Protocolo del Prctico de Gentica:

UBICACION Y MAPEO DE UN LOCUS INCOGNITA EN

Drosophila melanogaster1
Coordinadoras: Dras. Beatriz Goi y Yanina Panzera
Seccin Gentica Evolutiva Facultad de Ciencias

La mosca del vinagre, Drosophila melanogaster, es un organismo eucaritico de experimentacin en Gentica. Tiene las siguientes ventajas: 1) un ciclo vital relativamente corto a temperatura ambiente, entre 10-14 das; 2) es fcil de criar en botellas o tubos de vidrio con un medio de cultivo barato y sencillo de preparar; 3) una gran productividad, una pareja produce varios cientos de descendientes; 4) un nmero cromosmico bajo, 4 pares de cromosomas; y 5) un gran nmero de caracteres heredables que afectan la morfologa del adulto. Los objetivos de este prctico es introducir al estudiantes en aspectos de la biologa y gentica en D. melanogaster. Se realizarn cruzamientos genticos para estudiar el modo de herencia, ubicacin y mapeo de un locus incgnita en D. melanogaster. El practico permitir elaborar un informe final en base a las observaciones y el anlisis de los datos de los cruzamientos realizados en clase y discutidos por el grupo participante. Dada la dinmica de los prcticos de Drosophila, se recomienda LEER el protocolo antes de asistir a clase. Se trabajar en grupos de tres a cuatro estudiantes.

CRONOGRAMA 9-10 octubre 11-12 octubre CLASE 1. Introduccin a la biologa y gentica de D. melanogaster CLASE 2. Drosophila. PARTE I. Modo de herencia y ligamiento gentico de la mutacin incgnita. Primer cruzamiento. CLASE 3. PARTE I continuacin. Observacin de la F1. Segundo cruzamiento CLASE 4. PARTE I. Observacin de la F2 y determinacin del ligamiento gentico de la mutacin incgnita

25-26 Octubre 8-9 noviembre

22-23 noviembre CLASE 5. PARTE II. Mapeo gentico de la mutacin incgnita. Mapeo de tres puntos

Basado en el protocolo del curso Genetics 100L de la Univ California en Davis.

29-30 noviembre CLASE 6. PARTE II. Observacin de la F2. Anlisis de los resultados para el mapeo de tres puntos. Discusin final de resultados

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CLASE 1. Introduccin a la biologa y gentica de D. melanogaster En este prctico se observar distintos aspectos del objetivos generales del prctico ciclo de vida, reconocimiento de los sexos, comportamiento sexual, observacin de mutantes que afectan el fenotipo del adulto, y tcnica de anestesia, manejo y observacin de las moscas. Ciclo de Vida D. melanogaster (Clase: Insecta; Orden: Diptera) es un insecto holometbolo, su ciclo vital consta de cuatro estadios: huevo, larva, pupa y adulto (o imago) (FIGURA 1). Las hembras comienzan a depositar los huevos alrededor del tercer da de vida del imago y contina hasta su muerte. Los huevos son puestos en la superficie del alimento (o medio de cultivo). A simple vista los huevos se ven como un objeto pequeo, blanco y oblongo, con un par de filamentos anteriores. El desarrollo del huevo comienza con la fecundacin y consta principalmente de la formacin de los tejidos larvales. Despus de un da o dos, las larvas emergen de los huevos y comienzan a introducirse en el medio de cultivo. Como la cutcula de los insectos no es elstica, la larva muda peridicamente. Existen tres estados larvales, separados por las mudas correspondientes. Durante el tercer estadio larval, la larva se alimenta hasta estar pronta a pupar, en ese momento, se dirige fuera del medio de cultivo hacia un lugar seco donde se detiene. .Durante el estadio pupal ocurre una reorganizacin de tejidos (metamorfosis) y a los 4 das emerge el adulto de la cubierta pupal. En buenas condiciones de cultivo y a 25C transcurren alrededor de 10 das desde la puesta de los huevos hasta la emergencia del imago; el adulto puede sobrevivir y permanecer frtil por un mes. Si la temperatura permanece entre 22C y 27C, se producir una nueva generacin de moscas en aproximadamente 2 semanas (por ello el practico se realiza cada 15 das, para sincronizar con el ciclo de vida). Medio de cultivo Las moscas se pueden cultivar en un medio compuesto por agar-levadura-harina de maz-glucosa. A la papilla se le agrega un conservante conocido como nipagin. Este medio se dosifica en tubos o botellas de vidrio o plstico. Los tubos son identificados con el tipo de cruzamiento, fecha y nombre del grupo. Procedimiento para anestesiar las moscas Para adormecer las moscas utilizaremos los vapores de trietilamina (=TE). Se proceder as: 1) Dosifique entre 10 y 15 gotas de trietilamina (TE) en una piseta con algodn dentro. Note que los vapores que saldrn estarn impregnados de fuerte olor. 2) Transfiera las moscas a un tubo de plstico (Falcon) anestesiador (=TA),, tape el mismo con un tapn de polifom y dosifique vapores de TE dentro de dicho tubo por el orificio del tapn. 3) Una vez que TODAS las moscas estn inmovilizadas, depostelas inmediatamente sobre una tablilla. Las moscas permanecern anestesiadas por 45. La exposicin prolongada a TE puede matar las moscas y se presentarn con alas y patas extendidas en ngulo recto del cuerpo y

