CALMODULINA E ATP-ase DO CLCIO Carlota Saldanha Instituto de Bioqumica da Faculdade de Medicina de Lisboa

RESUMO O processo de contraco do msculo esqueltico inicia-se com a libertao de clcio existente no retculo sarcoplsmico despolarizado, aps excitao nervosa. Os ies clcio ligam-se troponina C e as alteraes conformacionais ocorridas no complexo resultante transmitem-se s molculas de tropomiosina e actina, possibilitando a interaco actina-miosina conducente contraco muscular. O relaxamento muscular ocorre por repolarizao da membrana do retculo sarcoplsmico, acompanhada de influxo de Ca2+ mediado pela bomba de Ca2+ (actividade ATPase). A calmodulina (CaM) uma protena receptora de Ca2+ para o qual possui alta afinidade (Kd 10-6M) e especificidade, que intervm na contraco e relaxamento musculares de modos directo e indirecto, respectivamente. O primeiro processo refere-se interaco miosina-actina, que facilitada pela fosforilao das cadeias leves de miosina na presena da protena-cinase (da cadeia leve da miosina) dependente de Ca2+ e calmodulina. A fosforilao da cadeia leve da miosina (extremidade globular) induz alteraes conformacionais nesta ("cabea"), favorveis ligao com a actina. A aco indirecta da calmodulina manifesta-se pela calsequestrina (protena da membrana interna do retculo sarcoplsmico) que apresenta propriedades de protena-cinase dependente da calmodulina, e est envolvida na regulao da actividade enzimtica da ATPase Ca2+Mg2+. As alteraes conformacionais existentes na ATPase Ca2+Mg2+ (que ocorrem na interconverso da enzima entre dois estados) e nas protenas tropomiosina e actina, esto associadas s funes biolgicas de relaxamento e contraco musculares.

Palavras-chave: Conformao proteica, calmodulina, calsequestrina, ATPase Ca2+Mg2+, fosforilao

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ABERTURA DOS CANAIS DE CLCIO POR ESTIMULAO NERVOSA A propagao do impulso nervoso na placa motora induz despolarizao na membrana externa da fibra muscular. A passagem do potencial de aco resultante para o interior da fibra muscular mediada pelos tbulos T que transmitem um sinal A cisterna terminal, com consequente abertura dos canais de Ca e sada do io para o espao mioplsmico (ou sarcoplasma). Eizenberg (1) confirmou o mecanismo molecular explicativo da natureza do sinal proposto por Fransini-Armstrong e Nunzi (2) e Shneider e Chandler (3), que consiste na induo de alteraes conformacionais numa enzima localizada na cisterna terminal com prolongamento pelo tbulo T, (protena juncional) pelos factores variao do potencial de membrana e movimento de carga ocorrentes na membrana do tbulo T (Fig. 1). O produto resultante da aco cataltica da enzima um efector actuante nos canais de sada de clcio, situados na cisterna terminal.

FIGURA 1 a) Esquema estrutural de junes intracelulares constitudas entre regies de cisterna terminal do retculo sarcoplsmico que ladeiam um tbulo transverso T no msculo esqueltico. b) Ampliao de uma juno celular: aquando da despolarizao do tbulo transverso T ocorrem alteraes conformacionais nos receptores localizados na membrana deste as quais so transmitidas protena funcional com subsequente abertura dos canais de clcio.

Outros mecanismos tm sido sugeridos, baseados no aumento da concentrao de Ca2+citoplsmico como indutor da abertura dos canais (4). ACO BIOLGICA DO Ca2+ INTRACELULAR

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O aumento da concentrao, de clcio no sarcoplasma esta associado A contraco muscular por estimulao de processes sequenciais, que envolvem (i) interaces do io clcio com molculas de troponina C com consequente alterao conformacional desta protena, (ii) que transmitida s molculas de tropomiosina e actina, (iii) facilitando a posterior ligao actina da molcula de miosina (com actividade ATPsica), e inicio de contraco muscular (Fig. 2). Segue-se o relaxamento muscular, por repolarizao da membrana do retculo sarcoplsmico e reposio dos nveis de Ca2+ no interior da cisterna terminal, custa de um processo activo mediado pela bomba de clcio do retculo sarcoplsmico (caracterizado por actividade ATPsica). Adicionalmente, a calsequestrina localizada na membrana externa do lmen da cisterna terminal contribui para a manuteno dos nveis normais de clcio dentro do retculo sarcoplsmico.

