Laboratorio de Gentica Aplicada MC.

Eleazar Serrano Guzmn

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MANUAL DE LABORATORIO DE GENETICA APLICADA

Universidad Autnoma de Chiapas Faculta de Ciencias Qumicas Campus IV MC. Eleazar Serrano Guzmn 2012

Laboratorio de Gentica Aplicada MC. Eleazar Serrano Guzmn INDICE DE PRCTICAS

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OBJETIVOS Procedimientos de seguridad en el laboratorio de Gentica Aplicada Buenas Prcticas de Laboratorio Clasificacin de los agentes de riesgo potencial Agentes Qumicos.. Agentes Fsicos. Agentes Biolgicos. Clasificacin de riesgos por el cdigo de colores.. Sistema de National Fire Protecction Association (NFPA 704-M).. Interpretacin cuadro riesgo.. Hoja de Seguridad. Residuos. Practica 1 Medidas de seguridad y calidad en e laboratorio de Gentica Aplicada Practica 2 Tcnica SQUASH para la identificacin de cromosomas. Practica 3 Identificacin de cromatina X en mucosa bucal. Practica 4 Extraccin y purificacin de ADN de clulas procariotas (E. coli) Practica 5 Extraccin y purificacin de ADN de clulas Eucariotas. Practica 6 Corrimiento electrofortico de ADN.. Bibliografa.

5 5 7 7 8 9 10 10 11 11 13 15 22 25 28 31 34 37

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OBJETIVO GENERAL DE LA MATERIA: en base a los conocimientos previos teoricos y de laboratorio el alumno identificara las diferentes pruebas de laboratorio basadas en biomoleculas especificas, con carcter diagnostico.

OBJETIVOS DE LOS APUNTES DE LA MATERIA: este material es una guia para el estudiante para ayudarlo a la comprension de los temas y la investigacin de las unidades tematicas desde el analisis de los acidos nucleicos, proteinas hasta las metodologias para su analsis.

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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIAPAS FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS CAMPUS IV

PROCEDIMIENTOS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE GENETICA APLICADA.

La principal funcin de la seguridad en un laboratorio de Gentica es reducir la posibilidad de accidentes para proteger al personal y a las instalaciones. De las actitudes y acciones de las personas que trabajan en un laboratorio, depende su propia seguridad y la de los dems, as como la calidad de servicios que estn ofreciendo. El buen uso de los aparatos, el diseo de una estrategia de trabajo y los riesgos de errores son las reglas bsicas de seguridad para prevenir riesgos fsicos, qumicos, biolgicos y radiolgicos, en cualquier laboratorio y especficamente el de Gentica aplicada, por lo cual se requiere de personas entrenadas, concientes y responsables.

Buenas Prcticas de Laboratorio Las buenas prcticas incluyen reglas, recomendaciones o prohibiciones relacionadas con el conocimiento, el sentido comn y la solidaridad en el ambiente de trabajo. Estar PROHIBIDO comer, beber (incluye tomar mate), almacenar alimentos, correr, fumar, maquillarse o manipular lentes de contacto en el laboratorio. An cuando no se estn realizando Trabajos Prcticos (tericos, seminarios, etc.). El rea de trabajo debe estar limpia y ordenada. No debe colocarse libros, mochilas o bolsas sobre las mesas de trabajo. Se deber verificar que la mesa de trabajo est limpia al comenzar y al terminar el trabajo realizado.

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Se deber usar vestimenta adecuada: MANGA LARGA preferentemente de algodn (que no ser utilizado fuera del laboratorio), zapatos cerrados (no sandalias), y tener el pelo recogido. Es obligatorio el uso de ANTEOJOS DE SEGURIDAD, segn sea lo que corresponda, durante la realizacin de los Trabajos Prcticos. Los ojos son rganos muy vascularizados que pueden absorber rpidamente algunos compuestos qumicos, por otra parte aunque no estemos trabajando directamente estamos expuestos a posibles aerosoles y vapores. Las gafas son de uso personal y no pueden ser intercambiadas entre los alumnos. Los alumnos o docentes que realicen tareas experimentales en el laboratorio es de CARCTER OBLIGATORIO usar guantes apropiados acorde a los riesgos y los reactivos que se manipulen. Los guantes previenen el contacto con agentes txicos o biolgicos, quemaduras por superficies calientes, fras o corrosivas y cortes por objetos punzantes. Los guantes debern desecharse al terminar el trabajo, no se tocarn con ellos lapiceros, carpetas, picaportes, teclados, etc. PROHIBIDO pipetear con la boca. Se podrn utilizar pipetas de vidrio o plstico con pipetor o micropipetas. Los alumnos y docentes deben estar familiarizados con los elementos de seguridad disponibles, salidas, extintores, lavabos. Toda herida, an los pequeos cortes, que se produzca durante un trabajo prctico deben ser informados obligatoriamente al docente. Todos los materiales potencialmente contaminados se deben descontaminar o esterilizar antes de desecharlos o reutilizarlos. El desecho de los residuos (solventes, cidos, compuestos orgnicos, radioistopos, etc.) deben respetar las normas establecidas y no tirarse al cao o en la basura comn. La manipulacin de los microorganismos y material biolgico, debe ser restringida a los laboratorios y de ninguna manera se debe permitir su dispersin o propagacin en el medio ambiente, aunque podran parecer inofensivos.

