LacI apresentou anormalidades na estrutura do biofilme formado, bem como na sua manuteno, quando comparados com a cepa selvagem de G. diazotrophicus PAL5, o que indica a possibilidade destes mutantes apresentarem baixa colonizao vegetal, visto que os biofilmes so descritos na literatura, como importantes mecanismos para o estabelecimento de interaes benficas planta-bactria (Figura3). 52
Figura 2. Exemplo de representao esquemtica do alinhamento de sequncias de DNA geradas atravs de sequenciamento bidirecional, a partir de DNA genmico purificado de um mutante nocauteado no gene da protena Diguanilato Ciclase (GGDEF).
Figura 3. Microscopia eletrnica de varredura da cepa selvagem de G. diazotrophicus PAL5 e das linhagens mutantes GGDEF e Lac I.
Estes mutantes esto sendo submetidos a anlises protemicas, para realizamos uma anlise global das protenas diferencialmente expressas, observadas atravs de anlises comparativas entre os perfis proticos gerados pelas linhagens mutantes e selvagem, em condies timas de crescimento bacteriano. Para execuo destas anlises, realizamos extrao e purificao de extratos proticos totais, seguido de quantificao e anlises de perfis proticos gerados atravs das metodologias de SDS Page e gis bidimensionais.
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Atravs da metodologia de SDS Page (Figura 4), excisamos 05 bandas de protenas diferencialmente expressa do mutante GGDEF e 02 bandas do mutante LacI, o que possibilitou a identificao de 121 protenas no mutante com insero no gene da protena diguanilato ciclase (GGDEF) e 11 protenas no mutante do regulador transcricional com domnio LacI (Dados no exibidos).
M Marcador de peso molecular Full-range rainbow; GD Cepa selvagem de G. diazotrophicus PAL5; 1- Mutante -GGDEF; com insero no gene da protena Diguanilato Ciclase
4- Mutante com insero no gene do Regulador Transcricional da famlia Lac I.
Figura 4. Gel de SDS page de extrato total de protenas de G. diazotrophicus PAL5 e mutantes GGDEF e LacI.
Atravs da anlise de gis bidimensionais, pudemos verificar a presena de diversas protenas diferencialmente expressas, nos mutantes analisados (Figura 5), entretanto, at a presente data s conseguimos identificar 114 protenas no mutante do regulador transcricional com domnio LacI (Dados no exibidos).
Figura 5. Gis bidimensionais de extrato total de protenas da cepa selvagem de Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5 e das bactrias mutantes GGDEF e Lac I.
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Atravs da anlise em espectrmetro de massa Madi Tof-Tof das proteinas diferencialmente expressas excisadas de geis bidimensionais do mutante LacI, identificamos um regulador de duplo componente, o qual geralmente funciona como um complexo sistema de transduo de sinais e monitoramento, que permite os mais variados microorganismos se adaptarem e sobreviverem as mudanas do meio em que se encontra. Este sistema geralmente composto por uma protena histidina quinase, que possui um domnio de reconhecimento de sinal, que se autofosforila quando adequadamente estimulada, a qual passa atuar diretamente relacionada a mobilidade e produo exopolissacarideos (JERS et al., 2011). Este dado corrobora com as imagens obtidas atravs da microscopia eletrnica de varredura, onde o mutante LacI apresentou grande produo de biofilme, sendo que aparentemente este