FIGURA 2 O processo de contraco do msculo esqueltico induzido por estimulao nervosa consiste no movimento dos filamentos finos (I) e grossos (A) resultante da ocorrncia de alteraes conformacionais das protenas (miosina, actina, tropomiosina e troponina) induzidas pelo io clcio.

O processo bioqumico de contraco/relaxamento musculares requer a participao do io clcio nas etapas de transporte passivo (canais de Ca2+) e activo (ATPase Ca2+) e da interaco com as protenas troponina e calsequestrina. O io clcio intracelular ocorre em baixas concentraes (10-7 M a 10-8 M) e apresenta propriedades atmicas (raio inico e nmero de coordenao) que contribuem para o exerccio

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da funo biolgica de segundo mensageiro com caractersticas de universal, mercurial, sincrnico e cominatrio (5). A concentrao de clcio intracelular pode ser alterada em alguns tecidos por um processo dependente da renovao metab1ica dos fosfoacilinositois, que so desdobrados pela aco da fosfolipase C em inositol trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DG) (6). O IP3 induz a mobilizao do Ca2+ dos organelos intracelulares para o citoplasma e estimula as protenascinases dependentes da calmodulina; o diacilglicerol activa a protena-cinase C (6). Assim, as protenas cinases activadas intervm em reaces de fosforilao de protenas intracelulares que consequentemente participam nos processes conducentes resposta celular - imediata (dependente de IP3) e/ou sustida (dependente do DG) - ao estmulo inicial. O grau de fosforilao das cadeias leves de miosina aumenta proporcionalmente frequncia de contraco do msculo esqueltico (7). No entanto, h discordncia quanto ao envolvimento do inositol-trifosfato na regulao da contraco do msculo esqueltico (8, 9, 10). Meyer (11) sugeriu que o io clcio, para exercer a aco de segundo mensageiro, necessita da presena de protenas ligantes. A primeira calciprotena a ser descoberta foi a troponina C (12), seguida da calmodulina, cuja origem e composio da palavra esto ligadas a Sheung e Kakinchi (13). CARACTERIZAO DA MOLCULA DE CALMODULINA A calmodulina (CaM) regula a concentrao intracelular do clcio em vrios tecidos e medeia mltiplas funes do io actuando em enzimas-chave de sistemas de transporte e sequncias metab1icas (protena-cinases e fosfatases) (14-17). O Quadro 1 apresenta exemplos de c1ulas e/ou tecidos onde se localiza e actua a calmodulina (5, 16, 17). QUADRO 1 EXEMPLOS DE CALMODULINA ALGUNS PROCESSOS BIOLOGICOS MEDIADOS PELA

________________________________________________________________ LOCALIZAO PROCESSOS BIOLOGICOS ________________________________________________________________ Membranas ps-sinpticas Espermatozides Clulas epiteliais do intestino Libertao de neurotransmissores Fertilizao do vulo Contractilidade muscular Metabolismo do glicognio Fgado Metabolismo do glicognio Pncreas Secreo da insulina Corao, Crebro Metabolismo dos nucletidos Cromossomas Mitose-polimerizao e despolimerizao dos microtbulos ________________________________________________________________ A calmodulina apresenta caractersticas acdias, estrutura terciria (18) com quatro locais de ligao ao clcio (19), cujo preenchimento pode ser parcial e/ou total (5) (Fig. 3).

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FIGURA 3 Representao esquemtica do preenchimento dos quatro locais de ligao existentes na molcula monomrica de calmodulina (CaM) pelos ies clcio e consequentemente alterao conformacional para a forma de monmero activo (Ca CaM).

