Experiencia N 1 EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO

Objetivo: Determinar el Km experimental de la pepsina (E) para la albmina (S) , a partir de una grfica de vi contra [S] (ecuacin de Michaelis-Menten) y/o en una grfica de dobles recprocas 1/vi contra 1/[S] (ecuacin de Lineweaver-Burk). Materiales: 1. Gradillas y tubos de ensayo

2. Pipetas de vidrio

3. Espectrofotmetro

4. Bao Mara 37C

5. Solucin de albumina 50 mg%

6. Solucin de pepsina 0.5 %

7. HCl 1N

8. Agua destilada

Procedimiento: Proceder con la preparacin de la siguiente batera de 8 tubos indicada a continuacin.

Tubos N ml agua destilada ml HCL 1N ml albumina ml pepsina

1 8 0,5 1 -

2 7 0,5 2 -

3 6 0,5 3 -

4 5 0,5 4 -

5 4 0,5 5 -

6 3 0,5 6 -

7 2 0,5 7 -

8 5

Leer los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 en el espectrofotmetro y considerar dichas lecturas (absorbancias) como Lectura Inicial. Seguidamente, incubar los ocho tubos a 37C por 5 minutos. Luego, medir 0.5 mL de pepsina del tubo 8 y aadirlo al tubo 1. Mezclar y mantenerlo en incubacin a 37C por 5 min ms. Posteriormente, proceder de la misma manera luego de 1 min ms con el tubo 2 aadindole 0.5 mL de pepsina del tubo 8 y mantenerlo en incubacin a 37C, despus seguir el mismo procedimiento para el tubo 3 y as sucesivamente hasta llegar al ltimo tubo (tubo 7), siempre en incubacin de 37C. Recordar que el tiempo de reaccin para cada tubo es de 5 minutos luego del cual se debe sacar el tubo respectivo del bao mara y llevarlo a leer inmediatamente al espectrofotmetro a 440 nm. Considerar las segundas absorbancias como Lectura Final.

Actividad enzimtica = Lectura inicial Lectura Final

Hacer la diferencia respectiva: ACTIVIDAD ENZIMATICA Mesa 1 Mesa 5 1 0,063 0,069 2 0,109 0,144 3 0,190 0,197 4 0,198 0,317 5 0,218 0,315 6 0,258 0,373 7 0,314 0,163

Clculo de la concentracin de sustrato: Se calculo con la siguiente frmula Tubo N1: Tubo N2: Tubo N3: Tubo N4: Tubo N5: Tubo N6: Tubo N7: : C1V1 = C2V2

50mg% 1ml = [S] 10ml [S] = 5 50mg% 2ml = [S] 10ml [S] = 10 50mg% 3ml = [S] 10ml [S] = 15 50mg% 4ml = [S] 10ml [S] = 20 50mg% 5ml = [S] 10ml [S] = 25 50mg% 6ml = [S] 10ml [S] = 30 50mg% 7ml = [S] 10ml [S] = 35

Grfico Act. Enzimtica vs. [S] mesa 1

Grfico Act. Enzimtica vs. [S] mesa 5

Grfica de dobles recprocas 1/act. Enz. vs. 1/[S]Mesa 1

Grfica de dobles recprocas 1/act. Enz. vs. 1/[S]Mesa 5

Discusin de resultados : Primeramente, con el clculo de la concentracin del sustrato, se not un incremento progresivo de razn 5 con forme aumentaba tambin la cantidad que se aada a los tubos respectivos. Lo que se pudo observar a partir de la experiencia de los compaeros de las mesas 1 y 5 -que realizaron el experimento- es que los datos desde el inicio no coincidieron a pesar de que se trabaj con las mismas concentraciones y datos tericos, razn por la cual podemos aducir que se produjo errores en el pipeteo de las muestras, adems de que seguramente los tiempos de incubacin no fueron exactamente los requeridos para el experimento. Se observa que en el caso de la mesa 1, las absorbancias van incrementndose a medida que la concentracin del sustrato (albmina en este caso) tambin aumenta. Caso contrario ocurri en los datos obtenidos por la mesa 5, en los que se nota un incremento del valor de las segundas absorbancias hasta el tubo 4, luego la lectura del tubo 5 tiene un ligero descenso y vuelve a subir el valor en el tubo 6 hasta que desciende nuevamente en la toma de absorbancia del tubo 7. En este caso, las segundas lecturas (absorbancias) fueron irregulares, incrementando y descendiendo indistintamente.

Conclusiones -Los experimentos realizados se basan en el conocimiento previo de la enzima y su naturaleza principalmente proteica que interviene en reacciones biolgicas acelerando la velocidad de reaccin . -Existen factores que alteran la actividad enzimtica como la concentracin de sustrato o concentracin de enzima los que a medida que estos se incrementan, tambin se da un aumento de la velocidad; tambin est el caso del pH que altera la actividad enzimtica pues, basados en que como la conformacin de las protenas depende, en parte, de sus cargas elctricas, habr un pH en el cual la conformacin ser la ms adecuada para la actividad cataltica (pH ptimo).