INMUNOLOGA BSICA CURSADA 2013 La Inmunologa estudia un sistema sumamente interrelacionado y dinmico, pero la metodologa de estudio por temas,

, obliga a separar contenidos ntimamente relacionados que deben ser finalmente integrados. Es importante considerar esta caracterstica desde el primer da de clases para encarar su estudio intentando incorporar paulatinamente los temas y alcanzar la comprensin global. Nuestro objetivo es que puedan comprender el funcionamiento del Sistema Inmune y utilizarlo como herramienta de decisin en el diagnstico, profilaxis y solucin de problemas de la prctica profesional. En la cursada 2013 hemos decidido abordar los contenidos de Inmunologa Bsica a travs de diferentes metodologas de Trabajos Prcticos: Durante las clases terico-prcticas se analizarn y resolvern preguntas y problemas en forma grupal. El objetivo de estas preguntas es utilizarlas como eje temtico, para que guen al alumno en el estudio de cada tema. Se espera que los alumnos sean capaces de contestar stas u otras preguntas similares despus de haber estudiado el tema. Algunas clases consistirn en la discusin de trabajos cientficos relacionados con los temas tratados durante el curso. Nuestro objetivo es que comprendan la metodologa de trabajo y de investigacin en Inmunologa y que a travs de esta discusin puedan integrar contenidos de la materia. Los trabajos prcticos de laboratorio sern realizados en forma directa por los alumnos y supervisados por los docentes. Los alumnos, formarn grupos de trabajo y presentarn un informe por cada trabajo prctico realizado en el laboratorio. La presente gua de Inmunologa est destinada a facilitar el abordaje de los contenidos que se tratarn en las clases prcticas, por lo que es complementaria y de ninguna manera reemplaza a la bibliografa recomendada. Esperamos que la informacin presentada en esta gua les sea til. Si tienen dudas o dificultades, acerquen sus inquietudes a los docentes participantes del curso y responsables de la redaccin de la presente gua. La Sra. Viviana Chevaga, secretaria del rea, los orientar administrativamente en el horario de 13.30 a 19.30 en forma telefnica (4524-8450) o por mail a inmuno@fvet.uba.ar.

Docentes del curso 2013

Dra. Med. Vet. Silvia L. Mundo Dra. Lic. Silvia Colavecchia MS. Md. Vet. Adriana M. Fontanals Dra. Md. Vet. Ana M. Jar MS.Vet. Ana Jolly Vet. Laura Bass Vet. Brbara Fernndez Med. Vet Liliana Gilardoni Vet. Lucas Goldman MS. Md. Vet. Federico Hoffman Med. Vet. Liliana Ramayo Vet. Pablo Regner Vet. Ana Stempler Med. Vet. Adriana Suraniti Alumna Mara Laura Fortuny Profesora Adjunta a cargo J.T.P. J.T.P. J.T.P. J.T.P. Ayudante de 1era. Ayudante de 1era. Ayudante de 1era. Ayudante de 1era. Ayudante de 1era. Ayudante de 1era. Ayudante de 1era. Ayudante de 1era. Ayudante de 1era. Ayudante de 2da

INDICE
Sistema de evaluacin Condiciones para promocionar Condiciones para regularizar Condiciones para quedar en condicin de asistencia cumplida Bibliografa fundamental Bliografa ampliatoria Programa analtico Conceptos bsicos de bioseguridad Toma de muestras para la evaluacin del sistema inmune Tcnicas de evaluacin de inmunidad innata Complemento Anticuerpos Purificacin y fraccionamiento de anticuerpos Protenas del plasma y suero Electroforesis Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) Introduccin a las tcnicas serolgicas Diliciones Conversin serolgica o seroconversin Sensibilidad y especificidad ELISA RIA (radioinmunoensayo) Inmunoblot Inmunocromatografa Inmunohistoqumica Inmunofluorescencia Citometra de Flujo Tcnicas de interaccin secundaria: precipitacin y aglutinacin Grupos sanguneos Linfoproliferacin Tcnica de seroneutralizacin Inhibicin de la hemoaglutinacin Tcnica de fijacin de complemento 4 4 4 4 5 5 5 8 12 16 23 25 27 36 37 42 48 48 50 52 53 62 63 66 67 69 73 79 90 94 98 104 106

Tcnica de polarizacin fluorescente Citotoxicidad Tcnicas para la deteccin de anticuerpos maternales Inmunoelectroforesis Ejercicos y problemas de aplicacin Gua de Lectura para un trabajo cientfico modelo

109 112 117 120 124 142

El cronograma de las clases se encuentra en el diarito y aparacern en cartelera web. Los das de laboratorio, consulte con su docente dnde y en qu horario debe concurrir. No olvide traer el guardapolvo. REQUISITOS PARA CURSAR REGULARES: Parasitologa Fisiologa Microbiologa APROBADAS: Qumica biolgica Histologa SISTEMA DE EVALUACIN Los alumnos sern evaluados a travs de: a) El desempeo en los trabajos prcticos. b) La aprobacin de los informes de laboratorio. c) Dos parciales obligatorios. CONDICIONES PARA PROMOCIONAR Haber cumplido con el 75% de asistencia a los terico-prcticos. Aprobar todos los informes (de carcter grupal) correspondientes a los trabajos prcticos de laboratorio. Aprobar los parciales con por lo menos el 80% de los contenidos de cada uno. Aprobar un coloquio integrador en fecha a convenir con los alumnos. CONDICIONES PARA REGULARIZAR Haber cumplido con el 75% de asistencia a los terico-prcticos Aprobar todos los informes (de carcter grupal) correspondientes a los trabajos prcticos de laboratorio. Aprobar los parciales con por lo menos el 60% de los contenidos. CONDICIONES PARA QUEDAR EN CONDICIN DE ASISTENCIA CUMPLIDA Haber cumplido con el 75% de asistencia a los terico-prcticos. Aprobar todos los informes (de carcter grupal) correspondientes a los trabajos prcticos de laboratorio. REQUISITOS PARA DAR EL FINAL APROBADAS: Fisiologa. Microbiologa. Parasitologa.

BIBLIOGRAFA FUNDAMENTAL

FAINBOIM, L. y GEFFNER, J. Introduccin a la Inmunologa Humana. 5ta Edic. 2005

editorial Mdica Panamericana. TIZARD, I. Inmunologa Veterinaria. 8Va. Edic. 2009. Editorial Harcourt Grade de Espaa SA. 592PP. Gua de Trabajos Prcticos. rea de Inmunologa. 2010

BIBLIOGRAFA AMPLIATORIA

ABBAS, A; LICHTMAN, A; PILLAI, S. Inmunologa Celular y Molecular, 6ta. Edic. 2008. Editorial Elsevier. DAY M.J. Clinical Immunology of the Dog and Cat 2da. ed., Editorial Blackwell. 2008. MURPHY K., TRAVERS P., WALPORT M. Inmunobiologa de Janeway, 7ma. ed., Editorial Mc Graw Hill. 2010. REGUEIRO GONZALEZ J., LOPEZ LARREA C., GONZALEZ RODRIGUEZ S., MARTINEZ NAVES E. Inmunologa: Biologa y Patologa del Sistema Inmunitario, 4ta. ed., Editorial Panamericana. 2010 ROITT I., inmunologa. Fundamentos, 11va. ed., Editorial Panamericana. 2008. PARSLOW T., STITES D. Inmunologa Bsica y Clnica, 10ma ed., Editorial Manual Moderno. 2005. PROGRAMA ANALTICO

Unidad 1: Mecanismos de Defensa RGANOS Y TEJIDOS LINFOIDES rganos linfticos primarios y secundarios: Estructura. Diferencias en las especies domsticas: Bolsa de Fabricio. Ganglios linfticos en cerdos. Glndulas de Harder. Patrones de migracin celular: molculas asociadas. SISTEMAS INMUNES Barreras naturales: piel y mucosas. Mecanismos humorales: va alternativa del complemento; protenas de fase aguda; interferones. Mecanismos celulares: fagocitosis y lisis. Citotoxicidad natural. Importancia de la respuesta T gama-delta y LB1 en las especies domsticas y de produccin. SISTEMA INMUNE ESPECIFICO Propiedades: especificidad, adaptabilidad y memoria. Organizacin clonal. Molculas de superficie: concepto de receptor. Clulas que reconocen al antgeno en forma especfica: Linfocito B (LB), Linfocito T (LT). FILOGENIA DE LOS MECANISMOS DE DEFENSA ONTOGENIA DE LOS MECANISMOS DE DEFENSA EN LAS ESPECIES DOMESTICAS Y DE PRODUCCIN.

Unidad 2: Inmunoqumica ANTGENOS Antigenicidad e Inmunogenicidad. Estructura fsico-qumica de los antgenos. Haptenos. Carriers. Concepto y tipos de determinantes antignicos. Tipos de Antgenos: propios (de rgano; de grupos sanguneos; de gnero H-Y) y extraos (de patgenos, de tumores, de transplantes). ANTICUERPOS Inmunoglobulinas (Igs) de membrana y secretadas. Estructura fsico-qumica: cadenas pesadas y livianas, dominios constantes y variables. Clases y subclases. Caractersticas de las Igs en las diferentes especies domsticas y de produccin: IgT en equinos, IgY en aves e Igs en camlidos. La Ig como antgeno: isotipo, alotipo e idiotipo. Funciones biolgicas de las diferentes clases de Igs. Distribucin en el organismo. RESULTADO DE LA UNION DEL ANTICUERPO CON EL AG. Neutralizacin. Opsonizacin. Activacin del Complemento. Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). PASAJE DE IGS MATERNO FETAL. Incidencia de los diferentes tipos de placentacin en el pasaje de Igs. de la madre al feto en las especies domsticas. Composicin en Igs. del calostro y leche. Importancia de la ingestin de calostro. Tcnicas de determinacin de la ingestin de calostro. Unidad 3: Molculas de membranas relacionadas con el reconocimiento antignico MADURACION DE LOS LINFOCITOS B Generacin de diversidad de las Igs: Recombinacin somtica, hipermutacin, conversin gnica, diversidad N-Terminal. Mecanismos caractersticos en las diferentes especies. Ontogenia del linfocito B. Exclusin allica, exclusin isotpica. Splicing alternativo. MOLECULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD Molculas de histocompatibilidad clase I y clase II: Estructura. Localizacin. Funcin. Complejo mayor de histocompatibilidad: nomeclatura y herencia. Mapa gentico en las especies domsticas y de produccin. Molculas de histocompatibilidad no clsicas. RECEPTOR ANTIGENICO DEL LT Estructura, molculas asociadas (CD3, CD4, CD8) y otras molculas de adhesin. MADURACION DE LOS LINFOCITOS T Generacin de diversidad de los receptores T. Educacin tmica de los LT. MECANISMOS DE AUTOTOLERANCIA PROCESAMIENTO Y PRESENTACION ANTIGENICA Va endoctica y va biosinttica. Unidad 4: Respuesta Inmune COLABORACIN CELULAR Activacin de los LT, Interleuquinas. Influencia del antgeno y el microambiente en la cooperacin celular: Perfiles Th 1 y Th 2. Colaboracin T-B: Activacin de LB y produccin de Igs: Switch isotpico. Antgenos timodependientes y timo-independientes. Colaboracin T-T: Citotoxicidad ejercida por LT citotxicos. Colaboracin T-Macrfagos: Macrfagos activados. Memoria inmune.

 REGULACIN DE LA RESPUESTA INMUNE Regulacin intrnseca: Efecto de la desaparicin del Ag., Niveles de Igs: retroalimentacin. Regulacin por linfocitos T (Th 3). Regulacin extrnseca: neuroinmunoendocrinologa. Regulacin en sitios privilegiados: ojo, placenta, sistema nervioso central. CINTICA DE LA RESPUESTA INMUNE Respuesta inmune sistmica. Respuesta inmune en mucosas: caractersticas diferenciales en las especies domsticas. Unidad 5: Daos producidos por el Sistema inmune HIPERSENSIBILIDAD TIPO I Alergia. Shock anafilctico: rgano de choque en las diferentes especies. HIPERSENSIBILIDAD TIPO II Daos por anticuerpos en enfermedades autoinmunes y en reacciones alogeneicas. Anemia hemoltica en equinos y cerdos. HIPERSENSIBILIDAD TIPO III Daos por complejos inmunes en enfermedades autoinmunes y en enfermedades infecciosas crnicas. Pimetra en caninos. HIPERSENSIBILIDAD TIPO IV Bases celulares de la hipersensibilidad retardada. Granuloma tuberculoso. Dermatitis por pulgas en caninos. HIPERSENSIBILIDAD TIPO V Anticuerpos anti-receptores. FENMENOS DE AUTOINMUNIDAD Concepto. Ejemplos de enfermedades autoinmunes especficas de rgano y sistmicas. INMUNODEFICIENCIAS Inmunodeficiencias primarias y secundarias. Virus inmunosupresores que afectan las diferentes especies. TRANSPLANTES Mecanismos de rechazo del injerto. RESPUESTA INMUNE A TUMORES Unidad 6: Respuesta Inmune a Patgenos RESPUESTA INMUNE A BACTERIAS, VIRUS, PARSITOS Y HONGOS Antgenos involucrados. Mapeo de epitopes. Ciclo biolgico del patgeno. Inmunidad innata. Inmunidad especfica. Mecanismos de evasin. Consecuencias desfavorables. Unidad 7: Inmunoprofilaxis INMUNOPROFILAXIS PASIVA Ventajas e inconvenientes de su uso. ELABORACIN DE SUEROS HIPERINMUNES Uso de aves en la elaboracin de sueros hiperinmunes. Produccin de anticuerpos por biotecnologa. INMUNOPROFILAXIS ACTIVA Tipos de vacunas. Ventajas e inconvenientes de su uso: Vacunas atenuadas. Vacunas inactivadas.

Vacunas a subunidades. Vacunas a pptidos. Vacunas recombinantes (a vectores). Vacunas deleteadas. Vacunas a DNA desnudo. METODOLOGA DE PREPARACIN DE VACUNAS Proceso de produccin de inmungenos a escala industrial. Requisitos de bioseguridad. Controles durante las diferentes etapas de produccin. Mtodos de inactivacin. Mtodos de atenuacin. Uso de adyuvantes. Aprobacin de vacunas por organismos oficiales. Controles de inocuidad, esterilidad y potencia. ADMINISTRACIN DE VACUNAS Vas de inmunizacin. Esquemas de vacunacin en las diferentes especies animales. Vacunas mixtas. Fracasos de la vacunacin. Reacciones adversa a la vacunacin. Unidad 8: Tcnicas Inmunolgicas de Diagnstico TCNICAS DE IDENTIFICACIN DE IGS. Precipitacin salina. Cromatografa. Electroforesis. Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE). TCNICAS DE INTERACCIN (AG-AC) PRIMARIA Tcnicas inmunoenzimticas: ELISA. Inmunoblot. Inmunohistoqumica. Inmunofluorescencia. Citometra de flujo. Radioinmunoensayo. TCNICAS DE INTERACCIN (AG-AC) SECUNDARIA Inmunodifusin. Inmunoelectroforesis. Aglutinacin. Lisis por Complemento. TCNICAS DE INTERACCIN (AG-AC) TERCIARIA Inhibicin de la hemoaglutinacin. Seroneutralizacin. Seroproteccin. Intradermorreaccin. Fijacin de Complemento. TCNICAS CELULARES Fagocitosis. Linfoproliferacin. Intradermorreaccin. Citotoxicidad. APLICACIN DE LAS TCNICAS INMUNOLGICAS Evaluacin del sistema inmune en un individuo. Deteccin de la respuesta inmune frente a patgenos. Diagnstico de hipersensibilidades. Evaluacin del resultado de la inmunoprofilaxis. HIBRIDOMAS Y ANTICUERPOS MONOCLONALES Hibridomas: Produccin y seleccin. Anticuerpos monoclonales: Produccin. Aplicaciones.

Conceptos Bsicos de Bioseguridad

Cuando en un ambiente se manipulan agentes infecciosos se producen una serie de riesgos a los que estn expuestas las personas, el medio ambiente e incluso toda la comunidad. Estos riesgos varan segn el agente, su patogenia y otros factores como las maniobras o procedimientos empleados. Las Normas de Bioseguridad pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgo inherente a la manipulacin de material peligroso. Por ello, se efecta una evaluacin de los riesgos biolgicos para darles a las personas una contencin (instalaciones, equipo de proteccin y

prcticas de trabajo) que reduzca la exposicin hasta lmites mnimos, de forma que estn expuestos al menor riesgo posible (aclarando que, el riesgo cero no existe). Clasificacin de agentes biolgicos Los agentes biolgicos se clasifican en grupos segn su peligrosidad hacia el hombre: Grupo 1. Microorganismos que presentan poca probabilidad de causar enfermedad en el hombre. Ejemplos: Bacillus subtilis, Saccharomyces sp. Grupo 2. Aqullos que pueden causar una enfermedad en el hombre y pueden suponer un peligro para las personas expuestas, siendo poco probable que se propaguen a la poblacin. Generalmente existe profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Ejemplos: Actinomyces sp, Bacteroides sp, Enterobacterias, Salmonella sp, Shigella sp, Candida sp, Cryptococcus neoformans. Grupo 3. Microorganismos que pueden causar enfermedades graves en el hombre y presentan un serio peligro para las personas expuestas, con riesgo de que se propaguen a la poblacin. Generalmente existe generalmente profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Ejemplos: Mycobacterium tuberculosis y bovis, Brucella sp, Histoplasma capsulatum, Neisseria meningitidis, Coccidioides inmitis, Chlamydia trachomatis, Virus de la encefalomielitis equina. Grupo 4. Agentes que, causan enfermedades graves en el hombre, y suponen un serio peligro para otras personas expuestas, con muchas probabilidades de que se propague a la poblacin. Generalmente no se cuenta con profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Ejemplos: Virus de Lassa, Machupo y Ebola. Niveles de contencin El primer principio de Bioseguridad es la contencin. El trmino "contencin" se emplea para describir los mtodos que hacen seguro el manejo de materiales infecciosos en el laboratorio. El propsito de la contencin es reducir al mnimo la exposicin del personal de los laboratorios, de otras personas y del entorno, a agentes potencialmente peligrosos. Se suelen describir cuatro niveles de contencin o de seguridad biolgica, que consisten en la combinacin, en menor o mayor grado, de tres elementos de seguridad biolgica: la tcnica microbiolgica, el equipo de seguridad y el diseo de la instalacin. Cada combinacin est especficamente dirigida al tipo de operaciones que se realizan, las vas de transmisin de los agentes infecciosos y la funcin o actividad del laboratorio. a) Nivel de contencin 1: Es el nivel de seguridad requerido para los agentes biolgicos del grupo 1. Es el utilizado habitualmente en los laboratorios de prcticas de universidades o centros docentes donde se emplean cepas no patgenas (E. coli K12, B. Subtilis, Naegleria sp, Saccharomyces cerevisiae, etc.). Ejemplos tpicos son todos los microorganismos que se utilizan en la industria de la alimentacin para la elaboracin de quesos, cerveza, embutidos, etc. b) Nivel de contencin 2: Es el obligado para agentes del grupo 2 como algunos que, perteneciendo a la propia flora habitual del hombre, son capaces de originar patologas infecciosas humanas de gravedad moderada o limitada. Deben ser manipulados por personal especializado (tcnicos de laboratorio, especialistas en Microbiologa) y son los que con ms frecuencia se estudian en el Laboratorio de Diagnstico Veterinario (Ascaris sp, Estafilococos, Salmonella, Toxoplasma, Clostridium sp, etc.). c) Nivel de contencin 3:

Debe utilizarse cuando se manipulan agentes biolgicos del grupo 3, microorganismos que cursan con patologas graves, de difcil y largo tratamiento, que pueden curar con secuelas y son capaces de producir la muerte. El mayor y ms frecuente peligro que entraan stos es la infeccin adquirida a travs de aerosoles y fluidos biolgicos. Por ello, las principales medidas a tomar en este caso son la correcta manipulacin y la utilizacin de cabinas de seguridad. En los Laboratorios de Diagnstico Veterinario debe evitarse la contaminacin ambiental y la infeccin del operador con patgenos como M. tuberculosis, Brucella sp, Virus de la encefalomielitis equina, etc. Estos microorganismos slo pueden ser procesados por personal calificado y en una zona con la infraestructura apropiada para el Nivel de Contencin 3, es decir, con aire acondicionado independiente, sin recirculacin de aire, con gradiente de presin, cabinas de seguridad, etc. d) Nivel de contencin 4: Es el nivel requerido cuando se trabaja con un agente patgeno extico o no, que produce una enfermedad infectocontagiosa, de alta mortalidad y para la cual no existe tratamiento o el tratamiento existente es poco fiable. Normalmente son microorganismos de dosis infectiva baja y alta contagiosidad. Agentes del grupo 4 animales de experimentacin infectados con ellos: Ejemplos de este nivel son los arenavirus como el que produce la fiebre de Lassa y el virus Machupo, virus Ebola, etc. Adems, deben incluirse en este nivel de contencin los microorganismos propios del grupo 3 que adquieran propiedades patgenas que los eleven al grupo 4. Un ejemplo sera Mycobacterium bovis multirresistente que puede causar fallecimiento por fracaso teraputico. En la prctica veterinaria diaria, el profesional se encuentra expuesto a agentes patgenos pertenecientes a los grupos 2, 3 y eventualmente al grupo 4, que son potencialmente peligrosos tanto para l mismo como para sus pacientes y otras personas. Por lo tanto, deben tomarse todas las precauciones y establecer y respetar medidas de contencin adecuadas para evitar el riesgo de la diseminacin a la comunidad. El inicio de algunas enfermedades profesionales es lento y muchas veces enmascarado por otros trastornos fsicos. Por esto, el profesional veterinario tiene que tener una clara conciencia del riesgo de su profesin y conocer en cada una de sus actividades los riesgos a los cuales puede verse expuesto. Slo si se conocen las posibles enfermedades a las que se expone el veterinario, su forma de transmisin, produccin y exposicin, se podrn realizar las acciones correspondientes a fin de prevenirlas. Bioseguridad en el consultorio veterinario. Durante la revisacin clnica se contaminan las manos del profesional, por lo tanto deben lavarse entre la atencin de pacientes. Asimismo, debe desinfectarse la camilla y todos los elementos empleados durante la consulta. Es comn la toma de muestras (sangre, orina, materia fecal, biopsias, etc.) para efectuar anlisis complementarios que ayuden al diagnstico o al seguimiento de un caso clnico. Estas muestras, en general, son analizadas por laboratorios de diagnstico externos a la clnica, por lo tanto debe evitarse la diseminacin de patgenos durante su traslado: Los tubos de sangre deben estar correctamente tapados e identificados. Nunca se debe enviar la sangre dentro de la jeringa de extraccin. Si se toman muestras de orina o muestras de rganos para diagnstico histopatolgico (conservados en formol al 10%), los frascos deben estar cerrados hermticamente. Las muestras de rganos remitidas en fro para diagnstico microbiolgico deben colocarse en bolsas plsticas cerradas. Nunca se deben colocar muestras de diferentes rganos en la misma bolsa. Todas las muestras deben remitirse dentro de cajas, preferiblemente de telgopor (con refrigerantes, cuando se requiera) y adecuadamente precintadas para evitar su apertura accidental.

10

Las muestras deben ir acompaadas de un protocolo de remisin de muestras que incluya el tipo de muestra que se enva, el anlisis solicitado y una resea clnica del caso. Esta resea debe contener la especie animal de la que provienen las muestras, edad, sexo, sintomatologa observada, hallazgos de necropsia y el diagnstico presuntivo; de manera que el destinatario est advertido de los riesgos potenciales antes de tomar contacto con la muestra.

Residuos patognicos: Son considerados residuos patognicos todos aquellos desechos o elementos materiales en estado slido, semislido, lquido o gaseoso que presumiblemente presenten o puedan presentar caractersticas de infecciosidad, toxicidad o actividad biolgica que puedan afectar directa o indirectamente a los seres vivos o causar contaminacin del suelo, del agua o de la atmsfera, que sean generados en la atencin de la salud humana o animal por el diagnstico, tratamiento, inmunizacin o provisin de servicios, as como tambin en la investigacin o produccin comercial de elementos biolgicos o txicos. (Ley 154 de la Ciudad Autnoma de Buenos Aires, 18 de febrero de 1999). Residuos patognicos son, por ejemplo: Los provenientes de cultivos de laboratorio, restos de sangre y sus derivados. Restos orgnicos provenientes del quirfano, de servicios de hemodilisis, hemoterapia, anatoma patolgica, morgue. Restos, carcasas y excrementos de animales de experimentacin biomdica. Algodones, gasas, vendas, jeringas, objetos cortantes o punzantes, materiales descartables y otros elementos que hayan estado en contacto con agentes patognicos y que no se esterilicen (Nivel de bioseguridad 3). Todos los residuos, cualesquiera sean sus caractersticas, que se generen en reas de alto riesgo infectocontagioso (Niveles de bioseguridad 3 y 4). Restos de animales provenientes de clnicas veterinarias, centros de investigacin y acadmicos. Frascos de medicamentos y vacunas vacos. Los residuos patognicos deben tratarse de manera especial hasta su destino final. Esta actividad est reglamentada en la ley N 154 de la Ciudad Autnoma de Buenos Aires. Todos los residuos patognicos deben colocarse en bolsas rojas de ms de 120 micrones de espesor. Estas bolsas se colocan en cajas de cartn o en recipientes plsticos debidamente sellados e identificados. El tratamiento de estos residuos es llevado a cabo por empresas especializadas que cuentan con la infraestructura necesaria para esterilizarlos sin riesgo de eliminar patgenos al medio ambiente. En general los residuos patolgicos son incinerados en hornos a temperaturas mayores a los 1200C que dejan como residuo vapor de agua y cenizas inocuas (hornos pirolticos). Bioseguridad en la produccin agropecuaria Son varias las zoonosis que el profesional puede adquirir durante prcticas rutinarias en la produccin agropecuaria, por lo tanto tambin deben tomarse precauciones. Usar mameluco descartable o de algodn resistente al lavado intenso y botas de goma. Revisar el estado de la manga, andenes, cepos, puertas laterales, etc. Usar guantes para realizar tacto rectal o necropsias. Comprobar el buen funcionamiento de las jeringas metlicas, verificar que no tengan prdidas cuando se inyecta. Desinfectarlas y lavarlas muy bien luego del uso. No reutilizar las jeringas descartables. Luego del trabajo en la manga, desinfectar las botas y colocar la ropa en una bolsa plstica y luego lavarla, separada de otras, en agua a 90C. Enterrar o incinerar los cadveres de animales sospechosos de haber muerto por enfermedades infecciosas graves o zoonticas. La prctica depender de la enfermedad de la que se sospeche.

11

Remitir las muestras al laboratorio siguiendo las indicaciones descriptas anteriormente.

Bioseguridad en el laboratorio de diagnstico El laboratorio de diagnstico recibe muestras que deben ser consideradas como potencialmente peligrosas y deben tomarse todos los recaudos necesarios para evitar el contagio y la diseminacin de los agentes infecciosos. No comer, beber o fumar en el laboratorio. Debe usarse guardapolvo u otra indumentaria diferente a la ropa de calle. Utilizar guantes para manipular las muestras. Nunca pipetear con la boca, usar pipetas automticas, propipetas o peras de goma. Luego de trabajar, desinfectar las mesadas y todos los elementos utilizados. Luego de procesadas, tratar las muestras como residuos patognicos. Rotular todos los frascos utilizados en el laboratorio indicando su contenido, la fecha de apertura o preparacin, la fecha de vencimiento y la peligrosidad de la solucin o sustancia qumica (irritante, carcinognica, inocua, etc.).

Toma de muestras para la evaluacin del Sistema Inmune

La toma de muestras es el primer paso antes de indicar cualquier prueba de laboratorio; sin ella no hay sustrato sobre el cual comenzar a trabajar, por lo cual es el primer tema que se trata. Se entiende la importancia de detenerse en algunos puntos sobre ellas si se piensa qu pasara si se cometen errores durante su recoleccin: el estudio de muestras inapropiadas o mal conservadas puede llevar a resultados falsos que invaliden la prueba. Por lo tanto, se nombran a continuacin algunos conceptos a tener en cuenta en la toma de muestras, como primer paso, antes de empezar a trabajar. Se hace hincapi en las muestras de sangre y suero ya que, la evaluacin de la respuesta inmune sistmica se realiza a partir de sangre perifrica, y la obtencin de suero a partir de sangre es frecuente en inmunologa (por ejemplo, para buscar anticuerpos). Las pruebas sobre estas muestras, en laboratorios de inmunologa, se realiza con dos objetivos principales: 1. En el caso del diagnstico de enfermedades infecciosas: - Identificar y tipificar antgenos en una muestra: por ejemplo, Parvovirus canino o Coronavirus bovino en materia fecal. En estos casos se utilizan anticuerpos especficos contra el patgeno o contra subtipos o cepas del mismo. Identificar la produccin de anticuerpos especficos contra un determinado patgeno, por ejemplo: anticuerpos antiBrucella abortus, anticuerpos antiVirus de la Fiebre Aftosa, etc., obteniendo como resultado: presencia o ausencia de anticuerpos, si la tcnica es cualitativa; el ttulo de estos anticuerpos, si la tcnica es semicuantitativa; los miligramos de anticuerpos especficos, si la tcnica es cuantitativa.

12

2. En el caso de la evaluacin del sistema inmune (SI): - Determinar los niveles de inmunoglobulinas en general o de alguna clase de inmunoglobulina en particular, por ejemplo, cuando queremos saber si un animal tiene niveles normales de IgG en suero. - Determinar la relacin entre las clulas pertenecientes al sistema inmune; por ejemplo, relacin CD4/CD8. - Evaluar la funcionalidad de las clulas del sistema inmune, midiendo su proliferacin o la produccin de citoquinas. Conocer la tcnica que se va a usar permitir: *Elegir la tcnica ms adecuada, segn el objetivo del inmunodiagnstico. *Tomar la muestra correcta. *Evaluar los resultados de forma de cumplir los objetivos planteados. Es por eso que, consecuente con la toma de muestras se describirn las tcnicas, ya que es necesario conocerlas para saber qu muestra tomar y cmo prepararla. Toma de muestras de sangre: La toma de muestras de sangre es una de las prcticas ms habituales en la clnica diaria. Se realiza en razn de mltiples objetivos, entre los cuales tenemos desde una prueba bioqumica hasta un examen de funcionalidad celular. De acuerdo con estos objetivos, vara la manipulacin y preparacin de las muestras. Es por ello que es importante conocer algunos conceptos bsicos para que la maniobra realizada resulte en datos que nos puedan servir de base para formular un diagnstico exacto. A continuacin se enumeran algunos consejos particularmente tiles: - Extraer la cantidad mnima necesaria para las pruebas. Esto es crtico cuando se deben hacer sangras sucesivas a pequeos animales. - Consultar con el laboratorio que procesar la muestra. Algunas de las pruebas realizadas en los laboratorios de Inmunologa clnica deben tener una notificacin previa (como la prueba de estimulacin de linfocitos) y requieren del envo de una muestra control junto con la muestra del paciente. Cuando la muestra debe ser extrada con anticoagulante, previo a la extraccin debe ser consultado el laboratorista, quien indicar el ms conveniente para las pruebas que deba realizar. Los ms usados son los quelantes del Ca++ como el citrato de Na o la solucin de Alsever que tiene glucosa para proteger a los eritrocitos y citrato de Na como anticoagulante. - Trabajar cuidadosamente para obtener la muestra en las condiciones ms aspticas posibles. Siempre es recomendable usar jeringas y agujas descartables o esterilizadas por calor seco. - Evitar la hemlisis. La presencia de hemoglobina puede afectar algunos resultados. El uso de elementos sucios o mojados (excepto con anticoagulantes), el manipuleo brusco y la formacin de espuma cuando trasvasamos la muestra de la jeringa al tubo de ensayos pueden producir hemlisis. La susceptibilidad a sta, segn las especies y en orden creciente es: equinos, bovinos, ovinos, aves, felinos y caninos. - Tener en cuenta que lo ptimo es obtener la muestra en el mismo laboratorio para evitar el deterioro que sufre durante el envo; esto es de particular importancia en los estudios que impliquen evaluacin de clulas o de los factores del complemento. - Las pruebas que requieren clulas viables hacen necesario que la sangre se transporte en hielo hasta el laboratorio en pocas horas. Si esto no es posible, se debe enviar la muestra acondicionada del modo ms conveniente para cada caso y lo ms rpidamente posible. - Rotular las muestras de forma inequvoca y acompaar las muestras con el correspondiente protocolo que contenga la mayor cantidad de informacin posible. Es comn observar que los profesionales remitan muestras en las cuales slo se detalla, por ejemplo, el nombre de la mascota en tratamiento. Es importante aclarar no slo las pruebas que se solicitan al laboratorio, sino tambin adjuntar fecha, especie, sexo, diagnstico
13

presuntivo y una breve resea del caso en cuestin, ya que esto ser de suma utilidad a la hora de interpretar los resultados por parte del personal del laboratorio. (Se adjunta como ejemplo el protocolo de envo de muestras utilizado en el servicio que brinda el rea de Inmunologa). Extendidos de Sangre: Los extendidos de sangre conviene hacerlos inmediatamente despus de extrada la muestra, junto al animal. Para esto se utilizan las ltimas gotas de sangre que quedan en la aguja. Preparados correctamente, estos extendidos son estables an si no estn fijados. Pueden teirse hasta varios das despus si se conservan secos y protegidos de la humedad. Envueltos en papeles limpios y colocados en un recipiente hermtico, pueden remitirse por correo. El mtodo de fijacin puede variar segn la tincin, pero en general se pueden fijar con calor o con distintos alcoholes. Los extendidos fijados son de estabilidad casi indefinida. Extraccin de Suero: Para extraer el suero de la sangre total obtenida, se la deja coagular. Una vez formado el cogulo, se lo desprende del vidrio con la ayuda de una aguja o varilla. Para obtener la mayor cantidad posible de suero, se coloca el tubo en una estufa a 37oC durante 30 minutos a 1 hora y luego, para obtener la mayor retraccin del cogulo, se lo deja en heladera (4 oC) durante una noche. A partir de aqu, se puede centrifugar el tubo (a 3000 r.p.m. durante 30 minutos) o extraer directamente el suero (sobrenadante) con una pipeta. En ambos casos debe operarse cuidadosamente tratando de evitar tocar el cogulo para no producir hemlisis. El suero puede mantenerse a 4oC durante 48-72 horas. Si hay riesgo de contaminacin, conviene agregarle una pizca de azida sdica (este conservante puede ser txico por lo que es conveniente consultar al profesional del laboratorio antes de hacerlo). Si no se va a usar dentro de ese lapso, el suero debe congelarse a temperaturas inferiores a -20oC (lo ptimo es a 70oC). Si bien a estas temperaturas prcticamente no hay degradacin proteica, s la hay durante cada ciclo de congelacin descongelacin. Para los exmenes serolgicos de diagnstico especfico no tiene mayor importancia, pero para exmenes electroforticos conviene evitar el congelamiento si es posible Es conveniente aclarar en el protocolo si la muestra ha sido congelada o mantenida a 4oC y cualquier otra observacin que se considere necesario. Tambin se puede enviar la sangre entera, siempre que no se tarde ms de unas pocas horas. La sangre entera se conserva refrigerada, nunca congelada, pero si se prevn demoras entre la extraccin y la llegada al laboratorio, lo mejor es enviar el suero ya separado.

14

Ej. : PROTOCOLO DE ENVO DE MUESTRAS

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS AREA INMUNOLOGA SERVICIO DE DIAGNSTICO INMUNOLGICO

N DE PROTOCOLO

Fecha de recepcin:

Examen solicitado:............................................................................................................ Muestra remitida:............................................................................................................... Observaciones de la muestra:...........................................................................................