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Clasificacin de los agentes de riesgo potencial Los agentes cuya manipulacin en el laboratorio pueden presentar un riesgo potencial para la salud se pueden clasificar en tres grupos: a) agentes qumicos, b) agentes fsicos y c) agentes biolgicos. Hay muchos factores que influyen en el riesgo de estos tres grupos de agentes, de tal manera que todos deben de ser manejados con precaucin, tanto por sus efectos conocidos, como por sus efectos desconocidos. a) Agentes qumicos En el laboratorio se manipulan gran cantidad sustancias qumicas potencialmente peligrosas. En funcin de sus riesgos se pueden clasificar en:

Irritante: que da lugar a reacciones locales en mucosas y piel (ejemplo: HCl diluido, fenol, etc.). Toxica: que ocasiona dao a la Salud cuando es ingerida, inhalada o absorbida por la piel o las mucosas (ejemplo: acrilamida, metanol etc.). Carcinognicas: que puede provocar cncer (ejemplo: bromuro de etidio, etc.). Mutagnicas: que provoca alteraciones en el material gentico ( ejemplo: bromuro de etidio) Teratgena: que ocasiona dao al feto Corrosiva: que provoca el desgaste gradual de diversos tipos de material (ejemplo: HCl, NaOH, etc.). Inflamable: que tiene un punto de inflamacin inferior a 60C, y puede empezar su combustin por friccin, cambios qumicos, etc. Explosiva: que es capaz de producir una reaccin detonante a 25C y 1.03 Kg/cm de presin.

Para identificar estos compuestos existe una sealizacin internacional (Figura 1) la cual es importante conocer.

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b) Agentes fsicos

Equipos de laboratorio: Los accidentes producidos con equipos suelen ser por fallas humanas debido a: prisas, desconocimiento del manejo, uso inadecuado, falta de mantenimiento, etc. En el laboratorio estos accidentes se asocian generalmente al uso de las centrifugas (un rotor mal equilibrado puede causar que se rompa l y que salgan volando piezas, al tratar de parar el rotor con las manos uno se podra lastimar, etc), de las cmaras de electroforesis (al quedarse bajo tensin, o sin avisar de uso con alto voltaje). Generalmente todos los aparatos son elctricos y por lo tanto se tienen que manipular con las mismas precauciones elementales que cualquier otro de uso domstico para evitar shock elctrico, corto-circuito y fuego.

Radiaciones: Las radiaciones X, UV e ionizantes, como las emitidas por los radioistopos son potenciales carcingenos, mutgenos y teratgenos. Su uso requiere tomar las medidas necesarias para evitar una exposicin sin proteccin y/o prolongada.

Sustancias y elementos radioactivos: El material radioactivo se puede manipular nicamente en laboratorios autorizados por las Comisiones Nacionales de Salvaguardia y bajo reglas especficas y estrictas. Todas estas se establecen con la finalidad de que el personal quede expuesto a dosis mnimas con el material radioactivo. Los tres factores de proteccin radiolgicas son: tiempo (se debe limitar al mnimo el tiempo de exposicin); distancia (se debe evitar el contacto o el riesgo de contacto directo con la persona); y blindaje (se debe utilizar proteccin para limitar la exposicin a las radiaciones). A parte de la exposicin a las

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radiaciones se incluye dentro de los riesgos: la contaminacin de la piel, o de las uas y el deposito de los radioistopos en el cuerpo.

c) Agentes biolgicos En un laboratorio de Gentica aplicada, el personal puede estar en contacto directo con diversos agentes biolgicos (virus, bacterias, clulas) durante su cultivo y tipificacin o durante el tratamiento de muestras biolgicas potencialmente contaminadas (sangre, orina, tejido, etc.). En la entrada de todos los laboratorios debe existir informacin sobre el nivel de seguridad con el que se trabaja: Nivel I: Agentes que no se ha comprobado que producen enfermedad en adultos sanos. Slo este nivel de riesgo est permitido para los laboratorios de enseaza de grado. Nivel II: Agentes asociados a enfermedades humanas de riesgo potencial moderado para el personal y el medio ambiente (transmisin por ingestin, dao percutneo, contacto con mucosas). Nivel III: Agentes indgenas o exticos con potencial de transmisin por aerosol, causantes de enfermedades graves o letales. Riesgo personal elevado, moderado riesgo para el medio ambiente. Nivel IV: Agentes exticos que producen enfermedades mortales, que pueden producir epidemias o de va de transmisin desconocida. Elevado riesgo personal y para el medio ambiente. Estos agentes se clasifican en diferentes grupos dependiendo de los riesgos y en consecuencia de las precauciones a tomar para trabajar con ellos, como se indica en la tabla 1.

