ADN Sdico de origen Vegetal. INCI Name: SODIUM DNA. DNA. (source: wheat germ).

Identificacin: Mediante la reaccin de Dishe (difenilamina en medio cido: AcH/S04H2) produccin de color azul al calentar en BM : presencia de desoxirribosa como nucletidos concatenados (reacciona cada vez que halla dos purinas adyacentes). Para un volumen final de reaccin de 3 ml (1ml de muestra y 2 ml de reactivo) la sensibilidad para un ADN vegetal es por lo menos de 0,5 mg. Cuantificacin: Mtodo de Dische El Mtodo de Dishe se puede utilizar para cuantificar exactamente si solo se comparan ADNs de igual origen, mismo grado de pureza y misma forma de preparacin. Sin embargo puede dar una buena idea de homogeneidad de partidas, y actividad frentre a muestras de distinto origen. Es una tcnica sencilla al alcance de cualquier laboratorio de control de calidad. a-Muestra (ADN Na vegetal.Biogel 2%): diluir con agua destilada 1/10. b-Blanco: agua destilada. Reactivo de trabajo (Dishe): En el momento de realizar la medicin mezlar en el siguiente orden, todos p.a. 1-100 ml de Acido Actico Glaciar. 2-2,75ml de Acido Sulfrico. 3- 1 gramo de Difenilamina base. (la droga pura es blanca) La solucin es incolora o muy ligeramente amarilla. Distintas partidas de AcH o distintas marcas, dan distintas coeficientes de absorbancia/gramo y diferentes color de blanco (Burton). Manejar con cuidado. Usar propipeta. Utilizar un patron tratado de la misma forma que la muestra con una dilucion adecuada a la concentracin. Blanco Muestra Patron

Agua destilada

2 ml

--------2 ml 5 ml

-------2 ml 5 ml

ADN Biogel 1 o 0,5 % --Reactivo de Dishe 5 ml

Vortexear inmediatamente al agregado del reactivo.

Llevar a BM hirviente durante 10 minutos. Dejar enfrar. Leer a 600 nm, llevando a cero con el blanco, usando cubeta de cuarzo de 1 cm de paso. Comparar Patron frente a la Muestra. En la literatura no hallamos validaciones actualizadas, nuestra experiencia nos indica: Error intra ensayo: Menor del 5%. Error inter ensayo: Alrededor de 20 %. Literatura: Dische, Z (1930). Mikrochemie, 8,4. Burton et Al (1956). Bioch. 62, 315. En esta cita se indican las interferencias que aumentan o disminuyen el color en la reaccin. Methods in Enzimology: Vol III. pp 680. Metodologas ms modernas, aunque ms complicadas para identificar ADN y cuantificarlo se encuentran en: Molecular Cloning. Second Edition. E.5 Ethidium Bromide fluorescent Quantitation of the Amount of Double stranded DNA. Los mtodos espectroscpicos en el producto final, si bien permiten a diluciones adecuadas (1/20) observar el pico a 260 nm caracterstico, es de destacar que los conservadores empleados pueden interferir en el clculo de la relacin 260/280. Viscosidad: Mtodo Brookfield: Rango aceptado 50-1000 cps (Pin 2 25C 30 RPM).

El producto tiene un perodo de uso util de por lo menos un ao a partir de la fecha de fabricacin. Tcnica para deteccin y verificacin rpida de la presencia de ADN de alta polimerizacin en el producto. Reactivos: alcohol etlico 96. 1) Colocar en una probeta de 500 ml, 300 ml de alcohol etlico 96. Arrojar en forma decidida, sin salpicar sobre el acohol, 100 ml del ADNNa Biogel 2%. No mover. No agitar.

2) Se observar que el ADN de alta polimerizacin comienza a desprenderse desde el fondo y se dirije hacia la superficie del lquido. No mover. No agitar. Dejar reposar 3 horas como mnimo. Lo ideal son 24 horas.

3)

Se formar una fibra algodonosa, blanca que se desprende de una masa algo amarillenta desde el fondo. Sobre este material (secado por exprimido, nunca bajo estufa) se puede realizar, previa disolucin en agua destilada: (es lenta, dejar 24 horas hidratar) a) Identificacin de Desoxirribosa: Mtodo de Dishe. (color azul). b) Espectrofotometra y Relacin 260/280. c) Medir protenas (Lowry).

4) Volcal el lquido remanente en la probeta sobre otra probeta vaca y limpia de 500 ml. Se ver que se recupera an ms ADN de este material (este material contiene ADN de ms bajo peso molecular). Dejar reposar si es posible 24 horas. El ADN que se desprende puede analizarse de la misma forma. El ADN muy fragmentado es un polvillo que enturbia la solucin.