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algunos caracteres fenotpicos, como los ojos, se oscurecern y deformarn, en tal caso descarte las moscas muertas. 4) En caso de utilizar las moscas anestesiadas para realizar un cultivo o cruzamiento, disponga el frasco de cultivo en forma horizontal hasta que las moscas se despierten.

Identificacin de los sexos Se pueden utilizar varios criterios para distinguir los sexos en los adultos (FIGURA 2) 1. Tamao del adulto. La hembra es generalmente ms grande que el macho. 2. Forma del abdomen. El abdomen de la hembra se curva y termina en punta; el abdomen del macho es redondeado y ms corto. 3. Marcas en el abdomen. Bandas claras y oscuras alternan en la porcin posterior de la hembra; mientras que en el macho estn fusionados y forman una banda oscura. 4. Apariencia del peine sexual. En los machos existe un pequeo penacho de setas en el segmento basal del tarso en el primer par de patas llamado peine sexual, es el nico carcter sexual secundario que diferencia los machos jvenes de las hembras. El "peine sexual" tambin sirve para sexar individuos en pupas. 5. Genitalia externa del abdomen. La genitalia es un carcter sexual primario y caracterstico de cada sexo. En las hembras se encuentra el ovipositor en la punta del abdomen. En el macho existen ganchos pigmentados, ordenados en forma circular y localizados en el extremo caudal. 6. rganos sexuales durante el estadio larval. Los sexos en larvas se diferencian por el tamao de los testculos (ms grandes) que los ovarios ubicados en el tercio posterior de la larva y distinguidos a travs del tegumento en larvas de tercer estadio. En moscas recin emergidas de la carcasa pupal, el color es grisceo, las bandas dorsales del abdomen se oscurecern ms tarde, las alas pueden no estar extendidas y aparecern como una estructura oscura y hmeda, las alas luego se secan y despliegan. El proceso se acelera bajo el calor de la luz del microscopio. Podrn ver las alas desplegadas en un perodo de 5-10 minutos. Utilice un pincel o esptula para mover las moscas. Comportamiento sexual Todos los insectos muestran una compleja repuesta a estmulo sexual; Drosophila no es la excepcin. El apareamiento comienza con el golpeteo del macho sobre el abdomen de la hembra, con su pata anterior, cono conocido como la primera respuesta del cortejo del macho hacia la hembra. Este es el modo de identificar su propia especie. Se aproxima a la hembra desde adelante y realiza crculos alrededor de ella efectuando medias vueltas. Extiende un ala que hace vibrar por unos segundos. Si la hembra es receptiva resulta la cpula. Los espermatozoides del macho son depositados en el tero de la hembra y retenidos all en el receptculo seminal y la espermateca. Puede existir ms de un apareamiento. Cmo podemos observar el cortejo de Drosophila melanogaster? Para observar el comportamiento de cortejo, se debe emplear hembras vrgenes ya que el macho puede aparearse muchas veces. Para ello se les proporcionarn hembras vrgenes y machos jvenes. Observe las diferentes etapas del cortejo y la copula. Procedimiento para observar las moscas al microscopio