DATOS DEL PACIENTE

Especie:

Raza:................................................................................................................................. Edad:................................................................................................................................. Sexo: M H

DATOS DEL PROPIETARIO

Apellido y Nombre:............................................................................................................ Telfono:............................................................................................................................

DATOS DEL PROFESIONAL

Apellido y Nombre:............................................................................................................ Telfono:............................................................................................................................ Pertenece al Hospital Canepa: SI NO N de Historia Clnica:............................. DIAGNOSTICO PRESUNTIVO:........................................................................................ ANALISIS COMPLEMENTARIOS REALIZADOS:.......................................................... MEDICACIN RECIBIDA:...........................................................................................

15

Tcnicas de evaluacin de inmunidad innata

La respuesta inmune innata representa la primera lnea de defensa del husped a la infeccin. Una de sus caractersticas primordiales es la capacidad de responder a patgenos que no ha visto previamente. Esta capacidad inherente del sistema innato se debe a su habilidad de reconocer estructuras muy conservadas y compartidas por diversos patgenos. Dichas estructuras son conocidas como patrones moleculares asociados a patgenos (PAMPs, acrnimo proveniente del nombre en ingles: pathogen associated molecular patterns) entre los que podemos ejemplificar a componentes de la pared bacteriana como lipopolisacridos (LPS), peptidoglicanos y cido lipoteicoico entre otras estructuras. Estas molculas pueden ser vistas como firmas moleculares de los microorganismos invasores. Si bien las bacterias de distintas cepas presentan algunas diferencias estructurales, se describen patrones conservados. Por ejemplo, el lpido A que forma parte del LPS de las bacterias Gram negativas es siempre constante y es el responsable de los efectos proinflamatorios, mientras que el antgeno O es variable entre las distintas especies y no es reconocido por el sistema inmune inespecfico. De esta forma, el sistema inmune innato puede responder a muchas infecciones slo con un repertorio limitado de receptores. El reconocimiento de los PAMPs est mediado por estructuras tambin muy conservadas en la evolucin y que son conocidas como receptores para el reconocimiento de patrones (PRRs, acrnimo proveniente del nombre en ingles: pattern recognition receptors). Entre los PRRs se describen varias familias, entre ellas, los receptores de tipo Toll (TLR) son capaces de reconocer distintos PAMPs. Al menos diez miembros de la familia de TLR se identificaron en mamferos y cada miembro es capaz de reconocer distintos PAMPs. Por ejemplo, el TLR 2 reconoce peptidoglicano y cido lipoteicoico del S. aureus. El TLR 4 reconoce LPS de bacterias gram negativas incluyendo a E. coli. Fagocitosis Los mecanismos que tienen las clulas para incorporar en su interior fluidos, solutos y partculas desde el medio externo son: pinocitosis, endocitosis mediada por receptores especficos y fagocitosis. Mediante el proceso de pinocitosis ingresan a las clulas fluidos y solutos. Por medio de la endocitosis mediada por receptores especficos, entran a la clula macromolculas, virus y otras partculas de pequeo tamao. Ambos mecanismos son independientes de la polimerizacin de la actina. En cambio, la fagocitosis, que es la ingestin de partculas de mayor tamao, ocurre por mecanismos dependientes de la actina. Las clulas ms eficientes para fagocitar partculas son los monocitos, macrfagos y neutrfilos a los que se los denomina fagocitos profesionales. La fagocitosis fue descripta por Metchnikoff en 1882 y es uno de los mecanismos asociados al sistema inmune que aparece ms tempranamente en la escala filogentica. Se conoce como fagocitosis al proceso por el cual una partcula es ingerida por una clula. Las partculas pueden ser bacterias, parsitos, clulas muertas y partculas inertes como el carbn, etc. La partcula puede ser degradada o no luego de la fagocitosis dependiendo de la naturaleza de la misma. No todos los microorganismos son fagocitados; muchos de ellos tratan de evadir el reconocimiento que es la primera etapa de la fagocitosis. Simultneamente con esta evasin, el sistema inmune de los vertebrados ha evolucionado para contrarrestarlo. Se conocen factores sricos denominados opsoninas que favorecen el reconocimiento e ingestin de microorganismos. Las principales opsoninas son los anticuerpos (IgG e IgM), los factores del complemento (C3b, C3bi, etc.) y las protenas de fase aguda. Entre las protenas de fase aguda se encuentran la protena C reactiva, las protenas de unin al lipopolisacrido (LBP) y protenas de alto peso molecular llamadas fibronectinas. El LBP se une al LPS bacteriano y aumenta la unin de stos a la molcula de CD14 presente en la membrana de las clulas fagocticas. La

16

fibronectina puede unirse a algunas bacterias como el Staphylococcus aureus y actuar como puente entre la bacteria y el polimorfonuclear (PMN). El reconocimiento del microorganismo est mediado por diferentes receptores de membrana del fagocito pertenecientes a los PRRs o aquellos que reconocen a las opsoninas. Estos receptores pueden estar involucrados tanto en la adherencia como en la activacin del proceso de fagocitosis. Algunos de ellos son, por ejemplo, el receptor para el fragmento cristalizable constante de la inmunoglobulina G (FcR), el receptor para la protena C3b del complemento (CR1)), o para la protena C3 (CR3 o CD11b/CD18), y los receptores de patrones (PRRs) como el receptor de manosa, y el receptor scavenger o carroero. Se ha observado que la cantidad de anticuerpos IgG necesarios para inducir la ingestin de un microorganismo se reduce alrededor de 100 veces si ste adems est recubierto por C3b. Estos receptores actan cooperativamente para estimular vas de sealizacin, no slo para iniciar la polimerizacin de la actina sino tambin para activar la NADPH-oxidasa para la produccin de O2. Este ltimo es uno de los mecanismos citotxicos que entran en juego luego de la fagocitosis. Clulas efectoras de la fagocitosis Los polimorfonucleares se originan en la mdula sea (MO) y son continuamente enviados a la circulacin. Viven pocos das y tan pronto como los microorganismos invaden los tejidos dejan el torrente circulatorio, se adhieren al endotelio celular activado y se mueven a travs de la barrera endotelial hacia el sitio de la lesin. Son considerados como la primera barrera de defensa frente a los microorganismos, ya que son los primeros en llegar al sitio de invasin atrados por los factores quimiotcticos que se generan en el foco inflamatorio. Los factores quimiotcticos son principalmente componentes bacterianos, productos de degradacin de las bacterias, mediadores de la inflamacin y restos de tejidos alterados por la invasin. Los monocitos se originan tambin en MO y pasan a la circulacin, desde donde se extravasan a los tejidos y se diferencian en los distintos rganos, tomando caractersticas propias como es el caso de las clulas de Kupffer en el hgado, los macrfagos alveolares en el pulmn y los histiocitos en el tejido conectivo. La transformacin de monocito a macrfago tisular involucra una serie de cambios morfolgicos y metablicos en la clula, como son el aumento del tamao celular, la modificacin en la calidad y cantidad de enzimas lisosomales, etc. Activacin del polimorfonuclear / macrfago Los PMN responden a una gran variedad de factores quimiotcticos, incluyendo los Nformilpptidos, factores derivados de la activacin del complemento como el C5a, los leucotrienos B4 (LTB4), la interleuquina 8 y el factor activador de plaquetas (PAF). Algunos de los receptores de los factores quimiotcticos han sido identificados como miembros de la superfamilia de los receptores unidos a la GTPasa (protenas G), cuya caracterstica estructural es que poseen 7 dominios transmembrana. Estos receptores existen en estados interconvertibles de alta y baja afinidad a consecuencia de que desarrollan un ciclo de intercambio del nucletido guanina e hidrlisis de GTP durante el cual estas protenas sufren varios cambios conformacionales. Estos estados de alta o baja afinidad dependen del microambiente y los niveles de factores quimiotcticos. Las protenas G funcionan como intermediarios entre los receptores de superficie celular y las enzimas efectoras responsables de la generacin de segundos mensajeros: AMPc inositoltrifosfato (IP3), Ca2+, diacilglicerol (DAG), cido fosfatdico (PA), cido araquidnico (AA). Estos segundos mensajeros son generados directa o indirectamente como consecuencia de la activacin de las fosfolipasas A2, C y D. La activacin de los segundos mensajeros permite la remodelacin de la membrana citoplasmtica, el aumento del metabolismo de los fosfolpidos, la polimerizacin de la actina y el estallido respiratorio. Los eventos tempranos de activacin estn interrelacionados y son fundamentalmente cuatro:

17

1234-

fosforilacin en tirosina de protenas de membrana y citoplasmticas hidrlisis del fosfolpido inositol de membrana incremento del Ca2+ citoplasmtico incremento de la actividad de la proteinquinasa C (PKC)

Los neutrfilos contienen una gran variedad de quinasas de serina/treonina y de tirosinas. Estas enzimas son blanco especfico de los segundos mensajeros. El entrecruzamiento de FcR induce la activacin de diversas familias de quinasas y de tirosinas. Macrfagos y PMN defectivos para estas quinasas exhiben una considerable disminucin de la fagocitosis y produccin de O2. Mecanismo de fagocitosis La interaccin receptor-ligando entre el fagocito y la partcula a ingerir activa la maquinaria de la fase de ingestin para lo cual es necesario la modificacin de las protenas involucradas en el remodelamiento de la membrana y el citoesqueleto: actina, miosina y protenas de unin a la actina. Los microfilamentos de actina en la porcin de citoplasma que subyace al sitio de unin comienzan a polimerizarse. Esta polimerizacin lleva a que la membrana envuelva la partcula, formndose seudpodos (extensiones de la membrana en forma de dedos). Estos rodean a la partcula y finalmente se fusionan formando la vescula fagoctica o fagosoma primario. Mientras esto ocurre, los grnulos citoplasmticos se funden con la membrana del fagosoma y se produce un fagolisosoma. En el interior del fagolisosoma, la partcula ingerida queda expuesta a sistemas microbicidas que pueden clasificarse como oxgeno independientes y oxgeno dependientes. Molculas efectoras independientes del oxgeno Estas sustancias estn localizadas en los lisosomas o grnulos citoplasmticos, se liberan dentro de los fagolisosomas y no requieren la produccin de oxidantes para ser activas. Pueden actuar tanto intra como extracelularmente en el caso de que la partcula sea muy grande para ser ingerida generando lesin en el tejido subyacente y efecto conocido como fagocitosis frustrada. Estos agentes incluyen proteasas y enzimas hidrolticas como fosfolipasas, glicosidasas y lisozima; la fagocitina y las leucinas que actan sobre las membranas bacterianas; la lactoferrina fija el hierro privando a las bacterias de este elemento indispensable para su crecimiento y la lisozima, que cliva los mucopptidos de la pared celular bacteriana. Molculas efectoras dependientes del oxgeno Durante el proceso de fagocitosis las clulas pueden incrementar en 50 veces la cantidad de oxgeno consumido y metabolizar grandes cantidades de glucosa. Debido al gran consumo de oxgeno, este fenmeno se denomina estallido respiratorio. El consumo de oxgeno es utilizado para la produccin de metabolitos txicos como anin superxido, perxido de hidrgeno, radicales hidroxilo, oxgeno singulete, hipocloritos y cloraminas. Se ha confirmado experimentalmente la relacin entre la citoxicidad de los macrfagos y la produccin aumentada de los reactivos del nitrgeno e intermediarios del oxgeno. En los sobrenadantes de cultivo de macrfagos activados por citoquinas se encuentran niveles elevados de nitritos inorgnicos (NO2-) y de anin superxido (O2-), ambos asociados con la actividad antimicrobiana. Las vas oxidativas productoras de estos dos metabolitos son diferentes y no comparten precursores comunes. El siguiente esquema muestra las vas de produccin de molculas efectoras, sealando algunos de los estmulos necesarios para su activacin, a saber: interfern gamma (IFN), lipopolisacrido de E. coli (LPS) y forbomiristil acetato (PMA).

18

L-arginina
Activacin por INF y LPS Oxido ntrico sintasa (INOS)

oxgeno
Estimulacin por fagocitosis o tratamiento con PMA NADPH oxidasa

xido ntrico (NO)

anin superxido (O2)

nitrito (NO2-)

Otros reactivos intermediarios y molculas efectoras

perxido de hidrgeno (H2O2) radicales hidroxilo (OH)

nitrato (NO3-)

Existen mecanismos para incrementar la capacidad microbicida del H2O2, Uno de ellos es la accin de la mieloperoxidasa (MPO), que cataliza la oxidacin y halogenacin de diferentes estructuras presentes en los microorganismos. El xido ntrico (NO) posee una vida media de pocos segundos, interacta con una serie de molculas dando como resultado citotoxicidad. En presencia de oxgeno y agua, el NO genera otros reactivos intermedios del nitrgeno y por ltimo se descompone para formar NO2y NO3-. Los niveles de formacin de los reactivos del oxgeno y produccin de NO estn relacionados con el grado de susceptibilidad a las infecciones. A modo de ejemplo, podemos citar la Enfermedad Granulomatosa Crnica que se presenta en individuos genticamente deficientes en la enzima NADPH oxidasa. Mtodos de evaluacin de las fases de la fagocitosis a) Quimiotaxis: La quimiotaxis es el movimiento de los PMN a travs de un gradiente de concentracin de sustancias (como la formil-metionina) que producen migracin dirigida. Los factores quimiotcticos provienen principalmente de componentes bacterianos, de la degranulacin de los mastocitos durante el proceso inflamatorio y de la activacin del complemento (el C5a est considerado como uno de los ms potentes factores quimiotcticos). Las pruebas de quimiotaxis se utilizan, en determinados pacientes sospechados de padecer una inmunodeficiencia, para evaluar la capacidad de sus clulas principalmente neutrfilos frente a factores comprobadamente inductores de migracin Tcnica de migracin celular bajo capa de agarosa: Consiste en preparar un medio soporte de agarosa sobre un portaobjeto en el cual se siembran las clulas en posicin central, ubicando frente a las mismas la sustancia quimiotctica y una sustancia control. Durante la incubacin las clulas migran. Luego se fijan con metanol, se desprende la capa de agarosa y se tien las clulas. La migracin de los PMN se evala microscpicamente comparando la distancia recorrida en direccin al factor quimiotctico (dirigida) y la migracin espontnea de las clulas (al azar). Los valores normales deben determinarse para cada especie y en el laboratorio de referencia. b) Quimiotaxis y adherencia Tcnica de migracin y adherencia a travs de una membrana: para ello se utiliza la cmara de Boyden, que posee una membrana microporosa con poros de 3 micrones de dimetro. Se colocan las clulas en un compartimento y los factores quimiotcticos en otro y se

19

lleva a incubar. La capacidad de las clulas para migrar hacia el estmulo se evala tiendo las que quedan retenidas en la membrana. Los resultados se comparan con los obtenidos con clulas del mismo animal (sin estmulo) y con PMN de un individuo normal utilizado como control de valor de animal sano. b) Activacin: La activacin de las clulas fagocticas se sealiza a travs de eventos de fosforilacin y desfosforilacin de las protenas celulares involucradas en la trasmisin de la seal de activacin. La posibilidad de identificar protenas fosforiladas con el uso de anticuerpos monoclonales que detectan, por ej., tirosinas fosforiladas, permite identificar el primer paso de activacin de las clulas fagocticas. Para esta evaluacin es necesario recurrir a las tcnicas de PAGE e Inmunoblot a partir de las clulas activadas (ver captulos correspondientes en la presente gua). La identificacin de la migracin de protenas del citoplasma al ncleo celular para regular la trascripcin de molculas relacionadas con la inflamacin y fagocitosis constituye tambin una manera de identificar los primeros eventos de activacin celular. Como ejemplos de estos sistemas podemos incluir la activacin del factor NF-kB que involucra la degradacin del factor inhibidor de kB citoplasmtico (protena IkB) y el incremento de sus componentes p50 y p65 en el ncleo celular. Esta modificacin en los componentes proteicos celulares tambin se estudia utilizando anticuerpos marcados y mediante el uso de tcnicas de SDS-PAGE e inmunoblot. c) Ingestin: La etapa de ingestin se puede evaluar utilizando como partcula a ingerir diferentes microorganismos. La utilizacin de levaduras como por ejemplo el Saccharomyces cerevisiae, se fundamenta en el tamao de las partculas (fcil de ver en el microscopio ptico) y la estructura de manosas que poseen estos microorganismos que son fcilmente detectados por los PRRs. La capacidad de ingestin de las clulas provenientes del individuo a evaluar se determina realizando una cuantificacin del nmero de levaduras ingeridas en un determinado tiempo de incubacin. El recuento de las partculas o microorganismos ingeridos puede ser realizado mediante diversas metodologas: - Tincin de las clulas con las coloraciones de Wright o Giemsa; de esta manera se diferencian las clulas que han ingerido de las que no. Se deben contar por lo menos 200 clulas y determinar cuentas partculas por citoplasma celular es considerado como ingestin positiva. Los mtodos microscpicos requieren una laboriosa observacin para determinar la asociacin de los microorganismos a las clulas y discriminar si estos microorganismos fueron ingeridos o no. -Marcacin de las partculas a ingerir con fluorescena; se utiliza la marcacin de la partcula con isotiocianato de fluorescena u otro colorante fluorescente previo a la incubacin con las clulas, luego se elimina por lavado las partculas no ingeridas y se detectan las clulas que ingirieron por microscopia de fluorescencia o citometra de flujo (ver captulo correspondiente en la presente gua). La utilizacin de la coloracin combinada diferencial con bromuro de etidio permite identificar las bacterias extracelulares (fluorescen en color rojo-naranja) de aqullas internalizadas (permanecen de color verde correspondiente a la fluorescena). -Marcacin de componentes bacterianos como protenas, DNA y/o RNA con sustancias radiactivas. Las bacterias se marcan durante su fase de crecimiento con aminocidos o nucletidos marcados con 14C, 35S amino 3H nucletidos: tritio y luego del experimento de ingestin en el que se incuban las clulas y las bacterias durante un periodo de tiempo generalmente entre 30 a 60 minutos a 37C se lavan las clulas para eliminar las bacterias no ingeridas y se utiliza un detector de radioactividad como un contador de centelleo lquido o slido para cuantificar la radiactividad retenida por el sedimento celular. Esta actividad se relaciona con el nmero de partculas radiactivas ingeridas y por lo tanto con la capacidad de ingestin de las clulas fagocticas del individuo evaluado.

20

d) Digestin:

Evaluacin del estallido respiratorio

Reduccin del colorante nitroazul de tetrazolio El nitroazul de tetrazolio (NBT) es un aceptor de un electrn utilizado para detectar en forma indirecta la produccin de superxido por parte de los PMN estimulados. El NBT de color amarillo y soluble, se transforma en formazn de color azul e insoluble que precipita intracelularmente.
NBT (color amarillo y soluble) + O2- ---------- Formazn (color azul e insoluble) + O2

Para esta prueba se pueden utilizar PMN provenientes de sangre entera aislados del individuo, estimulados con levaduras o forbolmiristilacetato (PMA) Luego de una incubacin de 30 minutos a 37C, la formacin del formazn puede ser evaluada cuali o cuantitativamente. Los cristales pueden identificarse intracelularmente por microscopa y realizar un recuento del nmero de clulas que sufrieron estallido respiratorio, o bien los cristales pueden ser solubilizados utilizando N,N dimetilformamida y realizar la cuantificacin por espectrofotometra obteniendo los datos en densidad ptica. Quimioluminiscencia El estallido respiratorio en los PMN normales est asociado con la generacin de energa luminosa conocida como quimioluminiscencia, la cual es dependiente de la produccin del oxgeno singulete (1O2). Este oxgeno se produce cuando uno de los electrones desapareados de oxgeno es elevado a una rbita superior con la inversin del spin. La luz se emite cuando el electrn retorna a su nivel inicial y se mide como quimioluminiscencia. El oxgeno singulete es producido por la reaccin entre H2O2 y el hipoclorito:
H2O2 + OCl----------
1

O2

H2O

Cl-

La luz emitida se mide por la deteccin fluoromtrica apropiada. La sensibilidad del ensayo se incrementa por el uso de hidracina cclica, 5-amino-2,3-dihidro-1,4-phthalazinedione (luminol) que actan como substrato para el 1O2. La luminiscencia se mide en un contador de centelleo usando el canal del 3H. Evaluacin de la produccin de xido Ntrico (NO) Puede realizarse mediante la evaluacin de la produccin de NO o de la enzima que cataliza su produccin (iNOS o NOS2) Produccin del NO Los niveles de produccin de NO en los cultivos de macrfagos estimulados con bacterias o productos bacterianos nos permiten evaluar el grado de activacin de estas clulas. La vida media del NO es de segundos, por esto, la evaluacin de su produccin se realiza mediante la cuantificacin de nitritos en el medio de cultivo. La sntesis de nitritos comienza 4 a 6 horas luego del tratamiento con IFN y LPS en un cultivo de macrfagos y es lineal por 72 horas. La identificacin de este metabolito en los sobrenadantes de cultivo se realiza mediante la utilizacin del reactivo de Greiss (sulfanilamida y naftiletilendiamina) que se colorea cuando reacciona con nitritos y nos permite relacionar la coloracin con los niveles producidos en un cultivo. El cambio de color se evala por espectrofotometra a 550 nm. Se realiza una curva patrn utilizando diferentes concentraciones conocidas de NaNO2 y reactivo de Greiss. De esta curva se obtiene la relacin que permite estimar la produccin de NO in vitro.

21

Los anlogos de la L-arginina,como la NG-monomethyl-L-arginina (L-NMA), poseen accin inhibitoria de la produccin de nitritos a partir del NO por la va de la iNOS por un fenmeno competitivo. La utilizacin de estas molculas permite confirmar que el aumento de produccin de nitritos en un cultivo est dado por este mecanismo. Incremento de la sntesis de la enzima xido ntrico sintasa inducible (iNOS o NOS2) La produccin de NO en altos niveles se cataliza por la accin de la enzima xido ntrico sintasa inducible. La expresin de esta enzima se produce por la accin de IFN y LPS en los cultivos y se relaciona con la activacin de macrfagos in vivo. Para la evaluacin del aumento en la produccin de esta enzima se utilizan anticuerpos monoclonales que reconocen su estructura marcados con enzimas que se utiliza para identificarla en los extractos proteicos celulares evaluados mediante las tcnicas de SDS-PAGE e Inmunoblot. Evaluacin del efecto bacteriosttico o bactericida La digestin de las partculas ingeridas depende no slo de los mecanismos O dependientes y O independientes descriptos sino de la capacidad del microorganismo de evadir o inhibirlos, las bacterias intracelulares pueden permanecer en estas clulas fagocticas que se transforman en su habitat. En el caso de bacterias extracelulares u otros patgenos este mecanismo se constituye como capaz de contener o eliminar al agente agresor constituyndose en un mecanismo efector bacteriosttico o bactericida. Estos mecanismos pueden ser evaluados utilizando tcnicas de cultivo bacteriano y determinando el nmero de unidades formadoras de colonias sobrevivientes al proceso de fagocitosis. Deficiencias en el mecanismo de fagocitosis Las deficiencias pueden estar dadas en el nmero de clulas fagocticas que posee un individuo (diferencias cuantitativas) o sobre la funcionalidad de alguno de los mecanismos descriptos (diferencias funcionales). Las granulocitopenias son frecuentes en las deficiencias secundarias a enfermedades linfoproliferativas, tratamientos inmunosupresores o excesiva destruccin mediada por anticuerpos anti-leucocitarios. Las deficiencias funcionales pueden afectar la movilidad y adherencia o la capacidad de ingestin y digestin. Algunas de las deficiencias descriptas como entidades clnicas son: Enfermedad Granulomatosa Crnica Deficiencia en la adhesin leucocitaria Deficiencia en glucosa 6 fosfatodeshidrogenasa Deficiencia en los grnulos secundarios Para el diagnstico de estas inmunodeficiencias se trabaja con niveles de complejidad crecientes. Ensayos de nivel bsico: 1. Determinacin cuantitativa y morfolgica de los granulocitos y monocitos. 2. Estudios de mecanismos microbicidas oxigeno dependientes. a) Prueba de la reduccin del nitroazul de tetrazolio. b) Quimioluminiscencia. Ensayos de nivel complejo: 1. Estudio de la expresin de las protenas de adhesin (antgenos LFA-1, CD11b/CD18, etc.) 2. Ensayos de quimiotaxis. 3. Estudios enzimticos: mieloperoxidasa, glucosa 6 fosfatodeshidrogenasa, etc.

22

Bibliografa 1. Wyllie J. Currents Protocols in Immunology.1994. 2. Margni R.A. Inmunologa e Inmunoqumica. Fundamentos. Editorial Mdica Panamericana S A 1996. 3. Baehner RL, Nathan DG. Quantitative nitroblue tetrazolium test in chronic granulomatous disease. N.Engl. J. Md. 278: 971-976. 1968. 4. Abramson JS, Wheeler JG. The Neutrophil. Oxford University Press. 1992. 5. Aderem A, Underhill DM. Mechanisms of phagocitosis in macrophages. Ann Rev Immunol 1999. 17:593-623.

Complemento
El sistema de complemento (C) est formado por unas 30 protenas del suero que interaccionan entre s de modo regulado formando una cascada enzimtica que permite una amplificacin de la respuesta inmune humoral. Las principales consecuencias de la activacin del C son: 1. Lisis del microorganismo o clula diana 2. Opsonizacin, con la consiguiente mejora de la fagocitosis y destruccin del microorganismo fagocitado 3. Quimiotaxis sobre los fagocitos 4. Accin anafilotxica, 5. Eliminacin de inmunocomplejos circulantes El complemento puede activarse por tres vas: 1. La va alternativa, en la que interacciona directamente con la superficie del microorganismo. 2. La va de las lectinas, una especie de variante de la va clsica, pero que se inicia sin necesidad de anticuerpos 3. La va clsica, a travs de la interaccin del C con inmunocomplejos. Las tres rutas comparten las ltimas fases, consistentes en el ensamblaje del denominado complejo de ataque a la membrana (CAM). El complemento puede ser estudiado para determinar su concentracin o funcionalidad en un animal sospechoso de padecer una inmunodeficiencia o una enfermedad autoinmune. La concentracin de los factores del complemento en un suero problema se miden por inmunodifusin simple radial o prueba de Mancini (ver captulo sobre reacciones secundarias). La funcionalidad del complemento en un suero problema se evala por la tcnica de hemlisis. Por otra parte, el complemento puede ser utilizado como un indicador de que la reaccin Ag-Ac tuvo lugar, ya sea para identificar antgenos como anticuerpos. Por ejemplo, la lisis por complemento se puede utilizar para tipificar grupos sanguneos en animales utilizando anticuerpos especficos. Mientras que, la tcnica de fijacin de complemento se emplea para detectar Acs especficos para el diagnstico de algunas enfermedades infecciosas, utilizando un Ag de referencia. Fundamentos de la hemlisis mediada por complemento: Cuando a una suspensin de GR sensibilizados con anticuerpos especficos se le agrega complemento, se produce la hemlisis y la consiguiente liberacin de hemoglobina (Hb) en el sobrenadante. Esta concentracin de Hb est en funcin directa con el grado de hemlisis que tuvo lugar en la muestra y puede ser evaluada por absorcin a 542 nm en un espectrofotmetro. Los estudios de cintica de esta inmuno-hemlisis han demostrado que la sensibilidad de estas valoraciones es mayor cuando el ttulo se establece sobre la base de la dosis de complemento que produce la lisis del 50% de los hemates del sistema. Esto tiene una explicacin clara si se analiza la curva que resulta de graficar los porcentajes de hemlisis en funcin de la cantidad de complemento agregado al sistema, puede observarse que dicho grfico no corresponde a una recta, sino a una curva sigmoidea que presenta una marcada pendiente en la zona que va del 25 al 75% de hemlisis. Los extremos de la curva,
23

que corresponden a la zona que va del 0 al 25% y del 75 al 100 % de hemlisis, presentan una pendiente significativamente menor o nula.

Figura 1: Porcentaje de hemlisis en una muestra de GR sensibilizados en funcin de la cantidad de complemento agregado. El porcentaje de hemlisis se mide como la concentracin de Hb que se obtiene en el sobrenadante por absorcin a 542 nm. Fuente de complemento: suero fresco de cobayo.

De este grfico se deduce que, cuando se hacen cuantificaciones de C a 50% de hemlisis, el consumo de pequeas cantidades de complemento produce cambios significativos en el porcentaje de hemlisis. Esta relacin no se observa cuando las cuantificaciones de C se realizan sobre la base del 100% de hemlisis. Por esto, la tcnica es ms sensible basndose en el 50% de hemlisis. Se define as la unidad de complemento hemoltica 50% (CH50), que corresponde a los mililitros de suero fresco completo (como fuente de complemento) que son necesarios para producir la lisis del 50% de los GR sensibilizados con anticuerpos, durante una hora de incubacin a 37C. La unidad CH50 se calcula sobre 5 X 108 eritrocitos ptimamente sensibilizados, resuspendidos en un volumen total de 7.5 ml, en presencia de concentraciones ptimas de Calcio y Magnesio, a una fuerza inica y a un pH ptimo para cada especie. Evaluacin de la funcionalidad del complemento en un suero problema En la prueba para evaluar la funcionalidad del complemento, los sueros de los animales problema y de referencia se diluyen en forma seriada en un rango que va desde 1/20 a 1/320. Luego se agrega una suspensin estndar de eritrocitos ptimamente sensibilizados a cada dilucin de suero. El complemento presente en el suero se activa por los Acs que recubren los GR (complejos inmunes) y causa la lisis de los eritrocitos (hemlisis). El porcentaje de hemlisis es proporcional a la concentracin de complemento dentro de cada dilucin de cada suero en particular. La hemoglobina liberada se mide en un espectrofotmetro luego del perodo de incubacin. Se deben realizar los siguientes controles: 0% de hemlisis (buffer + GR sensibilizados), y 100% de hemlisis (agua destilada + GR sensibilizados). El porcentaje de hemlisis para cada dilucin de suero evaluado se calcula de la siguiente forma: DO (problema) - DO (0%lisis) % de hemlisis = x 100 DO (100% lisis) - DO (0%lisis)

24

Este ensayo produce tambin una curva sigmoidea si se grafica el % de hemlisis vs. la dilucin del suero problema. El valor del 50% de hemlisis es el elegido para definir el ttulo de un suero como la inversa o recproca de la dilucin del suero que produce un 50% de hemlisis. Las muestras de suero que van a ser utilizadas para evaluar la funcin del C deben ser conservadas a -70C dentro de las 2 hs de extradas, dada la labilidad de las protenas del C. Mediante esta tcnica se evala la va clsica de activacin del complemento. Este ensayo tambin puede ser realizado usando placas de agarosa que contienen GR sensibilizados. El suero se agrega en hoyos cavados en la placa de agarosa y se permite que difunda durante 20 hs a 4C. Las placas se incuban luego a 37C por 90 min para permitir la hemlisis, que se ve como un anillo rodeando los hoyos, cuyo dimetro es proporcional al logaritmo de la concentracin del complemento en el suero.

Anticuerpos
Obtencin de anticuerpos policlonales o sueros hiperinmunes: Cuando se inmuniza un animal con un antgeno y se provoca una respuesta inmune aumenta notablemente en el suero del animal la cantidad de Igs especficas frente al antgeno empleado. Esto es la consecuencia de la seleccin clonal de los linfocitos B que producen anticuerpos contra el antgeno, el cual puede presentar diferentes epitopes, y cada uno de ellos ser reconocido por varios clones de linfocitos B que producirn inmunoglobulinas especficas. Como consecuencia de esta respuesta inmune humoral especfica se acumulan un nmero desconocido, posiblemente elevado, de diferentes molculas de inmunoglobulinas especficas frente al antgeno en el suero del animal inmunizado. Se trata de un suero producido por la accin de sntesis de numerosos clones de linfocitos B y por ello se ha denominado policlonal. (Figura 1)

Anticuerpo policlonal Figura 1: Produccin de anticuerpos policlonales.

25

El proceso de inmunizacin es aquel en el que se inyecta al animal el antgeno slo o con adicin de adyuvantes, cuya funcin es favorecer su inmunogenicidad. Cuando la inmunizacin se realiza sobre animales vrgenes o naive, a la primera dosis se la describe como: inmunizacin primaria o respuesta primaria. La primer dosis induce la sensibilizacin del individuo generando la expansin de los clonos especficos y la aparicin de clulas de memoria, pero la calidad de la respuesta en niveles de anticuerpos y clulas especficas puede ser incrementada y mejorada en dosis sucesivas, por lo tanto en los planes de inmunizacin se aplican diversas dosis. Existen numerosos protocolos de inmunizacin, con una duracin variable, aunque una fase de inmunizacin primaria suele durar de 1 a 3 meses con inyecciones cada 15 a 21 das, y el proceso puede durar de 3 a 6 meses (puede variar tambin de acuerdo con la especie a inmunizar). La cantidad de antgeno depender del animal empleado. Los ms comnmente utilizados son ratn, rata, conejo, cabra y gallina. Las cantidades oscilan de los 50 a 1000 g de antgeno para una dosis en ratn a los 0,25 a 5 mg por dosis en el caso de la cabra o los 15 mg en el caso de caballo. Cuando nuestro objetivo es obtener sueros hiperinmunes para utilizar como reactivos de diagnstico o inmunidad pasiva, los planes estn compuestos por varias dosis. Si nuestro objetivo es sueros anti-sueros de diferentes especies, debemos considerar la distancia filogentica para la eleccin de la especie dadora de suero. Como ejemplo, la utilizacin de la gallina como especie para obtencin de anticuerpos tiene dos ventajas: la distancia filogentica existente con los mamferos, y la purificacin de los anticuerpos de la yema del huevo, es engorrosa pero su obtencin no afecta la vida del animal dador. En conclusin, se denomina suero hiperinmune al obtenido de animales que han respondido a mltiples inoculaciones de un antgeno determinado. Las aplicaciones son numerosas, por ejemplo, como reactivos para el diagnstico de ciertas enfermedades. Estos sueros contendrn anticuerpos policlonales en alta concentracin contra los distintos componentes de un antgeno. Anticuerpos monoclonales Kohler y Milstein desarrollaron una tcnica que permiti la produccin de anticuerpos producidos a partir de un solo clon de linfocitos B. El fundamento de la tcnica consiste en fusionar linfocitos B provenientes de un ratn inmunizado con el antgeno de inters con lneas celulares provenientes de mielomas no secretante murino. Los hbridos resultantes presentan dos propiedades: secretan anticuerpos especficos hacia el antgeno empleado en la inmunizacin, proliferan indefinidamente y pueden ser mantenidos como lneas celulares. Esta tecnologa ha revolucionado el empleo de los anticuerpos, tanto en lo referido al enfoque diagnstico como teraputico. Es importante destacar que mediante esta metodologa se pueden obtener anticuerpos homogneos (ya que proviene de un nico clon de linfocitos B) y de muy alta especificidad, lo que facilita la puesta a punto y repetitividad de varias tcnicas inmunolgicas. Los anticuerpos monoclonales son inmunoglobulinas secretadas por un nico clon de linfocitos B y por lo tanto, con idntica secuencia aminoacdica en sus regiones variables. Poseen una especificidad nica, con una afinidad hacia el antgeno determinada e invariable y presentan un nico isotipo. En estas caractersticas residen las principales ventajas que presentan los anticuerpos monoclonales para su uso en investigacin y diagnstico. Por el contrario, los anticuerpos policlonales consisten en una mezcla de inmunoglobulinas provenientes de distintos clones de linfocitos B. A continuacin se enumeran las principales diferencias entre anticuerpos monoclonales y policlonales: Anticuerpos monoclonales: 1. Son qumicamente homogneos, poseen las propiedades individuales de la secuencia de aminocidos de ese particular anticuerpo. 2. Son de especificidad definida porque todas las molculas tienen la misma regin hipervariable.

