Southern blotting

Aun cuando proceden de distintas clulas, monohebras de ADN con secuencias complementarias se asocian para construir una doble hlice al ponerlas en contacto en un medio determinado. Lo mismo ocurre entre cadenas de ADN y ARN cuando tienen la complementariedad necesaria como para establecerse apareamientos estables entre las bases nitrogenadas de amabas hebras. Este fenmeno es utilizado para reconocer la presencia de determinado ordenamiento de bases en una muestra de cido nucleico, en el que debe de disponerse un trozo de ADN de secuencia complementaria con la investigacin. Un procedimiento en el cual se utilizan sondas en el llamado Southern blotting (Southern: nombre del mtodo, blotting: transferencia de un lugar a otro) El ADN de la muestra es seccionado por una endonucleasa de restriccin; los fragmentos son separados por electroforesis en gel de agarosa, que despus se sumerge en una en una solucin alcalina para desnaturalizar los dobles enlaces de ADN. Luego, el ADN es trasferido a otro medio ms fcil de efectuar las manipulaciones, por lo que se coloca en una cubeta varias capas de papel absorbente empapado en una solucin salina. Encima de este papel se dispone el bolque de gel que contiene el ADN separado y sobre l se aplica una lmina de nitrocelulosa. Finalmente se colocan varias capas de papel absorbente seco. La solucin asciende por capilaridad desde el papel absorbente inferior hacia el gel, y alcanza el filtro de nitrocelulosa y el papel absorbente superior. El ascenso del lquido arrastra el AND estacionado en el gel, que es retenido por el filtro, obtenindose una rplica del gel. Se reir la lmina de nitrocelulosa y se la calienta en una estufa para fijar el ADN. En el filtro se detecta la presencia de ADN de secuencia determinada, utilizando un segmento complementario marcado con P que sirve de sonda. Si se pone en contacto el filtro de nitrocelulosa con una solucin de la sonda, sta hibridara en los sitios donde exista ADN de secuencia complementaria. Se forman dobles hlices adheridos al filtro y el ADN excedente se elimina por lavado. Sobre el filtro se coloca una pelcula fotogrfica sensible en el que aparecern las bandas correspondientes a los segmentos en los cuales se ha producido hibridacin con la sonda radiactiva.

Amplificacin de secuencia de ADN

Reaccin en cadena de la polimerasa
Analizar un trozo de ADN que representa una porcin nfima dentro de una muestra dada puede frustrar la investigacin, es por esto que es necesario recurrir a mtodos que permitan amplificar

los mtodos tales como el clonado y la reaccin en cadena de la polimerasa. La ltima, permite multiplicar a voluntad un segmento dado de ADN en una muestra. Para aplicar este mtodo es necesario conocer las secuencias que flanquean el tramo de ADN por reproducir y sintetizar oligonucletidos complementarios con una de las hebras de ADN (quienes actuaran como iniciadores) en la proximidad del segmento que interesa. Primero se calienta el ADN de la muestra hasta su total desnaturalizacin en presencia de los oligonucletidos iniciadores. Al enfriarse, estos se aparean con los sectores complementarios de cada una de las hebras, sealando el sitio de comienzo de la replicacin. Se agrega a la mezcla de ADN polimerasa y desoxirribonucleotidos trifosfato para comenzar el ensamble de una nueva cadena a partir del extremo 3 de los iniciadores. Al finalizar esta etapa, se ha duplicado el segmento de ADN. Se inicia entonces un segundo ciclo, calentando la mezcla a fin de separar las dobles hlices formadas. Como en el medio existe un exceso de oligonucletidos iniciadores, los extremos complementarios de las monohebras se aparean con ellos y la polimerasa reanuda la elongacin hasta completar las cadenas. Ahora se ha cuadruplicado la cantidad inicial de los trozos de ADN seleccionado. El calentamiento necesario para desnaturalizar el ADN inactiva la mayora de las polimerasas obligando a reponer la enzima despus de cada etapa. Para evitar esto, se usa ADN polimerasa aislada de la bacteria termfila Thermus aquaticus, resistente a las temperaturas empleadas. Como los oligonucletidos iniciadores, solo se aparean a los extremos de determinado sector del ADN, es este el que resulta duplicando en cada ciclo y su cantidad en la mezcla va creciendo en progresin. Despus de unos 25 ciclos se produce una multiplicacin de ms de un milln de veces y la casi totalidad del ADN en la preparacin corresponde al segmento inicialmente elegido.

Aplicacin de tcnicas de ADN recombinante

Produccin de protenas de uso teraputico: la introduccin de bacterias de informacin gentica para elaborar protenas humanas tiene un importante desarrollo industrial. Se produce en cantidad protenas de uso teraputico, ejemplo insulina, etc. Produccin de vacunas: tradicionalmente las vacunas se elaboraban con agentes infecciosos muertos, en la actualidad se obtienen antgenos por tecinas de ADN recombinante, este elimina los riesgos de las anteriores vacunas, porque permite suministrar solo la protena antignica libre de agente infeccioso. Terapia gentica: la introduccin de genes normales en clulas con genes defectuosos es hoy posible gracias a la tcnica de ADN recombinante. Hay nuevas perspectivas para alteraciones genticas que no tenan soluciones. La transferencia de genes a clulas somticas corrige el defecto sobre el tejido tratado, las clulas germinales no son modificadas. Si bien eventualmente

podra alcanzarse la curacin clnica el individuo sigue transmitiendo la alteracin a descendencia.

su

La manipulacin gentica con clulas germinales humanas plantea riesgos y serios problemas de carcter tico, actualmente no es permitida por los organismos oficiales supervisores de la investigacin cientfica de muchos pases.