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Ajuste el microscopio MENOR aumento, haga FOCO. Si es necesario, aumente la magnificacin. Coloque las moscas anestesiadas en fila horizontal sobre la tablilla blanca. No coloque la luz muy cerca de las moscas, el calor excesivo las deshidratar y acabar matndolas. Identifique la morfologa de las moscas y el reconocimiento de los sexos con la ayuda de la FIGURA 2 Y 3. Cabeza La cabeza est compuesta de seis segmentos fusionados. 1. Antenas, cada una consiste de tres segmentos 2. Aristas. ramificadas y surgiendo cerca de la base del segmento distal de cada antena. 3. Proboscis. lengua. 4. Ojos compuestos, constituidos por un gran nmero de facetas separadas (omatidia). 5. Ocelos, ojos simples en nmero de tres ubicados entre los ojos compuestos sobre la superficie dorsal de la cabeza. 6. Setas. Vibrillas, orbitales, ocelares, verticales, postverticales. Torax El trax est compuesto de tres segmentos fusionados. 1. Protrax, consiste de hmeros pares, y el primer par de patas (cada pata consiste de coxa, trocnter, fmur, tibia y 5 articulaciones tarsales; recuerde que el "peine sexual" est presente solamente en el segmento proximal del tarso en los machos). 2. Mesotrax, consiste del mesonoto ubicado dorsalmente y el escutelo, la mesopleura ubicada lateralmente, la pteropleura y la esternopleura; las alas (observe la posicin general de las venas longitudinales y de los nudos); y el segundo par de patas. 3. Metatrax, consiste en el mesonoto, hipopleura y los balancines (alas posteriores modificadas) y el tercer par de patas. 4. Espirculos torcicos, en nmero de dos. 5. Setas: dorsocentrales, notopleurales, presuturales, supra-alares, postalares, escutelares. Abdomen El abdomen consiste de siete u ocho segmentos visibles en la hembra y cinco seis en el macho. 1. Tergitos, escleritos dorsales (placas tegumentales) una por segmento. 2. Esternitos, escleritos ventrales, uno por segmento (numero diferente entre los sexos) 3. Espirculos abdominales, siete en cada lado del abdomen. 4. Regin genital, arco genital en machos.
LOS CARACTERES HEREDITARIOS

Antes de observar los mutantes, uno necesita familiarizarse con el aspecto del tipo salvaje de Drosophila, es decir, el ms frecuentemente encontrado en poblaciones naturales. Se conocen miles de mutaciones en Drosophila pero se enumerarn solo aqullas relevantes a esta prctica. Ojos Tipo salvaje: rojos, de forma oval y con muchas facetas. Mutantes: cambios en el color, forma y nmero de facetas. Alas Tipo salvaje: bordes lisos, venacin uniforme, se extienden ms all del abdomen. Mutantes: cambios en tamao y forma; ausencia de venas especficas; cambios en la posicin de las alas en la posicin de descanso. Setas Tipo salvaje: Largas y suaves (ntese la distribucin en la cabeza y el trax). Mutantes: ms cortas, gruesas deformadas, pueden cambiar su distribucin.

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Color del cuerpo Tipo salvaje: bsicamente gris, con un patrn de reas claras y oscuras. Mutantes: negro (variando los grados), amarillo, el color mutante puede ser determinado mas claramente observando el color de las venas de las alas, cetas del cuerpo y las patas.
EL GENOMA DE DROSOPHILA

D. melanogaster tiene cuatro pares de cromosomas: los cromosomas sexuales X/Y y los autosomas 2, 3 y 4. El cuarto cromosoma (odot) es el ms pequeo. El par sexual en hembras es XX, y en machos XY. Individuos X0 son machos, pero estriles aunque su aspecto sea normal, mientras que individuos XXY producen hembras normales y frtiles El tamao del genoma de Drosophila es alrededor de 165 millones de bases y estimado unos 14.000 genes (por comparacin, el genoma humano tiene 3.300 mb y unos 70.000 genes). El genoma ha sido completamente secuenciado y esta en curso la secuenciacin y anotacin del genoma de otras 11 especies de Drosophila. La posicin relativa de muchos genes de D. melanogaster a lo largo de los cromosomas ha sido identificada y mapeada basndose en la frecuencia de recombinacin con los genes vecinos. Esta ubicacin se denomina mapa de ligamiento o mapa gentico. SMBOLOS USADOS EN GENTICA EN DROSOPHILA Las moscas tipo salvaje y los alelos que dan este fenotipo designan como +. El smbolo + a veces se refiere al genoma entero un gen. El smbolo usado para cada alelo mutante, sin embargo, se deriva del nombre descriptivo del rasgo mutante, en ingls, latn u otro idioma, por ej: "Cy" para el fenotipo "Curly". Los alelos recesivos se designan por letras minsculas, ej: "dp" para dumpyy los dominantes por la mayscula, ej: "Cy". Si un individuo (o cepa) se designa es (ej.: dp, ec, ey), se asume que es homocigota para estos genes mutantes y contiene alelos de tipo salvaje en otros loci. Si el individuo (o cepa) es heterocigota para uno o ms genes, los genes de ambos cromosomas homlogos deben especificarse, por ejemplo: Genes ubicados en el mismo cromosoma: dp + bwV
_______________