26

3. Poseen una nica avidez y afinidad. 4. Su estabilidad fsico-qumica depende de cada anticuerpo monoclonal en particular. Pueden ser sensibles a cambios de pH, temperatura, liofilizacin y marcacin con enzimas o istopos. 5. En general, no poseen reactividad secundaria, o sea, no forman complejos antgenoanticuerpo insolubles con antgenos mono o bivalentes. Pueden hacerlo si el antgeno tiene epitopes repetitivos. 6. Se pueden producir en cantidades ilimitadas. Anticuerpos policlonales: 1. Son heterogneos. Sus propiedades constituyen un promedio de las propiedades de los distintos anticuerpos constituyentes (del antisuero). 2. Son una mezcla de anticuerpos con especificidades propias para cada epitope del inmungeno. Por lo tanto, la probabilidad de reacciones cruzadas con epitopes de otros antgenos es mayor a la de los anticuerpos monoclonales. 3. Su avidez y afinidad corresponden al conjunto de la mezcla de anticuerpos y varan en funcin del momento de la respuesta inmune en que se realiz la determinacin. As, la afinidad media de los anticuerpos detectada al comienzo de una respuesta inmune ser menor que la detectada a medida que la respuesta inmune avanza. Estos se debe a que a medida que la respuesta inmune se va desarrollando, se produce la maduracin de la afinidad de los anticuerpos. 4. Son estables como consecuencia de su heterogeneidad, lo que permite que sean ms resistentes frente a distintos cambios fsico-qumicos. 5. Poseen reactividad secundaria debido a la presencia de mltiples anticuerpos dirigidos contra distintos epitopes en la molcula antignica, lo que permite la formacin de una red antgeno-anticuerpo. 6. Se producen en animales inmunizados. Por lo tanto, es difcil de estandarizar.

Purificacin y fraccionamiento de anticuerpos

1-Aislamiento y Purificacin de Anticuerpos El aislamiento o la purificacin de anticuerpos se requiere para un gran nmero de tcnicas, tanto de diagnstico como de investigacin. Existe una amplia variedad de mtodos utilizados para purificar anticuerpos. La correcta eleccin del mtodo de purificacin depender de un nmero de variables, que incluyen: el uso posterior de los anticuerpos purificados, la especie y el material a partir del cual se parte, la clase y subclase de Ig (en el caso de un anticuerpo monoclonal). En la tabla 1 se muestran las posibles fuentes de anticuerpos para su purificacin. Tabla 1: Comparacin de diferentes fuentes de anticuerpos
Fuentes Tipo de Anticuerpo Concentracin de Anticuerpos totales (mg/ml) Concentracin de Anticuerpos especficos (mg/ml) Anticuerpos contaminantes Posible pureza de anticuerpos especficos (%)

Suero Sobrenadante de cultivo de hibridoma (con 10% de Suero Fetal Bovino) Sobrenadante de cultivo (sin Suero Fetal) Lquido asctico

policlonal

10

1 (10% mximo)

Otros Ac del suero Anticuerpos bovinos

10% como mximo

Monoclonal

0.05 (5%)

> 95%

Monoclonal Monoclonal

0.05 1-10

0.05 (100%) 0.9-9 (90%)

Ninguno

>95%

Anticuerpos de 90% ratn Fuente: Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory. 1988. pp726.

27

Mtodos de Aislamiento y purificacin

1-a Precipitacin
Las interacciones de una protena en agua ocurren entre las molculas de protena-agua y protena-protena. Cuando predominan las interacciones protena-agua, stas se hallan en solucin; cuando predominan las segundas (protena-protena), stas precipitan. Cuando a una protena que se encuentra en solucin acuosa agregamos una sal, como la sal es ms hidroflica que la protena, interacciona con el agua, le quita el agua y hace que predominen las interacciones protena-protena. Por lo tanto, la protena precipita. Es importante considerar el pH de la solucin de trabajo: Cuando el pH de la solucin es igual al punto isoelctrico (pI) de la protena, la carga neta de dicha protena es cero y por lo tanto sus molculas no se repelen, se aglomeran y precipitan. Es conveniente trabajar con sulfato de amonio a 4C: A mayor temperatura, mayor solubilidad proteica y viceversa; esto se cumple para el rango de 0 a 40C. En resumen, los factores que afectan la concentracin salina a la cual una protena en particular precipitar son: 1- el nmero y la posicin de los grupos polares; 2- el peso molecular de la protena a purificar; 3- el pH de la solucin; 4- la temperatura a la que se desarrolla la precipitacin. Precipitacin salina La precipitacin salina es un mtodo que permite separar las distintas fracciones proteicas del suero. Las sales mas comnmente utilizadas son el sulfato de amonio y el sulfato de sodio. La ventaja de trabajar con sulfato de amonio es que no se cristaliza a temperaturas bajas ni a temperatura ambiente, como lo hace el sulfato de sodio. La concentracin de sal a la cual precipitan los anticuerpos vara segn la especie. Por ejemplo, la mayora de los anticuerpos de conejo precipitan con una solucin saturada al 40%, mientras que los anticuerpos de ratn necesitan entre 40-50%. Precipitacin con cido caprlico La adicin al suero de cidos grasos de cadena corta como el cido caprlico en condiciones medianamente cidas, precipita la mayora de las protenas con excepcin de las IgGs. Esta metodologa, por lo tanto, permite obtener IgG purificada a partir de suero si se la realiza en combinacin con otras metodologas (por ejemplo, cromatografa de intercambio inico). 1-b Cromatografa La caracterstica que distingue a los mtodos cromatogrficos es la presencia de dos fases mutuamente no miscibles (una mvil y una estacionaria) que se hallan en contacto. La muestra a purificar se introduce en la fase mvil, por lo que es transportada a lo largo de una columna que contiene la fase estacionaria homogneamente distribuida. Los diferentes componentes de la muestra experimentan repetidas interacciones entre la fase mvil y la fase estacionaria. Durante el proceso, los componentes de la muestra se separan en funcin de su interaccin con la fase estacionaria: el componente que menos interacta es el menos retenido y eluye primero, el que ms interacta resulta retenido ms fuertemente y eluye ltimo. Una separacin ptima entre dos componentes de una muestra se obtiene cuando el componente que eluye en segundo trmino es retenido lo suficiente como para impedir su superposicin con el componente que eluy en primer trmino. Las macromolculas biolgicas difieren en sus caractersticas fisicoqumicas: tamao, forma, carga, hidrofobicidad y arreglo de sus grupos funcionales dentro de su estructura tridimensional. La separacin de las muestras entre las fases aprovecha las diferencias entre las propiedades fisicoqumicas de cada uno de los componentes de una muestra dada. Es lgico, por lo tanto, que los mtodos cromatogrficos ms comunes para la purificacin de estas molculas sean:

28

 Cromatografa de exclusin molecular (discriminacin por tamao y forma), Cromatografa de intercambio inico (discriminacin por carga), Cromatografa de interaccin hidrofbica (discriminacin por superficie hidrofbica), Cromatografa de afinidad (distribucin de aminocidos especficos en la superficie de las protenas, inmovilizacin de metales). Cromatografa de Exclusin Molecular

Fundamentos: Este tipo de cromatografa utiliza como soporte esferas de gel con poros de diferente tamao. Una columna construida de esta manera tendr dos volmenes medibles, el volumen externo (Vo), constituido por el volumen intersticial (el espacio que queda entre las esferas de gel), y el volumen interno (Vi) que es el volumen de las esferas a los que los solutos y solventes pueden acceder cuando se introducen dentro de aqullas a travs de sus poros. Las molculas que no puedan acceder al Vi, debido a que su tamao es mayor al de los poros, slo se equilibrarn en el Vo, mientras que las de menor tamao se equilibrarn en ambos volmenes. Cuando una muestra compleja de protenas y otros componentes, disuelta en un pequeo volumen, es aplicada a una columna con estas caractersticas, filtrar a travs de la misma. Las protenas de mayor peso molecular eluirn con el Vo y por lo tanto eluirn primero, mientras que las protenas de menor tamao, que pueden acceder al Vi, eluirn ms tardamente y en un volumen de elucin (Ve) determinado que depender de su peso molecular. Ver esquema

Aspectos metodolgicos: La matriz ms utilizada en este tipo de cromatografa es Sephadex , que se expende en forma de polvo y puede tener diferentes tamaos de poro, lo que implica la separacin de protenas de diferente tamao. Las muestras no pueden contener una concentracin proteica de ms de 50 mg/ml. Las muestras deben ser clarificadas por centrifugacin a fin de eliminar todo el material insoluble que pueda disminuir el flujo de la columna y contaminar la matriz de la misma previo a la cromatografa. La fuerza inica de los solventes cromatogrficos debe ser lo suficientemente elevada como para impedir la adsorcin inespecfica del soluto a la matriz por interacciones electrostticas o uniones de Van Der Waals Como las molculas de IgM son mucho ms grandes que las molculas de IgG y de otras protenas que se encuentran en el suero, la cromatografa de exclusin molecular puede

29

ser usada para separar IgM. Cuando se requiere obtener una preparacin pura de IgM, se puede utilizar esta tcnica combinada con la precipitacin con sulfato de amonio. Cromatografa de Intercambio Inico

Fundamentos: La cromatografa de intercambio inico trabaja mediante la unin de biomolculas con una carga determinada, a una matriz estacionaria de carga opuesta. Las biomolculas se unen a resinas de intercambio inico cuando tienen carga opuesta a la de los iones fijos de la resina. Esta unin es de tipo electrosttico y reversible: La fuerza de esta unin puede ser modificada variando la concentracin salina y el pH de la solucin buffer utilizada como eluyente. La separacin de dos o ms sustancias mediante la utilizacin de resinas de intercambio inico se consigue por un mecanismo de adsorcin reversible, que consiste en la fijacin inicial y posterior remocin de tales sustancias a una resina estabilizada. Si las sustancias fijadas tienen diferentes propiedades elctricas, mediante la variacin del pH o fuerza inica del eluyente se conseguir que cada una de ellas eluya por separado. Matrices y solventes: La matriz puede estar constituida por silicato de aluminio, resinas sintticas, polisacridos como la celulosa o el dextrano, etc. La naturaleza de los grupos cargados es la que determina el tipo y la fuerza de unin del in intercambiador. Los dos tipos de resinas ms utilizadas son: de intercambio catinico (con matrices con carga negativa) y de intercambio aninico (con matrices con carga positiva). La eleccin correcta de la resina, en especial en lo que se refiere al grupo funcional que le aporta la carga, depender de la carga neta de la sustancia que se desea separar. En los casos de molculas anfotricas como las protenas, que poseen grupos cargados positiva y negativamente, su carga neta depender del pH del medio. Estas sustancias, segn sea el pH del medio, podrn unirse a resinas aninicas o catinicas; en su punto isoelctrico (pI), tendrn carga neta cero y no se fijarn a ningn tipo de resina intercambiadora. Cromatografa de Afinidad Fundamentos: La tcnica de cromatografa de afinidad es una de las tcnicas ms utilizadas para la purificacin de protenas. Consiste en una cromatografa de adsorcin en la que se aprovecha la especificidad de interacciones biolgicas como las interacciones antgeno-anticuerpo, enzima-inhibidor, hormona-receptor, lectina-hidrato de carbono, etc. La biomolcula que se quiere purificar (por ejemplo, un anticuerpo) usualmente tiene un sitio de reconocimiento a travs del cual puede interactuar con otra molcula natural o artificial a la que se llama ligando. El ligando es inmovilizado sobre una matriz polimrica y es usado para capturar selectivamente a la biomolcula que se desea purificar, cuando sta se encuentra en una mezcla impura. La biomolcula deseada puede ser eluda del ligando por cambios en las condiciones externas (pH, fuerza inica, solventes y temperatura) que desestabilizan la interaccin biomolcula ligando y permiten que la molcula deseada sea eluida en forma purificada. Existe una gran diversidad de biomolculas que pueden purificarse por este mtodo cromatogrfico, entre ellas: antgenos, anticuerpos, enzimas, protenas unidas a hormonas, protenas unidas a vitaminas, receptores, glicoprotenas, lectinas, ARN, ADN, bacterias, virus, fagos, clulas y protenas producidas por ingeniera gentica. La naturaleza de la matriz a la que se fijan los ligandos es muy importante, ya que en las condiciones experimentales debe ser fsica y qumicamente estable, no debe actuar como tamiz molecular y debe asegurar un buen flujo durante la elucin. Existen numerosas matrices comerciales disponibles en su forma activada o sin activar para ser utilizadas como soporte para el ligando. La activacin de la matriz se realiza para que el

30

ligando quede inmovilizado en ella a travs de una interaccin qumica que produzca una unin estable entre matriz y ligando. En general, se utilizan matrices de naturaleza polisacrida, en su mayora derivados de la agarosa. Debido a su estructura qumica, estas matrices tienen la caracterstica de ser casi inertes, de forma que no producen interacciones inespecficas. Esto es esencial porque la cromatografa de afinidad se basa en interacciones especficas. La seleccin del ligando utilizado en cromatografa de afinidad debe tener en cuenta: 1- que la afinidad de unin del ligando sea especfica y reversible por la sustancia que ser purificada. 2- que el ligando posea grupos qumicamente modificables que permitan su unin a la matriz sin que se destruya su capacidad de unin a la sustancia que ser purificada. Por ejemplo, si el ligando es un anticuerpo, ste se va a unir a la matriz a travs de su porcin Fc, y por lo tanto, quedar libre el sitio de unin al antgeno. Al agregar un antgeno, ste ser reconocido y unido por el anticuerpo inmovilizado en la columna. Las dems molculas presentes pero no unidas a la matriz (no reconocidas por el ligando) se eliminan por lavado. Posteriormente, el antgeno unido al anticuerpo de la columna se eluye y se obtiene en forma pura. El ligando idealmente debera tener una afinidad de unin de 10-4 a 10-8 M-1 en solucin. Si la constante de disociacin es mayor que 10-8 M-1 esta tcnica no puede ser utilizada para la purificacin de estas molculas pues la unin es muy estable y la separacin de la biomolcula del ligando se hace muy difcil. Estas afinidades muy altas corresponden a la interaccin hormona-receptor para lo cual este mtodo no resulta til. Ejemplos: Purificacin por columna de protena A-sepharosa: La protena A se encuentra en las paredes celulares de Staphylococcus aureus y tiene la particularidad de unirse al fragmento Fc de anticuerpos. Se han encontrado protenas similares en otras bacterias (por ejemplo protena G en Streptococcus sp.). Aunque se desconoce la explicacin biolgica de la fuerte afinidad que tienen la protena A y la protena G con las molculas de IgG, se supone que representara un mecanismo de escape de las bacterias a la respuesta inmune del husped. A partir del estudio de estas protenas, se las comenz a utilizar para purificar especficamente anticuerpos a partir de una muestra impura. La protena A se acopla a una matriz de sepharosa activada. En la Tabla 2 se muestran las afinidades de las protenas A y G con anticuerpos de diferentes especies: Tabla 2 Especie Afinidad por Protena A Afinidad por protena G Humano ++++ ++++ Caballo ++ ++++ Vaca ++ ++++ Cerdo +++ +++ Oveja +/++ Cabra ++ Conejo ++++ +++ Hamster + ++ Pollo + Cobayo ++++ ++ Rata +/++ Ratn ++ ++ Fuente: Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory. 1988. pp726.

31

Purificacin por columnas de inmunoafinidad En este caso se puede utilizar una columna a la que se une un anticuerpo especfico frente al antgeno que se va a purificar o una columna a la que se une un antgeno, al colocar la muestra a purificar solo se unirn los anticuerpos especficos frente a ese antgeno. Purificacin por columnas de afinidad a metales El nquel es un metal que tiene afinidad por el aminocido histidina. Esta propiedad es aprovechada para la purificacin de protenas recombinantes a las que se le agrega una cola de 6 histidinas. La columna unida al nquel permite la purificacin de dichas protenas por su afinidad al aminocido histidina. Posibles mtodos de elucin de la muestra: La fuerza de los complejos antgeno-anticuerpo depende de la afinidad relativa y la avidez de los anticuerpos. La orientacin estrica, la densidad de acoplamiento y las interacciones no especficas pueden tambin influenciar la unin. Antgenos y anticuerpos estn unidos por una variedad de fuerzas, las cuales incluyen: -Fuerza inica -Interacciones hidrofbas -Puentes de hidrgeno -Fuerzas de Van Der Waals El objetivo de la elucin es recuperar la protena unida especficamente con un alto rendimiento, pureza y estabilidad. Para ello es necesario recuperar los antgenos o anticuerpos provenientes de los inmunocomplejos. 1-Elucin especfica: Utiliza soluciones de elucin con diferentes caractersticas, entre las cuales se encuentran alto pH, presencia de calcio o magnesio, presencia de agentes quelantes como el EDTA, etc. 2-Elucin cida: Se puede utilizar Glicina-HCl 0.02M pH 2.5, Citrato de sodio pH 2.5, etc. En algunos casos en que las soluciones que se utilizan aumentan las interacciones hidrofbicas entre antgeno y anticuerpo, se obtiene una baja recuperacin con este tipo de metodologa. La disociacin de estos complejos inmunes puede hacerse ms efectiva si se incorpora cido propinico 1M o 10% de dioxano o etilenglicol al eluyente cido. 3-Elucin bsica: Este tipo de elucin se utiliza para obtener protenas de membrana que se unen por interacciones hidrofbicas y otros antgenos que precipitan en condiciones cidas pero son estables en condiciones bsicas. Es menos frecuentemente utilizada que la elucin cida. Pueden usarse los siguientes compuestos: NaOH 1M, Dietilamina 0.05 M pH 11.5, etc. 4-Elucin por agentes caotrpicos: Estos agentes desestabilizan la estructura terciaria de las protenas. Se utilizan para romper interacciones inicas como los puentes de hidrgeno y algunas interacciones hidrofbicas. Los agentes caotrpicos ms utilizados son: guanidinio, urea-HCl 6M etc. En la Figura 1 se esquematiza la metodologa de purificacin de protenas por columna de afinidad. Regeneracin de las columnas El ltimo paso, luego de la elucin por cualquier mtodo de eleccin, es la regeneracin de las columnas de afinidad. Este paso es importante dado que las columnas pueden reusarse y tras sucesivos lavados con soluciones buffer se pueden utilizar para otras muestras.

32

Figura1: Esquema de purificacin de una protena a travs de una columna de afinidad Interaccin ligando-receptor (unin reversible)

a) Inmovilizacin del ligando

Matriz

+
Ligando

b) Adsorcin del ligando al receptor en una muestra

compleja
+ impurezas

Muestra

c) Elucin de la muestra unida (receptor) en forma pura

pura

+
En la tabla 3 se muestran los mtodos de purificacin de anticuerpos. Generalmente es necesario utilizar varias tcnicas para obtener una mejor purificacin

33

Tabla 3: Mtodos de aislamiento y purificacin de anticuerpos

Aplicaciones Ventajas Desventajas Precipitaciones y cromatografa de intercambio inico (DEAE) Aislamiento y concentracin de anticuerpos de todas las fuentes y espacios. No como paso nico. cido caprlico para IgG. Fcil. Bajo costo. til para grandes volmenes. Concentra la muestra. Rinde anticuerpos impuros. No se usan solas. cido caprlico no se usa para IgM.

Aislamiento

Sulfato de amonio/ Ac. Caprlico DEAE/ Sulfato de amonio Aislamiento a partir de lquido asctico y suero policlonal. Bajo costo. til para grandes volmenes. Rinde anticuerpos casi puros. Exclusin molecular Obtencin de IgM. No como paso nico. Separa IgM de otros anticuerpos en sueros policlonales. Rinde anticuerpos impuros. Diluye la muestra. No para IgG. Requiere mltiples pasos. Rendimiento moderado. Con cido caprlico solo IgG.

Cromatografa de afinidad: Protena A Obtencin de IgG. Anticuerpos puros. Fcil. Un paso. Altos rendimientos. Caro.

Purificacin

Cromatografa de afinidad: Antgeno (Inmunoafinidad) Purificacin de lquido asctico y sueros policlonales. Rinde anticuerpos puros y especficos. Caro. Muchos pasos. Antgenos puros. Inactivacin de anticuerpos.

Cromatografa de afinidad: Anticuerpo (Inmunoafinidad) Purificacin de clases y subclases de anticuerpos especficos de sueros policlonales. Rinde anticuerpos especficos de especie. Caro. Rendimiento bajo a moderado. Muchos pasos.

2- Fraccionamiento de anticuerpos El uso de un anticuerpo intacto en algunas tcnicas inmunoqumicas introduce ciertos problemas. Por ejemplo, muchas clulas tienen receptores para el fragmento Fc de los anticuerpos y al interaccionar con ellos puede ocurrir activacin celular, lisis, etc. Estos problemas se pueden resolver si se utilizan fragmentos de anticuerpos. Como mtodo de estudio de la estructura de las inmunoglobulinas, se han empleado enzimas proteolticas que clivan a los anticuerpos en diferentes fragmentos. Las enzimas que ms se utilizan son la papana, la tripsina y la pepsina. En la figura 2 se muestran los resultados esperados de la digestin de los anticuerpos con las diferentes enzimas. La papana cliva la molcula de IgG en tres fragmentos de semejante peso molecular (45 a 50kDa). Dos de estos fragmentos, idnticos entre s, son denominados Fab (fragmento de unin al Ag). En ellos reside la capacidad de reconocimiento antignico, expresando una nica valencia. El tercer fragmento, denominado Fc (fragmento cristalizable) no participa en el reconocimiento antignico. La tripsina acta de manera similar a la papana y permite obtener los mismos fragmentos. La pepsina, por su parte, cliva el fragmento Fc en piezas pequeas y deja el resto de la molcula intacta. Esta porcin intacta, denominada (Fab)2, se halla constituida por dos fragmentos Fab unidos a travs de los puentes disulfuro intercatenarios. Presenta, por lo tanto, dos sitios de reconocimiento antignico por lo que su valencia es dos.

34

Un tercer fragmento de anticuerpos, el Fv, es de gran utilidad para los estudios de afinidad de antgeno y anticuerpo. Este fragmento est compuesto por las porciones variables de las cadenas liviana y pesada, con lo cual posee un slo sitio de combinacin al antgeno. Tanto el fragmento Fab como el fragmento (Fab)2 estn estabilizados por los puentes disulfuro intercatenarios. Dado que el fragmento Fv no posee estas uniones, debe estabilizarse agregando un pptido de unin o linker. El fragmento linker es una pequea secuencia que une el extremo amino terminal de la cadena liviana con el extremo carboxiterminal de la cadena pesada. La estructura que se obtiene recibe el nombre de single chain fraccin variable (scFv) que se puede sintetizar mediante tcnicas de ADN recombinante.

Papaina

Pepsina

Bibliografa: 1. Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory. 1988. pp726. 2. Affinity Chromatography: principles and methods. Pharmacia fine chemicals. 3. Cuatrecasas, P; Wilchek, M and Anfinsen, C. B. Selective enzyme purification by affinity Chromatography. 1968. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 61: 636-643. 4. Fainboim, L; Satz L y Geffner, J. Introduccin a la Inmunologa Humana. 1999. 387 pp 5. Gagnon, P. Purification tools for monoclonal antibodies.1996. Validated Biosystems. Inc.249 pp. 6. Margni, R. A. Inmunologa e Inmunopatologa. Fundamentos. Editorial panamericana Buenos Aires quinta edicin. 1996. 976pp 7. Roitt, I; Brostoff, J and Male, D. Immunology . Fifth Edition. Mosby International. LTD. 423 pp. 8. Subramanian, A. Immunoaffinity Chromatography. 2000 Methods in Molecular Biology Vol 147: 95-104.

35

9. Kent, U.M. Purification of Antibodies Using Affinity Chromatography. 1999. Methods in Molecular Biology Vol 115: 23-28. 10. Wilchek, M and chailen, I. An Overview of Affinity Chromatography. 2000. Methods in Molecular Biology. Vols 147: 1-6.

Protenas del plasma y suero

La sangre est compuesta por clulas (eritrocitos, leucocitos y plaquetas) y plasma. Cuando se extrae sangre venosa con anticoagulantes, los elementos celulares en suspensin pueden ser separados por centrifugacin. El sobrenadante que se obtiene, denominado plasma sanguneo, posee un 10% de solutos disueltos, compuestos a su vez por un 2 % de nutrientes orgnicos y sustancias de desecho, un 1% de sales inorgnicas y un 7% de protenas plasmticas. Si por el contrario dejamos que la sangre extrada coagule y luego la centrifugamos, obtendremos lo que denominamos suero, que no posee fibringeno ya que es el precursor de la fibrina, protena formadora del cogulo sanguneo y se consume durante la coagulacin. El suero contiene las mismas protenas del plasma excepto el fibringeno y los factores V y VIII de la coagulacin que son consumidos durante la formacin del cogulo. El fibringeno, precursor de la fibrina, es producido por el hgado y constituye el 4 6 % de las protenas totales del plasma. Si se somete un suero a una corriente elctrica y bajo determinadas condiciones (electroforesis) las protenas del suero se distribuyen en diferentes fracciones, a saber: *Albminas: es la protena ms abundante del suero, vara segn la especie entre un 35 y 50% de las protenas totales. Es sintetizada por el hgado y su principal funcin es el mantenimiento del volumen (equilibrio osmtico). Adems es transportadora de sustancias poco solubles en agua (ej: cidos grasos libres). *Globulinas: la fraccin globulnica de las protenas plasmticas es una mezcla muy compleja que se agrupa en cuatro fracciones con funciones diferentes: alfa-1, alfa-2, beta y gamma 1. -1 globulinas: Glicoprotenas Globulina fijadora de tiroxina Protrombina Antitripsinas HDL (lipoprotena de alta densidad) 2. -2 globulinas: Factor IX Antiplasmina Haptoglobina Ceruloplasmia Amiloide A VLDL (Lipoprotena de muy baja densidad) LDL (Lipoprotena de baja densidad) 3. -globulinas: Transferrina Fibringeno Factores del Complemento Protena C reactiva

36

Amiloide A Ferritina Pueden aparecer trazas de IgM, IgA e IgG en especies domsticas.

4. Fraccin globulinas: IgM IgA IgE en concentraciones nfimas IgG Cada especie posee un perfil electrofortico caracteristico, a modo de ejemplo se muestran los Valores Normales en suero para caninos Protenas Totales 5.50 - 7.50 g/dl Albminas Globulinas Globulinas Globulinas Relacin A/G 2.47 - 3.60 g/dl 0.66 - 1.57 g/dl 1.04 - 2.17 g/dl 0.33 - 0.75 g/dl 0.70 - 1.20

Electroforesis
Se conoce como electroforesis al movimiento de partculas cargadas bajo la influencia de un campo elctrico. Cuando una mezcla de molculas que presentan diferente carga neta y tamao es colocada en un campo elctrico uniforme, migran a distintas velocidades. Como resultado, ocurre la separacin de estas sustancias. La velocidad de migracin de una sustancia en un campo elctrico depende de varios factores tales como la carga, el tamao de la partcula, el pH, la fuerza inica, la viscosidad del medio y adems, la temperatura e intensidad de la electricidad. Las protenas y los aminocidos poseen cargas positivas y negativas debido a la presencia de grupos ionizables como el grupo carboxilo o el grupo amino, lo que hace que en una solucin se comporten como anfolitos. As, dependiendo del pH de la solucin, pueden existir en tres formas inicas: *Cargados positivamente *Cargados negativamente *Sin carga o como molculas neutras (en una solucin con pH igual a su punto isoelctrico). El punto isoelctrico (PI) de una molcula (en este caso una protena) es el pH en el cual la carga neta de la misma es cero. Si se mantiene a este pH, la protena no migra cuando se la somete a la accin de un campo elctrico. El PI es inherente a la estructura primaria de la protena, pues depende de cules aminocidos forman la cadena polipeptdica. Por lo tanto, a determinado pH, distintas protenas con distinto punto isoelctrico tendrn distinta carga neta, lo que permitir separarlas e identificarlas por medios electroforticos. J. Tiselius fue el primero que utiliz la electroforesis en 1937 para separar los componentes del suero. Existen dos mtodos generales para separacin de protenas por electroforesis: electroforesis libre o de frente mvil, que se realiza en una fase lquida, y electroforesis de zona, que utiliza una matriz slida o soporte, como el papel de filtro, membranas de acetato de celulosa o geles de almidn, poliacrilamida, agar o agarosa. Estos materiales son porosos e hidratados y permiten retener las protenas. De ambas, la electroforesis de zona es la que tiene mayor aplicacin en el laboratorio clnico por su sencillez y mayor capacidad de resolucin. Para la separacin de las protenas del suero, por ejemplo, se utiliza frecuentemente acetato de celulosa como matriz y se escoge un

37

pH alcalino, en el que todas las protenas estn cargadas negativamente y migran hacia el polo positivo (nodo). En estas condiciones, la albmina es la que migra ms rpidamente hacia el polo positivo, seguida por: alfa, beta y gammaglobulinas. Tcnica La muestra se siembra sobre un soporte de agar o acetato de celulosa y se somete a corriente elctrica. El paso de la corriente provoca la migracin de las diferentes protenas que conforman la muestra, pero cada una de ellas lo har a una velocidad diferente segn su punto isoelctrico. El pH del buffer utilizado es de 8,6, a este pH, todas las protenas estn cargadas negativamente. La ms cargada es la albmina, con un PI mucho menor que el pH del medio (PI de la albmina: 4,4); las menos cargadas, por el contrario, son las gammaglobulinas, con un PI mucho ms cercano al pH del buffer (PI de las gamaglobulinas: 6,8-7,2). Por lo tanto, las albminas son las que migran ms rpido hacia el polo positivo, seguidas por las alfa, beta y por ltimo las gammaglobulinas. Al efecto de la carga se suma el efecto electroendosmtico, que consiste en un movimiento en sentido opuesto a la corriente elctrica que detiene parcialmente la corrida de las protenas. Este es causado porque la mayora de los soportes no son neutros. Debido a su carga fuertemente negativa, las albminas logran superar ampliamente el efecto, mientras que las gammaglobulinas, cuya carga negativa es menor, no pueden superarlo tan fcilmente y quedan detenidas en el punto de siembra o incluso son arrastradas hacia el polo negativo. Materiales Tiras de acetato de celulosa para electroforesis Solucin amortiguadora (Buffer Veronal pH 8,4-8,6) Cuba de electroforesis Fuente de poder Solucin colorante Solucin decolorante Solucin transparentizante Densitmetro Integrador Procedimiento Es fundamental que todo el material que se vaya a utilizar est bien limpio y seco. 1. Se sumergen las tiras en la solucin amortiguadora (buffer) durante por lo menos 10 minutos. 2. Se elimina el exceso de lquido entre dos hojas de papel de filtro. 3. Se extienden las tiras sobre un portaobjetos teniendo la precaucin de que no queden burbujas entre el vidrio y la tira. Las tiras de acetato de celulosa tienen dos caras diferentes: una es la superficie penetrable donde deben sembrarse las muestras, la otra no es penetrable de tal manera que no debe ser utilizada para la siembra. Para diferenciarlas, las tiras tienen uno de sus ngulos recortado, este debe quedar ubicado en el ngulo inferior derecho. 4. Se coloca el portaobjetos sobre el puente de la cuba de electroforesis. 5. Se siembran las muestras con el sembrador. Los sembradores estn estandarizados para sembrar siempre el mismo volumen de muestra. Los equipos generalmente traen 3 sembradores de diferente volumen. Segn el ancho de sembrador que se utilice, se podrn sembrar 1, 2 3 muestras por tira. Una de las muestras se tie con azul de bromofenol, el cual se asocia a las molculas de prealbmina y permite identificar el frente de corrida. 6. La cuba se llena hasta una altura determinada con el buffer de corrida, se conecta a la fuente de poder y se aplica una corriente constante de 200 voltios durante 30 minutos. El grado de separacin obtenido para las protenas de una muestra dada, vara segn sea la especie de la que de proceda la muestra y depende del tiempo de corrida y del voltaje aplicado. Por lo tanto, estos parmetros deben estandarizarse previamente segn las

38

necesidades de cada caso en particular. (Por ejemplo, una muestra de suero equino se corre a 200 voltios durante 25 minutos; una muestra de suero canino se corre a 180 voltios durante 20 minutos). 7. Una vez finalizada la corrida, se desconecta la cuba de la fuente de poder y se procede a colorear las tiras, sumergindolas durante 5 minutos en la solucin colorante de proteinas. 8. Se procede luego a la decoloracin de la tira, sumergiendo las tiras en solucin decolorante. El objetivo del decolorante es barrer con el colorante que no se uni a las proteinas. Este procedimiento se repite hasta que las tiras queden blancas (es conveniente ir renovando la solucin decolorante durante este procedimiento). 9. Las tiras se sumergen en metanol puro durante 30 segundos y luego en la solucin transparentizante durante 1 minuto. 10. Las tiras se colocan sobre un portaobjetos con el ngulo cortado de la tira ubicado en el ngulo inferior izquierdo (en forma invertida a como lo sembramos), de esta forma la cara sembrada queda boca abajo, mirando el vidrio. No deben quedar burbujas entre el vidrio y la tira. 11. Los portaobjetos se colocan en una estufa a 80 C hasta su transparentizacin total. La tira de acetato debe quedar completamente transparente para que pueda efectuarse la medicin por densitometra. 12. Las diferentes bandas de protenas separadas a partir de la muestra original sobre la tira de acetato de celulosa, teidas y transparentizadas, son ledas en un densitmetro. El aparato debe ser previamente calibrado segn la longitud de onda que vamos a utilizar (generalmente 520 nm), el largo de la tira que vamos a medir y la concentracin de protenas de la que partimos. El densitmetro detecta y registra los datos de absorcin de luz de cada banda de protena y los transforma en un valor numrico de concentracin y en un grfico (ver figura al final del tema) Aplicaciones de la electroforesis La electroforesis es un mtodo extraordinariamente valioso para el diagnstico de las alteraciones en los componentes proteicos del suero, orina y lquido cefalorraqudeo (LCR). Mediante esta tcnica se puede diagnosticar un aumento, disminucin o alteracin de las protenas (paraprotenemias) Por ejemplo ciertas patologas como: Mieloma mltiple: se detecta la aparicin de una banda o curva restringida en la regin de las gamma globulinas, asociada a hallazgos anormales en la electroforesis de orina (protena de Bence-Jones) Hipogammaglobulinemias: Disminucin de las gammaglobulinas. Esclerosis Mltiple: Aparicin de bandas oligoclonales en el LCR (en humanos). Hipoproteinemias por prdida de protenas por el sistema digestivo: Disminucin general de todas las protenas. Dficit de alfa-1 antitripsina: Disminucin de las alfaglobulinas. Enfermedades infecciosas o neoplsicas agudas: Aumento de alfa-1 globulinas. Sndrome nefrtico o procesos hemolticos: Aumento de alfa-2 globulinas. Debe hacerse hincapi que la electroforesis es casi siempre una prueba que puede llevar a un diagnstico presuntivo de las anormalidades de las protenas del suero, orina o LCR. Ejemplos de hiperglobulinemias Policlonales - Infecciones virales, bacterianas (brucelosis, piodermis), hongos, parsitos (dilofilarias). - Enfermedades inmunomediadas: Lupus eritematoso sistmico Trombocitopenia inmunomediada Anemia hemoltica autoinmune. Pnfigo. Artritis reumatoidea, Poliartritis - Neoplasias (generalmente no relacionadas con el sistema inmune)

39

Monoclonales - Neoplasias (Mieloma mltiple, linfosarcoma, macroglobulinemia.) Ejemplos de hipoalbuminemias Resultado de enfermedades como insuficiencia heptica crnica y sndrome de mala digestin mala absorcin. Hipergammaglobulinemia Secuestro de protenas en cavidad pleural, peritoneal y tejido subcutneo. Dilucin por fluidoterapia. Patologas renales (glomerulopatas). Quemaduras Ejemplos de hiperalbuminemia Deshidratacin Patrones de electroforesis de anomalas de las protenas sricas en diversas enfermedades

ACETATO DE CELULOSA

PROTEINOGRAMA

40

Patrn electrofortico del LCR en un sujeto normal y en un enfermo con esclerosis mltiple

ACETATO DE CELULOSA

PROTEINOGRAMA

Patrn electrofortico de las anomalas urinarias en mieloma ACETATO DE CELULOSA PROTEINOGRAMA

Bibliografa 1. Morilla A. y Bautista C. R. Manual de Inmunologa Mxico: Editorial Diana.1 edicin, septiembre de 1986. Captulo 6. 2. Margni R. A. Inmunologa e Inmunohistoqumica Fundamentos. Bs.As.: Editorial mdica Panamericana 1 edicin, octubre de 1972. Edicin consultada: 5 edicin septiembre de 1996. Captulo V. 3. Stites Daniel P. y Terr Abba I. Inmunologa Bsica y Clnica Editorial El Manual Moderno S.A. de C. V. Mxico D.F. 7 edicin. 1993 Seccin II. Captulo 18. 4. Inmunologa bsica. Gua de trabajos prcticos. Fac. Cs. Veterinarias. Ao 2000.

