Enzimologia 2012/2013 Licenciatura em Bioqumica/FCUL Docentes: Ana Ponces Freire e Marta Sousa Silva Discentes: Alexandra Salvado (40267)

e Andreia Sousa (40261) Departamento de Qumica e Bioqumica Data: 20 de Novembro de 2012

Structure-guided alteration of coenzyme specificity of formate dehydrogenase by saturation mutagenesis to enable efficient utilization of NADP+
Aggeliki Andreali,Dimitris Platis, Vlamidir Tishkov, Vladimir Popov and Nikolaos E. Labrou Introduo O estudo dos autores debruou-se sobre o enzima formato desidrogenase de Candida boidinii (CboFDH), que catalisa a reaco de oxidao do anio formato a dixido de carbono com a reduo simultnea de NAD+ a NADH. Este enzima abundante, desempenha um papel importante no fornecimento de energia aos microrganismos metilotrficos e apresenta como principal potencial biolgico a regenerao de NADH. Do mesmo modo que o NADH, o NADPH (outro cofactor) apresenta tambm custos elevados e no existem formato desidrogenases dependentes de NADP+, pelo que o principal objectivo dos autores passou por alterar a especificidade do enzima em relao ao coenzima (de NAD+ para NADP+), de modo a reduzir os custos. Para reduzir os custos da utilizao deste cofactor, outro dos objectivos passou por criar um sistema de reciclagem para o NADPH, onde o NADP+ ser convertido a NADPH por um enzima com o intuito de gerar um produto comercial e, simultaneamente, regenerado por outro desidrogenase usando NADPH como coenzima.

Procedimento, Resultados e Discusso De modo a alterar a especificidade do enzima os autores utilizaram a tcnica de mutagnese de saturao, criando uma biblioteca de mutantes que contm todas as mutaes possveis numa ou mais posio alvo e, para identificar quais os resduos responsveis pela alta especificidade de CboFDH para o NAD+, alinharam a sua sequncia com sequncias de FDH de outros organismos. Os resultados obtidos mostraram que as posies responsveis por esta especificidade eram a 195 (Asp) e 196 (Tyr), pelo que foi realizada outra mutagnese, recorrendo tcnica de PCR-overlap), onde foram seleccionados os clones recombinantes que apresentaram maior razo NADP+/NAD+. Na posio 195 foram seleccionados 4 clones com essa razo mais elevada, em que o resduo de Asp foi substitudo por Ser, Ala, Gln e Asn. Procedeu-se ento purificao da WT e dos mutantes para a anlise cintica, onde se variou as concentraes dos substratos. Atravs da anlise dos resultados, observou-se que a WT apresenta uma clara preferncia para o NAD+ como coenzima, uma vez que apresenta um baixo Km (alta afinidade) e um elevado Kcat para o NAD+ e um alto km (baixa afinidade) e um baixo Kcat para o NADP+. Dos mutantes com maior actividade, o escolhido para a segunda ronda de mutagnese foi o Asp195Gln uma vez que o que apresenta a conjugao de menores valores de Km e maiores valores de kcat e um dos que apresenta maior atividade para o NADP+ em relao WT. Pela primeira ronda de mutagnese, os autores concluram que quanto maior a hidrofobicidade do aminocido maior o km para o NADP+, ou seja, menor a afinidade do enzima para este coenzima. Na posio 196 foram tambm seleccionados 4 clones que apresentavam maior actividade especfica para o NADP+. Neste caso, o resduo de tirosina foi substitudo por Ser (em dois mutantes), Pro e His. Tal como no caso da mutao na posio 195, procedeu-se purificao da estirpe selvagem (WT) e das estirpes mutantes e sua anlise cintica. Diferentemente ao caso Pgina 1 de 2