dp bw/cn

+ cn + Genes ubicados en cromosomas diferentes: +

_____

dp
_____

+
_____

+/ec ; +/dp ; +/ey

ec

ey

Genes ubicados en cromosomas homlogos: Las mutaciones separadas por una barra (/) simboliza que estn en cromosomas homlogos, por ejemplo: Ly Sb/In(3)LVM. Las mutaciones separadas por punto y coma (;) simboliza que estn en cromosomas diferentes, ejemplo: w; Cy/bw (crom x; crom 2).

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CROMOSOMAS BALANCEADORES

Los cromosomas balanceadores poseen determinadas propiedades: 1. Suprimen la recombinacin en el segmento invertido (los machos de Drosophila NO recombinan!!) 2. Portan marca dominantes (ej, GFP) y fenotipo recesivo (letal); o portar una mutacin dominante (ej. Cy) que es, a su vez, homocigota letal. 3. Llevan el alelo salvaje para el gen blanco. La mayora de las mutaciones recesivas son invisibles en condicin heterocigota por lo que la habilidad de realizar cruzamientos en los que los genotipos invisibles de la progenie puedan ser contados con una seguridad del 100% proveen de una herramienta gentica inigualable. Este es una de las propiedades de los cromosomas balanceadores. H J Mller invent la idea de los balanceadores cuando identifico al cromosoma ClB por su propiedad como supresor del intercambio gentico en el X y lo utiliz para aislar nuevas mutaciones letales ligadas al cromosoma X. Se han construido cromosomas balanceadores para el X (F por First), el 2 (S por Second y el 3 (T por Third). En el prctico de Drosophila utilizaremos balanceadores para el cromosoma 2 (SM6) y cromosoma 3 (In(3)LVM). Por ejemplo el SM6, se describe como: In(2LR)SM6, al Cy dp cn sp; porta una inversin pericntrica que ocupa el brazo izquierdo y derecho del cromosoma 2 , una mutacin dominante (Cy) y adems otras mutaciones recesivas: (al), dumpy (dp), cinnabar y speck (sp). El homlogo del SM6 lleva una mutacin dominante: brown variegated bwvque es homocigota letal (al igual que Cy), la cepa se la denomina por su fenotipo como: Cy/bwv.
CMO REALIZAR UN CRUZAMIENTO EXPERIMENTAL?

Para realizar un cruzamiento gentico necesita utilizar hembras vrgenes. La manera ms fcil de obtener hembras vrgenes est basada en el hecho de que los machos rara vez copulan con hembras cuya edad es menor a las 8 12 horas de emergidas (a 25C). Entonces, si todas las moscas adultas se eliminan del tubo de cultivo, las hembras que emerjan dentro de las 10 prximas horas sern vrgenes. El perodo que se puede colectar hembras vrgenes se puede extender incubando los cultivos a 18C. Conviene "limpiar" el frasco de hembras en la maana temprano y colectar vrgenes en la tarde puesto que la mayor parte de la emergencia de las moscas se realiza en horas de luz, principalmente en la maana. Como alternativa se pueden colectar pupas hembras y aislaras en un tubo hasta su eclosin. Machos de cualquier edad pueden ser utilizados en un cruzamiento. En el prctico, el docente coordinador le facilitar las hembras vrgenes para cada cruzamiento. Ponga las moscas anestesiadas el tubo de cultivo en forma horizontal hasta que se despierten. En cada tubo ANOTE: el tipo de cruzamiento (indicando los fenotipos hembras y machos) la fecha y el nombre del grupo. A la semana despus de haberse realizado el cruzamiento, los adultos (=moscas parentales) se descartarn para no ser confundidos con la progenie. UBICACION Y MAPEO DE UN LOCUS INCOGNITA EN Drosophila Objetivo Determinar el modo de herencia, la ubicacin cromosmica (PARTE I) y la posicin en el mapa del cromosoma (PARTE II) de un locus incgnita (mutacin). Cada parte tiene dos series de cruzamientos. Cada grupo recibir una cepa que lleva un alelo mutante incgnita cuyos individuos expresan un fenotipo fcilmente distinguible de las moscas salvajes. Se deber