41

Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE)

La tcnica de electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) es un mtodo analtico de mezclas de protenas u otras sustancias que combina la velocidad de migracin por accin de un campo elctrico (relacionado con el tamao molecular de la sustancia) con el tamizado molecular (relacionado con el tamao del poro del gel soporte), para separar los componentes de una muestra simple o compleja. Los geles de poliacrilamida pueden ser: PAGE no desnaturalizante: La muestra se analiza en su estado natural y este mtodo nos permite identificar el peso molecular (PM) de sus componentes. SDS-PAGE: La muestra se analiza luego de un proceso de disociacin de la muestra con detergentes. Este mtodo es el ms utilizado en Inmunologa y nos permite identificar antgenos o epitopes secuenciales ya que la muestra que se analiza est desnaturalizada o disociada. A continuacin describiremos las caractersticas del SDS-PAGE. Las muestras a analizar son hervidas a 100C en presencia de un agente disociante (dodecilsulfato de sodio o SDS), presente en exceso y un agente desnaturalizante (2mercaptoetanol o 2-ME). En estas condiciones, el grupo tiol del 2-mercaptoetanol rompe los puentes disulfuro que puedan existir y hace que la protena se desdoble en sus polipptidos constitutivos, los que fijan SDS en una relacin constante (1.4g SDS/g de protena). La carga del poliptido se hace insignificante ante el exceso de carga negativa del SDS. En consecuencia, la carga de todas las molculas ser idntica y su desplazamiento en el campo elctrico depender exclusivamente de su tamao molecular. El SDS-PAGE permite determinar aproximadamente el PM de una protena si se la compara con patrones conocidos que hayan sido analizados simultneamente. El gel utilizado en esta tcnica resulta de la polimerizacin en largas cadenas de acrilamida monomrica y su entrecruzamiento con la NN-metilenbisacrilamida. La polimerizacin necesita un iniciador del proceso, como el NNNN-Tetrametildiamina (TEMED) y el persulfato de amonio (PSA). El TEMED cataliza la formacin de radicales libres a partir del persulfato de amonio. La concentracin de los componentes del gel (acrilamida y bis-acrilamida) utilizados en su armado determina el dimetro de poro. Cuanto mayor es el porcentaje de acrilamida/bisacrilamida utilizado, ms pequeo es el poro obtenido. De acuerdo al PM que necesitemos estudiar se seleccionar un determinado poro de gel, por ejemplo: 15% de acrilamida permite separar un PM de 12 a 45 kD 10% de acrilamida permite separar un PM de 17 a 50 kD 5% de acrilamida permite separar un PM de 60 a 200 kD Las muestras se siembran en un gel de poro grueso (gel de paso rpido, apilamiento o stacking) que permite que todos los componentes de la muestra se concentren en una zona estrecha y comiencen la migracin por el gel de separacin en forma simultnea, lo que facilita la comparacin entre muestras y los patrones de PM. Existen sistemas de geles continuos y discontinuos. En los sistemas discontinuos (los ms usados) los buffers utilizados para los geles de apilamiento y de separacin poseen diferente fuerza inica y pH.

42

En forma de sntesis los pasos a seguir son: A- Armado del gel de poliacrilamida B- Preparacin de las muestras C- Siembra de las muestras en el gel D- Corrida electrofortica E- Tincin del gel F- Anlisis e interpretacin de los resultados Los geles teidos muestran la complejidad de las muestras ya que en cada calle se observarn un nmero de bandas variables dependiendo de las distintas protenas que componen la mezcla. La distancia que recorri cada protena en el gel desde el sitio de sembrado de la muestra es proporcional a su peso molecular, por lo tanto, cuanta ms distancia recorrida menor el PM de esta protena. Las protenas del mismo PM corren en forma conjunta. Algunas de las utilidades son: Identificar el PM de los componentes en muestras complejas Identificar pureza en extractos purificados Constituir el primer paso para el anlisis antignico en muestras que se conoce como inmunoblot Anexo A modo de ejemplo, se describen los pasos necesarios para realizar un gel de poliacrilamida al 15% utilizando la cuba Mini-Protean II (nombre comercial del equipo provisto por laboratorios Bio-Rad). 1. Armado del gel entre de placas de vidrio: Realizar una delicada limpieza de las placas de vidrio con alcohol etlico. Formar un sndwich con ambos vidrios ubicando entre ellos los espaciadores. Ubicar el sndwich en la abrazadera de manera que la placa ms pequea quede hacia delante (introducir entre ambos platos la tarjeta alineadora). Ajustar los tornillos de la abrazadera en forma manera cruzada. Verificar que no existan prdidas de lquido: colocar agua entre ambos platos con una pipeta plstica y observar si el nivel de agua desciende. Si existen prdidas, rehacer el armado.

43

2. Preparacin de la solucin de poliacrilamida-bisacrilamida La preparacin del gel de poliacrilamida debe realizarse en un frasco limpio y desengrasado. Debe trabajarse siempre con guantes y preferentemente con barbijo (la acrilamida es una sustancia neurotxica que se absorbe a travs de piel y mucosas). El oxgeno inhibe la polimerizacin, por lo que se recomienda desgasificar el agua y todas las soluciones a utilizar. Preparar el gel de separacin: Agregar al frasco las respectivas cantidades de agua, mezcla de acrilamida: bisacrilamida (en una proporcin de 30:0.8), 1.5 M Tris y SDS 10%. Agregar los agentes iniciadores de la polimerizacin: PSA y TEMED. Se debe tener en cuenta que la mezcla comenzar a gelificarse, de manera que los pasos a seguir debern realizarse con la debida celeridad. Verter la solucin con una pipeta plstica entre ambas placas hasta 2 cm por debajo del borde superior. Agregar rpidamente unas gotitas de agua sobre la solucin para evitar el ingreso de oxgeno que retrasa la polimerizacin de la acrilamida. Preparar el gel de apilamiento o stacking. Hacer esto mientras gelifica el gel de separacin, que generalmente demora entre 20 y 30 minutos. No agregar el PSA ni el TEMED a la solucin de gel de apilamiento hasta que el gel de separacin haya gelificado. Una vez ocurrida la gelificacin, retirar el agua, verter el gel de stacking y colocar el peine (para generar las calles) suavemente, evitando la formacin de burbujas. Dejar que la acrilamida polimerice durante 60 minutos a temperatura ambiente. Una vez gelificado, retirar el peine.

3. Armado de la cuba
Con el armado de la cuba se generan las dos cmaras entre las cuales pasar la corriente elctrica. Los geles de poliacrilamida quedarn comunicando las dos cmaras (una andica y otra catdica) y el pasaje de corriente a travs del gel producir la corrida del material a analizar. Por lo tanto, del correcto armado depender el xito del anlisis de la tcnica. Se colocan ambos geles en el soporte ad hoc tomando en cuenta la limpieza de las gomas y su lubricacin. Es fundamental que la cmara que se genera entre los dos geles no pierda. Para comprobar esto se debe cargar con buffer la cmara interna fuera del tanque y observar que no se produzcan prdidas. Si esto sucede es posible sellar los bordes de la cuba con agar al 1%, hasta lograr el aislamiento de la cmara interior. Una vez logrado esto, se coloca el soporte dentro del tanque y se llena la cmara exterior con un volumen de buffer que llegue aproximadamente hasta la mitad de su altura. El buffer con que se llenan las cmaras y que se utiliza para la corrida es denominado buffer electrodo.

44

4. Preparacin de las muestras El volumen mximo de muestra que puede sembrarse por cada calle es de 20l. En este caso, hay que considerar que la muestra est diluida en buffer muestra (preparado a una concentracin de 2X), y por lo tanto el volumen real de la muestra ser de 10l. Una vez diluida la muestra en su buffer se debe hervir durante 10 minutos a fin de que se produzca la desnaturalizacin de las protenas a estudiar. Nota: La sensibilidad de la tcnica depende del colorante de protenas que se va a utilizar para ver las bandas, pero el rango de deteccin se encuentra entre 1 a 10g. En el caso de muestras complejas conviene sembrar de 50 a 100g de protena total. 5. Siembra de las muestras Las muestras se siembran una por cada calle, tomando nota del orden en el que fueron sembradas para poder identificarlas ms tarde. Como control se agrega una calle con marcadores de PM. Estos marcadores son una mezcla de protenas con PM conocido que permiten confirmar el tamao de un fragmento cualquiera en el gel. 6. Corrida La cuba se conecta a la fuente de poder y se corre a voltaje constante, 70 volts durante 2 a 3 horas. El frente de corrida, marcado por el colorante presente en el buffer muestra, permite determinar en qu momento la muestra ha alcanzado la parte inferior del gel. Una vez concluida la corrida, se desconecta la fuente de poder y se desarma la cuba. Con guantes y una esptula se despega el gel de los vidrios. El destino de este gel puede ser la tincin o la

45

transferencia a una membrana de nitrocelulosa para posteriormente identificar la protena por inmunoreactividad. 7. Coloracin de las protenas corridas Si el destino es la coloracin para protenas, se lo sumerge en colorante Azul de Coomassie (Coomassie Blue). Este colorante permite detectar entre 0.2 a 0.5 g de protenas. La solucin colorante contiene cido actico que permite fijar las protenas a la vez que se tien. En los casos en que la sensibilidad de la tincin con Coomassie Blue no sea suficiente, se puede utilizar la tincin argntica (Silver stain) que permite detectar hasta 2 ng de protenas por banda. La tincin argntica, adems es til para detectar polisacridos y protenas altamente glicosiladas. Bibliografa Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory. 1988. pp726. Mini-PROTEAN II Electrophoresis Cell Instruction Manual. Bio-Rad Margni, R.A. 1996. Inmunologa e Inmunoqumica Fundamentos. Ed. Interamericana.

46

47

Introduccin a las tcnicas serolgicas

El diseo de una tcnica inmunolgica est relacionado con el resultado que pretendemos obtener. Este resultado permite clasificarlas en: TCNICAS CUALITATIVAS Indican la presencia o ausencia de una "sustancia" (antgeno o anticuerpo) en una muestra. En algunos casos el resultado es suficiente para confirmar un diagnstico. TCNICAS SEMICUANTITATIVAS Brindan una idea de la cantidad de sustancia presente en una muestra. A tal fin, la tcnica se realiza sobre varias diluciones de la muestra para obtener el ttulo, que es la inversa de la ltima dilucin que da resultado positivo. El ttulo es una manera indirecta de cuantificar la sustancia reaccionante y es directamente proporcional a la cantidad de "sustancia" presente en la muestra y al lmite de deteccin de la tcnica utilizada. Por esto, cuando tenemos un resultado expresado en ttulo debemos indicar cul fue la tcnica empleada. TCNICAS CUANTITATIVAS Determinan la cantidad o la concentracin de la "sustancia" presente en una muestra. Requieren utilizar estndares de concentraciones conocidas que se evalan simultneamente con la muestra y nos permiten realizar curvas patrones. La cantidad de la sustancia presente en la muestra se calcula a partir de la curva patrn, por interpolacin del resultado obtenido en la medicin de la muestra problema. Controles internos y externos Para que una tcnica sea convalidada necesitamos incluir controles internos y externos. Consideramos controles internos a aqullos que se corren simultneamente en cada prueba que se realiza. Generalmente son histricos y deben corresponder a sueros o muestras cuyos resultados son positivos y a otros cuyos resultados deben ser fehacientemente negativos. Antes de realizar la lectura de las muestras problemas debe confirmarse que los resultados de los controles internos se encuentren dentro de los rangos esperados; de no ser as la prueba debe descartarse y repetirse para obtener un resultado confiable. Nos referimos a controles externos a aqullos que son evaluados en otros laboratorios, llamados laboratorios de referencia, que controlan y avalan nuestros resultados. Mtodo de obtencin del ttulo en las tcnicas semicuantitativas Las tcnicas semicuantitativas utilizan la dilucin de la muestra a fin de evaluar los niveles de antgeno o anticuerpo presentes en ella. .

Diluciones
Una dilucin es una mezcla volumen/volumen en proporciones conocidas, formada por una cierta cantidad de la sustancia que queremos diluir, o soluto (en el ejemplo, un suero) ms una cierta cantidad de diluyente (por ejemplo solucin fisiolgica o medio de cultivo) Puede expresarse como una fraccin donde el numerador representa la unidad del soluto (S) y el denominador la suma del soluto ms el diluyente (D), o sea el total de la solucin. Por ejemplo - Dilucin 1/2 (factor de dilucin 2): - Dilucin 1/5 (factor de dilucin 5): - Dilucin 1/8 (factor de dilucin 8): - Dilucin 1/10 (factor de dilucin 10):

1 parte de S + 1 parte de D. 1 parte de S + 4 partes de D. 1 parte de S + 7 partes de D. 1 parte de S + 9 partes de D.

48

Las diluciones pueden expresarse tambin en forma logartmica, con slo colocar el logaritmo del denominador de la fraccin como potencia negativa. As, por ejemplo: la dilucin 1/2 (log 2= 0.3) se expresa como 10 -0,3 la dilucin 1/10 (log 10=1) se expresa como 10 -1

Como se ve, S est ms diluido en la dilucin 1/10 (10-1) que en 1/8, 1/5 1/2. (10-0,3) O sea, que la mayor de estas cuatro diluciones es 1/10. Para preparar una dilucin 1/3, por ejemplo, se pueden usar diferentes volmenes segn el requerimiento de la tcnica a usar: Dilucin 1/3: 1 parte de S + 2 partes de D. - 0,3 ml de volumen final: 0,1 ml de S + 0,2 ml de D - (0,1/0,3 = 1/3) - 1,5 ml de volumen final: 0,5 ml de S + 1,0 ml de D - (0,5/1,5 = 1/3) Una dilucin seriada es aqulla en la que se realizan diluciones sucesivas del soluto, de forma tal que el factor de dilucin se mantiene constante y la dilucin anterior se utiliza como fuente de soluto para la dilucin siguiente. Por ejemplo: Dilucin seriada en base 2. (Factor de dilucin=2) 1/2 x2 1/4 x2 1/8 x2 1/16 x2 1/32 x2 1/64

(2=1+1)

1+1

1+1

1+1

1+1

1+1

Dilucin seriada en base 10. (Factor de dilucin =10) 1/10 x10 1/100 x10 1/1000 x10 1/10000

(10=1+9)

1+9

1+9

1+9

En todos los casos, si deseamos mantener el volumen constante, se descarta del ltimo tubo la misma cantidad que tomamos de cada uno de los tubos anteriores. El ttulo nos da una idea de los niveles de antgeno o anticuerpo presentes en una muestra. La principal aplicacin de este concepto se refiere al nivel de anticuerpos especficos (contra un antgeno dado) presente en un suero u otra muestra biolgica. Para obtener el ttulo de anticuerpos, por ejemplo, de un suero, se hace una dilucin seriada de dicho suero y a cada dilucin se la enfrenta con una cantidad fija del antgeno para el cual es especfico. La reaccin observada entre antgeno y anticuerpo depender de la tcnica que se use (aglutinacin, precipitacin, ELISA, etc.). El ttulo de anticuerpos presentes en el suero (ttulo del suero) ser la inversa de la mayor dilucin en la que se observa reaccin positiva. En el siguiente ejemplo: Dilucin 1/2: reaccin positiva Dilucin 1/4: reaccin positiva Dilucin 1/8: reaccin positiva Dilucin 1/16: reaccin positiva Dilucin 1/32: reaccin positiva Dilucin 1/64: reaccin negativa El ttulo ser la inversa de la dilucin 1/32, es decir, 32.

49

Si la dilucin 1/64 hubiese dado un resultado positivo, deberamos haber seguido diluyendo el suero hasta llegar al primer resultado negativo: cuando nuestro objetivo es obtener el ttulo de un suero debemos llegar hasta la dilucin lmite o final de reaccin. El nivel o ttulo de anticuerpos especficos contra un antgeno en particular presentes en el suero de un individuo refleja la respuesta inmune humoral de ese individuo frente a ese antgeno. En medicina veterinaria, el anlisis serolgico poblacional es empleado para realizar estudios epidemiolgicos, para establecer diagnsticos y desarrollar planes sanitarios frente a distintas enfermedades.

Conversin serolgica o seroconversin

Se dice que hay conversin serolgica cuando el ttulo de anticuerpos contra determinado antgeno en un individuo aumenta en por lo menos dos diluciones seriadas entre una primera y una segunda muestra de sangre obtenida esta ltima, por lo menos 15 a 20 das despus de la primera. Una variacin menor a 2 diluciones podra deberse slo a variaciones en el procedimiento, o sea al error experimental aceptado. La seroconversin aporta datos referentes a la etapa de la infeccin en la que se encuentra un individuo, sobre todo en enfermedades tales como toxoplasmosis o leptospirosis, en las que nicamente el aumento del ttulo de anticuerpos contra los respectivos microorganismos indica enfermedad aguda. Independientemente de la tcnica utilizada para determinar el ttulo podemos decir que dado que la capacidad de respuesta es propia de cada individuo y est influenciada genticamente, slo una comparacin con valores propios (previos y posteriores) puede determinar si ha aumentado o disminuido la respuesta frente al antgeno. Fundamentos de las tcnicas serolgicas Las reacciones antgeno-anticuerpo (Ag-Ac) pueden llevarse a cabo in vitro si se respetan las condiciones fisiolgicas en las que normalmente ocurren (pH, tonicidad, temperatura) y pueden emplearse como una herramienta diagnstica de rutina tanto en laboratorios de investigacin bsica como en la clnica mdica veterinaria. La reaccin Ag-Ac implica una unin de tipo no covalente, reversible entre ambas molculas. La forma complementaria de las nubes de electrones en el sitio de combinacin entre el anticuerpo (paratope) y el determinante antignico (epitope) hace que las dos molculas encajen de manera ajustada, de modo que la distancia intermolecular se torna muy pequea y aumentan en grado considerable las fuerzas de interaccin no covalentes que participan en la unin. Cuando la complementariedad espacial no es la ideal, se produce superposicin de las nubes electrnicas y se generan fuerzas de repulsin que determinan que la fuerza de unin (afinidad) sea diferente en distintos anticuerpos que reconocen un mismo epitope. La especificidad de la reaccin antgenoanticuerpo es de tal magnitud que el cambio de un solo aminocido de una protena puede provocar el reconocimiento nulo por parte de un anticuerpo o al menos variaciones significativas de su afinidad por la protena modificada. Esta caracterstica se emplea en diferentes campos de la investigacin cientfica para la identificacin y caracterizacin in vitro de infinidad de molculas, tales como hormonas, drogas, etc. En el campo de la investigacin aplicada y el laboratorio de diagnstico, la especificidad de la reaccin se emplea adems para diferenciar e identificar virus, bacterias, glbulos rojos (determinacin de grupos sanguneos) u otros antgenos en diferentes muestras biolgicas (sangre, suero, orina, tejidos, etc). Las tcnicas inmunolgicas pueden ser de interaccin primaria o secundaria

50

 De Interaccin PRIMARIA: Ocurren en milisegundos y estn determinadas por la afinidad del paratope del anticuerpo por el epitope de un antgeno. La reaccin no se puede reconocer a simple vista, por lo tanto, para determinar si la misma tuvo lugar se emplean mtodos en los que el antgeno o el anticuerpo se marcan con una molcula que puede ser un radioistopo (en la prueba de RIA), una enzima (en las pruebas de ELISA, Inmunoblot e Inmunohistoqumica) o un fluorocromo (en la Inmunofluorescencia). Estos mtodos transforman la reaccin primaria en seales (radiactivas, colorimtricas o fluorescentes) que pueden interpretarse y cuantificarse. De Interaccin SECUNDARIAS: Es la consecuencia de la unin antgeno-anticuerpo luego de ocurrida la reaccin primaria, dadas por las caractersticas del antgeno y del anticuerpo. Si el antgeno es polivalente (varios determinantes antignicos) y el anticuerpo acta como divalente o polivalente, se forma una red o entramado en el que un anticuerpo est unido a por lo menos 2 partculas antignicas diferentes y cada partcula antignica est unida a una o ms molculas de anticuerpo. Esta reaccin puede observarse a simple vista. Segn la solubilidad del antgeno involucrado en la reaccin (soluble o particulado) recibe diferentes nombres: SI EL ANTGENO ES SOLUBLE, SE DENOMINA PRECIPITACIN. SI EL ANTGENO ES PARTICULADO, SE DENOMINA AGLUTINACIN. De interaccin TERCIARIAS: Cuando el reconocimiento del antgeno por el anticuerpo ocurre in vivo, pueden presentarse manifestaciones visibles en el animal evaluado. Caractersticas de una prueba serolgica Las interacciones primarias Ag-Ac no siempre son detectables por interaccin secundaria o terciaria. Existen requisitos mnimos para que las reacciones secundarias o terciarias se produzcan, que son de tipo cuantitativo, como la concentracin del anticuerpo y del antgeno, y cualitativo, como las propiedades de la clase de inmunoglobulina comprometida en la reaccin y las caractersticas del antgeno, adems de la concentracin de sales en el medio. Las pruebas serolgicas aplicadas al diagnstico de enfermedades infecciosas: El estado de enfermedad de un individuo se confirma por el aislamiento del agente causal. Esta confirmacin constituye el denominado estndar de oro (gold standard). En enfermedades no infecciosas, el estndar de oro puede ser una biopsia u otro criterio que pueda diagnosticar inequvocamente la enfermedad. Dado que no siempre es posible la identificacin del agente involucrado, la deteccin de anticuerpos especficos contra ese agente se puede emplear como herramienta para arribar al diagnstico. Sin embargo, debemos considerar que la sola deteccin de anticuerpos especficos contra un microorganismo no significa que el individuo est enfermo. Los anticuerpos calostrales y los producidos por vacunaciones son reconocidos de la misma manera que los producidos por el agente salvaje. No todas las pruebas serolgicas tienen la misma capacidad para diferenciar los individuos sanos de los enfermos. Existen dos parmetros empleados generalmente para evaluar las pruebas diagnsticas en general y las pruebas serolgicas en particular: la sensibilidad y la especificidad, que se obtienen al comparar los resultados obtenidos en la prueba evaluada con los obtenidos con la prueba estndar de oro o de referencia.

51

Podemos definir entonces: SENSIBILIDAD: Es la habilidad de una prueba para detectar a TODOS los animales probadamente enfermos (positivos reales). ESPECIFICIDAD: Es la habilidad de una prueba para detectar SOLO a los animales probadamente enfermos (verdaderos positivos). Dicho de otra manera, es la capacidad detectar como negativos a los que verdaderamente negativos.

Tcnica de Referencia o Infeccin Real + (enfermo) Tcnica Objeto de Valoracin + (sano) B

A
C

Los clculos se realizan mediante las frmulas: SENSIBILIDAD = A / A+C

ESPECIFICIDAD = D / B+D En las que: (A) Positivos en que coinciden ambos mtodos (Positivos Verdadero). (B) Negativos reales que la tcnica objeto de valoracin da como positivos (Falsos Positivos). (C) Positivos reales que la tcnica objeto de valoracin da como negativos (Falsos Negativos). (D) Negativos por ambas tcnicas (Negativos Verdadero)

Poblacin sana

Poblacin enferma Resultado de la prueba: + Valor de corte

S: Proporcin de verdaderos positivos que son detectados. E: Proporcin de verdaderos negativos que son detectados.

52

El trmino sensibilidad posee otra acepcin que se refiere al nivel de deteccin mnimo o lmite de deteccin de una tcnica inmunolgica. Este concepto se refiere a la cantidad mnima de anticuerpos reaccionantes necesaria para que stos puedan ser detectados por una determinada tcnica. En la tabla se ejemplifican los valores de sensibilidad como lmite de deteccin de las tcnicas inmunolgicos a fin de compararlas

Tcnica RIA ELISA AGLUTINACIN INMUNOFLUORESCENCIA PRECIPITACIN (*) (*) Difusin doble en agar

Lmite de deteccin (mg/ml de Ac) 0,0001 0,0003 0,0300 0,5000 1 - 4,0000

ELISA
Engval y Perlmann en Holanda, al mismo tiempo que Van Weemen y Schuurs en Suecia (1971) describieron una tcnica inmunoenzimtica para detectar antgenos o anticuerpos en lquidos corporales, como mtodo alternativo al uso de radioistopos radioinmunoensayo (RIA). Ambas (ELISA y RIA) son tcnicas de interaccin primaria. Esta tcnica se denomina ELISA, por el acrnimo del trmino en ingls Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay o Ensayo Inmuno-absorbente Ligado a Enzimas. El ELISA es una tcnica de interaccin primaria que permite evidenciar la presencia de anticuerpos (o antgenos) a travs de la unin especfica con su antgeno (o anticuerpo) correspondiente que se encuentra unido a un soporte inerte. El revelado de esta interaccin Ag-Ac se realiza utilizando alguno de los dos componentes de la interaccin (generalmente un anticuerpo) marcado con una enzima (conjugado). La presencia de la enzima en la reaccin se revela a travs de la transformacin de un sustrato incoloro en un producto coloreado. Existen diversos esquemas de la tcnica que comprenden generalmente tres etapas: 1. Inmovilizacin del inmunorreactante (antgeno o anticuerpo) en la fase slida. 2. Reaccin del inmunorreactante con su correspondiente antgeno o anticuerpo. 3. Deteccin del antgeno o anticuerpo mediante la utilizacin de un segundo anticuerpo conjugado con una enzima. Como toda reaccin antgeno-anticuerpo, posee un equilibrio dinmico con una primera etapa reversible y una etapa irreversible. Esta cintica depende de la molaridad del medio (soluciones tamponadas -o buffers- utilizados) y del tiempo y temperatura en que se produce la reaccin (incubacin). Enzimas utilizadas en los ensayos inmunoenzimticos Las enzimas a ser utilizadas en estos ensayos deben reunir ciertos requisitos. Deben ser solubles en agua, incoloras, inodoras y atxicas. Deben ser estables al almacenamiento y luego de la detencin de la reaccin enzimtica. No deben ser fotosensibles. Deben ofrecer un amplio rango de linealidad entre su concentracin y la intensidad de color formado. Los sustratos de estas enzimas deben poseer un alto coeficiente de extincin molar, con un mximo de absorbancia entre 400 y 600 nm.
53

La peroxidasa y la fosfatasa alcalina son las dos enzimas ms utilizadas. Desde hace algunos aos se ha difundido el uso de ureasa, -galactosidasa y glucosa-oxidasa. Peroxidasa Las peroxidasas son hemoprotenas que transfieren Hidrgeno desde un donante (DH) al O del H2O2. La peroxidasa ms utilizada, obtenida del rabanito (HRP: Horse-Radish Peroxidase), posee un alto contenido en hidratos de carbono que facilita la conjugacin a anticuerpos. Para revelar la reaccin qumica producida se utilizan diferentes cromgenos, entre ellos: 2,2-azino-di-(3-etil-benzotiazolina)-6-sulfonato de diamonio (ABTS), que absorbe a 405 nm. cuando se oxida vira al color verde. 3-metil-2-benzotiazolinona hadrazona (MBTH), que reacciona con el cido 3-(dimetilamino) benzoico (DMAB), que absorbe a 590 nm. orto-fenilendiamina (OPD) o 1,2,-bencenodiamina, que absorben a 492 nm. Cuando se oxida vira al color ocre Diaminobenzidina (DAB): cuando se oxida vira al color pardo El sustrato ms utilizado con peroxidasa es el agua oxigenada o perxido de hidrgeno (H2O2): La accin de la peroxidasa sobre el perxido de hidrgeno degrada este compuesto dando agua y liberando oxgeno (O-). El oxgeno, a su vez, oxida al cromgeno que pasa de incoloro en su estado reducido a coloreado en su estado oxidado. H2O2 (sustrato) PO H2O + O- (dador de electrones)

Cromgeno (-) incoloro (-) reducido, (+) oxidado

Cromgeno (+) coloreado

Como todas las enzimas, la peroxidasa acelera el proceso de degradacin del sustrato sin perder su funcionalidad, por lo tanto, se encuentra en condiciones de reaccionar nuevamente una y otra vez es por eso que debe agregarse una sustancia de solucin de freno o stop que modifica el pH. Fosfatasa alcalina Las fosfatasas alcalinas utilizadas en los ELISAs se aslan a partir de intestino bovino o de Escherichia coli. Estas enzimas hidrolizan una amplia gama de steres de fosfatos (como los de alcoholes primarios, secundarios, fenoles y aminas), tienen un pH ptimo alcalino (por lo que se emplean soluciones a base de dietanolamina con pHs cercanos a 9) y requieren Mg y Zn como cofactores. Los cromgenos ms utilizados para esta enzima son: -pNPP (paranitrofosfato) que vira de incolora a amarillo. -5- bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro blue tetrazolium (NBT/BCIP) que vira de incoloro a azul. a) Procedimiento general de la tcnica de ELISA aplicada a la medicin de anticuerpos: La muestra a evaluar puede ser un suero, un producto de secrecin o de excrecin. 1. El Ag (ej: Brucella abortus) se resuspende en buffer Carbonato-Bicarbonato pH 9.6 o en buffer fosfato (PBS) pH 7 y se adsorbe sobre los hoyos de una microplaca de plstico durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. 2. El exceso de Ag se remueve mediante lavados con 0.05-0.1% de Tween 20 en PBS (PBST). 3. Se agrega una solucin que contiene protenas que no son reconocidas por los anticuerpos especficos (solucin bloqueante), para limitar la unin inespecfica de protenas. Se puede

54

utilizar 10% de leche descremada en polvo resuspendida en PBS. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. 4. El exceso de solucin bloqueante se remueve mediante lavados con PBST. 5. Se agrega el suero problema y los sueros control positivo y negativo por duplicado o triplicado. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. (El suero problema es aqul del cual se quiere conocer si posee Acs especficos contra el Ag que se encuentra pegado en la placa, en este caso es un suero bovino en el que se analiza la presencia de Acs anti-B. abortus). 6. Los anticuerpos no unidos al Ag se remueven mediante lavados con PBST. 7. Se agrega un anticuerpo unido a enzima (conjugado) que reconoce a las inmunoglobulinas de la especie de la cual estamos evaluando el suero (En este caso, el conjugado ser un Ac anti-Ig bovina). Si el Ac especfico est presente, el anticuerpo conjugado reacciona con l y queda unido. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. 8. El exceso de conjugado se remueve mediante lavados con PBST. 9. Se agrega el sustrato de la enzima. La reaccin de la enzima con el sustrato resulta en un producto coloreado y es un indicador visual de que la reaccin antgeno-anticuerpo ha tenido lugar. 10. Dado que las enzimas pueden continuar degradando el sustrato dependiendo del tiempo y la temperatura se realiza el frenado de la actividad enzimtica a tiempo de reaccin determinado que se relaciona con la aparicin de color en los controles negativos de sustrato. El freno depende de la enzima utilizada y es en el caso de peroxidasa cido sulfrico y para fosfatasa se utiliza el hidrxido de sodio, ambos modifican el pH y la reaccin se frena. 11. La reaccin cromtica puede ser leda a simple vista o cuantificada por espectrofotometra. La intensidad de la reaccin es proporcional a la cantidad de enzima activa presente en cada hoyo. Lectura: En caso de haber anticuerpos antibrucella en el suero bovino problema, se observar la aparicin o cambio de color en el sustrato. En un primer paso, los anticuerpos del suero se unen al antgeno pegado a la placa. Al agregar los anticuerpos conjugados a la enzima, stos reconocen y se unen a los anticuerpos del suero. La enzima queda adherida y se produce as la reaccin al agregar el sustrato. De no haber anticuerpos especficos en el suero problema, el resto de los anticuerpos se eliminan con el lavado. Al agregar el Ac anti-bovino marcado con la enzima, ste no reconoce ninguna molcula especfica y se elimina al realizar el ltimo lavado. Por lo tanto, al agregar el sustrato no se producir ninguna reaccin especfica. Se puede observar un nivel bajo de seal por autodegradacin del sustrato o debido a la presencia de enzima por lavado ineficaz de la placa. Por esto es tan importante que despus de cada incubacin se proceda al lavado con soluciones salinas con detergentes suaves, a fin de eliminar las protenas unidas de manera inespecfica a los soportes slidos. b) Procedimiento general de la tcnica de ELISA aplicada a la medicin de antgenos: La muestra a evaluar puede ser un suero, un producto de secrecin o de excrecin. 1. El anticuerpo especfico para ese antgeno se resuspende en buffer Carbonato-Bicarbonato pH 9.6 o en buffer fosfato (PBS) pH 7 y se adsorbe a los hoyos de la placa durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. 2. El exceso de Ac se remueve mediante lavados con 0.05-0.1% de Tween 20 en PBS (PBST). 3. Se agrega una solucin que contiene protenas que no son reconocidas por los anticuerpos especficos (solucin bloqueante), para limitar la unin inespecfica de protenas. Se puede utilizar 10% de leche descremada en polvo resuspendida en PBS. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. 4. El exceso de solucin bloqueante se remueve mediante lavados con PBST.

55

5. Se agrega la muestra a evaluar (muestra problema) y los controles positivos y negativos por duplicado o triplicado. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. (Muestra problema es aqulla en la que se quiere determinar la presencia del Ag para el que son especficos los Acs fijados a la placa) 6. Los antgenos no unidos al Ac se remueven mediante lavados con PBST. 7. Se aade un segundo anticuerpo especfico para ese antgeno, pero unido a una enzima (conjugado). Si el Ag especfico est presente, el anticuerpo conjugado reacciona con l y queda unido. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. El exceso de conjugado se remueve mediante lavados con PBST. 8. Se coloca el sustrato de la enzima y se relaciona la actividad enzimtica observada con la concentracin del antgeno presente en la muestra.