biofilme, apresenta aspecto instvel e possui baixa capacidade de adeso a superfcie teste de l de vidro (Figura 3). Neste sentido, acreditamos que o nocaute do gene do regulador transcricional LacI, possa ter induzido uma elevada expresso deste receptor, acarretando uma maior produo e secreo de exopolissacadeos, porm esta produo aumentada no foi capaz de manter o biofilme estvel . Alm disso, verificamos nas anlises protemicas de bandas excisadas de gis de SDS Page do mutante da enzima diguanilato ciclase, uma elevada produo da enzima histidinol dehidrogenase, a qual um produto do gene HisD, que geralmente utilizado como um mediador na etapa final da via metablica de histidina (PAHWA et al., 2010), cujo esta via metablica de suma importncia para o funcionamento da histidina quinase, a qual utilizada como um domnio de reconhecimento de sinal que se autofosforila e tambm est diretamente ligada a mobilidade e produo de exopolissacardeos (JERNAL & SCHIRMER, 2009), entretanto, no caso deste mutante quando submetido a microscopia eletrnica de varredura, apresentou baixa produo de biofilme em contato com a superfcie teste de l de vidro (Figura 3), pois provavelmente o gene da diguanilato ciclase e da histidinol dehidrogenase devam esto atuando dentro da mesma via metablica, a qual possivelmente deva estar sendo regulada pela enzima dinaguilato ciclase. CONCLUSES Com os experimentos conduzidos at este momento, podemos verificar diversas alteraes fenotpicas produzidas atravs das mutaes randmicas realizadas, porm ainda se sabe muito pouco sobre os processos que envolvem a produo, maturao e desenvolvimento do biofilme de G. diazotrophicus PAL5. Tendo conhecimento da importncia desse mecanismo para o processo de colonizao vegetal, pretendemos submeter esses mutantes a interao com plntulas de cana de acar, para estimarmos as taxas de colonizao vegetal, bem como analisarmos tecidos vegetais colonizados, atravs de microscopias eletrnicas de transmisso e varredura. Paralelamente, iremos iniciar os experimentos de complementao dos mutantes em anlise, com finalidade de revertermos a mutao produzida. AGRADECIMENTOS Ao IFRJ, Finep-MCT, Faperj, Capes e CNPq pelo apoio financeiro.
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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS BERTALAN M. et al.. Complete genome sequence of the sugarcane nitrogen-fixing endophyte Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5. BMC Genomics, 10: 450-459, 2009. JENAL U; SCHIRMER T. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signaling, NATURE. doi:10.1038/nrmicro2203, 2009. JERS C, KOBIR A, SNDERGAARD EO, JENSEN PR & MIJAKOVIC I. Bacillus subtilis TwoComponent System Sensory Kinase DegS Is Regulated by Serine Phosphorylation in Its Input Domain. PLoS ONE, 6(2): 1-10, 2011. MUNZ-ROJAS J; FUENTES-RAMREZ LE; CABALLERO-MELLADO J. Antagonism among Gluconacetobacter diazotrophicus strains in culture media and in endophytic association. FEMS Microbiol. Ecol., 54: 57-66, 2005. PAHWA S; KAUR S; JAIN, R. Structure based design of novel inhibitors for histidinol dehydrogenase from Geotrichum candidum. Elsevier Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, doi:10.1016/j.bmcl.2010.04.116, 2010.
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ESTUDOS PRELIMINARES VISANDO O APROVEITAMENTO DO PRARAIO (Melia azedarach L. - MELIACEAE)