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identificar el carcter mutante. Luego se proceder al anlisis gentico (PARTE I y II) tal cual se describe a continuacin. PARTE I CLASE 2. Drosophila. PARTE I. Modo de herencia y ligamiento gentico de la mutacin incgnita. Primer cruzamiento. Recibir una mutacin incgnita identificada por un nmero. Registre el nmero en sus apuntes, sta ser su mutacin durante todo el prctico de Drosophila. Examine las moscas que llevan la mutacin incgnita y compare con las moscas de tipo salvaje y con los diagramas que se muestran en este protocolo a fin de determinar la nica anormalidad fenotpica que lleva el mutante. Cuando crea que ha identificado el fenotipo anormal asociado con el mutante, consulte con el docente para asegurarse de que sea as. Designe un nombre a su mutacin que sea representativo del carcter mutante, dibuje o describa el carcter mutante junto con el numero en sus apuntes. Examine el fenotipo de las cepas marcadoras (o balanceadoras), las mismas estn descritas al final de este protocolo. En lo sucesivo tendr que identificar los fenotipos mutantes y salvajes. Se realizar DOS series cruzamientos para determinar la relacin de dominancia de los alelos en el locus mutante y asociar su mutacin con un cromosoma especfico. Durante esta clase prctica realice los siguientes tres cruzamientos: 1. Mutantes 2. Mutantes

x x

tipo salvaje (Prueba para ligamiento al sexo o crom. X) Cy/bwV (Prueba para el cromosoma 2)

3. Mutantes x Ly Sb/In(3)LVM (Prueba para el cromosoma 3) Recibir 3 tubos de cultivo, uno para cada cruzamiento. En cada cruzamiento utilice alrededor de 8-10 hembras vrgenes y de 10-12 machos de la cepa mutante. El docente le proveer de las hembras vrgenes y Ud seleccione los machos. Seale en cada tubo el tipo de cruzamiento, la fecha y el nmero de su mutacin. Coloque los tubos con las moscas anestesiadas en forma horizontal. (Los docentes se encargarn de mantener su cepa mutante, y de recolectar vrgenes para el proximo cruzamiento, 3ra semana). Llene la TABLA 1 de manera de poder interpretar los resultados de los cruzamientos cuando examine la progenie en la prxima clase.

2da SEMANA (trabajo realizado por los docentes) Se eliminarn las moscas parentales de cada cruzamiento. Se cultivarn las cepas mutantes puras y colectarn hembras vrgenes para prxima clase prctica de Drosophila.
CLASE 3. PARTE I continuacin. Observacin de la F1. Segundo cruzamiento Observe la progenie (F1) de cada cruzamiento. Cuente los machos y las hembras, anotando el fenotipo y la frecuencia de cada uno y entre los datos en la TABLA 2. Compare sus resultados con los fenotipos que entr en la TABLA 1 para determinar si su mutacin se hereda como un gene recesivo dominante. No tire las moscas (F1) de cada cruzamiento hasta que realice los siguientes cruzamientos:

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1. Para determinar su mutacin est ligada al cromosoma X cruce los individuos de la progenie (F1) del cruzamiento #1 entre s. Simplemente transfiriera alrededor de 10 15 hembras y 10 machos a un tubo con nuevo medio de cultivo. 2. Para determinar su mutacin est ligada al cromosoma II, colecte machos F1 del cruzamiento #2, utilice individuos del fenotipo Cy (Curly) si su mutacin afecta el color de los ojos, bwV (marrn variegado) si afecta otro carcter, y crcelos con hembras vrgenes de su mutacin. 3. Para determinar su mutacin est ligada al cromosoma III, cruce Ly Sb (Lyra, Stubble) del cruzamiento #3 con vrgenes de su mutacin. Se preparar un total de 3 tubos, uno por cada tipo de cruzamiento. Para el cruzamiento #2 y #3 utilice alrededor de 8-10 hembras vrgenes (provistas por el docente) y 10-12 machos en cada tubo. Seale en cada tubo el tipo de cruzamiento, la fecha y el nmero de su mutacin. Coloque los tubos con las moscas anestesiadas en forma horizontal. Determine los fenotipos y proporciones esperadas para cada uno de estos cruzamientos en la TABLA 3 segn las distintas hiptesis. Estos datos sern utilizados para interpretar los datos que obtenga de SUS experimentos.

4ta SEMANA (trabajo realizado por los docentes) Se descartarn las moscas parentales, se realizar la rplica de cada mutante para perpetuar la misma, y comenzar la PARTE II.
CLASE 4. PARTE I. Observacin de la F2 y determinacin del ligamiento gentico de la mutacin incgnita Observe la progenie (F2) de cada cruzamiento. Cuente los machos y las hembras, anotando el fenotipo y la frecuencia de cada uno. Entre los datos en la TABLA 4. Para determinar el ligamiento cromosmico de su mutacin, compare SUS datos experimentales con las proporciones esperadas en la TABLA 3 para cada hiptesis. Confirme el resultado de ligamiento con el docente antes de continuar con el experimento. PARTE II CLASE 5. PARTE II. Mapeo gentico de la mutacin incgnita. Mapeo de tres puntos Observar las cepas mutantes que podrn ser utilizadas en el mapeo de tres puntos (la descripcin de cada mutacin esta al final del protocolo): Cepa : C(1) DX y f; cv f las hembras son yellow y forked (cuerpo amarillo) y los machos son cv f Son todas mutaciones ligadas al cromosoma X. Cepa balancedora Bl L2/Cy Son todas mutaciones ligadas al cromosoma II. Cepa balancedora Ly Sb/In (3 LVM Son todas mutaciones ligadas al cromosoma III Como TAREA GRUPAL: 1. PLANTEE los cruzamientos INDICADOS para realizar el mapeo de tres puntos de SU MUTACIN. Describa los mismos en la TABLA 5.

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2. Cuales son las condiciones genticas que posibilitan el mapeo gentico de tres puntos? 3. Cuntas generaciones necesita para realizar el mapeo de tres puntos? 4. Cul es el genotipo esperado de la hembra que Ud tendr que construir? Cmo describe el genotipo de una hembra heterocigota para tres puntos? 5. Qu tipo de progenie espera OBSERVAR en la F2? Describa la misma en su cuaderno. 6. Cmo puede determinar la posicin del locus incgnita? En qu medida es importante identificar los fenotipos producto del DOBLE crossing over? 7. Cmo podr determinar la distancia entre los loci? Qu medidas de unidad de mapa debe utilizar? 8. Cmo podr determinar si ocurre el fenmeno de interferencia entre loci? En la prxima clase de Drosophila se le proveer de la progenie (F2) que le permita realizar el mapeo de tres puntos de su mutacin. CLASE 6. PARTE II. Observacin de la F2. Anlisis de los resultados para el mapeo de tres puntos. Discusin final de resultados Examine y cuente la progenie (F2) de su mutacin. Si su mutacin est en un autosoma, cuente tanto los machos y como las hembras; si est en el cromosoma X cuente slo los machos de la progenie. Clasifique el mximo de la progenie obtenida para obtener resultados confiables. Determine el nmero de moscas de cada fenotipo. Para facilitar este trabajo, separe primero aquellas moscas por la presencia o ausencia del carcter mutante ms fcil de identificar, luego (en cada grupo) identifique la presencia o ausencia del siguiente carcter y as sucesivamente. Si otro grupo posee la misma mutacin incgnita sumen los datos de cada fenotipo. Coloque los datos en la TABLA 5. Al final de prctico se le examinar los siguiente puntos. 1. Describa en la TABLA 5 los cruzamientos realizados en la Parte II. 2. Determine la posicin de su mutacin en el mapa. Describa en la Tabla 5 los datos que apoyan dicha su conclusin. Describa en detalle sus clculos. 3. Dibuje el mapa gentico y muestre las distancias y posicin de los loci. Calcule tambin el coeficiente de coincidencia y la interferencia.MUTACIONES Y CEPAS DE DROSOPHILA UTILIZADAS EN EL PRCTICO