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Tabla 1.- Niveles de bioseguridad y resumen de sus recomendaciones

Nivel Practicas y tcnicas Practicas estndar Equipo de seguridad Instalaciones Bsicas

microbiolgicas Equipos de seguridad normal para un laboratorio estndar

II

Practicas del nivel 1, acceso Equipos de contencin limitado, descontaminacin parcial (campanas de de residuos infecciosos, uso bioseguridad I y II) de guantes, sealamiento de seguridad. Practicas de nivel 2 ropa Equipo de contencin parcial apropiada para el laboratorio (campanas de bioseguridad I y acceso limitado. y II) Practicas de nivel 3 Equipos de contencin Mximo (campanas de bioseguridad III)

Bsicas

Contencin

III

IV

Mxima contencin

CLASIFICACION DE RIESGOS POR EL CODIGO DE COLORES Sistema de la National Fire Protecction Association (NFPA 704-M).
Establece un sistema de identificacin de riesgos para que en un eventual incendio o emergencia, las personas afectadas puedan reconocer los riesgos de los materiales respecto del fuego. Este cdigo ha sido creado para dar informacin al cuerpo de bomberos en el terreno. No identifica los peligros para la salud de una sustancia qumica, en situaciones distintas de una emergencia.

Laboratorio de Gentica Aplicada MC. Eleazar Serrano Guzmn Interpretacin cuadro riesgos NFPA

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Salud (azul)

Inflamabilidad (rojo)

Reactividad (amarillo)

Casos Especiales (Blanco) A Bata y lentes

4 Fatal

4 Extremadamente Inflamable

4 Puede detonar

3 Extremadamente Riesgosa 2 Riesgosa

3 Inflamable

3 Puede detonar con golpe o calor

B Bata, lentes y Guantes C Bata, lentes, guantes y mascarilla

2 Calentamiento Moderado. Lo que puede Inflamar

2 Cambio qumico Violento

1 Ligeramente Riesgosa

1 Combustible si se calienta

1 Inestable si se Calienta

D Bata, lentes, guantes y mascara de seguridad

0 Material Normal

0 No se quema

0 Estable

HOJA DE SEGURIDAD Es un documento que rene en forma ordenada y resumida, la informacin bsica de las caractersticas fisicoqumicas, de seguridad, ecolgicas, toxicolgicas y de acciones de emergencias de los materiales considerados riesgosos. Se considera una herramienta bsica para prevenir accidentes dentro y fuera de los centros de trabajo donde se manejan sustancias qumicas. As tambin es el mejor recurso del personal para responder a emergencias con materiales riesgosos.

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Estas hojas son requeridas por la legislacin mexicana [Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNA), Secretara de Comunicaciones y Transporte (SCT), Secretara del Trabajo y Prevencin Social (STPS), Secretara de Salud (SS), Secretara de Gobernacin (SG)]. Existe una serie de bancos de datos que cuentan con un gran nmero de hojas de datos de diferentes sustancias. Recientemente se acord que una hoja de seguridad completa debe contener la siguiente informacin:

1.- Identificacin del material (nombre y proveedor). 2.- Composicin e informacin de los componentes. 3.- Identificacin de su peligrosidad. 4.- Medidas de primeros auxilios. 5.- Medidas para prevencin de fuegos. 6.- Medidas para prevencin de accidentes. 7.- Manejo y almacenamiento. 8.- Equipo de proteccin personal. 9.- Propiedades fsicas y qumicas. 10.- Estabilidad y reactividad. 11.- Informacin toxicolgica. 12.- Informacin ecolgica. 13.- Consideraciones para su disposicin. 14.- Informacin para el transporte. 15.- Regulaciones. 16.- Informacin adicional.

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En un almacn de sustancias, siempre se debe contar con las hojas de datos de seguridad actualizadas de las sustancias que se manejen, y en un lugar de fcil acceso. Para consultarse cada vez que se va a manipular alguna sustancia especfica y as seguir las principales recomendaciones de manejo.

RESIDUOS. La primera tarea del personal de un laboratorio donde se generan residuos peligrosos es: 1.- Determinar cuando un material es residuo. 2.- Determinar si el residuo es un residuo peligroso. Los residuos peligrosos comprenden: 1.- Los residuos aislados, mezclados o en solucin; pueden presentarse en estado slido, liquido o en forma de lodos y son generados como subproductos de una sntesis o proceso. 2.- Los residuos resultantes de operaciones unitarias. 3.- En muchos casos, podran tambin convertirse en residuos peligrosos las materias primas que caduquen o se deterioren durante el tiempo de su almacenamiento. Es muy difcil establecer un sistema o mtodo de tratamiento general para todos los residuos especficos de un laboratorio, ya que depende del volumen generado, del tipo de laboratorio que se trate y sobre todo por la variedad de residuos que se generan; por otra parte los residuos casi nunca estn constituidos por un solo producto, por lo general son mezclas complejas. Un adecuado etiquetado y descripcin de la composicin cualitativa, en forma aproximada a la cuantitativa de los residuos peligrosos, es una responsabilidad importante en un sistema de tratamiento, ya sea por el mismo personal o a travs de una compaa especializada en manejo y disposicin de residuos peligrosos. Los responsables de una adecuada identificacin de los residuos, son los propios generadores, sean estudiantes, profesores o investigadores.