Preliminaries studies aiming the para-raio use (Melia azedarach L. - MELIACEAE) John Lee Alves Melo1; Joyce Cristina Castro1; Sara Godinho de Lima1; Tamara de Souza N. Pinto1; Maria Ins Teixeira2* ; Carlos Alexandre Marques1; Flvio de Almeida Violante1*
Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia do Rio de Janeiro, campus Nilpolis. Rua Lcio Tavares, 1045, Nova Cidade, Nilpolis, Rio de Janeiro, RJ. CEP 26.530-060. E-mail: flavio.violante@ifrj.edu.br. 2Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia do Rio de Janeiro, campus Duque de Caxias. Avenida Repblica do Paraguai, 120, Sarapu, Duque de Caxias, RJ. CEP 25.050-100. E-mail: maria.teixeira@ifrj.edu.br
1
Palavras-chave: Melia azedarach, para-raio, Nim. Keywords: Melia azedarach, para-raio, Nim. INTRODUO Melia azedarach L. uma espcie da famlia Meliaceae, chamada popularmente de Pra-raio no estado do Rio de Janeiro. Diversos autores apontam diferentes atividades atribudas a constituintes qumicos distintos desta famlia. So atribudas a ela atividades antifngica, bactericida, carrapaticida, inseticida, contra nematides, alm de ser considerada, em alguns pases, txica ao homem (ARAJO et al., 2009; VIEGAS-JNIOR, 2003) . A espcie mais conhecida desta famlia o Nim (Azadirachta indica), muito explorada como inseticida natural, inclusive com diversos estudos feitos pela Embrapa (NEVES et al., 2008). As duas espcies foram trazidas do continente asitico e se adaptaram muito bem ao territrio brasileiro. No entanto, a falta de estudos comparativos entre Nim e Pra-raio suscita dvidas quanto ao potencial de utilizao da ltima, visto que o Nim ainda bastante explorado. Com isso, o Pra-raio talvez seja uma espcie cujo aproveitamento econmico pode estar aqum do seu potencial como produto natural. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivos, a realizao de uma busca bibliogrfica mais ampla, alm da execuo de extraes de folhas e frutos, seguidas de testes de atividade biolgica, a fim de se obter informaes mais precisas sobre sua atividade biolgica. Alm disso, experimentos foram realizados visando obter um protocolo de cultivo e produo de mudas de Melia azedarach. Para realizao deste trabalho, ramos com folhas, flores e frutos (verdes e maduros) foram coletados em Nilpolis, RJ, s margens da rodovia via-Light. Aps coleta, esses ramos foram separados para a confeco de exsicatas (Figura 1) e posterior anlise morfolgica de autenticidade botnica, comparando-se as caractersticas observadas no material coletado com as descritas na literatura.
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O cultivo foi realizado com o plantio de sementes que foram submetidas a trs condies distintas: (i) escarificao; (ii) coco em gua por aproximadamente 2 minutos ou (iii) plantados sem tratamento prvio. Foram usados 20 tubetes plsticos para cada tratamento, tendo-se plantado 1 semente por tubete, conforme o caso. Como substratos foram usados terra preta ou um leito de cultivo composto por terra preta, esterco bovino e argila, na proporo 3:1:1. Em tubetes contendo ambos os substratos plantaram-se sementes escarificadas; sementes fervidas em gua por aproximadamente 2 minutos e sementes sem tratamento, totalizando 120 tubetes. O tempo necessrio para germinao e o nmero de sementes germinadas foram avaliados. Paralelamente, foram realizadas extraes das folhas e frutos coletados. Essas extraes foram realizadas em etanol e em hexano, quente, com o auxlio do Soxhlet, por aproximadamente seis horas e frio, no qual as folhas e frutos foram deixados nesses solventes por sete dias. Para a realizao dos testes de atividade biolgica, utilizou-se giz escolar embebido nos extratos e, posteriormente, banhado em leo usado para frituras pelos restaurantes locais. Papis de filtro foram riscados com o giz, previamente preparado, e colocados em placas de Petri, onde foram colocadas baratas (Periplaneta americana) que foram coletadas atravs de armadilhas espalhadas pelo campus do IFRJ em Nilpolis. Observou-se, por uma hora e meia, a reao apresentada pelas baratas ao giz mata-baratas confeccionado conforme descrito. Tambm foram realizados testes de atividade txica contra caramujosafricanos (Achatina fulica) coletados no campus Nilpolis e em So Joo de Meriti, RJ, no qual foi utilizado extrato etanlico da folha, extrado frio, realizando-se, simultaneamente, um ensaio controle utilizando apenas a mistura de lcool e gua, usada para solubilizar o extrato. RESULTADOS E DISCUSSO Atravs do exame das caractersticas morfolgicas confirmou-se a autenticidade botnica da espcie (Melia azedarach) (Figuras 4-8). Os frutos armazenados no laboratrio mostraram-se naturalmente muito sensveis infestao por fungos, contrariando informaes de que