Apesar do elevado nmero de estudos experimentais efectuados, para esclarecer o processo de ligao clcio/calmodulina, mantm-se a controvrsia entre dois modelos que propem a existncia na molcula de calmodulina de quatro centros de ligao, com afinidade semelhantes ou dois pares de centros com afinidade distinta. Os resultados obtidos com ensaios microcalorimtricos (20) e de antagonismo Ca2+/H+ (21) apontam a presena de quatro centros de ligao independentes na calmodulina, com valores de constantes de afinidade semelhantes para o clcio. Pelo contrrio, a interpretao dos dados obtidos com estudos de ressonncia magntica nuclear (22) e de cintica rpida (23), suporta o modelo de dois pares de locais de ligao orientados nas extremidades amina e carboxilo que apresentam relativamente ao clcio valores distintos de constantes de afinidade. A calmodulina tem outros seis centros de ligao passveis de serem ocupados por outro io que eventualmente module a ligao Ca2+/calmodulina (24). A ligao do io calmodulina induz nesta alteraes conformacionais traduzidas pelo aumento do contedo da estrutura , h1ice e maior exposio superfcie de segmentos hidrofbicos, os quais constituem zonas de ligao a protenas-alvo (5). Contudo, estas so activadas pela calmodulina se, pelo menos, trs centros de ligao estiverem ocupados pelo io clcio (24). A ligao entre o complexo Ca2+ calmodulina e as enzimas-alvo pode ser inibida por uma variedade de compostos exgenos de natureza hidrofbica (fenotiazinas (25), naftalenosulfonamidas (26), antagonistas do clcio (27) e macromolculas endgenas (protenas de baixo peso molecular (28) e polipptidos (29). As protenas-alvo que so activadas pela calmodulina no apresentam domnios especficos comuns para a ligao; podem ser classificados com base nos locais de ligao existentes na molcula de calmodulina que intervm no processo (30). Assim, existem trs

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classes consoante so activadas (i) pelo fragmento C-terminal e pelo complexo CAPPcalmodulina (calmodulina covalentemente ligada a um derivado de fenotiazina), (ii) pelo complexo CAPP-calmodulina e interaco sem activao pela extremidade C-terminal, (iii) por ligao a dois locais que no so os referidos (30). A utilizao de efectores em estudos experimentais contribui para o conhecimento do mecanismo molecular de contraco muscular, em geral, e em particular da aco exercida pela molcula de calmodulina. At data, no que respeita aos tbulos T do msculo esqueltico, no foi identificada nenhuma protena de caractersticas semelhantes calmodulina em associao com o canal de clcio. Hidalge e colaboradores (31) isolaram e caracterizaram a partir de preparaes de tbulos T de msculo esqueltico de coelho uma protena que apresenta propriedades similares s reveladas pela Ca2+-Mg2+-ATPase associada bomba de clcio, isto , estimulada e inibida, respectivamente, pela calmodulina e ortovanadato. Meissner (32) e Plank e col (33) demonstraram in vitro que adies de calmodulina exgena a preparaes de vesculas da cisterna terminal do tbulo T regulam a libertao de clcio pelos canais de clcio. Assim, Meissner (32) sugere que a represso de sada de clcio exercida pela calmodulina impede a remoo total do io do espao mioplsmico durante a actividade muscular prolongada. No entanto no controverso que a nvel de cadeia leve de miosina (MLC) 1 a fosforilao que ocorre na zona designada por "cabea", depende da presena do complexo Cacalmodulina (Ca-CaM) (Fig. 4). A ligao entre a cinase de cadeia leve da miosina (MLCK)1 (protena-alvo) e o complexo Ca-CaM conduz ao aparecimento de alteraes conformacionais nas molculas de calmodulina e de MLCK (34) e o grupo de Tokunaga (35) localizou recentemente na molcula de miosina a disposio tridimensional dos locais de ligao para as molculas de actina e ATP e Ca-CaM.

FIGURA 4 Esquema da fosforilao da cadeia leve da molcula de miosina (MLC) (zona globular A) que apresenta actividade hidroltica (ATPasica) e Ca2+ e calmodulina (CaM) dependente.

Siglas de nomenclatura anglo saxnica

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CARACTERIZAO DA ENZIMA Ca2+ ATPase NO RETCULO SARCOPLSMICO A membrana do msculo esqueltico dos tbulos transversos no contm Ca2+ ATPase dependente de calmodulina (36). No que respeita membrana do retculo sarcoplsmico (RS), os resultados dos estudos efectuados com inibidores de calmodulina sugerem que a fosforilao da ATPase Ca2+ no influenciada directamente pela calmodulina (5). A actividade cinase da calsequestrina, estimulada pela calmodulina, est envolvida na regulao da Ca2+ ATPase (aco indirecta da calmodulina) (37). A ATPase Ca2+ do RS pode existir nas formas mono (PM 110.000) e dimrica, prevalecendo a ocorrncia de dmeros na presena de agente quelante do io clcio (38). A estrutura proposta para a enzima descrita por um modelo sequencial que consiste em trs domnios que correspondem, nomeadamente, aos locais de fosforilao, ligao ao clcio e zona transmembrana (39, 40). Este modelo permite explicar o "ciclo" de reaces que ocorrem na translocao do io clcio do sarcoplasma para o lmen por cada mole de ATP hidrolisado, (Fig. 5).