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Todos los residuos deben estar etiquetados correctamente, indicando el nombre y ubicacin del generador, as como las precauciones e indicaciones correspondientes para el manejo adecuado del residuo. Los generadores de los residuos son responsables ante la Ley por los accidentes ocasionados por un inadecuado etiquetado y/o transporte y deben pagar por los daos causados a los seres vivos y a los bienes materiales, en ocasiones con dinero y en otros con encarcelamiento. Los residuos bien etiquetados deben proporcionar informacin adecuada de su composicin: el saber que en un contenedor se tiene los productos finales de una reaccin (por ejemplo, los residuos de la reaccin de Oxidacin de alcoholes), no es suficiente. Si el residuo es identificado como un compuesto especfico o mezcla conocida (nmero de productos, su naturaleza y cantidad), dan una idea de su peligrosidad, clase qumica, reactividad, grupos funcionales y con esto puede establecerse su compatibilidad, o medidas de emergencia en caso de un derrame accidental. El conocimiento de un producto qumico o de un residuo as como sus propiedades fsicas, qumicas y toxicolgicas, antes de tomar cualquier decisin del tratamiento es responsabilidad del personal que lo gener y/o lo tratar.

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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIAPAS FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS CAMPUS IV

PRACTICA No. 1 MEDIDAS DE SEGURIDAD Y CALIDAD EN EL LABORATORIO DE GENETICA APLICADA

OBJETIVO El alumno conocer las medidas de seguridad y calidad que se exigen en el laboratorio de gentica. Adems de estandarizar el manejo del material de precisin.

INTRODUCCIN Los agentes cuya manipulacin en el laboratorio pueden presentar un riesgo potencial para la salud, se pueden clasificar en tres grupos: agentes qumicos (sustancias irritantes, toxicas, carcinognicas, mutagnicas, corrosivas, etc.), agentes fsicos (uso inadecuado del equipo, falta de mantenimiento, elementos radioactivos, etc.), y agentes biolgicos (virus, bacterias, etc.). Hay muchos factores que influyen en el riesgo de estos grupos, de tal manera que todos deben ser manejados con precaucin tanto por sus efectos conocidos como por sus efectos desconocidos. Otro aspecto importante en el laboratorio de gentica es la elevada calidad de los resultados, por lo que se requiere la realizacin de controles de calidad durante todo el procedimiento. Dentro de los errores mas comunes que se realizan en este laboratorio son los debidos a los reactantes (muestras, reactivos, estndares, etc.) y los errores al nivel de las diferentes etapas de la

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tcnica (transferencia de reactivos y muestra, contaminacin inter-muestras, temperatura, duracin de la reaccin, etc.). Para prevenirlos es necesario realizar ciertas medidas de control como son la realizacin de un blanco, una curva de calibracin, uso de controles negativos, entre otros. La calidad depende de dos criterios esenciales: la exactitud y la presicin. La exactitud representa la concordancia entre el valor promedio aritmtico de varios resultados y el valor real (Figura 1). La inexactitud absoluta corresponde a dA = m - Y la inexactitud relativa dR = m- / La presicin (o fidelidad) es inversamente proporcional a la dispersin de los resultados obtenidos de ensayos respectivos sobre la misma muestra, en condiciones constantes y determinadas (Figura 1). La imprecisin esta evaluada por la desviacin estndar () o S n-1 S n-1= (x-m)
n-1

El resultado esta expresado en porcentaje del promedio o coeficiente de variacin CV = S n-1 - 100 m

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Exacto pero impreciso

Inexacto pero preciso

Exacto y preciso

Figura 1. Presicin y Exactitud.

Para lograr la calidad en cualquier tcnica que sea cualitativa como cuantitativa implica conocer dos caractersticas importantes de sta: su lmite de deteccin: concentracin mnima que se puede medir y que sea significativamente distinta del ruido de fondo. Por ejemplo,

Cul es la cantidad mnima de DNA que se requiere para obtener siempre la amplificacin del gen de inters? su lmite de linearidad (en caso de cuantificacin): rango de concentracin en el cual la concentracin medida es proporcional al valor real. La calidad de un anlisis, o experimento depende del buen conocimiento de los instrumentos de trabajo, uno de los ms importantes en esta rama de la investigacin es la micropipeta. De la buena calibracin de estos instrumentos depende la exactitud del resultado. -

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Descripcin de una micropipeta Botn de Botn de opresin Ajuste de volumen Micrmetro Indicador de volumen Cuerpo de la Micropipeta expulsin

Brazo de Columna de plstico Expulsin

Puntilla

Es indispensable no tratar de sobrepasar el volumen mximo ideado: una micripipeta de un mL no permite tomar volumen de 1.05 mL, por ejemplo. Al hacerlo as se descalibra la micropipeta, y por lo tanto no se pipetean los volmenes indicados. Del buen manejo de la micropipetas depende la exactitud y precisin de los pipeteos (Figura 2). 1) Sujetar la pipeta con una mano y con la otra ajustar el volumen que se desea medir utilizando el micrmetro. 2) Colocar la puntilla en la parte inferior de la pipeta.

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3) Presione el embolo con el pulgar hasta el primer tope, sumergir la puntilla en el liquido deseado y dejar regresar nuevamente el embolo a la posicin original (una manipulacin rpida puede causar errores en la medicin). 4) Quitar el exceso del lquido por fuera de la puntilla utilizando papel secante con mucho cuidado para evitar la contaminacin del orificio de la puntilla. 5) Para descargar el liquido, aplicar la puntilla contra la pared del tubo y oprimir el botn hasta el segundo tope. 6) Para retirar la puntilla usada presione el botn expulsor.