esta espcie teria atividade fungicida (Figuras 2-3). Os experimentos de cultivo foram bem sucedidos, pois foi possvel quebrar a dormncia da semente, j relatada em estudos anteriores (NEVES et al., 2008). Em 19 dias, houve germinao de duas das sementes escarificadas e uma semente fervida, ambas cultivadas na mistura de esterco bovino, terra preta e argila (leito). Aps 28 dias de plantio, 11 tubetes de sementes escarificadas (55%), cultivadas no leito, germinaram. Trs sementes sem tratamento, cultivadas em leito, tambm germinaram e apenas 1 semente fervida, em um tubete com leito, germinou. Nenhuma semente em terra pura, independente do tipo de tratamento para quebra de dormncia, germinou. Com isso, estabeleceu-se um protocolo de cultivo para esta espcie. O resultado do teste de atividade moluscicida foi negativo para o extrato etanlico da folha. Novos testes com novos mtodos para solubilizao dos extratos sero posteriormente feitos. O teste de atividade inseticida (contra baratas), feito com giz previamente produzido usando-se os extratos hexnico e etanlico da folha (feitos frio) e com extratos hexnico e etanlico dos frutos (feitos frio), posteriormente embebidos no leo usado em frituras, revelaram resultado negativo, pois mesmo aps uma hora e meia de exposio aos extratos no houve reaes de repelncia ou morte. Novos mtodos para confeco do giz, bem como novas metodologias para realizao desses testes sero executados na continuidade do presente trabalho. Testes para verificao da atividade antimicrobiana dos extratos tambm esto sendo realizados a fim de avaliarmos seu potencial de inibio sobre micro-organismos distintos. 58
Figura 1. Ramo florfero de Melia azedarach aps prensagem e secagem para confeco de exsicata. Barra = 2cm
Figuras 2-3. Frutos de M. azedarach. Figura 2. Frutos em diferentes estdios de maturao, mostrando infestao por fungos mesmo aps secagem em estufa. Barra = 2cm. Figura 3. Detalhe dos fungos infestando um fruto. Barra = 4mm. 59
Figuras 4-8. Aspectos morfolgicos da flor. Figura 4. Flor andrgina em detalhe, mostrando as cinco ptalas (seta) e o tubo formado pela soldadura dos filetes (estrela). Figura 5. Tubo formado pelos filetes (seta) e spalas em detalhe (Se). Figura 6. Pistilo em detalhe, mostrando o estigma (Es), o estilete (Et) e o ovrio (Ov) seguido pelo nectrio floral (seta). Figura 7. Seco transversal da nervura mediana do ovrio, mostrando os vulos distribudos em cinco lculos (seta). Figura 8. Detalhe dos dois vulos que ocorrem em cada lculo em seco longitudinal (seta). Barras = 2cm.
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CONCLUSES
No que diz respeito anlise das caractersticas morfolgicas das folhas, frutos e, principalmente, das flores, confirmou-se a autenticidade botnica do material coletado (Melia azedarach L. Meliaceae). Concluiu-se que a melhor forma de cultivo para esta espcie a utilizao do leito de cultivo como substrato e sementes escarificadas, pois o leito fornece mais nutrientes e a quantidade de gua para germinao. Alm disso, a escarificao proporciona a quebra da dormncia, facilitando a germinao das sementes. Os resultados obtidos relativos aos testes de atividade biolgica ainda no so conclusivos, pois tanto no ensaio feito com baratas quanto nos testes de atividade moluscicida no houve resultado positivo. Logo, concluiu-se que a metodologia de analise necessita ser revista, aprimorada e ampliada. Devido ao crescimento de fungos nos frutos e nos extratos aquosos das folhas e frutos questionase a atividade fungicida da referida espcie.
AGRADECIMENTOS Ao IFRJ e CNPq pelo apoio financeiro.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ARAJO SAC.; TEIXEIRA MFS; DANTAS TVM et al. Usos potenciais de Melia azedarach L. (Meliaceae): um levantamento. Arquivos do Instituto Biolgico, 76: 141-148, 2009. NEVES EJM; CARPANEZZI AA; VIANA PA et al. A cultura do nim. Coleo Plantar, 1 edio. Braslia, DF: Embrapa Informao Tecnolgica, 2008. VIEGAS-JNIOR, C. Terpenos com atividade inseticida: uma alternativa para o controle qumico de insetos. Qumica Nova, 26(3): 390-400, 2003.
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Atividade ATPsica (% do controle)

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Figura 3: Efeito do composto CZ-01 na captao de Rodamina 6G.

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Crescimento relativo ao controle (%)

0 25 0,39 6,25 1,562 0,195 0,781 CONTROL 3,125 12,5 50

Figura 4: Avaliao da toxicidade do composto CZ-01.

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00c 220,2 11,56 a 102,8 7,28 b 112,8 10,72 b 136,2 11,14 b

00c 3.394,63 189,78 a 1.734,85 40,71 c 1.659,63 68,12 c 2.080,56 115,59 b

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