Clasificacin de los ELISAs

Los ELISAs pueden clasificarse: - Segn busque antgenos (Directo) o anticuerpos (Indirecto) Segn la metodologa utilizada en:

1- De amplificacin de actividad o no competitivos En estos ELISAs se emplea un exceso del inmunorreactante con el objeto de obtener una seal mxima debida a la presencia del compuesto a medir. Estos ELISAs se subdividen de acuerdo a que el antgeno o anticuerpo a identificar sea inmovilizado en la fase slida (ELISA directo) o capturado por la molcula complementaria (ELISA indirecto y ELISA sndwich). ELISA DIRECTO: La muestra problema (de la cual no se sabe si contiene o no Ac o Ag) se inmoviliza sobre la fase slida. En caso de analizar Ac, estos se detectan por medio de Ags conjugados, y en el

56

caso de analizar la presencia de Ag, estos se detectan por Ac conjugados. (Fig. 1).

Positiva Negativa

57

ELISA INDIRECTO: En el ELISAs indirecto el antgeno o anticuerpo a identificar es capturado en la placa por la molcula complementaria (Ag o Ac), segn corresponda. O sea, si se desea detectar Acs especficos en un suero, se inmoviliza el antgeno en la fase slida y se lo hace reaccionar con el suero problema. Luego se utiliza un Ac anti-Ig de la especie conjugado a una enzima. Este sistema tiene alta detectabilidad debido a que varias molculas del conjugado enzimtico (AntiIg marcados con la enzima) pueden unirse a cada molcula de Ac que reaccion a su vez con el Ag inmovilizado, este efecto se traduce en una amplificacin de la seal. (Fig. 2)

= Ac problema o incgnita

ELISA DE CAPTURA O SANDWICH: Este sistema se emplea para la cuantificacin de Ags o para la deteccin de Acs contra el Ag capturado. En general es deseable que el conjugado enzimtico y el Ac inmovilizado provengan de la misma especie para evitar interferencias en el sistema, originadas por reaccin cruzada del conjugado con el Ac de captura. Para la deteccin de antgenos: se inmoviliza un Ac con el que se captura el Ag y se revela su presencia con un conjugado enzimtico anti-Ag, (Fig. 3).

Para la deteccin de anticuerpos: se inmoviliza un Ac con el que se captura el Ag, se agrega el anticuerpo problema o incgnita y se revela su presencia con un conjugado enzimtico antiAc o anti especie, (dibuje el esquema basndose en la Fig 3).

58

2- De modulacin de actividad o competitivos Estos ELISAs se basan en la competicin del analito a evaluar (antgeno o anticuerpo incgnita) con un reactivo patrn de similar estructura y afinidad (antgeno o anticuerpo conocido o patrn) y se detecta el resultado de esta reaccin luego de la estabilizacin del sistema. El conjugado enzimtico puede ser antgeno o anticuerpo segn el esquema, el que modula por competicin con el compuesto a analizar (antgeno o anticuerpo, respectivamente). Cantidades pequeas del conjugado enzimtico permiten obtener una mayor detectabilidad. Existen dos diseos generales de ensayos de modulacin de la actividad: a) Incubacin simultnea: El compuesto marcado con enzima y el compuesto sin marcar (compuesto a dosar) se incuban simultneamente en el sistema. b) Incubacin en etapas o por saturacin: El compuesto no marcado (a ser dosado) se incuba en una primera etapa. En una segunda etapa se incuba el compuesto marcado enzimticamente, el que reaccionar con los sitios no ocupados por el compuesto que reaccion en la primera etapa. Por ejemplo: en el ELISA competitivo se puede inmovilizar el anticuerpo en la fase slida y agregar el antgeno marcado con la enzima, aplicando cualquiera de estos dos diseos generales. Se observar una disminucin de la actividad enzimtica a medida que aumenta la cantidad de antgeno libre no marcado presente en una solucin patrn o en la muestra problema. El producto coloreado formado es inversamente proporcional a la concentracin de antgeno libre. En la Fig 4 se muestra un ELISA de competicin en etapas una de las cuales se realiza en fase lquida. Como se observa se inmoviliza el Ag patrn conocido en la placa y se cuenta con Acs anti-Ag especficos marcados con enzima. La muestra problema (en la cual se quiere conocer la presencia y cantidad del antgeno) se incuba en fase lquida con el anticuerpo marcado y luego se realiza el ELISA en placa con el antgeno patrn adsorbido en la placa. Cuanto ms antgeno problema haya reaccionado en la fase lquida menos cantidad de anticuerpo marcado podr reaccionar en la placa con el Ag patrn, por lo que los resultados (cantidad de antgeno en la muestra) son inversamente proporcionales a la densidad ptica obtenida.

59

Muestra negativa

Muestra positiva

o incgnita o patrn

Clculo del valor de corte

Para la interpretacin del ensayo y a fin de poder diferenciar entre muestras positivas y negativas, debe calcularse el valor de corte utilizando la siguiente frmula. Valor de corte = D.O promedio de los controles del suero negativo + 2 desvos estndar del suero negativo. El valor de corte debe ser tal que minimice los resultados falsos, ya sean positivos o negativos. En muchos casos existe una zona de solapamiento en la distribucin de la reactividad de sueros positivos y negativos, en la que no puede establecerse con certeza si una muestra es positiva o negativa. Por este motivo el valor de corte se determina de manera tal de tener ms falsos positivos o falsos negativos, segn qu tipo de error produzca consecuencias menos graves.

Controles
Para una correcta interpretacin de los resultados deben realizarse controles de todos los reactivos utilizados. Los controles deben permitirnos afirmar que el cambio de color detectado corresponde a la interaccin especfica entre Ag y Ac y no a reacciones inespecficas. Si las reacciones inespecficas se detectan estas deben ser minimizadas y tomadas en cuenta en el momento de establecer el valor de corte. Podemos ejemplificar los controles en un ELISA indirecto de la siguiente manera: Controles de los sueros Los valores obtenidos con estos controles repetidos en todos los ELISAs a travs del tiempo nos permite detectar repetitividad del ensayo y comparar resultados de diferentes das o entre laboratorios. A- Control positivo: suero de un animal convaleciente o polivacunado, con alto ttulo de anticuerpos especficos. B- Control negativo: suero de un animal sano y virgen (libre de anticuerpos especficos).

60

 Controles del conjugado A- Control negativo del Conjugado: Dicho control se realiza para determinar que el anticuerpo conjugado a la enzima no interacciona con ningn otro componente del sistema que no sea el anticuerpo primario. Se realiza de la siguiente manera: se pega a la placa el antgeno, se bloquea, no se incuba con el suero o anticuerpo primario (se mantiene el bloqueante), se coloca el anticuerpo conjugado y por ltimo el sustrato. Este no debera reaccionar con el antgeno pegado a la placa, dando reaccin negativa. B- Control positivo del Conjugado: Este control se realiza a fin de determinar que el anticuerpo conjugado a la enzima interacta correctamente con el anticuerpo primario. Se realiza de la siguiente manera: Se pega un suero de la especie frente a la cual es especfico en conjugado. Por ejemplo si el anticuerpo conjugado es un anticuerpo anti ratn se coloca en la placa suero de ratn, se bloquea, no se coloca anticuerpo primario y se coloca el anticuerpo secundario marcado con la enzima, continuando el resto de la tcnica de la misma manera. Este control debe dar positivo, es decir debe haber color en los hoyos indicando el correcto funcionamiento del conjugado. Control del sustrato: Este control nos permite determinar que el sustrato de la enzima no reacciona con ningn otro componente del sistema excepto con la enzima. Se realiza de la siguiente manera: se pega a la placa el antgeno, se incuba con el anticuerpo 1, es decir, el suero, y no se coloca el anticuerpo conjugado, y se coloca el sustrato el cual no debera modificar su color, ya que no hay en los hoyos enzima que catalice la reaccin. Control del bloqueante: Permite determinar que el bloqueo se realiz correctamente. Se realizan todos los pasos del ELISA, pero en la placa no se pega el antgeno, sino que se comienza a partir del bloqueante. Se coloca un suero positivo, el cual no debera reaccionar ya que no hay antgeno pegado en la placa. Sistemas alternativos de reconocimiento Los lmites de la reaccin Ag-Ac estn determinados por la valencia del Ac (2 para la IgG y 5 para la IgM) y por la constante de afinidad de unin del Ac (Ka =108 a 1010 M-1). La utilizacin de sistemas alternativos en algunas etapas de las reacciones de ELISA permiten amplificar los lmites de las reacciones Ag-Ac y/o facilitar la tcnica. Sistema avidina-biotina / estreptavidina-biotina: La avidina es una protena de la clara de huevo y la estreptavidina es una protena producida por ciertas levaduras. Ambas se caracterizan por su elevada afinidad por la biotina (Ka=1015 M1 ). Debido a que la biotina es fcilmente acoplable a distintas protenas (entre ellas, Ac y enzimas) por unin covalente, sin que se afecte su actividad biolgica, se han desarrollado mtodos inmunoenzimticos basados en la interaccin avidina-biotina. Protena A: Es una protena de la pared de Staphylococcus aureus que tiene alta afinidad por los fragmentos Fc de algunos isotipos de Igs (Ka=108 M-1). Tiene 4 sitios de unin, aunque generalmente reaccionan slo dos.

61

RADIOINMUNOENSAYO (RIA)
Los inmunoanlisis radiomtricos comprenden un conjunto de tcnicas en las cuales las molculas utilizadas se marcan radiactivamente. Como gua general puede considerarse que la determinacin de los antgenos se efecta con anticuerpos especficos marcados radiactivamente y que inversamente, la deteccin de anticuerpos especficos se realiza con los correspondientes antgenos marcados.

El desarrollo del radioinmunoensayo (RIA) comienza en 1956 en trabajos sobre el metabolismo de la insulina. En estos experimentos se hall que la cantidad de insulina marcada con tomos radiactivos que se una in vitro a una fraccin de globulinas de individuos diabticos, se relacionaba con la concentracin de insulina fra (no marcada) existente en el suero del paciente.
Entre las ventajas que tiene esta tcnica se encuentran: Alto lmite de deteccin Sencillez con respecto a las tcnicas utilizadas en endocrinologa. Versatilidad para su utilizacin en pequeos volmenes y en grandes series. La desventaja ms importante consiste en la manipulacin de componentes radioactivos que requieren de condiciones de bioseguridad estrictas tanto para la proteccin del operador como del medio ambiente, por lo tanto se utilizan en casos puntuales en los que la concentraciones del analito lo requieran. Por ejemplo, determinacin de hormonas o niveles de IgE sricas especficas. Dado que el RIA es una tcnica que se utiliza generalmente para medir sustancias que se encuentran en muy baja concentracin, los esquemas utilizados corresponden a la modalidad competitiva (ver descripcin referente a la tcnica de ELISA). Un ejemplo de la tcnica es la determinacin de TSH, ensayo que se realiza por el sistema de inhibicin competitiva de un antgeno marcado radiactivamente (trazador) a su anticuerpo especfico por parte del antgeno no marcado. El sistema descrito puede esquematizarse como una interaccin reversible combinada: Ag* Ac + Ag Ac-Ag Ac-Ag*

Donde Ac representa al anticuerpo especfico; Ag* es el antgeno marcado (trazador) libre; Ag es el antgeno libre no marcado de las soluciones patrones o de las muestras desconocidas; Ac-Ag* es el complejo soluble entre el anticuerpo y el antgeno marcado, y Ac-Ag es el complejo soluble con el antgeno no marcado. La reaccin obedece a la ley de accin de masas. El anticuerpo no discrimina entre antgeno no marcado (fro) y antgeno marcado (trazador), de modo que cuanto mayor sea la cantidad de antgeno fro presente, menor ser la cantidad de trazador que se une al anticuerpo. Bajo este principio, se puede determinar la concentracin de antgeno en muestras complejas de fluidos biolgicos con suficiente sensibilidad y especificidad, siempre que se cumplan los siguientes requisitos: Que el trazador sea altamente radiactivo y por lo tanto pueda colocarse en concentraciones infinitesimales. Que el anticuerpo sea altamente especfico, posea muy alta afinidad y se halle en muy baja concentracin. Que el anticuerpo no reconozca con diferente afinidad el antgeno fro del marcado.

62

Ejemplos de aplicacin de la tcnica de RIA RAST (RadioAlergoSorbent Test) o prueba de radialergoadsorcin: Es utilizado para la deteccin de IgE especfica de alergenos. El reactivo marcado es un Ac (generalmente monoclonal) anti-IgE. Si el animal tiene en su suero IgE especfica contra el alrgeno previamente adsorbido a un soporte, la radiactividad detectada por el RIA ser directamente proporcional a la concentracin de esa IgE. PRIST (Paper RadioImmunoabSorbent Test) o prueba radioinmunoabsorbente en papel: Es usado para la cuantificacin de niveles sricos de IgE. Se adsorbe la anti-IgE al soporte inerte, se agrega el suero del paciente, y luego de la incubacin y el lavado se revela con la utilizacin de una anti-IgE marcada radiactivamente. En esta tcnica hay una relacin directa entre la radiactividad medida y la concentracin de IgE. Bibliografa 1- Margni, R. 1996 Inmunologa e Inmunoqumica. Fundamentos. Editorial Panamericana. 2- Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory. 1988. pp726. 3- Roitt, I; Brostoff, J and Male, D. Immunology . Fifth Edition. Mosby International. LTD. 423 pp. 4- Morilla A. y Bautista C. R. Manual de Inmunologa Mxico: Editorial Diana. 1 edicin, septiembre de 1986.

Inmunoblot o Western-blot1
El anlisis de una muestra por la tcnica de inmunoblot requiere realizar una primera etapa de separacin de los componentes en un campo elctrico en geles de poliacriamida (PAGE) y posteriormente la transferencia de esas protenas ya separadas por peso molecular (PM), a una membrana. Esta transferencia se realiza poniendo en contacto el gel con una membrana de nitrocelulosa y aplicando una corriente elctrica a pH alto. Las molculas proteicas se movilizan y contactan con la membrana, a la cual se fijan. La unin a la membrana de nitrocelulosa es debida fundamentalmente a interacciones de tipo hidrofbico. Las molculas transferidas a la membrana son identificadas posteriormente por interacciones con anticuerpos especficos. Utilidades del Inmunoblot: Mediante este mtodo podemos identificar cul o cules de las molculas componentes de una mezcla son reconocidas por un anticuerpo. La posibilidad de separar los componentes biolgicos de una muestra por peso molecular, sumado al reconocimiento con anticuerpos, potencia la caracterizacin del antgeno. Recuerden que los antgenos evaluados con esta metodologa, si utilizamos como mtodo de separacin previo el SDS-PAGE, se encuentran desnaturalizados (por accin del beta-mercaptoetanol y del SDS sobre la muestra), por lo tanto estamos identificando antgenos de tipo secuenciales y no conformacionales. Tambin podemos evaluar la monoespecificidad de un anticuerpo como en el caso de los monoclonales para lo cual se realiza el PAGE del antgeno complejo luego la transferencia a
1

La transferencia de fragmentos de ADN separados por electroforesis desde un soporte gelificado a una membrana, fue descripta inicialmente por el Dr. Southern. Debido a ello, esta tcnica se denomin Southern-blot. La aplicacin de esta tcnica para el estudio de RNA se denomin Northern-blot y cuando sta se desarroll para protenas se la llam Western-blot. Por lo tanto son sinnimos.

63

una membrana de nitrocelulosa la que se usa como antgeno para interaccionar con el anticuerpo monoclonal. Como resultado se espera el reconocimiento de un slo componente por parte del anticuerpo. En forma de sntesis los pasos a seguir son: A- Preparacin de las muestras a analizar y realizacin del SDS-PAGE B- Transferencia del gel obtenido a una membrana de nitrocelulosa C- Bloque de los sitios libres de la membrana con una mezcla de protenas irrelevantes para el anlisis D- Utilizacin de un anticuerpo para identificar el antgeno a analizar sobre la membrana (Anticuerpo primario) E- Utilizacin de una anticuerpo conjugado con una enzima especfico para la especie que fue origen del anticuerpo primario (Anticuerpo secundario) F- Revelado con el sustrato que corresponda que precipite en el papel o que pueda ser revelado sobre una placa fotogrfica G- Anlisis e interpretacin de los resultados Las membranas teidas muestran la complejidad de las muestras ya que en cada calle se observarn un nmero de bandas variables dependiendo de las distintas protenas que sean reconocidas por el anticuerpo primario que componen la mezcla. Al dato del PM se le suma la antigenicidad de estos componentes analizados. Anexo A modo de ejemplo, se describen los pasos necesarios para realizar un inmunoblot utilizando la cuba Mini-Protean II (nombre comercial del equipo provisto por laboratorios Bio-Rad). Materiales necesarios: Guantes libres de talco 2 Esponjas finas tipo Scotch Brite 2 hojas de papel Whatman 3MM o equivalente Membrana de nitrocelulosa Aparato de electrotransferencia o electroblotting Lapicera que permita marcar la membrana aunque est humedecida. 1. Cuando la electroforesis ha concluido, se desarma la cuba y se retiran los geles. Se pueden equilibrar 30 minutos a temperatura ambiente en buffer de transferencia. Esto previene el cambio de tamao del gel durante la transferencia y elimina el exceso de SDS que puede interferir en ella. 2. El armado del sndwich se realiza en un contenedor lo suficientemente grande para que quepa el soporte abierto. Se llena el contenedor con buffer para que el soporte de transferencia quede cubierto. El soporte debe armarse sumergido para evitar en lo posible la formacin de burbujas de aire. 3. Sobre la base negra de una mitad del soporte, se coloca la esponja, seguida por un papel de filtro Whatman. Ambos deben ser del mismo tamao que el gel y deben estar embebidos en buffer de transferencia. 4. Se coloca el gel sobre el papel Whatman. Se quita cualquier burbuja de aire que haya quedado entre el gel y el papel, utilizando una pipeta de vidrio a modo de palo de amasar Las burbujas de aire se observarn posteriormente como manchas blanquecinas en las membranas. 5. Se corta la membrana a transferir unos milmetros ms grandes que los bordes del gel y se la equilibra durante 10 a 15 minutos sumergida en el buffer de transferencia. 6. Se humedece la superficie del gel y se coloca la membrana sobre su superficie. Se deben eliminar las burbujas de aire como en el paso 4. Se debe evitar levantar y re-posicionar la membrana sobre el gel, ya que algunas protenas comienzan a transferirse tan pronto como el gel toma contacto con la membrana.

64

7. Se coloca una segunda pieza de papel Whatman pre-humedecido y de esponja y se completa el armado cerrando el soporte de transferencia. 8. Se colocan los dos soportes armados en la cuba ad hoc. Se debe tener la precaucin de controlar los cdigos de colores que indican los electrodos. Como las protenas estn cargadas negativamente porque estn recubiertas con SDS, se mueven hacia el nodo (+: base roja). 9. Se coloca el contenedor con hielo dentro de la cuba y se llena la cuba con buffer de transferencia. El nivel del buffer debe superar el borde superior de la membrana, con el objetivo de que sta quede sumergida por completo y la transferencia sea pareja. 10. La transferencia se puede realizar durante 1 hora a 100 V agregando un refrigerante en la cuba durante 16 horas a 15-30 V en una habitacin refrigerada y con agitacin del buffer. 11. Cuando el tiempo se ha cumplido, se desconecta la cuba de la fuente de poder y se desarma el aparato. Los geles pueden ser teidos con Coomassie blue para determinar la eficiencia de la transferencia. Si se utiliz un marcador de peso molecular preteido, ste se puede utilizar como control de la transferencia. 12. Las membranas deben ser marcadas en sus extremos y calles para poder luego determinar la identidad de la muestra. En este procedimiento se logra tener las muestras (antgenos) adheridas a la membrana y en una posicin conocida y determinada por su PM. Deteccin por anticuerpos de los antgenos trasferidos a una membrana 1. Una vez retirada del aparato de transferencia, la membrana se coloca en un recipiente limpio, preferentemente de vidrio o polipropileno, o en una bolsa de nylon sellable 2. La membrana se bloquea con 10% de leche descremada en PBS (buffer de bloqueo), durante 1 hora a temperatura ambiente o durante 16 horas a 4C en agitacin constante. El objetivo del bloqueo es llenar todos los sitios libres con protena no reactiva. 3. La membrana se lava 4 veces con PBS durante 10 a 15 minutos por vez, a temperatura ambiente en agitacin constante. 4. El anticuerpo primario, es decir, el anticuerpo especfico para el antgeno que se quiere detectar, se diluye en el buffer de bloqueo. 5. El bloqueante se reemplaza por el anticuerpo primario y se incuba la membrana con el anticuerpo primario durante 1/2 a 1 hora a temperatura ambiente en agitacin constante. 6. La membrana se lava 4 veces con PBS durante 10 a 15 minutos por vez, a temperatura ambiente en agitacin constante. 7. El anticuerpo secundario, es decir, conjugado con fosfatasa alcalina o peroxidasa, se diluye en el buffer de bloqueo. 8. Se incuba la membrana con el conjugado durante 1/2 a 1 hora a temperatura ambiente en agitacin constante. 9. Se lava la membrana igual que en el punto 3. 10. El revelado se realiza dependiendo del substrato que corresponda segn la enzima utilizada. Si el anticuerpo usado est conjugado con peroxidasa, se debe agregar H2O2 como substrato y un colorante que cambia de color al oxidarse y precipita sobre la membrana, como el TMB (3,3, 5,5 tetramethylbenzidine). En el caso de usar un anticuerpo conjugado con fosfatasa, se puede usar BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt) como substrato y NBT (nitroblue tetrazolium clhoride) como colorante. Las bandas donde hubo reaccin antgeno-anticuerpo se hacen visibles por la precipitacin del colorante sobre la membrana; el fondo del papel donde no ocurri la unin se observa blanca. Cuando la imagen es ptima, se frena la reaccin diluyendo el substrato y el colorante con agua destilada. Luego la membrana se coloca entre papeles absorbentes y se puede registrar el resultado mediante un scanner o cmara fotogrfica. El poro de la membrana puede ser de 0.45m cuando se requiere retener protenas, pero algunos poliptidos pueden atravesar estas membranas sin unirse. Esto puede solucionarse utilizando membranas de poro ms pequeo, como por ejemplo, de 0.1m.

65

Las membranas de nitrocelulosa tienen una capacidad de unin de 80g de protena por cm2 de superficie. Otras membranas, como las catinicas de nylon (Zeta-Probe o Bio-Rad), son ms resistentes (no se rompen al secarse) y con su utilizacin se obtiene una capacidad de unin de protenas de hasta 500g/cm2. Esta caracterstica es ventajosa, pero por otro lado puede ser una desventaja, ya que hace que las membranas sean difciles de bloquear.

Inmunocromatografa
La inmunocromatografa es una tcnica inmunolgica que permite visualizar la reaccin antgeno-anticuerpo por la acumulacin de oro coloidal en zonas especficas del papel de nitrocelulosa donde se fijan previamente anticuerpos o antgenos de captura. Se realiza gracias a que el complejo de oro coloidal con los antgenos migran sobre el papel de nitrocelulosa para reaccionar especficamente con los anticuerpos inmovilizados en el papel, dando bandas coloreadas. El papel de nitrocelulosa permite la migracin por capilaridad de lquidos y solutos y a la vez conserva activos los anticuerpos fijados. El uso de anticuerpos conjugados con oro coloidal en las tcnicas de diagnstico rpido permiten la deteccin de antgenos en muestras biolgicas, siendo el objetivo principal de estas tcnicas alcanzar la seal especfica ms intensa con una mnima o nula reaccin inespecfica En la actualidad, esta tcnica se viene utilizando para el diagnstico rpido de varias enfermedades, a travs de la deteccin de antgenos en diversos lquidos biolgicos, tales como en infecciones por Streptococcus betahemoltico, Chlamydia, virus de la hepatitis, malaria, virus de la inmunodeficiencia felina y virus de la leucemia felina (VIF, VILEF) y parvovirus canino en Veterinaria.
Anticuerpos de deteccin marcados con Oro Coloidal

Antgeno en la muestra

Siembra de la muestra
NITROCELULOSA
Anticuerpo de Captura contra anticuerpo de deteccin Anticuerpo de Captura contra antgeno Especfico

Resultado positivo

Resultado negativo

El papel de nitrocelulosa con los anticuerpos de captura se incorporan a un casete de plstico y al agregar el fluido biolgico sospechoso como suero u orina este migra a travs del papel por cromatografa y reacciona o no en los sitios correspondientes a los anticuerpos. Esta reaccin se visualiza a travs del depsito localizado del Ac secundario marcado con oro coloidal. Bibliografa Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory. 1988. pp726. Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell Instruction Manual. Bio-Rad Margni, R.A. 1996. Inmunologa e Inmunoqumica Fundamentos. Ed. Interamericana.
66

Millipore A. A short guide for developing inmunochromatographic test strips (en lnea). 2nd edition; 2001 (Fecha de acceso: diciembre 2001). URL disponible en: http://www.com/oemproducts. Engler KH, Efstratiou A, Norn D, Koslov RS, Selga I, Glushkevich TG, et al. Immunochromatographic strip test for rapid detection of diphtheria toxin: description and multicenter evaluation in areas of low and high prevalence of diphtheria. J Clin Microbiol 2002; 4(l): 80-3.

Inmunohistoqumica
La historia de la inmunohistoqumica comienza en 1941 cuando Coons identifica neumococos usando un mtodo de fluorescencia directa. Ms tarde se desarrollan la inmunofluorescencia indirecta y las tcnicas inmunoenzimticas. En las ltimas dcadas, el uso de las tcnicas inmunohistoqumicas ha ido creciendo progresivamente hasta consolidarse como tecnologa esencial en el diagnstico anatomopatolgico de rutina. La inmunohistoqumica (IHQ) y la inmunocitoqumica (ICQ) son tcnicas cualitativas de deteccin y de localizacin de antgenos presentes en clulas y tejidos. Todas las tcnicas de IHQ e ICQ utilizan anticuerpos o sistemas amplificadores (sistema avidina: biotina) conjugados con enzimas y un cromgeno que precipita sobre los tejidos generando una reaccin coloreada. Existen diversos mtodos: Directo: el anticuerpo primario (dirigido contra el antgeno de inters) se encuentra conjugado con la enzima. Es fcil y rpido de realizar, pero tiene bajo lmite de deteccin. Indirecto: el anticuerpo primario, dirigido contra el antgeno, no est marcado luego se agrega un anticuerpo secundario conjugado con la enzima, que reconoce especficamente al anticuerpo primario (anti-Ig de la especie). El lmite de deteccin de este mtodo es 4 a 5 veces mayor que el mtodo directo La ventaja del uso de dos anticuerpos es la amplificacin de la reaccin en cada paso, es decir, por cada anticuerpo primario que reaccione lo reconocern dos o ms molculas de anticuerpos secundarios. Los anticuerpos utilizados en estas tcnicas pueden ser monoclonales o policlonales. En ambos casos tienen que tener alta afinidad y especificidad por el antgeno. En el caso de los sueros inmunes, es deseable que tengan ttulos elevados. De esta forma pueden ser usados en diluciones altas (muy baja concentracin) y se evita la aparicin de falsos positivos Si los anticuerpos no tienen elevada especificidad pueden producir reacciones inespecficas que lleven a falsos positivos. Tambin, algunas veces, puede aparecer reactividad cruzada cuando los anticuerpos reconocen sitios similares en molculas relacionadas. Para evitar estas falsas interpretaciones, la tcnica necesita realizarse con controles estrictos de todos lo pasos y de todos los reactivos. Las ventajas de las tcnicas inmunohistoqumicas son que permiten una localizacin ms precisa de la reaccin antgeno-anticuerpo; la tincin es permanente, estable, puede contrastarse y puede evaluarse con microscopio ptico. El material as estudiado puede archivarse por aos sin prdida de la intensidad de la reaccin. Tiene algunas desventajas como la presencia de reacciones inespecficas o cruzadas, especialmente cuando se utilizan anticuerpos policlonales. Los anticuerpos monoclonales han permitido aumentar la especificidad y sensibilidad de esta tcnica. Algunos reactivos son carcingenos potenciales y su manipulacin debe ser cuidadosa, requieren de estandarizacin precisa y estricto control de calidad.

67

Existen diversos tipos de tcnicas, cuya indicacin depender del anticuerpo a utilizar (monoclonal o policlonal), del material disponible (fresco, congelado o fijado en formalina) y de los antgenos a estudiar (de superficie o membrana, citoplasmticos o nucleares). Estas tcnicas necesitan de controles internos o paralelos, usualmente positivos y negativos. En los tejidos, las uniones inespecficas se pueden bloquear con albmina bovina, con leche descremada, o con suero normal de alguna especie distinta y alejada filogenticamente de la que se esta estudiando. Mtodos que utilizan la interaccin avidina-biotina: La avidina es una glucoprotena tetramrica de 67 kda, presente en la clara de huevo, que posee en su superficie regiones hidrofbicas que unen con gran afinidad la biotina. Por otra parte, las cadenas glucdicas de la avidina tienen una carga tal que las hace adhesivas con regiones cargadas del tejido, lo que aumenta el ruido de fondo (uniones inespecficas). La estreptavidina es una protena tetramrica de 60 kDa procedente de Streptomyces avidinii, con alta afinidad por la biotina. La biotina es una protena soluble en agua (vitamina H) de peso molecular bajo (244 Da) con un grupo carboxlico que permite su unin a los restos amino de las protenas. La biotinilizacin es una reaccin bioqumica que permite unir biotina por unin covalente a una gran variedad de molculas como enzimas, lectinas, anticuerpos, cidos nucleicos, etc. El pequeo tamao de la biotina hace que la biotinilizacin no afecte drsticamente las propiedades biolgicas de las molculas a las que se conjuga la biotina. Se han desarrollado varios mtodos que combinan los tres reactivos mencionados, puesto que a medida que se amplifican las seales, se aumenta ostensiblemente el lmite de deteccin de la tcnica. El esquema general del mtodo IHQ sera: 1 paso: Preparacin histolgica de los tejidos o clulas a estudiar 2 paso: Bloqueo de las peroxidasas endgenas 3 paso: Incubacin de los tejidos con el anticuerpo primario 4 paso: Incubacin con el anticuerpo secundario unido a biotina (anticuerpo biotinilado) 5 paso: Incubacin con una solucin de estreptavidina marcada con enzima peroxidasa 6 paso: Agregado del sustrato de la enzima y el cromgeno. Enzimas utilizadas: Las enzimas ms utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina, que reaccionan dando distintos colores con los diferentes sustratos segn la reaccin, lo cual servir para detectar distintas uniones antgeno-anticuerpo. Preparacin de tejidos para inmunohistoqumica: El xito de la inmunohistoqumica depende de la preservacin de los antgenos y del manejo de los anticuerpos. La conservacin de los tejidos por congelacin puede afectar los tejidos y la estructura celular, debido a la formacin de cristales de agua intracelulares. La necesidad de mantener la estructura tisular hace de la fijacin un paso fundamental en las tcnicas histolgicas. Esta necesidad de fijacin se contrapone al riesgo de provocar cambios estructurales y moleculares asociados a cualquier tratamiento de las clulas o tejidos destinados a la observacin microscpica. En IHQ, la fijacin y el tratamiento previo de los tejidos debe satisfacer diferentes criterios como: Retener los antgenos Preservar la antigenicidad Preservar la estructura Permitir la interaccin antgeno- anticuerpo Fijacin: El mayor problema que suelen presentar los fijadores qumicos es que pueden impedir la unin antgeno-anticuerpo, por el enmascaramiento del antgeno debido a cambios conformacionales

68

que ocurren en el antgeno (epitope). No existe un fijador universal, en todos los casos hay que realizar distintas pruebas con diferentes fijadores (y diferentes condiciones de fijacin) para cada antgeno y para cada tejido. El fijador mas utilizado es el formol tamponado, (formaldehdo al 10 % en fosfato disdico y monobsico) debido a que es ms accesible por costos y es menos agresivo a los tejidos que el formol puro. Bloqueo de peroxidasas endgenas Los tejidos tienen sus propias peroxidasas que interfieren con la reaccin cuando se utilizan anticuerpos marcados con peroxidasa. Para bloquear las peroxidasas endgenas se pueden incubar los cortes con una solucin de perxido de hidrgeno y metanol absoluto (entre 10 y 30 minutos) a temperatura ambiente. El mtodo es muy eficiente y lleva a la neutralizacin de las peroxidasas de los tejidos, sin afectar la inmunoreactividad. Otro mtodo consiste en hacer reaccionar las peroxidasas endgenas (inespecficas) con un cromgeno y luego efectuar la reaccin inmunohistoqumica (especfica) con otro cromgeno que desarrolle un color contrastante con el anterior. Preincubaciones Una vez obtenidos los cortes y antes de iniciar las incubaciones con los anticuerpos, se han de hacer diversas preincubaciones y lavados a fin de facilitar la penetracin de los anticuerpos y disminuir el marcaje inespecfico. Generalmente todas las preincubaciones se realizan en soluciones fosfato o tris-HCl o bien en solucin salina tamponada. En el caso de que el proceso se realice sobre portaobjetos gelatinizados, hay que calentarlos previamente entre 37 y 50C (dependiendo de la sensibilidad de los antgenos a la temperatura) durante 10 min. Aplicaciones de la IHQ en medicina veterinaria I. Diagnstico de infecciones: deteccin de microorganismos en los tejidos afectados. II. Diagnstico de enfermedades autoinmunes: deteccin de depsitos de anticuerpos o complejos inmunes en los tejidos afectados. III. Diagnstico de neoplasias: deteccin de marcadores tumorales especficos en las clulas neoplsicas. IV. Investigacin: por ejemplo, utilizando marcadores leucocitarios (CD Cluster of diferentiation) a fin de determinar poblaciones leucocitarias predominantes en ciertas afecciones o tejidos.

Inmunofluorescencia
La inmunofluorescencia es una tcnica de interaccin primaria que permite la localizacin de antgenos en tejidos, frotis de microorganismos, clulas o cultivos en monocapa. Tambin permite la bsqueda de anticuerpos especficos. Utiliza como reactivo una inmunoglobulina marcada con colorantes fluorescentes. Esta tcnica puede ser: Directa Indirecta Inmunofluorescencia Directa: Consiste en demostrar la presencia de un antgeno mediante la reaccin directa con un anticuerpo especfico marcado con un colorante fluorescente. El anticuerpo es obtenido a travs de la inoculacin del antgeno en un animal de experimentacin.

69

Inmunofluorescencia Indirecta: En este caso se busca, en el suero del paciente la presencia de anticuerpos especficos para un antgeno determinado. Se preparan improntas de los antgenos sobre portaobjetos, por ejemplo T. gondii, clulas infectadas por virus, etc. Sobre las improntas se coloca el suero en el cual se sospecha la presencia de anticuerpos especficos. Si la reaccin es positiva, habr formacin de complejos inmunes. Para hacer ostensible esta unin antgeno-anticuerpo, se debe utilizar una inmunoglobulina (anti-especie o antigamma) marcada, que reaccionar con el anticuerpo del paciente. La ventaja de la tcnica indirecta es que no se necesita un anticuerpo marcado para cada antgeno

Ventajas y desventajas de las tcnicas de inmunofluorescencia directa e indirecta: Ventajas: 1) Son muy verstiles y seguras para la deteccin de antgenos o anticuerpos. 2) Permiten implementar rpidamente nuevos ensayos. 3) En la IF indirecta, la seal es ms brillante que en la tcnica directa debido a que varias molculas de anti-inmunoglobulinas fluorescentes se pueden unir a cada uno de los complejos antgeno-anticuerpo formados en la primera etapa (es decir que la seal se amplifica). 4) En la IF indirecta, el uso de un reactivo conjugado anti-especie nico, para estudiar los anticuerpos problema frente a diferentes antgenos, permite ahorrar tiempo y dinero. . Desventajas: 1) Es necesario tener un microscopio de fluorescencia. 2) Es difcil la evaluacin de detalles bsicos. 3) Las preparaciones tienen vida muy corta debido a la prdida de color de los fluorocromos. 4) Se necesita personal muy entrenado para poder determinar entre una reaccin positiva y una impronta negativa, ya que habitualmente las clulas tienen un mnimo de autofluorescencia, que puede llevar a error cuando quien efecta la lectura no tiene experiencia suficiente. Fluorocromos Los fluorocromos son sustancias que se utilizan para marcar estos anticuerpos especficos. Estos colorantes permiten identificar la presencia de las sustancias marcadas con ellos, cuando son excitados por luz ultravioleta. Para unir los fluorocromos a un anticuerpo, estos deben cumplir con una serie de requerimientos: Que el fluorocromo desarrolle suficiente fluorescencia para que la seal emitida sea visible y no se vea interferida por la autofluorescencia del tejido. Que tenga un grupo funcional capaz de fijarse a la molcula de anticuerpo. Que sea soluble en soluciones acuosas, ya que los solventes pueden producir la desnaturalizacin de las protenas durante la unin. Que no pierdan fluorescencia al unirse con los anticuerpos.