Figura 5 Esquema em "ciclo" da reaco hidroltica catalisada pela enzima Ca2+ ATPase (40; 41). A ligao do io Ca2+ enzima (E), facilita a ocorrncia de fosforilao pelo ATP da enzima (na subcamada da membrana voltada para o citoplasma) (E1 P.Ca2+). Subsequentemente a libertao do io clcio no lmen ocorre por converso da enzima forma E2 P.Ca2+. Posteriormente h hidrlise de fosfoenzima originando a forma E2 a que se segue isomerizao para a forma E1. No processo de transduco de energia, a enzima adopta dois estados conformacionais, El e E2. O primeiro tem dois centros de alta afinidade para o io clcio, situados na face citoplsmica da membrana do retculo sarcoplsmico, e o segundo apresenta dois locais de menor afinidade situados no lmen. A translocao do io clcio dos centros de maior para os de menor afinidade ocorre em simultneo com os processes de fosforilao e alterao conformacional, que so acompanhados por movimentos estruturais no domnio de ligao ao clcio (rotao nas h1ices) (42). A cedncia do io clcio pela forma E2 rpida e favorecida pela presena dos ies amnio. O proteolpido acdico, fosfolambano, existe na membrana do retculo sarcoplsmico em igual proporo estequiomtrica da Ca2+ ATPase e um efector da enzima (43). A forma

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fosforilada do fosfolambano induz alteraes conformacionais na enzima, activa a hidrlise do ATP e a translocao do io clcio a ela associado (44). A diminuio de concentrao do io clcio no sarcoplasma, resultante da aco da Ca2+ ATPase, induz a dissociao entre o io e as molculas de troponina C, ocasionando o relaxamento. Assim, a energia na forma de ATP necessria nos processos de contraco e relaxamento muscular. SUMMARY Releasing of calcium ions from the sarcoplasmic reticulum after nervous stimulation initiates the process of skeletal muscle contraction. Calcium ions bind to troponin C and conformational alterations occur in the resulting complexes that are transmitted to tropomyosin and actin molecules, leading to muscle contraction. Relaxation occurs after repolarization of the sarcoplasmic reticulum membrane, and is accompanied by calcium influx, which is mediated by the calcium pump (ATPase activity). Calmodulin is a calcium binding protein with great affinity (kd 10-6 M) and specificity. It is involved in muscle contraction and relaxation respectively in a direct and indirect way. The former process is related to myosin-action interaction, which is facilitated by myosin light-chain phosphorilation in the presence of a calcium-dependent myosin light chain protein kinase and calmodulin. Phosphorylation of myosin light chain (globular extremity) induces conformational alterations on this "head", which favour its binding to actin. The indirect action of calmodulin is manifested by calsequestrin (a protein of the inner membrane of sarcoplasmic reticulum), which presents calmodulin dependent protein kinase properties and is involve in the regulation of Ca2+ Mg2+ ATP enzymatic activity. The conformational alterations in Ca2+ Mg2+ ATPase (occurring in the interconversion between the two states of the enzyme) and in the proteins tropomyosin and actin proteins are related to the biologic function of relaxation and muscle contraction. BIBLIOGRAFIA 1 - EISENBERG R.S. Membranes, calcium and coupling. Can. J. of Phys. and Pharmacol.65:656690,1987. 2 - FRANZINI-ARMSTRONG C. and NUNZI G. Junctional feet and particles in the triads of a fast twitch muscle fibre. J. Muscle Res. Cell Motil. 4:233-252,1983. 3 - SCHNEIDER M.F. and CHANDLER W.K. Voltage dependent charge movement in skeletal muscle: a possible step in excitation contraction coupling. Nature 242:244-246,1973 4 - FABIATO A. Simulated calcium current can both cause calcium loading in a trigger calcium release from the sarcoplasmic reticulum of a skinned canine cardiac Purkinje cell. J. Gen. Physiol. 85:291-321,1985. 5- STOCLET J.C., GERARD D., KILHOFFER M.C., LUGNIER C., MILLER R. and SCHAEFFER P. Calmodulin and its role in intracellular calcium regulation. Prog. in Neurob. 29:321-364,1987. 6 - RASMUSSEN H. The calcium messenger system. N. Engl. J. of Medicine 314:1094-1101,1986. 7 - BARSOTTI R.J. and BUTLER T.M. Chemical energy usage and myosin light chain phosphorylation in nammalion skeletal muscle. J. Muscle Res. Cell Motil. 5:45-64,1984.

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