Figura 2. Influencia de la posicin de la pipeta sobre la exactitud del volumen pipeteado

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MATERIALES Y REACTIVOS Micropipetas (10, 100 y 1000L) Vaso de precipitado de 100mL Balanza analtica

PROCEDIMIENTO 1.- Calibrar micropipetas de diferentes capacidades (10,100 y 1000 L). 2.- Medir un volumen determinado (100L) de agua en un vaso de precipitado, previamente tarado, y pesar en balanza analtica. Realizar diez repeticiones. 3.- Anotar en la tabla los valores determinados 4.- Obtener el peso promedio, volumen promedio pipeteado y el coeficiente de variacin. 5.- Comparar el resultado con el real (100L) y discutir. TABLA
Ensayo N. 1 2 3 4 5 Peso en mg Ensayo N. 6 7 8 9 10 Peso en mg

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CUESTIONARIO 1.- Cuales son las reglas de seguridad bsicas en el laboratorio de gentica? 2.- Qu es un control negativo? 3.- Cmo evitaras los errores debidos a los reactantes? 4.- Menciona al menos tres errores realizados durante el procedimiento de una tcnica de laboratorio y como los evitaras? 5.- Dibuja una micropipeta y ubica sus partes. 6.- Cules son las principales fuentes de error en la manipulacin de micropipetas?

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PRACTICA No. 2

TECNICA DE SQUASH PARA LA IDENTIFICACION DE CROMOSOMAS

OBJETIVO: El alumno aplicar la tcnica de Squash para la identificacin de cromosomas en diversas muestras vegetales.

INTRODUCCIN Los cromosomas de la clula estn constituidos por cromatina y contienen informacin gentica de su especie, la cual es necesaria para el funcionamiento de sus clulas, la morfognesis de los organismos, as como su reproduccin. Son estructuras visibles al microscopio compuesto solo durante la divisin celular mitosis o meiosis, en la interfase solo se aprecia en el ncleo delgados filamentos de cromatina. Los cromosomas contienen la informacin necesaria para los cambios del material gentico, contenidos en ellos la variacin, mutacin y seleccin de los seres vivos. La morfologa del cromosoma se llama al aspecto externo que presenta en las etapas de la divisin celular. Estos se pueden clasificar en cuatro tipos de acuerdo con la forma que presentan durante la metafase y la anafase media. Telocntricos. Centrmero ubicado en el extremo proximal, lo que da aspecto bastoniforme, el cromosoma tiene solo un brazo. Acrocntricos. Centrmero ubicado en posicin subterminal, lo que da lugar a la formacin de un brazo muy corto. Submetacntricos. Brazos desiguales en forma de J. Metacntricos. Brazos iguales o casi iguales en forma de V.

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El nmero de cromosomas es una constante que puede explicar la individualidad a travs de las generaciones celulares del individuo, hay excepciones sobre la variacin del nmero de cromosomas. Los seres vivos constituyen un juego o complemento somtico diploide de cromosomas originado por la unin de dos gametos: el espermatozoide y el ovulo, cada uno de los cuales aporta un juego de cromosomas, haploide o monoploide. El nmero somtico o diploide en el hombre es de 46, formado por los juegos haploides de cada gameto, cada uno con 23 cromosomas. Cada juego haploide se designa por n y el diploide por 2n. El cariotipo puede ser representado por un esquema que se denomina idiograma, basado en los valores promedios. As pues, se considera un cromosoma metacntrico si su ndice brazo largo / brazo corto es 1, es decir, que presenta los dos brazos iguales.

MATERIALES Y REACTIVOS Muestra problema Material de diseccin Vaso de precipitado de 50mL Tubos de ensaye de 13X100 Porta y cubreobjetos Mechero bunsen Microscopio compuesto Agua destilada Acetato de Orcena al 1%

PROCEDIMIENTO 1.- Realizar el pre-tratamiento indicado por el instructor 2.- Colocar la muestra en un tubo de ensaye con acetato de orcena durante 20 minutos. 3.- Calentar ligeramente con el mechero bunsen. 4.-Sacar la muestra y cortar en forma transversal finamente.

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5.-Montar en portaobjetos y adicionar una gota de colorante. 6.- Poner el cubreobjetos y presionar la muestra con la ayuda de la goma de un lpiz nuevo (Squash). 7.- Fijar la muestra con la flama del mechero y esperar a enfriar para posteriormente observar al microscopio. 8.- Observar primero los contornos y despus ir hacia el centro.

CUESTIONARIO 1.- En que consiste la teora cromosmica? 2.- Qu es el cariotipo y que utilidad tiene en estudios genticos? 3.- En que consiste la amniocentesis? 4.- Describe dos desordenes genticos humanos causados por mutaciones a nivel de gen y dos a nivel de cromosoma. 5.- Esquematiza el cariotipo de un vegetal.

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PRACTICA No. 3

IDENTIFICACION DE CROMATINA X EN MUCOSA BUCAL

OBJETIVOS: El alumno conocer la importancia de los estudios relacionados con la cromatina X. El alumno identificar corpsculos de Barr (Cromatina X) en muestras de mucosa bucal.