70

 Que no alteren la especificidad ni la actividad de los anticuerpos. Que al formar los conjugados no pierdan su fluorescencia con la accin de la luz. La marcacin de los anticuerpos con los fluorocromos se basa en complejas reacciones que llevan a la formacin de uniones covalentes entre ellos y las molculas de inmunoglobulinas. Esta unin se hace a pH alcalino. Adems, la conjugacin entre ambas molculas depende de la temperatura y del tiempo de reaccin. Cuando hay un exceso de anticuerpo con respecto al fluorocromo, se obtienen conjugados que emiten escasa fluorescencia. Cuando sucede lo contrario, es decir, cuando hay mucho fluorocromo unido al anticuerpo, se corre el riesgo de tener marcacin inespecfica. Los isotiocianatos reaccionan con los grupos aminos libres de los aminocidos de los anticuerpos, particularmente de la lisina. Es importante entonces que los buffers usados para la conjugacin no tengan grupos aminos (tris, azida, glicina, amonio, etc). El isotiocianato de fluorescena (FITC) es el fluorocromo ms usado para la conjugacin con anticuerpos. Produce una muy buena seal de color verde, que se diferencia notablemente de la autofluorescencia generalmente ms amarillenta y plida de los tejidos. La fluorescena es muy sensible a las variaciones de pH: La mayor emisin se obtiene a pH 8-9. El inconveniente ms importante es que pierde color rpidamente. Por ello, durante el tiempo que se mantengan las improntas teidas hay que tener la precaucin de guardarlas envueltas en papel de aluminio y en un sitio oscuro, para evitar el deterioro que les produce la exposicin a la luz. Microscopio de fluorescencia El microscopio de fluorescencia consta de: - el microscopio ptico - una lmpara de mercurio o halgena que emite luz ultravioleta - un sistema de filtros: a) El primer filtro es el de excitacin o seleccin de luz, ubicado entre la fuente de luz y el preparado. Tiene por objeto permitir el paso de ondas de luz con longitud tal que caiga en el rango azul, con el fin de que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisin de luz fluorescente. b) El segundo filtro es el de calor y est ubicado entre la fuente de luz y el filtro de excitacin en los microscopios de luz transmitida, y entre la fuente de luz y el espejo dicrmico en los microscopios de luz incidente. c) El tercer filtro es el de barrera, colocado antes del ocular para prevenir daos retinianos que podran ser causados por rayos ultravioletas que escapan por reflejo en el espejo dicrmico. Preparacin de los reactivos: Obtencin de los anticuerpos: Se obtienen mediante inmunizacin en animales. Las inmunoglobulinas se aplican en 2 3 inyecciones a intervalos de 3 a 4 semanas. El suero se recoge 7 a 10 das luego de la ltima inyeccin. La respuesta de anticuerpos se mide mediante mtodos serolgicos. Concentracin del Anticuerpo: Se logra mediante precipitacin con soluciones saturadas de sales de amonio. Los anticuerpos precipitados pueden permanecer en solucin salina de fosfatos (PBS) a pH 7.1. Conjugacin: Es posible conjugar las inmunoglobulinas a partir de suero completo o fracciones de suero luego de concentrar los anticuerpos. Se debe aadir al suero buffer carbonato-bicarbonato para mantener condiciones ptimas de pH (9.0). Se agita en bao de hielo aadiendo fluorocromo en un perodo de 15 minutos, Luego se mantiene el preparado en heladera toda la noche, en agitacin, ya que la conjugacin es del orden del 100% en 24 horas. Purificacin del conjugado: Se logra mediante la eliminacin por dilisis de las sales del buffer y de los elementos utilizados como solventes del fluorocromo (acetona) que podran daar al conjugado. Adems se utiliza extraccin con carbn o filtracin en columna de sephadex para eliminar los restos de fluorocromo que no se conjugaron y que pueden ocasionar tincin inespecfica.

71

Manejo de cortes y tejidos: Los cortes y frotis montados sobre portaobjetos que no se estudien de inmediato, se pueden proteger por inmersin en carbowax y almacenamiento a -20C. Los cortes liofilizados, protegidos con resina de polister, se pueden conservar varios meses en un desecador a 0C sin que pierdan sus antgenos. Es preferible trabajar con cortes fijados ya que la tincin inmunofluorescente en cortes sin fijar se acompaa de difusin o prdida del antgeno. Se deben usar fijadores que no alteren la estructura antgeno-anticuerpo, los ms empleados son alcohol etlico al 95% entre 4-30C, alcohol metlico, acetona o formol. Para bacterias es muy til la fijacin mediante calor. La inclusin en parafina de los tejidos es muy usado y puede lograr una localizacin ms precisa y una tincin ms viva que con cortes en congelacin. Procedimiento recomendado para la tincin por inmunofluorescencia directa: 1) Llevar el portaobjetos que contiene la muestra (clulas o tejido a analizar) a temperatura ambiente. 2) Colocar de 10 a 50 l (dependiendo del tamao de la muestra) de anticuerpo anti-antgeno conjugado en el portaobjetos. 3) Incubar en cmara hmeda a 37C por 30 minutos 4) Lavar el portaobjetos con buffer de lavado (PBS) y luego sumergirlo por 10 minutos en buffer de lavado (PBS) 5) Secar la parte posterior y los bordes del portaobjetos con una toallita de papel. No deben secarse las superficies teidas. No lavar con agua 6) Colocar una gota de lquido de montaje. Cubrir con cubreobjetos y observar en microscopio de fluorescencia a 100 a 250X. Confirmar a 400X. Procedimiento recomendado para la tincin con inmunofluorescencia indirecta 1) Llevar el portaobjetos que contiene la muestra (clulas o tejido a analizar) a temperatura ambiente. 2) Colocar de 10 a 50l (dependiendo del tamao de la muestra) de suero problema diluido en el portaobjetos. 3) Incubar el portaobjetos en cmara hmeda a 37C por 30 minutos. 4) Lavar el portaobjetos con buffer de lavado (PBS) y luego sumergirlo por 10 minutos en el mismo buffer. 5) Secar la parte posterior y bordes del portaobjetos. Colocar sobre la muestra 10 a 50 l de anti-IgG o anti-IgM conjugado con FITC. 6) Incubar como en el paso 3. 7) Lavar como en el paso 4. 8) Secar la parte posterior y los bordes del portaobjetos con una toallita de papel . No se deben secar las superficies teidas. No lavar con agua. 9) Colocar una gota de lquido de montaje. Cubrir con cubreobjetos y observar en microscopio de fluorescencia a 100 a 250X. Confirmar a 400X.

Bibliografa
1) Roum. Biotechnol. Lett., Vol. 6, No. 3, 2001, pp. 177.206. Bucharest University, Center for Research in Enzymology and Biotechnology, Roumanian Society of Biological Sciences 2) Veterinary Medical Research and Development, 2003 VMRD, Inc. P.O. Box 502, Pullman, WA 99163, U.S.A. 3) Immunobiology 5th ed. Janeway, Charles A.; Travers, Paul; Walport, Mark; Schlomchik, Mark. Garland Publishing c 2001 4) http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorophase.html 5) Manual de procedimientos. Instituto Malbrn.

72

Citometra de flujo
La citometra de flujo es una tcnica que permite la medicin y anlisis de mltiples caractersticas de una misma partcula. Estas partculas, generalmente clulas, fluyen a travs de una tubuladura sobre la cual incide un rayo lser. Las propiedades que pueden ser medidas incluyen el tamao de las partculas, la granularidad relativa (que es una medida de la complejidad interna) y la intensidad de la fluorescencia emitida. Estas caractersticas se determinan usando simultneamente un sistema ptico y un sistema electrnico que permiten conocer cmo la clula o partcula desva el rayo lser incidente y la fluorescencia que emite. Un citmetro de flujo consta de tres sistemas: 1. Sistema de fluidos 2. Sistema ptico 3. Sistema electrnico. El sistema de citometra de flujo permite analizar partculas de 0,2 a 150 micrmetros. La luz desviada por las partculas as como la fluorescencia emitida por ellas es captadas por lentes posicionados para tal fin. Luego la informacin es trasmitida a detectores que producirn seales electrnicas proporcionales a la seal ptica recibida Es decir que el sistema electrnico convierte las seales pticas en electrnicas para que puedan ser procesadas por una computadora. En algunos casos, cuando el aparato tiene sistema de separacin de partculas, el sistema electrnico identifica cules de las clulas o partculas guardar y cules desechar. . 1-Sistema de fluidos La zona del citmetro donde las clulas (o partculas) se juntan con el fluido se la conoce como cmara de flujo El fluido del citmetro se encuentra a presin y conduce la muestra a travs de la cmara de flujo. Las partculas de la muestra a ser analizadas llegan separadas y en una corriente de fluido presurizado. El propsito de este sistema es permitir que el rayo lser atraviese la muestra justo por el centro 2-Sistema ptico Est formando por un sistema de excitacin y uno de recoleccin. El sistema de excitacin consiste en un lser y lentes que se usan para enfocar el rayo lser El sistema de recoleccin consiste en lentes que colectan la luz emitida por la interaccin entre el rayo lser y la partcula y un sistema de espejos y filtros que encausan rangos de ondas determinados de la luz colectada a detectores pticos especficos. Generacin de dispersin: Cuando una partcula es incidida por el rayo lser se produce una desviacin de la luz que depender de las propiedades fsicas de las partculas, es decir: su tamao y complejidad interna. La membrana celular, el ncleo, y cualquier material granular que se encuentre dentro de la clula, afectan la desviacin de la luz. La forma de la clula y la topografa de la superficie celular tambin contribuyen a la desviacin total de la luz. La luz desviada hacia adelante (Forward Scattered light: FSC) es proporcional a la superficie o tamao celular. FSC es una medida de la luz difractada y es detectada por un fotodiodo en direccin frontal. La luz desviada hacia el costado (Side Scattered light: SSC) es proporcional a la granularidad celular y a la complejidad interna de las clulas. SSC es, esencialmente, una medida de la luz refractada que ocurre en cualquier interfase dentro de la clula donde hay un cambio en el ndice de refraccin. SSC se colecta aproximadamente a 90 grados del rayo lser mediante lentes colectoras y luego es redireccionada a un detector.

73

Correlacionando las mediciones de FSC y SSC se pueden diferenciar tipos celulares en una poblacin heterognea. La mayora de las poblaciones leucocitarias pueden diferenciarse usando FSC y SSC. Fluorescencia: Un compuesto fluorescente absorbe energa de cierto rango de longitud de onda que es caracterstico para ese compuesto. Esta absorcin de luz provoca que un electrn de la sustancia fluorescente alcance un mayor nivel de energa. El electrn as excitado decae en energa emitiendo el exceso como un fotn. Esta transicin de energa se denomina fluorescencia. Cuanta ms energa es consumida en la absorcin, ms energa es emitida en la fluorescencia. - El rango de onda en el cual un compuesto fluorescente puede ser excitado se conoce como su espectro de absorcin. - El rango de onda emitido por este compuesto es denominado su espectro de emisin. El lser de argn es comnmente usado en citometra debido a que su longitud de onda de 488 nm puede excitar ms de un fluorocromo. Entonces, se puede usar ms de un fluorocromo simultneamente, siempre que todos sean excitados a 488nm y que sus picos de emisin se encuentren lo suficientemente alejados entre s. La combinacin de isotiocianato de fluorescena (FITC) y ficoeritrina (PE) satisfacen este criterio. La magnitud de la seal detectada es proporcional al nmero de molculas de fluorocromo en la partcula. En una mezcla de clulas se pueden usar diferentes fluorocromos conjugados a anticuerpos monoclonales para distinguir las diferentes subpoblaciones celulares. El tipo de tincin captada por cada subpoblacin junto con la FSC y SSC, pueden ser usadas para identificar qu tipos celulares estn presentes en una muestra y los porcentajes relativos de las mismas. Filtros pticos: Una vez que la partcula pas a travs del lser, la SSC y la seal fluorescente emitidas van al fotomultiplicador, mientras que el fotodiodo colecta la FSC. La especificidad de un detector para una tincin fluorescente en particular se puede optimizar colocando un filtro que permite que slo un rango estrecho de longitudes de onda alcance el detector. Deteccin de seales: Los fotodetectores convierten las seales de luz en seales elctricas. La intensidad de las seales elctricas es proporcional a la intensidad de las seales de luz. Cuando la partcula se interpone en el haz de lser y comienza a desviar la luz o producir fluorescencia, se crea un pulso. El punto ms alto de este pulso ocurre cuando el rayo incide sobre el centro de la partcula y se capta el mximo de luz desviada o fluorescencia emitida. A medida que la partcula se aleja del rayo, el pulso baja a la lnea de base. Una vez que las seales de luz (fotones) golpean al fotodiodo, son convertidos en un nmero proporcional de electrones que se multiplican para crear una corriente elctrica mayor. La corriente elctrica viaja al amplificador y se convierte en un pulso de voltaje; este pulso depende del nmero de fotones detectados por el fotomultiplicador. 3-Sistema electrnico: recoleccin de datos. Las seales de luz se convierten finalmente en seales electrnicas, lo que permite que los datos puedan guardarse en una computadora. Pero cmo se define la muestra a tomar? Adquisicin de las muestras: Se denomina as a la toma de muestra por parte del citmetro Qu tipo de datos guardar la computadora, depender de los parmetros que previamente establezca el operador. Estos parmetros varan de acuerdo con las muestras a analizar.

74

Umbral: Se usa para limitar el nmero de eventos que adquiere un citmetro. El umbral se establece en un parmetro. Por ejemplo si el umbral se establece en FSC, slo sern registradas las seales generadas por partculas cuyo tamao sea mayor que el umbral establecido. Este control se usa para eliminar seales generadas por polvo, restos celulares, o ruido electrnico en el sistema. En aquellos equipos que tienen ms de un lser, se puede establecer un segundo umbral. En ese caso la seal emitida por la partcula a ser analizada deber alcanzar los dos umbrales para ser procesada como un evento. Los datos se guardan en un formato standard denominado Flow Cytometry Standard Format. Una sola clula analizada para cuatro parmetros FSC, SSC, FITC y PE genera 8 bytes de datos. Si se multiplica este valor para un slo dato, por el nmero de eventos que se adquieren en cada muestra y teniendo en cuenta que cada operador procesa cerca de treinta muestras por da, se puede tener una idea de la capacidad de almacenamiento de datos que tiene un citmetro. Una vez que los datos han sido guardados, pueden ser presentados y graficados en el citmetro de diversas maneras: como histogramas, grficos tridimensionales, grficos de puntos, etc. Determinacin de regiones o Gating: Un grupo de datos puede ser definido por un gate que es una barrera numrica o grfica. Esta barrera se usa para definir las caractersticas de las partculas que se analizarn. Por ejemplo, en una muestra de sangre, el operador puede querer analizar slo la poblacin linfocitaria. Basado en la FSC o el tamao celular la barrera (gate) puede establecerse en una curva de FSC vs SSC para permitir el anlisis de clulas que tengan slo el tamao de los linfocitos. Otro ejemplo. De la muestra slo se desea tomar la poblacin indicada en color amarillo, entonces se establece una barrera (gate) en esa zona y el equipo slo adquiere las partculas de esa regin.

Gate 1

75

Esquema de un citmetro de flujo

Muestra

Lmina de lquido

Flujo celular vibratorio Fluorescencia Roja

Lser

Fluorescencia Verde Dispersor de luz de 90 (granulosidad) Collar de carga Dispersor de luz frontal (tamao)

Tubos colectores

Desechos

Una vez adquirida la muestra, los datos son guardados en la computadora del citmetro y pueden ser analizados en cualquier momento y de diversas maneras. Por ejemplo:

Anlisis de datos para la determinacin de subpoblaciones: Consiste en mostrar en un grfico los datos colectados en un archivo y luego evaluar la distribucin de los eventos dentro de la curva. Los datos pueden ser subdivididos creando barreras (gates) sobre poblaciones especficas. Cabe aclarar, que en este caso los gates o barreras establecidos no son para la toma de muestras, sino para el anlisis de muestras ya adquiridas por el citmetro. Esto quiere decir que si el operador se equivoc cuando defini los parmetros de adquisicin de la muestra, esos datos los perdi. Por eso es muy importante conocer el material en anlisis. Por ejemplo, se puede establecer un gate sobre la poblacin linfocitaria, para obtener y analizar los datos de los eventos que se encuentran exclusivamente en esa regin determinada. Los datos obtenidos de esta regin delimitada, se analizan en otros grficos: histogramas de un parmetro, grficos de puntos de dos parmetros, curvas tridimensionales, etc. A partir de estos datos luego se obtienen anlisis estadsticos, que tambin son producidos por el sistema de anlisis de datos del citmetro. Por ejemplo, un histograma permite analizar un parmetro contra el nmero de eventos. Siempre se usa un control negativo para saber dnde hay que ubicar los marcadores sobre el histograma (Ver figura1a y b derecha). Estos marcadores son usados para especificar el rango de eventos que sern considerados positivos para un parmetro. Una vez que se ha

76

establecido el primer marcador sobre el control negativo (M1) se ubica el segundo marcador sobre el pico del histograma que contiene la poblacin considerada positiva (M2). Un grfico de puntos (dot plot) muestra los datos de dos parmetros. Cada punto puede representar uno o ms eventos, de acuerdo a lo establecido por el operador. (Ver figura 1b izquierda y figura 2) El marcador de cuadrantes divide un grfico de dos parmetros en cuatro secciones y permite distinguir poblaciones negativas, positivas y doble positivas. - El cuadrante inferior izquierdo (LL) muestra la poblacin negativa para ambos parmetros. - El cuadrante superior izquierdo (UL) muestra la poblacin que es positiva para el parmetro graficado sobre el eje vertical. - El cuadrante inferior derecho (LR) muestra la poblacin positiva para el parmetro graficado sobre el eje horizontal. - El cuadrante superior derecho (UR) muestra la poblacin positiva para ambos parmetros. FiGURA 1a

Negativo M1 N de clulas

Positivo M2

Fluorescencia

77

Figura 1 b: Grfico de puntos e histograma

SSC-H: Granulosidad y complejidad de la partcula FSC-H: Tamao de la partcula

Counts: Nmero de eventos FL1-H: Parmetro Figura 2: Grfico de puntos (dot plot)

78

Separacin de partculas (SORTING) En la mayora de las aplicaciones, una vez que la partcula ha pasado a travs del rayo lser, es enviada a desecho. El sistema de separacin de partculas permite capturar aqullas consideradas de inters para anlisis posteriores. Una vez colectadas, estas partculas pueden ser examinadas microscpica, bioqumica o funcionalmente. No todos los citmetros estn equipados para hacer separacin de partculas. Para efectuar la separacin de partculas, el equipo debe primero determinar cules son las de inters. Una vez que la poblacin de inters ha sido identificada en una curva de adquisicin de datos, se dibuja una regin alrededor de ella. Luego se carga esta informacin en el citmetro como regin de separacin. Esta regin identifica aquellas clulas que sern separadas de la corriente de fluido por donde transita toda la muestra. A medida que cada clula pasa por el lser, el equipo determina si la misma pertenece a la poblacin de inters. Dado que el alineamiento del lser y la velocidad de la corriente son fijos, el tiempo que toma el pasaje de las clulas a separar desde el lser hasta el tubo de captura, es constante.

Bibliografa:
1. 2. 3. 4. Roum. Biotechnol. Lett., Vol. 6, No. 3, 2001, pp. 177.206. Bucharest University, Center for Research in Enzymology and Biotechnology, Roumanian Society of Biological Sciences Veterinary Medical Research and Development, 2003 VMRD, Inc . P.O. Box 502,Pullman, WA 99163, U.S.A. Immunobiology 5th ed Janeway, Charles A.; Travers, Paul ; Walport, Mark ; Schlomchik, Mark. Garland Publishing c 2001 http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorophase.html

TCNICAS DE INTERACCIN SECUNDARIA: PRECIPITACIN Y AGLUTINACIN

Las reacciones secundarias pueden observarse a simple vista y reciben diferente nombre segn el antgeno involucrado en la reaccin sea soluble o particulado. Si el antgeno es soluble, hablamos de una reaccin de precipitacin. Si el antgeno es particulado, hablamos de una reaccin de aglutinacin. 1. PRECIPITACIN Cuando un anticuerpo bivalente es puesto en contacto con un antgeno polivalente soluble (protenas, virus) contra el cual el Ac es especfico, se forman complejos Antgeno-Anticuerpo (Ag-Ac) que se insolubilizan y dan lugar a una reaccin de precipitacin. La precipitacin se produce en dos etapas. En la etapa inicial, que se desarrolla rpidamente, es especfica y muy poco influida por la temperatura y la concentracin de electrolitos, se forman los complejos Ag-Ac primarios. En una segunda etapa, a medida que el tiempo transcurre, esos complejos Ag-Ac iniciales se agregan y originan micelas de diferentes tamaos. Cuando las micelas crecen por encima de cierta masa crtica, se tornan insolubles y precipitan espontneamente. Algunos complejos no alcanzan a hacerlo y quedan en solucin. Las micelas precipitadas tienden a sedimentar por accin de la gravedad y la velocidad de sedimentacin, es proporcional al volumen de las partculas y a las densidades de las partculas e inversamente proporcional a la densidad del solvente. La temperatura acelera esta segunda etapa, que es adems electrolitodependiente. Esta segunda etapa es ms lenta que la inicial, puede durar minutos e incluso horas para que se complete.

79

En los agregados de complejos Ag-Ac, cada molcula de antgeno est unida a ms de una molcula de anticuerpo y cada molcula de anticuerpo est unida a ms de una molcula de antgeno. Cuando los complejos Ag-Ac se producen con haptenos monovalentes o antgenos que poseen un solo determinante antignico por molcula, la precipitacin no se produce. Un hecho particular lo constituyen los anticuerpos monoclonales, que en su mayor parte no muestran actividad precipitante. Esto se debe a que en muchos de los casos los anticuerpos monoclonales reconocen a un nico epitope no repetido, lo que les impide formar agregados (micelas) aunque el antgeno sea una macromolcula (figura 1). Cuando se utilizan sueros inmunes obtenidos a partir de animales inoculados con estas mismas macromolculas la precipitacin s tiene lugar, pues en estos sueros hay una mezcla de anticuerpos que reconocen distintos epitopes del mismo antgeno, lo que posibilita la formacin de complejos mixtos Ag-Ac insolubles. La formacin de estos complejos ha sido explicada mediante la teora del enrejado, que considera que la composicin del precipitado formado es una consecuencia del modo en que el anticuerpo y el antgeno se han unido. Dada la bivalencia del anticuerpo y multivalencia del antgeno, las posibilidades de combinacin varan segn sea que en la mezcla exista exceso de antgeno, exceso de anticuerpo o equivalencia de ambos (figura 2). Figura 1

80

Figura 2

La capacidad de producir una reaccin de precipitacin es una propiedad de la mayor parte de los anticuerpos (a los que originalmente se llam anticuerpos precipitantes). Existen anticuerpos no precipitantes, llamados coprecipitantes, que pertenecen a la clase IgG. Los anticuerpos coprecipitantes carecen de la capacidad para precipitar el antgeno, no activan el complemento y su poder protector es diferente al de los anticuerpos precipitantes. - Se ha demostrado que en los anticuerpos coprecipitantes hay un resto glucdico del tipo rico en manosa, que puede ser removido mediante el empleo de enzimas. Cua ndo esto ocurre, los anticuerpos coprecipitantes se convierten en precipitantes. - La glicosilacin afecta a uno solo de los fragmentos Fab y es la responsable del particular comportamiento inmunoqumico y biolgico de estos anticuerpos, convirtiendo al anticuerpo en monovalente. - El comportamiento biolgico de los anticuerpos coprecipitantes de tipo IgG, podr resultar beneficioso o perjudicial para el husped segn el carcter propio o no propio de los antgenos involucrados y de la situacin particular en la que actan los anticuerpos. - Cuando un animal es inoculado a repeticin, los anticuerpos coprecipitantes constituyen del 10 % al 15% de la poblacin total y estn presentes a lo largo de toda la respuesta inmune. - Por inmunodifusin no se han detectado diferencias antignicas entre anticuerpos precipitantes (o simtricos) y coprecipitantes (o asimtricos) con la misma especificidad. - La relacin de IgG simtrico / asimtrico vara segn el antgeno sea soluble o particulado. Cuando el antgeno se encuentra en solucin, esta relacin en general es de 90 / 10, mientras que cuando el antgeno es particulado esta relacin se invierte y puede llegar hasta 30 / 70. - Se ha demostrado que en infecciones microbianas o parasitarias crnicas como brucelosis o tripanosomiasis, estos anticuerpos se producen en gran cantidad y se fijan firmemente al agente patgeno, pero no son protectores frente a la infeccin. Se especula que los anticuerpos asimtricos seran capaces de bloquear antgenos o epitopes, disminuyendo su concentracin y como consecuencia, interviniendo en la tolerancia de baja dosis. - Durante la preez hay un aumento de molculas IgG asimtricas especficas contra antgenos paternos. Esto, sumado al efecto bloqueante de los anticuerpos asimtricos, sugiere que estos anticuerpos con especificidad para los antgenos de origen paterno deben participar en la proteccin del feto en el tero materno.

81

Los anticuerpos asimtricos deben ser tenidos en cuenta en la interpretacin de los resultados de las pruebas de diagnstico. Las pruebas que se basan en reacciones de interaccin primaria (como ELISA o IFI) miden todos los anticuerpos especficos presentes en la muestra. Por el contrario, las pruebas que se basan en reacciones de interaccin secundaria (como precipitacin, aglutinacin y fijacin de complemento), slo detectan anticuerpos funcionalmente bivalentes o polivalentes (no as los anticuerpos monovalentes). Las proporciones relativas de anticuerpos simtricos / asimtricos presentes en los sueros hacen que cada prueba deba interpretarse de manera diferente, dado que una misma muestra arrojar diferentes ttulos de anticuerpos en las diferentes pruebas a las que sea sometida, segn sea el tipo de anticuerpos que identifique la prueba. Estas diferencias deben tenerse en cuenta cuando se realizan estudios de respuesta inmune humoral, correlaciones entre nivel de anticuerpos y evolucin de un proceso infeccioso o grado de proteccin contra el antgeno en estudio. Segn sea el medio en que se realice la prueba, la precipitacin puede ser en medios lquidos o en medios con geles. 1.a. Precipitacin en medios lquidos Precipitacin cualitativa Si una muestra biolgica sospechosa de contener un antgeno en particular se mezcla con igual volumen de una solucin que contiene los anticuerpos especficos (antisuero) y se observa turbidez del medio de reaccin, significa que la reaccin Ag-Ac tuvo lugar. La turbidez que se observa se debe a la precipitacin de los complejos inmunes formados entre el anticuerpo especfico presente en el suero y el antgeno presente en la muestra. La reaccin es cualitativa, ya que slo indica la presencia del antgeno en estudio, pero no aporta datos sobre su concentracin. El Mtodo del anillo, se basa en la reaccin que se produce en la interfase entre dos sustancias cuando en una serie de pequeos tubos se colocan sucesivamente y evitando que se mezclen, las soluciones de antgenos en diferentes diluciones y los anticuerpos que se corresponden.

MTODO: Se coloca en una serie de tubos 0,2 ml del suero con Ac especficos para el antgeno en estudio. Se aade luego por las paredes 0,2 ml de la muestra sospechosa de contener el antgeno, en diluciones seriadas. Se deja en bao de Mara a 37 C durante una hora y se observa si en alguno de los tubos aparece un precipitado anular blanco que indica reaccin positiva en ese tubo, es decir correspondencia entre Ag y Ac especficos que producen el enrejado en el tubo que contiene las concentraciones ptimas de ambos reactantes. 1.b. Precipitacin en medios con geles Las macromolculas pueden difundir libremente a travs de geles. Empleando soportes adecuados, en especial aquellos que como base tienen agar disuelto en soluciones salinas, es posible hacer migrar antgenos y anticuerpos de modo que al encontrarse interaccionen. En estos casos, los precipitados que se originan se visualizan como ntidas bandas de precipitacin. Se han descrito numerosas tcnicas cualitativas, semicuantiativas y cuantitativas entre las que pueden citarse la difusin simple, la difusin doble y la difusin radial. Difusin simple en tubo Este mtodo es conocido tambin como tcnica de Oudn simple, que se puede utilizar para analizar un antisuero. Consiste en colocar en un tubo de ensayo pequeo agar fundido (solucin al 1%) mezclado con un volumen igual del antisuero a analizar. Producida la solidificacin, se aade la solucin de antgeno. El antgeno difunde a travs del gel y crea un
82

gradiente de concentracin. En la interfase lquido-gel no se forma precipitado debido a la alta concentracin antignica en esta zona. La precipitacin aparece en forma de bandas en la zona donde la concentracin del antgeno que ha difundido es la ptima. Si en el suero hay ms de un anticuerpo y en la solucin aadida hay ms de un antgeno que se correspondan, se formarn tantas bandas de precipitacin como sistemas hayan interaccionado. Difusin bidireccional En este caso ambos reactivos (antgeno y anticuerpo) migran hacia un gel intermedio (sin reactivos) por diferencias de concentracin y forman el enrejado (precipitacin visible) en la zona en la cual se encuentran la mayor concentracin de complejos inmune asociados. MTODO: Mezclar partes iguales de agar al 1% (fundido y enfriado a 50 C) y el antisuero con especificidad contra el antgeno en estudio. Transferir 1 ml de la mezcla al tubo de reaccin, y enfriarlo rpidamente para que solidifique. Inmediatamente despus, aadir 0,5 ml de agar al 0,5% fundido y enfriado a 50 C. Una vez solidificado, agregar 1 ml de una mezcla en partes iguales de agar al 1% y antgeno. Despus de la solidificacin, dejar los tubos a temperatura ambiente durante 24 a 48 horas convenientemente tapados para evitar evaporaciones (*2) Proceder a la lectura de los resultados. Los anticuerpos y las partculas antignicas difunden desde la zona de agar al 1% hacia la zona de agar al 0,5%. En el punto de encuentro se forma la banda de precipitado. Difusin simple en placa, Inmunodifusin radial o tcnica de Mancini Este mtodo ha dado magnficos resultados para la cuantificacin de antgenos. Cuando un antgeno es colocado en un orificio practicado en una placa de agar, ste difunde en forma radial. Si en la matriz del agar hay anticuerpos monoespecficos, el antgeno que difunde formar complejos inmunes con los anticuerpos disueltos en el agar. Esta reaccin se observa como un halo de precipitacin. De acuerdo a los principios bsicos de la difusin, el dimetro del halo de precipitacin estar en relacin directa con la concentracin de antgeno. Si esta operacin se repite colocando en diferentes orificios de la placa cantidades variables y conocidas del antgeno en estudio (por ejemplo, diluciones en base 2) y se incuba hasta que el halo de precipitacin no se modifique, se puede confeccionar una recta con los resultados obtenidos, en la que se relaciona el dimetro de cada crculo de precipitacin (X) con la correspondiente concentracin antignica (Y). Esta recta permite calcular la concentracin de ese mismo antgeno en cualquier muestra desconocida, estableciendo el dimetro del halo de precipitacin de la muestra problema. La concentracin de la muestra podr determinarse luego por simple clculo o por interpolacin a partir de la curva de calibracin. La difusin radial se utiliza con muy buenos resultados para la valoracin de protenas que se encuentran presentes en mezclas complejas como por ejemplo los componentes del suero. Es indispensable disponer para ello de anticuerpos especficos contra cada uno de los antgenos que se quiere valorar. MTODO: Aadir 5-10 % del suero especfico (que contiene los anticuerpos) al agar fundido y enfriado a 50C, procurando que la mezcla sea lo ms homognea posible. Cubrir inmediatamente la placa con la mezcla anterior y dejar en reposo hasta su solidificacin. Mediante un sacabocados, efectuar sobre el gel una serie de orificios, los que deben estar situados a distancias convenientes entre s para evitar interferencias. (Se necesita un orificio para cada muestra a valorar y cuatro a cinco orificios para las distintas concentraciones del antgeno patrn que se utilizan para la elaboracin de la recta de calibracin). En uno de los orificios de la placa, colocar 2 microlitros de la solucin antignica a valorar (muestra problema), o una dilucin conveniente de esta solucin.

83

 En los orificios restantes, colocar 2 microlitros de cada una de las diluciones del antgeno patrn, de concentracin conocida. Mantener las placas a temperatura ambiente, en cmara hmeda, hasta que el halo de precipitacin no vare. Evaluar los resultados mediante la determinacin del dimetro de los halos de precipitacin. Los resultados pueden leerse sobre el material fresco o despus de lavar las placas (Ver mtodo ms adelante). Difusin doble en placa, Inmunodifusin doble o tcnica de Ouchterlony Ouchterlony describi un mtodo interesante de difusin doble en placas, el cual consiste en enfrentar las soluciones de antgeno y anticuerpo en perforaciones efectuadas en el gel (agar) a distancias convenientes. De esta manera, ambos difunden a travs del agar, se ponen en contacto y producen una banda de precipitacin cuando las respectivas concentraciones estn en relacin ptima. - Si las concentraciones de Ag y Ac colocados en los reservorios son las que corresponden a la zona de equivalencia, la banda de precipitacin se forma aproximadamente en la distancia media que separa esos reservorios. - Cuando hay exceso de antgeno, la banda de precipitacin se forma prxima al reservorio del anticuerpo - Cuando hay exceso de anticuerpo, la banda de precipitacin se forma prxima al reservorio del antgeno. Con esta tcnica puede tenerse una idea de las relaciones entre los pesos moleculares de los antgenos y anticuerpos reaccionantes, cuando se trabaja con concentraciones ptimas de Ag y Ac. - Si la banda de precipitacin formada es recta, indica que los pesos moleculares de ambos son muy prximos. - Si la banda es cncava con respecto al reservorio del antgeno, seala que el peso molecular de ste es superior al del anticuerpo. - Si la banda es convexa con respecto al reservorio del antgeno, seala que el peso molecular de ste es menor que el del anticuerpo Los dos fenmenos descritos son una consecuencia de las leyes generales de la difusin, que establecen que la distancia a la que una sustancia difunde est en relacin directa con su concentracin y en relacin inversa con su peso molecular. Dependiendo de la cantidad de muestras a analizar o del tipo de estudio a realizar, se emplean distintos esquemas reactivos, como por ejemplo: 1) 2) 3) 4)

Esta metodologa permite determinar si hay ms de un sistema reaccionando en forma simultnea, pues cada uno de ellos dar una banda de precipitacin especfica. Adems, nos permite identificar reacciones cruzadas, pues en estos casos habr fusin de bandas. Originalmente Ouchterlony describi tres tipos de reacciones: de identidad, no-identidad e identidad parcial. Estas reacciones se esquematizan en la figura 3 para el caso hipottico de tres antgenos (a, b, ab) y dos anticuerpos (A: anti-a, AB: anti-a y anti-b).