anterior, para esta posio foi seleccionado e sequenciado um clone com baixa actividade, que serviu como controlo negativo. A anlise da sequncia mostrou que neste clone a tirosina na posio 196 foi substituda por isoleucina. No entanto, este mutante no foi estudado pelos autores. Dos resultados obtidos, o mutante seleccionado foi Asp195Gln/Tyr196His pois apresentou maior afinidade (menor Km) e maior actividade cataltica com NADP+ como coenzima. Os autores acreditam que tal acontece uma vez que a cadeia lateral de histidina apresenta menos impedimento estereoqumico na ligao ao coenzima, e, provavelmente, interactua com o anel aromtico de adenina. Posteriormente, os autores estudaram a influncia do pH na velocidade limite para definir as propriedades cido-base do duplo mutante (Asp195Gln/Tyr196His) e identificar grupos funcionais especficos do enzima na reaco cataltica. O perfil de pH vs V mostrou dois pontos de inflexo a pKa = 5,90,1 e a pKa = 8,20,1, que foram comparados com o perfil de pH vs V da WT. Esta, apresentava tambm dois pontos de inflexo: pKa = 5,950,2 e pKa = 10,160,2. O primeiro pKa na gama de pH cido, sugeria que o centro activo constitudo por um grupo carboxilo ionizvel, que desempenha um papel importante na orientao correcta e polarizao do NAD+. Este pKa na zona acdica foi atribudo ao resduo de Asp na posio 282, que no afecta o enzima do duplo mutante uma vez que a sua posio est longe da posio que se encontra em estudo (195 e 196). Para a posio 196, os autores acreditam que o pKa = 10,16, que foi observada no enzima do tipo selvagem tem uma origem conformacional e tem sido atribudo a um evento cooperativo, o que leva a uma reorganizao da protena. A mudana deste pKa que foi observado na enzima do duplo mutante, Asp195Gln/Tyr196His (pKa = 8,2 0,1), provavelmente indica que as alteraes conformacionais da protena ocorrem prximo desta regio da protena ou, em alternativa, que esta regio tem um papel importante na reorganizao estrutural da protena durante a catlise. Infelizmente, no existe uma estrutura cristalina disponvel da enzima FDH dependente de NAD+ para permitir que as alteraes de conformao sejam precisamente atribudas a partes especficas da estrutura da protena. Por ltimo, para garantir que o duplo mutante podia ser utilizado na regenerao do NADPH, montou-se um sistema reaccional com citocromo p450, uma vez que este necessita constante fornecimento de NADPH. Como o P450 tem funo de monoxigenase oxida o 12-pNCA (cido (p-nitrofenil)dodecanico) a p-nitrofenolato, sendo que a formao deste produto pode ser seguida espectrofotometricamente a 410nm. Para garantir que o NADPH obtido exclusivamente da actividade do FDH mutante, no foi adicionado NADPH mistura reaccional. Atravs da observao dos resultados obtidos, ocorre um aumento da concentrao de p-nitrofenolato ao longo do tempo, o que significa que o sistema de reciclagem empregue era funcional, uma vez que para o citocromo oxidar o 12-pNCA necessita do NADPH, que apenas fornecido pelo enzima mutado. Os autores obtiveram um Kobs=0,0590,004 min-1 e, aps 40 minutos de reaco, obtevese um rendimento de 20%. Dado o baixo rendimento, os autores sugerem que necessrio uma investigao mais aprofundada sobre as condies ptimas do enzima.

Concluses Os autores chegaram concluso que a base molecular da especificidade do coenzima permanece uma questo de interesse fundamental em enzimologia uma vez que no existe uma abordagem universal para mudar a especificidade do coenzima em desidrogenases e que a estratgia experimental depende fortemente das caractersticas particulares do centro activo de cada enzima individual. No entanto, nesta actividade, o redesenho da especificidade do coenzima de CboFDH mostrouse muito eficaz e apesar do mutante exibir maior Km para o NADP+ e formato, apresenta os melhores requisitos para a regenerao do NADPH: baixo custo e disponibilidade elevada; a reao catalisada pelo enzima irreversvel (grande obteno de produto); fcil obteno e remoo do produto e grande actividade cataltica num largo intervalo de pH.

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