INTRODUCCIN Los trabajos de Alfred Jost (1947) en los cuales castraba embriones macho de conejo despus de la diferenciacin de los testculos pero antes de la masculinizacin de los conductos mesonfricos, demostraron que en ausencia de testculos el desarrollo de los embriones sigue un fenotipo hembra por lo tanto, en sentido embriolgico, el fenotipo hembra puede considerarse como neutro. Las substancias que secretan los testculos fetales inician el desarrollo de los conductos mesonfricos, y causan atrofia o regresin de los conductos de Mller; producindose as los caracteres masculinos. En la actualidad, sabemos que de existir el cromosoma Y, el fenotipo resultante es masculino, aun cuando existan tambin 2 o ms cromosomas X. La supervivencia del embrin exige la presencia de un cromosoma X cuando menos, y son necesarios dos cromosomas X para un desarrollo ovrico normal. Si el nico cromosoma sexual existente es de tipo X (XO), el fenotipo es femenino, pero la porcin germinativa de los ovarios no se desarrolla. En 1949 Barr y Bertram al estudiar neuronas de gato, observaron una diferencia entre los ncleos de clulas machos y hembras: sobre la cara interna de la membrana nuclear exista una pequea masa de cromatina densa, en las clulas de las hembras, posteriormente se vio que este fenmeno ocurra en

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casi todos los tejidos del cuerpo. Barr reconoci (1951) que se encontraba asociado al borde interno de la membrana nuclear y debido a su asociacin con el sexo femenino, se le denomino cromatina sexual, actualmente tambin se le conoce como corpsculo de Barr, cromocentro, cromatina X. Diferentes investigaciones reconocieron que mujeres con sndrome de Turner tenan cromatina negativa y que hombres con sndrome de Klinefelter presentaban cromatina positiva. Estudios posteriores demostraron que el corpsculo de Barr puede ser nico o mltiple y este ltimo caso se debe al exceso de cromosomas X en un individuo. Esto llevo a formular una regla precisa: todos los cromosomas X supernumerios se inactivan y el nmero de cromatinas X observadas corresponden al nmero de cromosomas X presentes, menos uno. Posteriormente los estudios de Ohno en 1959 demostraron que la cromatina sexual corresponde a la condensacin de uno de los cromosomas X en la mujer durante la interfase. En 1961 Mary Lyon present su hiptesis para explicar la presencia de cromatina X. Propuso que, en el momento de aparecer por primera vez la cromatina sexual en el embrin femenino, un cromosoma X de cada clula se inactiva, y constitua la masa de cromatina sexual. Pens tambin que esta inactivacin era al azar, de modo que, por probabilidad en el 50% de las clulas el cromosoma X inactivado provena del macho y el otro 50% de la hembra. De esta eleccin al azar, el mismo cromosoma X se seguir inactivando en las clulas descendientes.

MATERIALES Y REACTIVOS Cubreobjetos y Portaobjetos Mechero bunsen Microscopio compuesto Alcohol de 96 Aceto-orceina

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PROCEDIMIENTO 1.- Realizar dos raspados de la cara interna de la mejilla con una pequea esptula. 2.- Hacer un frotis con el segundo raspado y fijar con alcohol de 96. 3.- Retirar el exceso de alcohol y teir con aceto-orceina. 4.- Coloque el cubreobjetos y fije con la flama del mechero 5.- Observe al microscopio con los objetivos de 10, 40 y 100X, las clulas de la mucosa bucal e identifique la cromatina X.

CUESTIONARIO 1.- Describa la importancia de la cromatina X 2.- Indica otra metodologa para la identificacin de los cuerpos de Barr 3.- Menciona las ventajas y desventajas sobre la metodologa realizada en mucosa bucal para la identificacin de cromatina X 4.- Escriba 5 colorantes utilizados para la identificacin de Cromosomas. 5.- Ordenar el cariotipo humano que se proporciona en la hoja anexa, e identificar si presenta alguna alteracin, en que locus y a que sndrome se refiere.

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PRACTICA No. 4 EXTRACCION Y PURIFICACION DE ADN DE CLULAS PROCARIOTES (E. coli)

OBJETIVO: El alumno realizar la extraccin y purificacin de ADN de clulas procariotes (E. coli).

INTRODUCCIN Podemos identificar a las clulas en dos tipos, procariticas y eucariticas. La principal diferencia entre ambos tipos es que las clulas procariticas no tienen envoltura nuclear y su ADN ocupa en la clula un espacio denominado nucleode. Es interesente sealar que gran parte de nuestro conocimiento actual en gentica se origina en el estudio de virus y bacterias. Una clula bacteriana, como la Escherichia coli (E. coli) presenta un ADN con una sola molcula circular de 3,400,000 de pares de bases y una longitud total de 1.4 mm, comparado con la cantidad de ADN en el hombre, que es 700 veces mayor, es decir, el ADN de una sola clula diploide humana, completamente extendida, puede tener una longitud total de 1.7 m. Esta bacteria adems, presenta la ventaja de su fcil cultivo, tiene un tiempo de generacin corto y se adapta perfectamente a los estudios de laboratorio. La extraccin de ADN de una clula requiere la ruptura o lisis de la misma, la cual se consigue mediante mtodos fsicos o qumicos. Posteriormente se realiza una extraccin orgnica para precipitar todas las protenas y restos celulares. Finalmente se precipita el ADN y se eliminan las sales.