84

Figura 3

- En el caso I, los dos sistemas Ag-Ac que reaccionan son iguales y se funden en una nica banda de precipitacin (reaccin de identidad). - En el caso II hay dos sistemas Ag-Ac diferentes que reaccionan independientemente y cada uno produce una banda de precipitacin que se cruzan (reaccin de no-identidad) evidenciando la presencia de reacciones Ag.-Ac diferentes. - En el caso III, uno de los antgenos tiene un epitope que no existe en el otro. Por lo tanto ambas bandas de precipitacin se unen y funden parcialmente en una banda, apareciendo una prolongacin o espoln en la banda correspondiente al antgeno que contiene los dos epitopes. Este espoln indica que en este antgeno ab hay componentes antignicos no compartidos con el antgeno b (reaccin de identidad parcial). La difusin doble en placa es un excelente mtodo para el estudio de la homogeneidad de antgenos y anticuerpos purificados. Resulta muy til tambin para la bsqueda de impurezas, lo que est limitado por la concentracin en que stas se encuentren presentes, ya que la precipitacin se hace visible cuando los reactivos exceden valores mnimos. Para obviar este inconveniente, se emplean generalmente altas concentraciones de Ag y Ac, lo que permite aumentar la concentracin de las impurezas y asegurar su precipitacin. La inmunodifusin doble es utilizada ampliamente en el diagnstico serolgico de varias enfermedades en Medicina Veterinaria, por ejemplo para el diagnstico serolgico de la Anemia Infecciosa Equina, mtodo denominado Test de Coggins (figura 4). En esta prueba, en una perforacin central se coloca un purificado proteico del virus de la anemia infecciosa equina y en seis perforaciones equidistantes del antgeno y entre s, se intercalan sueros de animales positivos (suero control positivo) y sueros de animales que se desea investigar (sueros problema: S1, S2 y S3). - Si el suero problema es negativo (S3) las bandas de precipitacin de los dos sueros positivos adyacentes se introducen en la perforacin. - Si el suero problema es positivo (S2), se forma una banda de precipitacin entre el suero problema y el antgeno que se fusiona con las bandas de precipitacin de los dos sueros positivos adyacentes (reaccin de identidad). - Si la banda del suero positivo se dobla pero no forma una banda de identidad completa, el suero problema es considerado positivo dbil (S1). En cualquiera de estos dos ltimos casos el animal se considera infectado. Este esquema tambin se emplea para el diagnstico serolgico de otras enfermedades como Fiebre Aftosa en bovinos, Brucelosis en caninos (Brucella canis) u ovinos (Brucella ovis ) o la Enfermedad de Marek en aves.

85

Figura 4

S1 + Ag S3 + S2 +

Ag: antgeno +: suero control positivo S 1: suero positivo dbil S 2: suero positivo S3: suero negativo

MTODO: En una placa de Petri o un portabojetos se vierte el agar fundido y enfriado a 50C. Se deja solidificar y se confeccionan los orificios con un sacabocados. Para las pruebas diagnsticas de rutina en Medicina Veterinaria, se coloca el antgeno en el orificio central y en los orificios exteriores se intercalan el suero control positivo y cada uno de los distintos sueros problema. Las placas o portaobjetos se mantienen en cmara hmeda. La lectura de los resultados se efecta a las 48 - 72 horas. Si interesa conservar los resultados, el agar puede colorearse, previa desecacin. - En este caso, el agar debe lavarse previamente por inmersin en solucin salina durante un total de 24 a 48 horas, efectuando el recambio de la solucin salina cada 12 horas. Este lavado es necesario para eliminar las protenas no precipitadas. - Luego del lavado, el agar se cubre con un trozo de papel de filtro hmedo y se deja secar a temperatura ambiente. - Una vez seco, se retira el papel y se lo sumerge en la solucin colorante Azul de Coomasie durante aproximadamente 1 hora. El exceso de colorante se elimina por inmersin en solucin decolorante y se procede luego al secado en estufa a 50 C. 2. AGLUTINACIN Cuando un anticuerpo (bi o polivalente) es puesto en contacto con el antgeno para el cual es especfico, si este antgeno es polivalente y se encuentra en estado particulado (hemates, bacterias, clulas), se forman complejos Ag - Ac que dan lugar a una reaccin de aglutinacin. Esta reaccin puede observarse micro o macroscpicamente como agregados o grumos de nmero y tamao variable. Los principios que regulan la aglutinacin son los mismos que regulan la precipitacin; la ocurrencia de uno u otro fenmeno depende de que el antgeno sea particulado (se encuentre en suspensin) o soluble (en solucin). La aglutinacin se lleva a cabo en medio salino. La concentracin ptima de electrolitos es de 0,15 M. Se cree que el mecanismo de aglutinacin se debe a que los iones neutralizan en parte las cargas superficiales de las partculas antignicas, evitando el rechazo entre ellas y asegurando la aproximacin indispensable para que una molcula de anticuerpo reaccione con al menos dos partculas antignicas. De esta manera se inicia la formacin de los complejos inmunes que llevan a la aglutinacin.

86

2.a. Aglutinacin cualitativa; Los mtodos de aglutinacin cualitativa son muy utilizados en serologa diagnstica con el objeto de identificar bacterias, tipificar grupos sanguneos, etc. En estos casos es indispensable disponer de anticuerpos monoespecficos. Estas reacciones se efectan en portaobjetos mezclando las suspensiones de bacterias o hemates a identificar, con una batera de anticuerpos con diferente especificidad. La presencia de aglutinacin indica la especificidad del sistema reaccionante. MTODO (Identificacin de microorganismos): Se suspende el cultivo microbiano en estudio en solucin salina, procurando que la suspensin sea lo ms densa posible (no menos de 2 x 1010 bacterias/ ml). En un portaobjetos se coloca una gota de cada uno de los anticuerpos especficos (por ejemplo, suero anti Escherichia coli K88, suero anti E. coli K99 y suero anti E. coli F41) y otra de solucin salina (control negativo), de modo que estn a una distancia tal que se evite su mezcla accidental. A cada una de estas gotas, se aade un volumen igual de la suspensin bacteriana y se mezcla para homogeneizar. El portaobjetos se agita suavemente por rotacin manual. Se incuba durante unos minutos a temperatura ambiente y se observa. La aparicin de grumos o agregados en alguna de las mezclas indica la identidad de la bacteria en estudio. Estos grumos son de tamao variable. A veces son visibles a simple vista pero otras veces es necesario el uso de lupa o microscopio para observarlos. 2.b. Aglutinacin semicuantitativa: Los mtodos semicuantitativos consisten en determinar cul es la mxima dilucin del suero que se est analizando que es capaz de producir aglutinacin. Las diluciones se hacen generalmente en base dos y el ttulo se expresa por la inversa de la mxima dilucin aglutinante. Por ejemplo, si la dilucin 1/1024 aglutina y no lo hace la dilucin 1/2048, el ttulo ser 1024. Los valores obtenidos son groseros y pueden aproximarse efectuando diluciones intermedias. El estudio de la cintica del ttulo de anticuerpos especficos permite seguir la evolucin de una infeccin bacteriana o de una iso-sensibilizacin, por ejemplo, por antgenos hemticos. La determinacin de anticuerpos por aglutinacin puede hacerse mediante reacciones de lectura lenta o rpida. En el primer caso (lectura lenta) se emplean suspensiones diluidas y estandarizadas de un antgeno, que se mezclan con volmenes iguales de diferentes diluciones del suero a valorar, empleando como diluyente una solucin salina. Antgeno y anticuerpo se incuban en tubos de ensayo a 37C durante tiempo variable segn el estudio. El ttulo se determina buscando cul es el tubo con la mxima dilucin del suero que presenta aglutinacin. Tal es el caso de la prueba de Wright para el diagnstico de brucelosis y de la prueba de Microaglutinacin de Martin y Petit para el diagnstico de leptospirosis En la prueba de Wright la reaccin se realiza en tubos, en los que se enfrentan diluciones 1/25, 1/50, 1/100 y 1/200 del suero problema con una cantidad estandarizada de bacterias (Brucella abortus cepa 19). Las mezclas (de aspecto turbio blanquecino debido a las clulas bacterianas) se incuban a 37C durante 48 horas y luego se observan con luz tangencial sobre fondo oscuro. La aglutinacin se manifiesta como formacin de grumos grandes que sedimentan en el fondo del tubo. Paralelamente se observa la clarificacin del medio lquido, dado que las bacterias que le daban turbidez se encuentran en los grumos. La aglutinacin rpida es muy usada en serologa diagnstica. Por ejemplo para el diagnstico de brucelosis (por Brucella abortus, mellitensis y suis) se emplea la Reaccin de B.P.A. (Buffered Plate Antigen). En este caso, la reaccin se efecta en placas de vidrio. El antgeno que se emplea est 20 veces ms concentrado que el usado en la aglutinacin lenta y la lectura de los resultados se hace a los 8 minutos. En la prctica diaria el uso de las pruebas de aglutinacin se encuentra muy estandarizado, al punto que son las pruebas oficiales para el diagnstico de la brucelosis bovina. El Plan
87

Nacional de Erradicacin de la Brucelosis Bovina se basa en la vacunacin obligatoria de las terneras entre los 3 y 8 meses de edad y en la posterior identificacin y segregacin de los animales infectados. La identificacin de los animales infectados se realiza a travs de la deteccin de anticuerpos especficos contra Brucella abortus. En el caso particular de la cepa 19 de B. Abortus, la vacunacin desencadena en el animal una respuesta inmune primaria, con niveles de IgM que se mantienen en el tiempo y niveles bajos de anticuerpos de tipo IgG. Las tcnicas serolgicas de aglutinacin rpida y lenta se emplean para diferenciar los animales que presentan anticuerpos de tipo IgM a consecuencia de la vacunacin de aquellos que presentan anticuerpos de tipo IgG inducidos por una infeccin activa con la cepa de campo. Los sueros problema son analizados por la prueba de B.P.A, que permite la identificacin de los animales que presentan anticuerpos especficos contra Brucella abortus. Esta prueba es muy sensible pero poco especfica y adems no permite discriminar si los anticuerpos que reaccionan son de tipo IgG o IgM. Por lo tanto, las muestras que resultan positivas a B.P.A. son analizadas luego por las pruebas de Wright y por la Prueba del 2-mercaptoetanol. En ambos casos se enfrentan diluciones seriadas del suero problema con una suspensin estandarizada de Brucella abortus cepa 19. Los tubos de la prueba de 2-mercaptoetanol (2-ME) son tratados previamente con una solucin de 2-ME que destruye los puentes disulfuro de las IgM, por lo que estos anticuerpos pierden su poder aglutinante. De esta manera, si se observa aglutinacin an en los tubos tratados con 2-ME, significa que la aglutinacin es debida a la presencia de anticuerpos de tipo IgG. Los animales que resultan positivos a esta prueba son considerados como infectados y deben ser segregados del rodeo. Otra aplicacin de la tcnica de aglutinacin es la determinacin cualitativa y cuantitativa de anticuerpos antitoxoplasma. MTODO: Colocar 60ul de suero a analizar en el pocillo nmero 1 de una placa de microaglutinacin con pocillos de fondo cnico. Colocar una gota de buffer borato a temperatura ambiente desde el pocillo nmero 2 al nmero 8. Diluir el suero en el buffer borato utilizando un microdilutor, descartar el excedente del pocillo nmero 8). Colocar una gota de antgeno de toxoplasma en todos los pocillos. Agitar las placas enrgicamente durante 30 segundos cuidando de que no se derrame el contenido de los pocillos. Colocar un film plstico a fin de evitar la desecacin e incubar 24 horas a temperatura ambiente. La lectura se facilita si se efecta sobre un fondo oscuro o mediante iluminacin oblicua. La ausencia de aglutinacin se traduce por la aparicin de un pequeo botn netamente destacado. En caso de aglutinacin positiva, se observa un tapiz homogneo de clulas o un botn de mayor tamao que el anterior y con contornos irregulares. El ttulo del suero corresponde a la dilucin ms elevada que muestre una aglutinacin total o casi total. En este ltimo caso, el dimetro del tapiz debe ser superior a la mitad del dimetro del pocillo. El control del antgeno debe ser totalmente negativo. Tambin en este caso, para diferenciar si el anticuerpo que acta es de isotipo IgM o IgG se utiliza la prueba del 2-ME. Los valores lmite de esta tcnica son 1/128 para el perro y 1/256 para el gato. 2.c. Aglutinacin pasiva Los anticuerpos especficos contra un antgeno soluble no pueden detectarse por precipitacin si su concentracin es inferior a los 20 g/ml. Teniendo en cuenta que la aglutinacin es ms sensible, se ha procurado fijar antgenos solubles a partculas de modo de

88

transformar la reaccin de precipitacin en una reaccin de aglutinacin. Esto se ha logrado con magnficos resultados mediante la fijacin de antgenos solubles a hemates o partculas inertes como el poliestireno, el ltex y la bentonita. A la reaccin que resulta del empleo de glbulos rojos como soporte se la llama Hemoaglutinacin pasiva, y simplemente Aglutinacin pasiva cuando se utilizan otros soportes. Generalmente las uniones de los antgenos a los soportes son no covalentes y la fijacin se obtiene por mezcla directa. En el caso de los hemates, la fijacin de hidratos de carbono no necesita intermediarios; en cambio para la fijacin de protenas es necesario el tratamiento previo de los glbulos rojos con aldehdos simples como el frmico o pirvico. La aglutinacin pasiva es un mtodo semicuantitativo que, al igual que la aglutinacin, permite determinar concentraciones relativas de anticuerpos sobre la base de la mxima dilucin aglutinante. Es cuatro veces ms sensible que la aglutinacin y mucho ms an que la precipitacin. Esto es consecuencia del tamao de las partculas antignicas que intervienen en la reaccin. En la precipitacin, el antgeno es pequeo y se necesitan muchos complejos Ag-Ac agregados para que la reaccin se visualice, en tanto que en la aglutinacin pasiva se ha transformado al antgeno en una partcula de gran tamao, capaz de dar aglutinados visibles con unos pocos complejos Ag-Ac. El nmero de molculas de anticuerpo que intervienen en uno y otro caso difieren muchsimo, de ah la distinta sensibilidad (lmite de deteccin). La reaccin se efecta colocando en tubos distintas diluciones del suero a valorar y un volumen determinado del antgeno fijado al soporte. Anticuerpo y antgeno se mezclan mediante agitacin suave y se incuban durante un tiempo determinado, en general a temperatura ambiente. Los tubos se observan sin centrifugar, por la parte inferior, para determinar si ha habido aglutinacin. Esta tcnica se emplea para investigar hormonas y antgenos solubles en sangre, orina y otros fluidos. Fenmeno de Prozona: Cuando se valora un antisuero, la disminucin de la concentracin de los anticuerpos por el efecto de la dilucin del suero hace que la reaccin de aglutinacin decrezca hasta hacerse nula. No obstante ello, en algunos sueros se observa un comportamiento particular que est caracterizado por la ausencia de aglutinacin en los primeros tubos de la serie, en los que la concentracin de anticuerpos es mxima, y aglutinacin positiva a diluciones mayores del suero. A este fenmeno se lo llama prozona. Mediante el empleo de anticuerpos marcados se ha podido demostrar que en estos tubos, an en ausencia de aglutinacin, el anticuerpo est unido al antgeno. Puesto que existe un marcado exceso de anticuerpos respecto a los determinantes antignicos, estadsticamente es muy poco probable que los dos fragmentos Fab del anticuerpo puedan unirse a dos epitopes ubicados en partculas diferentes. Este fenmeno adems est relacionado con los anticuerpos asimtricos o monovalentes mencionados anteriormente. La reaccin de Coombs permite identificar estas reacciones incompletas. (Ver captulo de grupos sanguneos y reacciones posttransfusionales). Todo esto indica la necesidad de evaluar los sueros a ms de una dilucin para descartar los falsos negativos debidos al fenmeno de prozona.

Bibliografa 1. Morilla A. y Bautista C. R. Manual de Inmunologa Mxico: Editorial Diana.1 edicin, septiembre de 1986.Captulo 6. 2. Margni R. A. Inmunologa e Inmunoqumica Fundamentos. Bs. As. Editorial medica Panamericana 5 edicin septiembre de 1996. Captulo I. 3. Inmunologa bsica. Gua de trabajos prcticos. Fac. Cs. Veterinarias. Ao 2000. 4. Guerrero R.; Gonzalez C.L.; Medina E.L.; Epidemiologa.E.A.U.: Editorial: Addison-Wesley Iberoamericana.1 edicin, 1981. Edicin consultada, 1986. Captulo 14.

89

5. Manual de Procedimientos para el Diagnstico de la Brucelosis Bovina. Departamento de Brucelosis. DILACOT SENASA. 2000

Grupos sanguneos en caninos y reacciones post-transfusionales

Los antgenos de grupos sanguneos son glucolpidos y glucoprotenas localizados en la superficie de la membrana celular de los glbulos rojos. Son heredados en forma independiente entre ellos y por herencia mendeliana de dominancia autosmica. La denominacin internacional de grupos sanguneos caninos y sus caractersticas de muestra en la Tabla 1. TABLA 1: Grupos sanguneos del canino Grupo sanguneo (DEA) (1) 1.1 1.2 3 4 5 6 7 8 Incidencia en la poblacin (%) (2) 42 20 6 98 23 98-99 45 40 Presencia de anticuerpos naturales (3) No No S No S No S No

Importancia en la transfusin Reaccin hemoltica aguda. Reaccin hemoltica aguda. Retardada, secuestro de clulas, no hemlisis. Ninguna. Retardada, secuestro de clulas, no hemlisis. Desconocida. Retardada, secuestro de clulas, no hemlisis. Ninguna.

(1) DEA = Dog erythrocyte antigen. (antgeno eritrocitario canino) (2) La incidencia en la poblacin est basada en una compilacin de estudios internacionales. (3) Los anticuerpos naturales son anticuerpos especficos contra los antgenos de grupo sanguneo que el individuo no posee. Estn presentes en la sangre sin que haya habido exposicin previa a dichos Ags. Se sintetizaran por estmulos antignicos provocados por sustancias que estn en la naturaleza, especialmente en plantas y bacterias, que son de estructura muy similar a los Ags eritrocitarios. La importancia de los diferentes Ags de grupos sanguneos en las reacciones posttransfusionales se relaciona con su inmunogenicidad, su frecuencia en la poblacin y la presencia de anticuerpos naturales. El grupo sanguneo DEA1.1 es el ms inmunognico (siguindole el DEA1.2) y es capaz de provocar reacciones agudas de fuerte hemlisis intravascular por activacin de la va clsica del complemento. Sin embargo, debido a que no hay anticuerpos naturales contra este Ag, la reaccin post-transfusional aguda no tiene lugar en una primera transfusin a un receptor DEA1.1 negativo. El resto de los grupos sanguneos (a excepcin de DEA4), estn constituidos por Ags dbiles, que no provocan hemlisis intravascular sino una reaccin de secuestro y destruccin extravascular de los eritrocitos incompatibles por parte del sistema mononuclearfagoctico. El carcter retardado y no agudo de este tipo de respuesta determina que an con presencia de anticuerpos naturales en los animales negativos, como es el caso de los grupos DEA 3, 5 y 7, tampoco resulte crtica una primera transfusin de sangre incompatible. No se han identificado reacciones post-transfusionales relacionadas con el grupo sanguneo DEA4. Por esta razn, los animales portadores de este grupo sanguneo son considerados dadores universales. Las caractersticas de los grupos sanguneos caninos en lo que respecta a su inmunogenicidad (y consecuentemente, al tipo de reaccin que provocan) y la presencia o ausencia de anticuerpos naturales en la poblacin, determinan que una primera transfusin de sangre

90

incompatible, cualquiera sea el grupo sanguneo al que pertenezcan los eritrocitos transfundidos, no produzca una rpida destruccin masiva, sino las siguientes consecuencias: - Estimulacin de una respuesta inmune primaria que disminuye la vida media de los eritrocitos transfundidos, pues los mismos son destruidos progresivamente a medida que la respuesta inmune se desarrolla. - Vida media ms breve de los eritrocitos transfundidos si la incompatibilidad se debe a antgenos contra los cuales el receptor posee anticuerpos naturales. - Sensibilizacin del animal receptor a los Ags del grupo sanguneo incompatible transfundido. De este modo, en futuras transfusiones con sangre incompatible de igual grupo que la primera se producir una respuesta inmune secundaria. Este efecto es importante para grupos que provocan reaccin fuertemente hemoltica (DEA1.1 y en menor medida DEA1.2). - Posible sensibilizacin de la madre DEA1.1 negativa a los eritrocitos DEA1.1 del feto durante la preez (25 % de incidencia). Esta situacin es equivalente a la sensibilizacin por transfusin. En cuanto al recin nacido, ste puede llegar a tener problemas de hemlisis intravascular al mamar calostro que contiene los anticuerpos maternos contra su grupo eritrocitario (ver isoeritrlisis neonatal). Para prevenir las situaciones mencionadas, se recomienda tipificar previamente la sangre de donante y receptor o, en su defecto, realizar la prueba cruzada (cross-match). La mayor eficacia en la transfusin se logra cuando los eritrocitos del donante pertenecen a igual grupo sanguneo que los del receptor, o cuando se transfunden eritrocitos del grupo DEA4. Tipificacin de los antgenos de grupos sanguneos: La tipificacin consiste en incubar una suspensin de eritrocitos del individuo con antisuero o Acs monoclonales especficos para cada antgeno eritrocitario. La presencia de aglutinacin indica que se ha producido reaccin antgeno-anticuerpo y en consecuencia, hay certeza de que esos eritrocitos tienen el antgeno de grupo sanguneo para el cual es especfico el antisuero o los Acs monoclonales utilizados. Dada la alta probabilidad de reacciones falsas negativas, debe confirmarse el resultado mediante la prueba de Coombs (ver ms adelante). Es frecuente que slo se tipifique el grupo sanguneo DEA1.1. De este modo, si bien no se evita la disminucin de la vida media de los eritrocitos transfundidos debido a la posible incompatibilidad con otros grupos sanguneos, se elimina la posibilidad de reacciones hemolticas agudas graves. Prueba cruzada: En el caso de que no sea posible realizar la tipificacin, se impone la realizacin de una prueba cruzada. Esta prueba se subdivide en prueba mayor y prueba menor. En la prueba mayor se incuban los eritrocitos del donante con el suero o plasma del receptor. En la prueba menor se incuban los eritrocitos del receptor con el suero o plasma del donante. Se procede luego a la centrifugacin. La reaccin positiva, que consiste en la presencia de aglutinacin en el sedimento y/o de hemlisis en el sobrenadante, indica que el plasma tiene Acs contra los Ags eritrocitarios. En el caso de la prueba mayor, el resultado positivo hace contraindicada la transfusin. Una reaccin positiva en la prueba menor resulta significativa cuando se van a transfundir volmenes grandes de sangre y nos indica la conveniencia de transfundir slo eritrocitos y no sangre entera. El resultado de la prueba cruzada no indica identidad de grupos sanguneos entre dador y receptor; slo manifiesta la presencia o ausencia de Acs contra los Ags eritrocitarios en el plasma. Es una medida indirecta y parcial de compatibilidad sangunea, debido a que un resultado negativo slo indica que la transfusin no provocar reacciones post-transfusionales inmediatas, pero no garantiza que se eviten las consecuencias a mediano y largo plazo descriptas en el primer apartado.

91

PRUEBA DE COOMBS La aglutinacin es la manifestacin visible de una reaccin Ag-Ac en la cual el Ag es particulado, como por ejemplo las bacterias y los eritrocitos. Sin embargo, en algunos casos, si bien tiene lugar la reaccin Ag-Ac no se produce la esperada manifestacin visible, o sea, la formacin de lo que se denomina enrejado y que se visualiza en forma de aglutinacin. Diversas son las causas que pueden concurrir para producir este efecto: a- Exceso de Acs: En este caso, cada molcula de Ac se unira con la totalidad de sus valencias a una misma partcula antignica. As, sera imposible la formacin del enrejado pues no se produciran puentes de Acs entre las molculas de Ag. b- Presencia de Acs monovalentes: Son Acs que debido a determinadas caractersticas de glicosilacin se comportan como monovalentes, imposibilitando la formacin del enrejado. Los Acs contra Ags eritrocitarios pertenecen en su mayora a este grupo. c- Defecto de Acs: La cantidad de Acs especficos contra el Ag es muy escasa, y no alcanza para formar un enrejado del tamao suficiente como para que resulte visible. La prueba de Coombs, tambin llamada de la antiglobulina, permite evidenciar estas reacciones Ag particulado-Ac mediante el agregado de anti-Igs de la especie. Las anti-Igs agregadas (tambin llamadas suero de Coombs), harn de puente entre las regiones Fc de los Acs unidos a las partculas antignicas, formando de este modo el enrejado que se ve en forma de aglutinacin. La prueba de Coombs puede ser directa o indirecta. La tcnica de Coombs directa consiste en el agregado de la anti-Ig a una suspensin de partculas de la que nos interesa saber si ya llevan unidas anticuerpos. El diagnstico de la anemia hemoltica autoinmune, caracterizada por la presencia de auto-Acs contra los eritrocitos propios, constituye un ejemplo de uso de esta tcnica directa y consiste en el agregado del suero de Coombs a una suspensin de eritrocitos de un animal sospechoso de sufrir la enfermedad. La tcnica de Coombs indirecta, en tanto, consiste en el agregado de anti-Ig de la especie a una reaccin previa de aglutinacin que ha resultado negativa. Por lo tanto, implica dos pasos: una primera incubacin de la suspensin de Ag particulado con el antisuero y una segunda incubacin luego del agregado del suero de Coombs. De este modo podemos diferenciar los resultados falsos negativos, cualquiera sea la causa que los provoque, de los resultados negativos reales debidos a la ausencia de Acs especficos. La prueba de Coombs indirecta resulta de suma utilidad para evidenciar los fenmenos de prozona y para la tipificacin de grupos sanguneos. La reaccin de Coombs se esquematiza en la figura 1. Figura 1

92

ISOERITRLISIS NEONATAL Esta enfermedad, tambin denominada ictericia hemoltica del recin nacido, se produce cuando la madre transmite Acs contra los Ags eritrocitarios del cachorro a travs del calostro, provocando en el cachorro una reaccin de hemlisis intravascular aguda. Puede producirse cuando una madre DEA1.1 negativa, previamente sensibilizada al Ag eritrocitario DEA1.1, tiene un cachorro DEA1.1 positivo. El resto de los Ags de grupos sanguneos carecen de relevancia en lo que respecta a esta enfermedad, debido a que son Ags dbiles y no provocan reacciones de hemlisis intravascular. La sensibilizacin de la madre puede suceder por dos circunstancias: a- Que alguna vez haya recibido una transfusin de sangre DEA1.1. b- Que en una anterior preez de un cachorro DEA1.1 positivo, los eritrocitos del feto hayan pasado a la circulacin sangunea materna. Este hecho, que cuando sucede tiene lugar en fecha cercana al parto, estimula la produccin de una respuesta inmune especfica de tipo primaria en la madre. Esta respuesta da lugar a una muy baja o nula cantidad de Acs anti-DEA1.1 al momento de la produccin de calostro, por lo que no hay riesgo de isoeritrlisis neonatal en esta primera preez. No obstante, la madre queda sensibilizada para futuras gestaciones. En una posterior gestacin de un cachorro DEA1.1 y en el caso de que los eritrocitos del feto pasen a la circulacin materna, la hembra ya sensibilizada (cualquiera sea la causa de la sensibilizacin) responder a este estmulo antignico con una respuesta de tipo secundaria. Esta respuesta dar lugar a una rpida sntesis de una elevada tasa de Acs que sern transmitidos al recin nacido mediante el calostro. Los Acs anti-DEA1.1 al unirse a los eritrocitos del neonato, provocarn la activacin de la va clsica del complemento con la consecuente hemlisis intravascular aguda. La isoeritrlisis neonatal puede prevenirse si se evita que el recin nacido mame calostro, pero dado que el calostro es un alimento fundamental, no conviene privar de l al cachorro a menos que exista la seguridad de la presencia de Acs anti-eritrocitos. La realizacin de una prueba cruzada entre el suero o plasma de la madre y los eritrocitos del recin nacido, es la herramienta con que se cuenta para tomar la decisin: Un resultado positivo hace contraindicado el mamado de calostro. Es posible realizar esta prueba antes del parto utilizando los eritrocitos del padre; de este modo obtenemos el dato con anticipacin para poder preparar el manejo adecuado del recin nacido en caso de que la prueba arroje resultado positivo (administracin de calostro artificial, bsqueda de nodriza, etc) APENDICE Grupos sanguneos del felino
Grupo sanguneo A B AB Genotipo (1) A/A - A/B B/B A/B Frecuencia de expresin (2) El ms comn (74-100%) Menos comn (0-26 %) Menos comn (0,1-9,7%) Anticuerpos naturales (3) Puede haber una mnima reaccin anti-B Altos ttulos de anticuerpos naturales anti-A Ninguno

(1) (2) (3)

El alelo A es dominante. El fenotipo AB es el resultado de un tercer alelo que permite la expresin codominante de A y B. Estos datos estn basados en una compilacin de estudios internacionales. Hay peligro de reaccin post-transfusional entre receptor de grupo B y donante de grupo A, an en la primera transfusin.

Grupos sanguneos del equino La determinacin de grupo sanguneo en el equino se puede utilizar para la determinacin de paternidad. Tambin es una tcnica corriente en esta especie debido a la incidencia de anemia hemoltica del recin nacido.

93

Sistemas A D P Q C K T U

Alelos o factores A1 - A` - H - A - H - a D-Jd P1 - P` - p Q - R - S - QR - RS - q Cc Kk Tt Uu

Grupos sanguneos (1) A1 - A` - H - A1A` - A1H - A`H - A1A`H - (-) D - J - DJ - (-) P1 - P` - P1P` - (-) Q - R - S - QR - QS - RS - QRS - (-) C - (-) K - (-) T - (-) U - (-)

(1): Los complejos antignicos se heredan en bloques, es decir, en asociaciones definidas de factores sanguneos que constituyen los grupos sanguneos, no heredndose los factores componentes por separado. Bibliografa: 1. Halle A. Canine blood groups and their importance in veterinary transfusion and medicine. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice. Vol. 25, Number 6, Nov. 1995, 1323-1332. 2. Giger U et al. An acute hemolytic transfusion reaction caused by dog erythrocyte antigen 1.1 incompatibility in a previously sensitized dog. JAVMA, Vol. 206, May 1, 1995, 1358-1362. 3. Margni R. A. Inmunologa e Inmunoqumica Fundamentos. Bs. As. Editorial Mdica Panamericana. 5 edicin, septiembre de 1996. 4. Tizard, I. Inmunologa Veterinaria. Ed. Interamericana. M.C.Graw Hill. 4 Edicin, 1995.

Evaluacin de Inmunidad celular por linfoproliferacin

La prueba de linfoproliferacin consiste en la evaluacin de la expansin clonal de los linfocitos de sangre perifrica en cultivos estimulados en forma inespecfica (con mitgenos) o especfica (con antgenos). Los mitgenos son sustancias que tienen afinidad por determinadas estructuras qumicas de la superficie linfocitaria y que, al unirse a ellas, inducen la activacin y proliferacin de los linfocitos en forma policlonal e inespecfica. Son ejemplos de estos mitgenos la Concanavalina-A (Con-A), la Fitohemaglutinina (PHA), el mitgeno de la hierba carmn (PWM), el Lipopolisacrido (LPS) y la protena A del Staphylococcus, entre otros. Las poblaciones linfocitarias sobre las que actan estos mitgenos varan segn la especie animal. En la especie canina, por ejemplo, la Con-A se clasifica como mitgeno de clulas T en tanto que el LPS, la protena A y el PWM estimulan la diferenciacin de linfocitos B y la PHA activa ambas poblaciones linfocitarias. A diferencia de los mitgenos, los antgenos activan slo los linfocitos de los clones especficos y desencadenan una respuesta proliferativa, oligoclonal y especfica. Metodologa (Figura 1): A) Obtencin de las clulas mononucleares por separacin en gradiente de densidad Se centrifuga sangre heparinizada sobre una columna de un reactivo denominado FicollHypaque o similar. Este reactivo tiene la propiedad de crear un gradiente de densidad durante la centrifugacin, en el que cada componente de la sangre se ubica en un diferente nivel. De mayor a menor densidad (desde el fondo a la boca del tubo) se obtienen los siguientes estratos: eritrocitos, polimorfonucleares, Ficoll-Hypaque, clulas mononucleares y plasma. El halo formado por las clulas mononucleares (linfocitos y un mnimo porcentaje de monocitos) se aspira con una pipeta. Las clulas obtenidas se lavan con solucin salina y se resuspenden en medio de cultivo a la concentracin celular de uso.
94

B) Cultivo en microplacas de 96 hoyos Las clulas se resuspenden en medio de cultivo y se siembran en microplacas de cultivo de 96 hoyos. En estas placas vamos a tener: Hoyos controles, que contienen la suspensin celular sin estimular. Hoyos estimulados, que contienen la suspensin celular a la que se le agrega el estmulo proliferativo, ya sea mitgeno inespecfico o antgeno. Ambos tipos de cultivo se realizan al menos por triplicado. Las placas se incuban a 37C en estufa con ambiente hmedo y 5% de CO2. C) Marcacin con timidina tritiada Luego de varios das de cultivo, se agrega timidina tritiada a cada cultivo. Las molculas de timidina marcadas con tritio (3H) se incorporan al ADN de las clulas en proliferacin, que ahora tendrn ADN tritiado en sus ncleos. Transcurridas 12 a 16 horas de cultivo con el medio que contiene timidina tritiada, las clulas de cada hoyo se aspiran con un cosechador quedando retenidas sobre filtros especiales. D) Revelado de la proliferacin El tritio que marca las molculas de timidina emite radiacin beta que puede ser leda en un contador de centelleo lquido y cuantificada como cuentas por minuto (cpm) o desintegraciones por minuto (dpm). A mayor proliferacin en cada hoyo, mayor ser la radiactividad retenida en cada filtro, o sea mayor el nmero de cpm ledo. Se realiza el promedio de los triplicados correspondientes a cada muestra. Los resultados se expresan como ndice de estimulacin (I.E.), de acuerdo a la siguiente frmula: I.E. = promedio de cpm en los hoyos estimulados promedio de cpm en los hoyos controles

95

Figura 1 Sangre perifrica

Gradiente de Ficoll-Hypaque Plasma Halo mononucleares Ficoll Hypaque Polimorfonucleares Eritrocitos

Suspensin de clulas mononucleares (SCM)

Cultivo

Controles (SCM + medio de cultivo) Incubacin

Estimulados (SCM + medio de cultivo + estmulo: mitgeno o Ag)

Pulso de timidina tritiada

Cosecha

c.p.m.