La posicin de cada mutacin en el cromosoma y en el mapa de recombinacin est dado en parntesis, por ej: cv est en el X a 13.7 centimorgan del extremo del mapa gntico. Esta lista NO incluye la descripcin de las mutaciones incgnitas. cv (X-13.7) f (X-56.7) (Crossveinless; recesivo) Nudos de las alas ausentes presentes slo presente a trazos. Las venas L3 y L4 levemente deltoides en la punta. (Forked; recesivo) Setas cortas, torcidas y dobladas, con extremos divididos y abruptamente torcidos. Pelos afectados en forma similar, pero son visibles solamente a gran aumento. (Curly; dominante) Alas curvadas hacia arriba. Rara vez se solapa con el tipo salvaje a 25C pero si a los 19C. Generalmente letal en homocigotas, pero pueden emerger moscas homocigotas enanas mostrando el carcter de las alas de

Cy (2-6.1)

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forma ms extrema. La mutacin est asociada con una inversin en el segundo cromosoma del cual no se puede separar. bwV (2-104.5) (Brown-Variegated; dominante an cuando el smbolo bw est en minscula (son excepciones) Color de ojos al emerger marrn borra de vino claro, se oscurece a granate, es manchado con mculas ms oscuras que profundizan su color con la edad. Letal en homocigotas, frtil en heterocigotas. Asociado a una inversin en el segundo cromosoma. Bl (2-54.8) (Bristle; dominante) Las setas reducidas a la 1/2 2/3 de su longitud normal, mochas, ms gruesas y con engrosamientos en el perfil. Las setas escutelares posteriores a menudo se cruzan y se adhieren al tamao del cuerpo. Los ojos ms rugosos y ms grandes que los del tipo salvaje. Viabilidad del heterocigota buena pero errtica, los homocigotas son generalmente letales; los sobrevivientes son OO estriles y presentan el carcter de ojos rugosos. (Lobe; dominante) Reduccin variable en el tamao del ojo tanto en heterocigotas como en homocigotas. La viabilidad depende del tipo de alelo. Los alelos ms extremos, L2, muestran ojos reducidos en heterocigotas y muy reducidos y con poca viabilidad en homocigotas. (Lyra; dominante) Mrgenes laterales de las alas recortadas de tal manera que resultan con una forma angosta; ngulo entre las venas L2 y L5 reducido. Las setas cortas y retaconas, las postescutelares faltan a menudo. Ojos algo deformados con salientes. El abdomen oscuro y angosto con los bordes de los tergitos posteriores levantados. (Stubble; dominante) Las setas del heterocigota (Sb/+) tiene menos de 1/2 de la longitud normal y algo ms gruesas que el tipo salvaje. Homocigotas letales. Inversin en el cromosoma 3, fenotipo salvaje. Posee dos mutaciones que son recesivas letales en la regin invertida. (Curly sobre brown variegado) Cepa con la mutacin Cy en uno de los homlogos del cromosoma 2 y la mutacin bwV en el otro. Puesto que tanto Cy como bwV son letales en homocigotas, la cepa esta "balanceada", es decir, los individuos viables que aparecen en esta cepa son heterocigotas Cy/bwV. Ambas mutaciones estn asociadas con inversiones que previenen la recuperacin de gametos recombinantes producidos como resultado del crossing-over entre los cromosomas Cy y bwV.

L (2-70.0)

Ly (3-40.5)

Sb (3-58.2) In(3)LVM Cy/bwV

Ly Sb/In(3)LVM (Lyra Stubble sobre la inversin 3 LVM) Cepa mutante con las mutaciones Ly y Sb en uno de los homlogos del cromosoma 3, y la In(3)LVM en el otro. Dado que tanto Sb como In(3)LVM son letales en homocigosis, esta cepa est balanceada. La inversin previene la recombinacin entre los homlogos del cromosoma 3. cv f Bl L/Cy (Crossveinless forked) Cepa homocigota para las mutaciones cv y f. (Bristle Lobe sobre Curly) Cepa que lleva Bl y L2 en uno de los homlogos del cromosoma 2 y Cy en el otro. Individuos homocigotas para cualquiera de estos cromosomas son letales, de tal manera que la cepa est balanceada. Las inversiones previenen la recombinacin entre los cromosomas.