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Los anlisis moleculares requieren la obtencin de altas concentraciones de ADN puro con el fin de evitar errores posteriores, por lo que se debe tomar en cuenta la cantidad de muestra con que se cuenta. En el caso de cultivo bacteriano no debe ser mayor de 2X109 unidades formadoras de colonias (cfu) y para levaduras 2X107 cfu.

MATERIALES Y REACTIVOS Muestra de cultivo bacteriano (E. coli) Solucin de lisis -mercaptoetanol Fenol saturado Solucin de SEVAG Acetato de sodio 3M Etanol Micropipetas (2,10,100 y 1000L) Tubos eppendorf Centrifuga

PROCEDIMIENTO 1.- Centrifugar la muestra problema a 2000rpm durante tres minutos. 2.- Tomar un alcuota de 100L de precipitado y volver a centrifugar a 10,000rpm durante un minuto. 3.- Separar el precipitado y adicionar 100L de la solucin de lisis, 5L de mercaptoetanol y 250L de fenol saturado, mezclar. 4.- Adicionar 250L de solucin SEVAG y mezclar vigorosamente. 5.- Centrifugar a 10,000rpm durante diez minutos. 6.- Separar la fase acuosa, adicionarle 35L de acetato de sodio y mezclar. 7.- Agregar 1.5mL de etanol absoluto fro. Observar precipitado. 8.- Incubar una hora a -20C.

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9.- Centrifugar diez minutos a 10,000rpm. 10.- Separar el precipitado y adicionarle 200L de etanol al 70% fro. 11.- Centrifugar a 10,000rpm por diez minutos. 12.- Decantar el etanol y dejar secar a temperatura ambiente. 13.- Disolver el precipitado en 40L de agua tridestilada y cuantificar ADN por espectrofotometra.

CUESTIONARIO 1.- Investigar las caractersticas qumicas y fsicas de los reactivos utilizados en la prctica. 2.- Cul es la funcin del etanol en el procedimiento de la prctica? 3.- Explica las posibles fuentes de error en el procedimiento realizado. 4.- Qu es un control negativo y como lo aplicara en esta practica?

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PRACTICA No. 5 EXTRACCION Y PURIFICACION DE ADN DE CLULAS EUCARIOTES

OBJETIVO: El alumno realizar la extraccin y purificacin de ADN de clulas eucariotes.

INTRODUCCIN El cido desoxirribonucleico (ADN) se encuentra en todas las clulas de los seres vivos y contiene las unidades de la herencia conocidas como genes. A los genes se deben las caractersticas visibles del organismo que en conjunto se conoce como fenotipo. El gen es la unidad de la herencia y su papel en el organismo se revela mediante cambios en el fenotipo llamados mutaciones, que ocurren cuando algunas de las secuencias del ADN del total de la constitucin gentica o genotipo del organismo es alterada, y se pierde o se modifica la funcin del gen codificado. Estos genes se encuentran en las clulas eucariotes formando las estructuras macromoleculares: la cromatina o los cromosomas, estos ltimos son la forma transitoria y mas condensada de la cromatina, que se hacen evidentes durante la divisin celular. Este arreglo del ADN en forma de cromatina no solo sirve para empaquetar casi dos metros de ADN dentro de un ncleo de una clula, sino que tambin contribuye a regular la funcin de los genes. En la dcada del setenta, el panorama de los estudios en biologa molecular de genes eucariotes era incierto. La tremenda complejidad del genoma eucaritico (3 x 109 pares de bases por genoma humano haploide) constituan el principal obstculo para iniciar estos estudios.

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El descubrimiento de las enzimas de restriccin y la creacin del concepto de vehiculo molecular (vector) dio pie, al desarrollo de tres poderosos mtodos de estudio directo de los genes eucariticos: 1) determinacin de la secuencia nucleotdica de genes, 2) deteccin y caracterizacin de secuencias gnicas, por hibridacin molecular, usando rastreadores radioactivos y 3) clonacin molecular. Actualmente, las tcnicas de ADN son una de las herramientas ms tiles en varios campos de la investigacin, desde las pruebas de paternidad hasta la medicina forense.

MATERIALES Y REACTIVOS Muestra de sangre Solucin de lisis -mercaptoetanol Fenol saturado Solucin de SEVAG Acetato de sodio 3M Etanol Micropipetas (2,10,100 y 1000L) Tubos eppendorf Centrifuga

PROCEDIMIENTO 1.- Centrifugar la muestra a 2500rpm durante tres minutos. 2.- Separar los glbulos blancos y colocarlos en un tubo eppendorf 3.- Adicionar 100L de la solucin de lisis, 5L de -mercaptoetanol y 250L de fenol saturado, mezclar. 4.- Adicionar 250L de solucin SEVAG y mezclar vigorosamente. 5.- Centrifugar a 10,000rpm durante diez minutos. 6.- Separar la fase acuosa, adicionarle 35L de acetato de sodio y mezclar.

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7.- Agregar 1.5mL de etanol absoluto fro. Observar precipitado. 8.- Incubar una hora a -20C. 9.- Centrifugar diez minutos a 10,000rpm. 10.- Separar el precipitado y adicionarle 200L de etanol al 70% fro. 11.- Centrifugar a 10,000rpm por diez minutos. 12.- Decantar el etanol y dejar secar a temperatura ambiente. 13.- Disolver el precipitado en 40L de agua tridestilada y cuantificar ADN por espectrofotometra.

CUESTIONARIO 1.- Explica que es la paradoja del valor C 2.-Describe el procedimiento qumico y enzimtico, para la determinacin de la secuencia de nucleotidos en un gen 3.- Qu es un vector? 4.- Esquematiza el proceso de clonacin 5.- Cmo realizara la extraccin y purificacin de ADN en una muestra de tejido animal?

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PRACTICA No. 6 CORRIMIENTO ELECTROFORETICO DE ADN

OBJETIVO El alumno realizar el corrimiento electrofortico de cidos nucleicos extrados y purificados de diferentes tipos de muestras.

INTRODUCCIN La electroforesis es una tcnica analtica que permite la separacin de molculas como resultado de su diferente movilidad en un campo elctrico debido a su carga/masa. Esta tcnica consta de una fase mvil y una estacionaria, la primera proporciona el medio amortiguador que permite la movilidad de las molculas cargadas hacia los electrodos correspondientes cuando se genera un campo elctrico. La fase estacionaria por su parte, es un gel con tamao de poro homogneo que se encuentra sumergido en la fase mvil. Existen diferentes tipos de geles, como son los de poliacrilamida, almidn y agarosa, siendo este ltimo el ms utilizado para el anlisis de cidos nucleicos (100pb- 10Kb). Los cidos nucleicos son molculas cargadas negativamente, debido a la presencia de grupos fosfato en la estructura; por lo que la separacin en el gel se lleva a cabo en base a la masa molecular de los fragmentos de ADN. Transcurrida la electroforesis se lleva a cabo su deteccin mediante la tincin con bromuro de etidio y una posterior iluminacin con luz UV, llegndose a observar bandas fluorescentes. La electroforesis en gel de agarosa es una tcnica muy empleada que permite separar los fragmentos de ADN, localizarlos en funcin de su peso molecular (por comparacin con marcadores de peso molecular conocido) y

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puede llegar a permitir la extraccin del fragmento de inters para posteriores aplicaciones.

MATERIALES Y REACTIVOS Muestras extradas y purificadas de eucariontes y procariontes Agarosa 1% Buffer de corrimiento Buffer de muestra Bromuro de etidio Agua tridestilada Cmara electrofortica Fuente de poder Micropipetas Lmpara UV Matraz Erlenmeyer de 250mL Recipiente de plstico Placa de vidrio Tubos eppendorf

PROCEDIMIENTO 1.- Preparar el gel de agarosa al 1% 2.- Colocar el peine espaciador a una distancia aproximada de 1cm del borde del gel. 3.- Solidificar unos minutos y retirar el peine. 4.- Colocar el gel en la cmara de electroforesis y adicionar el buffer de corrimiento (fro) hasta tapar por completo el gel. 5.- En una placa preparadora de muestra se adicionar 3L de buffer de muestra y 5L de muestra problema a diferentes diluciones. 6.- Mezclar y adicionar 5L en cada pozo.

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7.- Cerrar la cmara electrofortica haciendo corresponder los polos. Colocar los pozos del lado negativo. 8.- Prender la fuente de poder y colocar el voltaje indicado por el profesor. 9.- Finalizado el corrimiento electrofortico, colocar el gel en un recipiente con bromuro de etidio y agitar suavemente durante aproximadamente 5 minutos. 10.- Colocar el gel en una placa de vidrio para observar bajo la lmpara de UV.

CUESTIONARIO 1.- Cual es la funcin del glicerol utilizado en el buffer de carga? 2.- Investigar las caractersticas y propiedades qumicas del bromuro de etidio 3.- Explica porque se utiliza la luz UV para observar el corrimiento electrofortico de ADN. 4.- Porque se prefiere usar el gel de agarosa para la separacin de ADN en vez de acrilamida? 5.- En base a los resultados obtenidos, que cambios realizaras en el procedimiento de la practica?

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Bibliografa

1.

Cole-Parmer 1999-2000. Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, IL. 1998. Hackett, W.J. y Robbins, G.P. 1982. Manual Tcnico de Seguridad. Representacionas y Servicios de Ingeniera, S.A., Mxico.

2.

3.

The Merk Catalogue. Merk KgaA, Darmstadt, BRD. 1996.

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The Merk Index. 12 . Merk KgaA, Darmstadt, BRD. 1996.

th ed

5.

Short Protocols in Molecular Biology. 4th ed. M. Ausubel F, Brent R, et al. 1999.

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Unidad VI. Estructura Qumica de los cidos Nuclicos

Objetivo

El alumno explicara la estructura y funcin de las molculas de ADN y ARN, para comprender la transmisin de la herencia en los seres vivos, cumpliendo as con el objetivo de la unidad.