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Libros de consulta
Lindsley, D. L. & G. G. Zimm 1992. The genome of Drosophila melanogaster. Academic Press. Klug y Cummings. 6 edicin. 2000. Concepts of Genetics. Ed. Prentice Hall Ramos, P y Col. 1993. Manual de Laboratorio de Gentica para Drosophila melanogaster. McGraw-Hill, Linea Schaum, Interamericana de Mexico, S.A.
http://flybase.bio.indiana.edu/ (Pagina principal) http://www.yale.edu/ynhti/curriculum/units/1996/5/96.05.01.x.html

INFORMES Se debe presentar un informes por equipo de trabajo y firmado por los integrantes que han colaborado en el mismo durante el prctico de Drosophila. Es muy importante no reproducir el material descriptivo de manuales o libros. La elaboracin del mismo se realizar en base a SUS observaciones y el anlisis de los datos de SUS cruzamientos. Tenga en cuenta que los sistemas biolgicos no reproducen datos idnticos en experimentos similares, por esta razn, los experimentos nunca "fallan" mientras se comprendan las razones de los resultados obtenidos. El prctico de Drosophila est dividido en dos partes, Parte I y Parte II, y requiere un total de cuatro series de cruzamientos. En este curso se les solicita un informe de la PARTE I. Informe de la PARTE I. Caracterizacin y localizacin de la mutacin Presente los resultados en forma de Tablas y texto muy resumido. 1. Describa en detalle el fenotipo y numero de cdigo de su mutacin incgnita. 2. Realice el esquema de los cruzamientos realizados en la Parte I. 3. Complete la Tabla 1 y adjntela con su informe. 4. Puede Ud. determinar si su mutacin es autosmica o ligada al X con solo los resultados de la progenie F1 de los tres cruzamientos que Ud realiz en la Parte I? Explique. 5. Puede Ud. determinar si su mutacin es dominante recesiva de los resultados de la progenie de los tres cruzamientos que Ud realiz en la Parte I? Explique. 6. Complete las TABLAS 2, 3 y 4. Compare sus datos (Tabla 2 y 4) con los esperados (Tabla 1 y 4 respectivamente). Explique los resultados obtenidos. 7 Cul es el cromosoma donde est ligada su mutacin? Explique cmo lleg a tal conclusin y cmo sus datos apoyan la exclusin de los otros cromosomas. 8. PROBLEMA. Un mtodo alternativo para determinar si una mutacin est ligada al cromosoma X es mediante el uso de hembras con cromosomas X unidos y que sean homocigotas para caracteres recesivos ligados al sexo con machos de la cepa mutante incgnita. En la cepa de Xunidos (XX) las hembras son XXY, con los dos cromosomas X fusionados. En la meiosis de la hembra los dos X-unidos van a un mismo polo en la primera divisin de la meiosis mientras que el cromosoma Y pasa al otro polo. De tal manera que son producidos dos tipos de huevos: XX e Y. Como las hembras son homocigotas para las marcas recesivas ligadas al X, los huevos que llevan los dos X-unidos transmiten las marcas recesivas. a) Cules seran los tipos cromosmicos que Ud. esperara en la progenie del cruzamiento entre individuos XXY (cromosomas X unidos) e XY? Cmo explicara Ud. el hecho de que solamente los tipos XXY y XY son encontrados en los descendientes de este cruzamiento? Muestre el cruzamiento usando el cuadrado de Punnet.

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b) En Drosophila, "yellow" (color amarillo del cuerpo) y "forked" (cetas en forma de tenedor) son caracteres recesivos ligados al X. Imagine que se establece un cruzamiento entre un macho mutante y una hembra XXY (cromosomas X unidos), yellow forked. Se podra distinguir de la progenie de este cruzamiento si el carcter mutante (del macho parental) es ligado al X o autosmico? De la misma manera, se podra distinguir si el carcter mutante es dominante recesivo? Explique ambas respuestas. Fecha de entrega: 15 y 16 de noviembre Fecha devolucin y clase de discusin: 22 y 23 noviembre

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