IE: X c.p.m. estimulados X c.p.m. controles

96

Se ha desarrollado una variante de la metodologa descripta, que utiliza directamente la sangre entera heparinizada diluida en medio de cultivo como fuente de linfocitos. En caninos, se ha demostrado que esta metodologa es comparable y an ms reactiva que la tcnica clsica descripta. Se postula que tiene la ventaja de reproducir mejor las condiciones in vivo y evitar la prdida de clulas (supoblaciones de L con diferentes funciones) que conlleva el proceso de purificacin en gradiente utilizado en la metodologa convencional. Aplicaciones La tcnica de linfoproliferacin puede aplicarse para evaluar: La capacidad funcional de los linfocitos. Los linfocitos normales deben presentar una respuesta proliferativa a la estimulacin con mitgenos inespecficos. La respuesta linfocitaria frente a un antgeno determinado, que nos permite identificar la sensibilizacin previa del individuo frente al antgeno. El efecto que tienen sobre la capacidad funcional de los linfocitos, aquellas enfermedades que provocan inmunodeficiencia (ej. moquillo canino, parvovirosis canina, leishmaniasis canina, etc.). El efecto de los inmunoestimulantes sobre la inmunidad celular El efecto de diferentes tipos de vacunas o esquemas de vacunacin sobre la inmunidad celular. Para ello, se vacuna a los animales in vivo y se mide la respuesta proliferativa al Ag in vitro. La accin inmunosupresora de ciertos frmacos como medicamentos inmunosupresores (utilizados para el tratamiento de enfermedades autoinmunes o linfoproliferativas) o de medicamentos cuyos efectos colaterales inmunosupresores requiere un seguimiento del paciente. El efecto que tienen las interleuquinas que se secretan frente a diferente tipo de situaciones (stress, quemaduras, traumatismos, etc.) sobre los linfocitos. Por ejemplo, la inmunodeficiencia severa combinada de los caninos (XSCID) es un desorden gentico caracterizado por la falta de funcionalidad de linfocitos B y T. En el trabajo que se cita infrascripto, esta anomala se evidencia in vitro mediante la prueba de proliferacin linfocitaria en cultivos estimulados con fitohemaglutinina (PHA). Los resultados no estn expresados en ndice de estimulacin, sino directamente en cpm. Como puede observarse en el grfico que se reproduce, la respuesta proliferativa de los linfocitos en los caninos con inmunodeficiencia severa combinada es significativamente menor a la de los linfocitos provenientes de caninos normales.

cpm

30.000

20.000

10.000

0 Normal XSCID
(Felsburg, J et al. Canine X-linked severe combined immunodeficiency. Veterinary Immunology and Immunopathology, 69 (1999), 127-135).

97

Bibliografa 1. Ramayo. L G, Soba M G, Mundo S L. Evaluacin de la inmunidad celular en caninos: prueba de proliferacin de linfocitos in vitro. InVet, 2005, 7 (1): 63-70. 2. Letwin, Bruce and Quimby, Fred. Effects of concanavalina-A, phytohemagglutinin, pokeweed mitogen, and lipopolysaccharide on the replication and immunoglobulin synthesis by canine peripheral blood lymphocytes in vitro. Immunology Letters, 14 (1986/1987), 79-85. 3. Krakowa, Steven, Ringer, Susan. Activation specificity of commonly employed mitogens for canine B- and T- lymphocytes. Veterinary Immunology and Immunopathology, 11 (1986), 281-289. 4. Krakowa, Steven et al. Immunosuppression by canine distemper virus: modulation of in vitro immunoglobulin synthesis, interleukin release and prostaglandin E2 production. Veterinary Immunology and Immunopathology, 15 (1987), 181-201. 5. Millen, G.L. et al. Vaccination of racing greyhounds: effects on humoral and cellular immunity. Veterinary Immunology and Immunopathology, 49 (1995), 101-113. 6. Cook G. et al. Transforming growth factor beta from multiple myeloma cells inhibits proliferation and IL-2 responsiveness in T lymphocytes. J. Leukoc. Biol. 1999 Dec; 66 (6): 981-988. 7. Choudhry MA, Hockberger PE, Sayeed MM. PGE2 suppresses mitogen-induced Ca2+ mobilization in T cells. Am. J. Physiol. 1999 Dec.; 277 (6 Pt 2): R1741-8. 8. Freitag KA et al. Acute starvation and subsequent reffeding affect lymphocyte subsets and proliferation in cats. J. Nutr. 2000 Oct.;130 (10): 2444-9.

Tcnica de Seroneutralizacin
Se define como seroneutralizacin a la prueba que detecta la prdida de infectividad de un microorganismo (virus o bacteria) o de toxicidad (toxinas) que se produce in vitro por la accin de anticuerpos especficos presentes en el suero. Dada la importancia que tiene la aplicacin de esta tcnica en virologa, la explicacin de la misma ser realizada basndonos en estos microorganismos. Fundamentos de la reaccin La reaccin consiste en mezclar un virus y el suero que se intenta evaluar y determinar si la capacidad infectante del virus se modifica (por la presencia de anticuerpos neutralizantes) o no. La combinacin de virus y suero generalmente es dbil y en ocasiones el virus no se inactiva durante el proceso. Por esta razn, la reaccin en un primer estadio puede ser reversible si se somete la mezcla a ciertas condiciones como vibracin inica, centrifugacin, variaciones de pH o simplemente dilucin y las partculas virales vuelven a ser infecciosas. Existe una relacin entre la reversibilidad de la reaccin virus-anticuerpo y el tiempo y la temperatura de incubacin. Cuanto mayor sea el tiempo de incubacin, la reaccin virusanticuerpo ser cada vez ms estable. La temperatura y el tiempo utilizados dependen del tipo de virus y el husped con que se trabaja. Generalmente se utiliza 1 hora a 37 C, pero los protocolos varan segn el sistema y se fijan para poder comparar resultados. Una de las explicaciones del fenmeno de neutralizacin es que el anticuerpo especfico envuelve a la partcula viral e impide que sta se ponga en contacto con las clulas susceptibles. Algunos autores afirman que hay dos etapas en la neutralizacin: 1) Formacin de partculas no infectivas pero absorbibles a las clulas por los sitios libres del virus. 2) Formacin de partculas no infectivas ni absorbibles, por bloqueo de todos los sitios activos. La presencia del virus no neutralizado se detecta a travs de diferentes sistemas como cultivos celulares (ya sean primarios, secundarios o lneas celulares), animales de laboratorio (ratones, hmster, etc.) o embriones de pollo (utilizando distintas vas de inoculacin: corioalantoidea, alantoidea, cavidad amnitica, cerebral, venosa, etc.).

98

Factores que influyen en la reaccin Los resultados de las pruebas de seroneutralizacin varan segn: - la especie y edad del individuo del cual provienen los anticuerpos - el sistema de deteccin, - la va de inoculacin (si se utilizan animales susceptibles), - la estabilidad del virus a cambios de temperatura, - el pH y otros diversos factores fsicos y qumicos. Por esta razn conviene contar con sueros testigos positivos (con anticuerpos neutralizantes) y negativos, pues un aumento aparente del ttulo neutralizante por elevacin de temperatura de incubacin o por un tiempo de incubacin ms prolongado, puede deberse a la prdida de infectividad del virus y no a la capacidad neutralizante del suero. Aplicaciones Esta tcnica serolgica puede ser utilizada para detectar y tipificar virus en animales infectados o para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes en animales que han superado la infeccin o han sido vacunados. La seroneutralizacin permite tambin identificar individuos que carecen de anticuerpos neutralizantes en su suero; estos individuos se deben seleccionar con preferencia en casos de vacunaciones, ya que representan una poblacin de riesgo. Recordemos que uno de los objetivos de la vacunacin es estimular la produccin de anticuerpos protectores, que son los que se evalan por esta metodologa y corresponden a anticuerpos capaces de evitar la infeccin. Con esta prueba se pueden seleccionar los animales vrgenes para las pruebas de potencia de vacunas y tambin evaluar la eficacia de una vacuna en desarrollo. Sin embargo, la prueba de seroneutralizacin no revela el estado inmunitario del animal en su conjunto, ya que evala nicamente inmunidad humoral. Esto significa que como muchas otras pruebas, no tiene en cuenta la actividad inmunitaria de base celular.

a) Seroneutralizacin como mtodo de tipificacin de un virus: Cuando los virus tienen una constitucin antignica nica (como rubola), todas las cepas de ese virus pueden ser neutralizadas con un mismo suero. Por el contrario, cuando un virus presenta diferencias antignicas entre sus distintas cepas, cada una de ellas deber ser neutralizada con un suero especfico que permita distinguir serotipos o serovariedades virales. Entre estos virus, que constituyen el grupo ms numeroso, se encuentran el de la Fiebre Aftosa, algunos enterovirus como el de la Poliomielitis, y adenovirus como el de la Hepatitis Canina. Cuando se procede al estudio de neutralizacin de algunos de los virus mencionados, es necesario disponer de tantos sueros neutralizantes especficos como tipos serolgicos (serotipos) existen. Esta operacin de neutralizacin se denomina tipaje o tipificacin. La reaccin consiste en mezclar volmenes iguales de virus purificado (ya sea por filtracin o centrifugacin) con cada uno de los sueros hiperinmunes monoespecficos, (anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales absorbidos), incluyendo los controles de virus y sueros. Las mezclas se incuban 1 hora a 37C, despus de lo cual cada una de ellas se siembra en cultivos celulares o se inocula en animales de laboratorio. En esta reaccin, el antisuero que neutraliza indica qu cepa o virus es el responsable de la destruccin o lesin del sistema sensible. La verificacin de la presencia eventual de dos o ms tipos de virus en una muestra se facilita si la neutralizacin se hace con todos los anticuerpos existentes. Por ejemplo, en el caso de parvovirus canino, la seroneutralizacin se lleva a cabo con los tres anticuerpos especficos para las cepas CPV2, CPV2a y CPV2b por separado y en forma combinada para poder identificar con que anticuerpo (s) especfico (s) se logra la neutralizacin.

99

b) Seroneutralizacin como mtodo de identificacin de anticuerpos neutralizantes: En ciertos casos es til determinar la presencia de anticuerpos neutralizantes homlogos en el suero de un animal, ya que stos indican una infeccin o vacunacin anterior. Cuanto mayor sea el ttulo obtenido indicar que cualquiera de estos eventos es ms reciente. En seroneutralizacin existen dos tcnicas: 1- Suero variablevirus fijo (SV - VF) 2- Suero fijovirus variable (SF - VV) Para ambas tcnicas se debe contar con sueros de referencia negativos y positivos. Los sueros positivos se obtienen de animales que han estado en contacto anteriormente con el antgeno (virus) y los negativos de animales que no han tenido contacto alguno con el mismo. Los sueros se inactivan durante 30 minutos a 56C para destruir los factores termosensibles del complemento y se titulan varias veces en cualquiera de los sistemas sensibles (clulas, embriones de pollo, ratones, etc.) Por ltimo se calcula la media de los ttulos obtenidos en las diferentes repeticiones. Estos sueros se conservan fraccionados a -70C. Los sueros problema se procesan de la misma manera, es decir, se inactivan 30 minutos a 56 C antes de proceder a su estudio y se prueban en las diluciones de uso sobre el sistema seleccionado para evaluar la seroneutralizacin, para determinar si presentan efecto de toxicidad. En general, en bajas diluciones, la mayora de los sueros poseen efecto txico. En estos casos se debe aumentar las diluciones y considerarse en el clculo del ndice de Seroneutralizacin (ver anexo). Los resultados se pueden expresar como: ndice de seroneutralizacin (IS): Este se obtiene a partir de diferentes clculos, por ej: Ttulo del virus - Ttulo del virus incubado con suero problema, o Ttulo del virus incubado con suero normal negativo - Ttulo del virus incubado con suero problema Por ejemplo, Ttulo de virus= 106.33 Ttulo del virus incubado con suero problema= 103.40 IS = 106.33 - 103.40 = 10 2.93 10 2.93expresa las dosis neutralizantes 50% del suero problema. Ventajas y desventajas de la eleccin de cada una de estas tcnicas: En la tcnica a SF - VV en general no se deben descartar los resultados por problemas de ttulo viral, a no ser que se produzca contaminacin. La tcnica a SV - VF es ms precisa, pero si las dosis infectantes obtenidas no son las correctas, la prueba debe ser desechada. Las tcnicas descriptas para cultivos celulares se pueden realizar en frascos de cultivo o en microplacas de cultivo, modificando los volmenes de reaccin. A fin de facilitar la lectura del efecto citoptico, se pueden utilizar colorantes sensibles al pH en el medio de cultivo, como por ejemplo rojo fenol, que permiten determinar el estado metablico de la microplaca. El color ser amarillo en los hoyos donde las clulas mantienen su viabilidad y ser rojo en los hoyos donde hubo efecto citoptico. Bibliografa 1. Gua de trabajos prcticos. Inmunologa. Ao 1980 2. Harris, RJC. Techniques in Experimental Virology. New York/London: Academic Press. 1964.

100

3. Robson, DS; Gillespie, JH; y Baker, J.A. The neutralization test as an indicator of immunity to virus diarrhea. Cornell Vet. 50: 503-509. 4. Sorenson, DK; Chow, TL; Kowalczyk, T.; Hanson, RP.; y Brandly, CA. Persistence in cattle of serum-neutralizing antibodies of vesicular stomatitis virus. Am. J. Vet. Res. 19: 74-77. 1958. Anexo Seroneutralizacin a Suero fijo-virus variable (SFVV): En esta tcnica el suero problema se diluye entre 1/2,5 y generalmente no ms de 1/10, dependiendo del virus con que se trabaje. Esta dilucin se siembra en cuatro tubos a razn de aproximadamente 1ml por tubo. Simultneamente se procede a la dilucin del virus en base 10. Las diluciones de virus a utilizar en la seroneutralizacin dependen de que los animales a evaluar sean libres o vacunados. Los rangos utilizados son arbitrarios, pero para su seleccin debemos tener en cuenta el origen de los animales a evaluar: - En el caso de ser animales libres de infeccin, se emplea un nmero bajo de dosis infectivas ya que al tener el suero niveles mnimos o nulos de anticuerpos, se necesita poco virus para superar el efecto neutralizante de los anticuerpos y llegar a determinar el efecto citoptico viral necesario para calcular el ttulo. - En cambio, si se trabaja con suero de animales vacunados, se utiliza un nmero ms alto de dosis infectivas ya que los niveles de anticuerpos esperados son mayores. Una vez obtenidas las diluciones del suero y el virus, se mezclan en partes iguales y se incuban 1 hora a 37C. Luego de la incubacin se siembran o se inoculan en el sistema elegido (clulas, ratones o embriones de pollo). No hay que olvidarse de colocar los controles con sueros de referencia positivos y negativos. Estas reacciones se incuban por un perodo variable que depende del sistema y del tipo de virus, pero que en general es de 3 a 10 das. Las lecturas se realizan diariamente buscando el efecto de la infeccin viral segn el sistema utilizado. - En el caso de los cultivos celulares, las lecturas se efectan por observacin microscpica del efecto citoptico que se pone de manifiesto como muerte celular, modificacin de la morfologa celular, etc. - En el caso de los huevos embrionados pueden ser la aparicin de pstulas, muerte del embrin, etc. - En el caso de los animales de laboratorio se tendr en cuenta si sobreviven o no. El clculo de los ttulos se realiza utilizando el mtodo de Reed y Muench, referido a las dosis infectivas en cultivo de tejido al punto final 50% (TCID50, por las siglas en ingls Tissue Culture Infectious Dosis 50%). Este trmino tambin se lo puede encontrar descrito como dosis de efecto citoptico 50% (DEC50). En la titulacin, el punto final se toma como la dilucin en la cual cierto porcentaje de cultivos o animales muestran lesiones. Se ha demostrado estadsticamente que el valor ms apropiado es aqul en el que la mitad de stos muestran efecto producido por la infeccin viral y la otra mitad no. Esta regin es la que ofrece mnimo error en lo que atae a la variacin individual en la sensibilidad al virus. La obtencin de resultados estadsticos requiere inocular el mayor nmero posible de rplicas y hacer diluciones poco espaciadas. Reed y Muench idearon un mtodo simple, denominado mtodo de los totales acumulativos. ste se basa en considerar que los animales o cultivos celulares que recibieron menor dosis de virus infectante y presentaron lesiones, hubieran mostrado las mismas lesiones con virus ms concentrado. El objetivo de este mtodo es conocer la dilucin del virus que corresponde al 50% de infeccin. Se utiliza un sistema de sumas para obtener los totales acumulados y obtener el clculo del punto final. Los valores acumulados se obtienen sumando en el sentido de las flechas, como se esquematiza en el siguiente cuadro.

101

Muestras o No animales Infectados o Valores Valores Dilucin infectados o infectados / muertos acumulados acumulados de virus vivos No (positivos) positivos negativos (negativos) infectados

Relacin acumulados % positivos / (1) Total de acumulados

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

4/4 4/4 4/4 4/4 3/4 0/4 0/4

4 4 4 4 3 0 0

0 0 0 0 1 4 4

19 15 11 7 3 0 0

0 0 0 0 1 5 9

19 / 19 15 / 15 11 / 11 7/7 3/4 0/5 0/9

100 100 100 100 75 0 0

(1) El porcentaje de cultivos o animales infectados representa la relacin entre el total de infectados y el total de cultivos o animales inoculados. Se observa que el punto final 50% est entre el 75% y 0%, que corresponde a las diluciones 10-5 y 10-6. Por lo tanto el valor debe estar comprendido entre ellos, debe ser mayor a 10-5 pero menor que 10-6. Para estimar cul es este valor se calcula la distancia proporcional (DP) entre dichas diluciones, utilizando la siguiente frmula: DP =. % de positivos superior a 50 50 % de positivos superior a 50 - % de positivos inferior a 50 .

En este ejemplo, DP = 75 - 50 = 0.33 75 - 0 Luego, (DP x log. del factor de dilucin) se suma en valor absoluto al exponente de la dilucin superior a 50. En este ejemplo, El factor de dilucin es 10 y el logaritmo de 10 es 1. La dilucin que da un porcentaje de positivos superior a 50 es 10-5 Por lo tanto, (0.33 x 1) + 5, determina que el valor es 10 5.33 El ttulo se expresa con exponente positivo y su valor corresponde a 1 ml de inculo. En este ejemplo, El volumen de virus inoculado fue de 0.1 ml. El ttulo, por lo tanto, ser: 10 5.33 x 10 = 10 6.33 TCID50/ml. ndice de seroneutralizacin (IS): Se puede obtener a partir de diferentes clculos, por ej: Ttulo del virus - Ttulo del virus incubado con suero problema, o Ttulo del virus incubado con suero normal negativo - Ttulo del virus incubado con suero problema Por ejemplo, Ttulo de virus= 106.33 Ttulo del virus incubado con suero problema= 103.40 IS = 106.33 - 103.40 = 10 2.93 10 2.93expresa las dosis neutralizantes 50% del suero problema.

102

Seroneutralizacin a Suero variable virus fijo (SV-VF): En esta tcnica se preparan diluciones (generalmente 1:2) de los sueros problemas y testigos en un buffer, con el siguiente criterio: Si los animales son vacunados se usar generalmente una dilucin entre 1/4 y 1/32 o ms, dependiendo del tipo de vacuna. Si los animales se trata de animales vrgenes se usarn diluciones de 1/2 a 1/8. Para realizar esta tcnica es necesario tener el virus que se va a utilizar previamente titulado, fraccionado y congelado a bajas temperaturas (en nitrgeno lquido a -196C, o en freezers ultrafros a -80C). Simultneamente se realiza la dilucin del virus de manera de obtener un inculo con las dosis infectantes deseadas con el que se enfrentarn los sueros. En esta tcnica debe incluirse siempre la titulacin del virus en la misma prueba, a fin de comprobar que las dosis infectantes inoculadas fueron las correctas. Generalmente para esta prueba se utilizan 1000 dosis infectantes/ml. Para preparar el inculo, por lo tanto, se debe conocer el ttulo previo del virus, por ejemplo 10 7.5 TCID50/ ml. Para obtener 103 TCID50/ml hay que diluir el virus. Para calcular qu dilucin del virus stock hay que efectuar para tener esa dosis, se realiza el siguiente clculo: 1 TCID50/ ml se obtendra en una dilucin 10-7.5 1000 TCID50/ ml se obtiene en una dilucin 1000 veces ms concentrada y ya que 1000 corresponde a 103, en este caso es 10-4.5 Es decir, que en este caso en una dilucin 104.5 de este virus habr 1000 TCID50/ ml. La dilucin 104.5 se puede realizar de diversas formas, por ejemplo con diluciones seriadas en base 10 mediante la cual se llega a la dilucin 10-4. La fraccin de dilucin que falta realizar es la representada por 100.5. El antilogaritmo de 0,5 es 3,16. Es decir que una dilucin 1/3,16 equivale a 100.5. En total, si la dilucin 1/3,16 se realiza a partir del tubo 104, se obtiene una dilucin 1/31600) que equivale a 104.5 y que contiene 1000 TCID50/ ml. A partir de esta dilucin, se realizan tres diluciones ms en base 10 para titular el inculo viral en simultaneidad con la prueba (control de ttulo viral). El inculo con las 1000 TCID50 se mezcla en partes iguales con los sueros problema y con los sueros de referencia. Dichas mezclas se incuban 1 hora a 37C y luego se siembran (sobre cultivos celulares) o se inoculan (en ratones o embriones de pollo). A partir de este punto las consideraciones son iguales que para la tcnica SFVV. Ejemplo de anlisis de resultados:
Dilucin del suero Log. de la Infectados dilucin muertos o No infectados Valores o vivos acumulativos infectados o muertos 4 0 4 0 3 1 1 4 0 8 Valores acumulativos no infectados o vivos 12 8 4 1 0 % de no infectados o vivos 100 100 80 20 0

1/4 1/8 1 /16 1 / 32 1 / 64

0.6 0.9 1.2 1.5 1.8

0 0 1 3 4

Al igual que en el caso SF-VV, se debe calcular la distancia proporcional (DP). DP = % de no infectados superior a 50 - 50 . % de no infectados superior a 50 - % de no infectados inferior a 50

DP = 80 - 50 = 0.5 80 - 20

103

DP x log. del factor de dilucin se suma al log. de la dilucin que presenta un porcentaje de no infectados superior al 50%, con el fin de obtener el ndice de Seroneutralizacin. La dilucin con un porcentaje de no infectados superior al 50% es 1/16 (log 16 es 1,2) El factor de dilucin es 2 (log.2 es 0.3), por lo tanto IS = 0.5 x 0.3 + 1,2 = 1,35. El antilogaritmo de 1,35 es 22,4. Podemos decir, entonces, que 1/22,4 es la dilucin del suero que protege al 50% de los animales. En este caso se calcula el porcentaje de animales vivos o no infectados ya que se desea conocer el poder de proteccin del suero. La prueba ser considerada como vlida si el ttulo de virus obtenido es el mismo que el ttulo previo con un margen de error de 0,3 log (una dilucin) por encima o por debajo del mismo.

Inhibicin de la Hemoaglutinacin
Introduccin: Hemoaglutinacin La capacidad de aglutinar glbulos rojos de ciertas especies animales (Hemoaglutinacin o HA) fue descripta para los virus de las familias Paramixoviridae, Ortomixoviridae y Parvoviridae. Las protenas virales responsables de esta propiedad se conocen como hemaglutininas. Estas son protenas de superficie de los viriones que se unen con receptores de la membrana de los hemates que poseen cido acetil neuramnico en su composicin. Esta interaccin entre los viriones y los hemates resulta en la produccin de un cuerpo compacto. La HA se produce cuando la proporcin entre la hemaglutinina viral y los eritrocitos es ptima, permitiendo la unin de varios eritrocitos adyacentes a una unidad de hemaglutinina. Esta caracterstica viral nos permite identificar y clasificar virus hemaglutinantes, aislados a partir de individuos infectados y propagados en huevos embrionarios o cultivos celulares. Adems, se puede titular virus por su efecto hemaglutinante, as como evaluar la capacidad de un suero de inhibir esta hemaglutinacin. La tcnica, que evala la capacidad de un suero de bloquear el efecto hemaglutinante del virus se conoce como Inhibicin de la Hemoaglutinacin (IH). Ambas pruebas (HA - IH) se realizan en microplacas de 96 hoyos con fondo en U o V. La HA se lleva a cabo utilizando diluciones del virus en base 2 a partir de la dilucin 1:2; los glbulos rojos (GR) capaces de ser aglutinados se colocan a una concentracin final de 0.5% o 1%. Como diluyente de los Ag y GR se utiliza solucin salina buffereada (PBS) con 0.1% de seroalbmina bovina (BSA). PROTOCOLO DE TITULACIN VIRAL POR HA: - Colocar 50 l de diluyente para el virus en cada uno de los 12 hoyos de la fila A de la microplaca. - Agregar 50 l de virus puro (obtenido del cultivo en huevos embrionados o en cultivos celulares) en el primer pozo de la fila A. - Utilizando una micropipeta de 50 l, efectuar diluciones seriadas en base 2 del Ag (de 1:2 a 1:2048), dejando el ltimo hoyo de la fila sin Ag para que sirva como control de eritrocitos. - Agregar 50 l de la suspensin de eritrocitos al 0,5 o 1% a cada hoyo, agitar levemente para mezclar los reactivos. - Cubrir la microplaca e incubar a 4 C durante 16 hs. - Leer una vez que est bien delimitado un botn en el fondo de cada pozo control de eritrocitos. Lectura: Con la ayuda de un espejo se observa el fondo de cada pocillo. Primero se realiza la lectura de los hoyos control. Hemoaglutinacin negativa: se observa la formacin de un botn de hemates de borde liso, ocasionado por la sedimentacin de los GR (Ej, en el control de GR).

104

Virus

A B C D E F G H

Ejemplo de titulacin de virus por hemoaglutinacin

Hemoaglutinacin positiva: se observa la formacin de un halo de hemates de mayor dimetro, color claro y borde irregular, ocasionado por la aglutinacin de los GR por accin del virus.

Interpretacin de la Titulacin: El punto final de la titulacin ser la dilucin ms alta del virus en la que se observe 100% de HA. Se considera que en esta dilucin existe una (1) unidad hemoaglutinante (UHA). En la siguiente figura se esquematiza la titulacin por Hemoaglutinacin de ocho muestras de virus (filas A - H). Los ttulos obtenidos figuran a la derecha de la placa. La tcnica de IH, descripta originalmente por Hirst (1942) y modificada posteriormente por Salh (1944) nos permite detectar y cuantificar anticuerpos (Ac) que poseen la propiedad de bloquear la actividad hemaglutinante de ciertos virus, unindose a las hemaglutininas virales e impidiendo de este modo su unin con los receptores eritrocitarios. Por lo tanto, esta tcnica nos permite identificar en un suero problema el nivel de anticuerpos capaces de inhibir la hemoaglutinacin. Hay que tener en cuenta que los resultados pueden verse afectados por la presencia en los sueros de inhibidores inespecficos (por ej. enzimas) y hemaglutininas naturales, por lo que es necesario evaluar simultneamente la capacidad hemaglutinante del suero. Cuando el nivel de hemaglutininas de los sueros es muy alto, algunos autores sugieren el tratamiento previo de los sueros con Kaoln o glbulos rojos para eliminar estas aglutininas. Debe considerarse que dichos tratamientos resultan en detrimento de la deteccin de bajos niveles de anticuerpos. PROTOCOLO DE TITULACIN DE ANTICUERPOS POR I.H.: a) Distribuir 25 l de solucin PBS 1X en los hoyos 1 a 11 de las filas que vayan a utilizarse de una placa de microtitulacin (utilizar placas con pocillos de fondo en V o en U) y 50 l a los hoyos 12 de las mismas hileras. b) Colocar 25 l de cada suero en el primer pocillo de cada dos hileras. Por cada suero se utilizan dos hileras. c) Utilizar una micropipeta para hacer diluciones 1:2 del suero en toda la placa (en general se comienza con una dilucin final de 1/10 para el primer hoyo (N 1) y se contina diluyendo en base 2 hasta el hoyo correspondiente a la columna 11 (1/10; 1/20; 1/40;... 1/10240). Descartar los 25 l excedentes del hoyo 11. De esta manera se obtiene una diluc in seriada (en base 2) del suero y un volumen homogneo de 25 l.

1/2048

105

d) Agregar 25 l de antgeno (virus) que contenga 4 a 8 unidades hemoaglutinantes, en los hoyos 1 a 11 de la primera hilera correspondiente a cada suero. Agregar 25 l de PBS en los hoyos 1 a 11 de la segunda hilera correspondiente a cada suero (para completar el volumen a 50 l). e) Homogeneizar golpeando ligeramente la placa e incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos. f) Aadir 50 l de suspensin de hemates al 1% o al 0,5% a todos los hoyos utilizados. La segunda hilera de cada suero no contiene virus, slo suero y glbulos rojos y nos permite realizar un control sobre la capacidad hemaglutinante del suero per se. Por su parte, el hoyo 12 de cada hilera contiene glbulos rojos y el diluyente del virus (PBS), como control para descartar una posible hemoaglutinacin inespecfica. g) Homogeneizar golpeando ligeramente la placa e incubarla a 4C durante 16 hs. h) Leer las placas cuando se hayan sedimentado los hemates de control (columna 12). La lectura se efectuar inclinando las placas y observando la presencia o ausencia de un botn bien definido similar al de los hoyos de control. i) El ttulo de Inhibicin de la Hemoaglutinacin ser la mayor dilucin del suero que produzca una inhibicin completa de 4 u 8 unidades hemaglutinantes de virus. j) En todas las pruebas deber incluirse una titulacin simultnea del virus para confirmar la presencia de las unidades de hemoaglutinacin requeridas

Tcnica de Fijacin de Complemento

Las caractersticas del sistema de complemento han permitido idear una reaccin serolgica denominada Fijacin de Complemento, la que mediante un sistema indicador permite determinar la fijacin del C a cualquier complejo antgeno-anticuerpo, est el antgeno en solucin o en suspensin. Como sistema revelador se emplea el denominado sistema hemoltico, que consiste en una suspensin de complejos antgeno-anticuerpo formados por glbulos rojos de carnero y anticuerpos con especificidad por estos hemates (hemolisina). Esta tcnica es muy empleada para la identificacin cuantitativa de anticuerpos contra un antgeno en particular y es la tcnica de referencia para muchas enfermedades infecciosas. Por ejemplo, en el diagnstico de brucelosis mediante este mtodo, el suero en estudio se incuba con una suspensin estandarizada de Brucella abortus y una cantidad conocida y estandarizada de complemento (medida en unidades CH50). En un paso posterior se agrega el sistema hemoltico. (Figura 1)

106

Figura 1 Componentes de la reaccin

Ag Suspensin de antgeno Suero problema

GR Sistema hemoltico

Complemento

Si la muestra no posee anticuerpos especficos contra Brucella abortus (figura 2 A), no se forman complejos antgeno-anticuerpo que activen el C. Por lo tanto, al agregar el sistema hemoltico, el C se fija a las membranas de los glbulos rojos sensibilizados y produce su lisis (figura 2 B).

Figura 2 A

Figura 2 B
C

GR
C

Ag

Ag

Si la muestra en estudio contiene anticuerpos especficos contra Brucella abortus, stos se fijan a la bacteria (figura 3 A) y activan el complemento por la va clsica, que produce su lisis. Cuando en un paso posterior se agrega el sistema hemoltico, ya no hay complemento disponible y los glbulos rojos permanecen intactos (figura 3 B).

107

Figura 3 A

Figura 3 B GR

Ag Ag

El consumo de C por los complejos inmunes se manifiesta indirectamente por la ausencia de hemlisis al agregar el sistema hemoltico. El C no fijado indica la ausencia de reaccin antgeno-anticuerpo durante la primera etapa de la prueba y se mide en unidades CH50 . Se realizan diluciones del suero en base 2 que se incuban con cantidades fijas y conocidas del resto de los reactantes. El ttulo se determina como la mxima dilucin de suero que produce la hemlisis del 50% de los glbulos rojos del sistema hemoltico. Para medir la hemlisis se centrifugan los tubos (para que sedimenten los glbulos rojos que no se hemolizaron). La hemoglobina presente en el sobrenadante se lee en unidades de densidad ptica en un espectrofotmetro a 542 nm de longitud de onda. Para llevar a cabo esta prueba deben tenerse una serie de consideraciones: Las muestras de suero, libres de hemates, deben ser inactivadas a 56C durante 30 minutos para desnaturalizar los factores del complemento del suero y evitar que interfieran en la prueba. El antgeno consiste en una suspensin de Brucella abortus cepa 19, inactivada, a una concentracin standard de 0,00018% v/v. Como fuente de complemento (C) se utiliza suero normal de cobayo. ste se conserva congelado y debe titularse cada vez que se usa. Para la prueba diagnstica se emplean 5 unidades CH50. La hemolisina es un suero de conejo hiperinmune contra hemates de oveja y se utiliza a la concentracin que produce como resultado en ese sistema 12 unidades CH50. Los hemates de oveja se obtienen por puncin de la vena yugular en condiciones de asepsia y con anticoagulante. Posteriormente se lavan por centrifugacin y reemplazo del suero por una solucin buffer. Se utilizan en una suspensin al 6% v/v. La Fijacin de Complemento es una tcnica muy laboriosa y que depende de parmetros muy estrictos en lo que refiere a la estandarizacin y titulacin de los reactantes. Su aplicacin esta limitada a los laboratrios de referncia nacionales e internacinales y reutiliza generalmente para confirmar la positividad de otras tecnicas. No es de prctica rutinaria, aunque como se mencion es la prueba de referencia para el diagnstico de muchas enfermedades infecciosas. Este mtodo tambin se emplea para identificar, tipificar y/o semicuantificar antgenos. En estos casos se emplean sueros especficos conocidos y a concentracin fija y diluciones de la muestra en estudio (en la cual se sospecha la presencia de un antgeno). La ausencia de hemlisis indica la formacin de complejos antgeno-anticuerpo debido a la presencia del antgeno en la muestra, e inversamente, la observacin de hemlisis indica que la muestra carece de antgeno.

108

Bibliografa Margni, R.A. 1996. Inmunologa e Inmunoqumica Fundamentos. Ed. Interamericana. 976 pp. Day, MJ. 1999. Clinical Immunology of the Dog and the Cat. Iowa State University Press.

Tcnica de polarizacin Fluorescente (FPA)

Este ensayo ha mostrado tener buena utilidad en la deteccin de ciertas enfermedades infecciosas. Es utilizada para identificar anticuerpos frente al Ag O-polisacrido de bacterias gram negativas (Brucella sp., Salmonera sp.) en muestras de suero, leche y sangre entera. Tambin est descripto su uso para la identificacin de antgenos como protenas o pptidos de Mycobacterium bovis y virus de la Anemia Infecciosa Equina. Esta tcnica detecta la unin de pequeas molculas marcadas con fluorescena (por Ej. antgenos) a grandes molculas (anticuerpos) cuando la muestra es incidida con un haz de luz polarizada. Fundamento: Todas las molculas en solucin rotan al azar. La velocidad de rotacin depende del tamao y es inversamente proporcional, por lo tanto las molculas pequeas rotan a mayor velocidad que las molculas grandes. Para realizar este ensayo se requiere de la emisin de una luz (onda electromagntica) (a partir de una lmpara de tungsteno) cuyo campo elctrico oscila en todas las direcciones espaciales al azar y con distintas longitudes de onda. Dicha radiacin atraviesa un polarizador de cristal lquido que deja pasar solo un rayo de luz polarizada plana azul (481-489 nm). Al incidir la luz polarizada plana sobre el trazador (fluorocromo ligado al antgeno), lo eleva a un estado de excitacin, tras el cual dicho trazador vuelve al estado de equilibrio emitiendo un haz de luz verde (525-550 nm) que es captado y analizado por el equipo. En el caso de que el antgeno marcado estuviese unido a una molcula de anticuerpo de gran tamao, su velocidad de rotacin disminuye y permite que la emisin de luz verde se detecte en el mismo plano de polarizacin que la radiacin recibida, mantenindose la polarizacin. Por lo tanto, se detecta un valor alto de polarizacin. Por lo contrario, si dicho trazador est unido solo al antgeno (de pequeo tamao) la rotacin es rpida y la luz verde emitida se ubicar en otro plano distinto al de la luz polarizada. De esta manera, se pierde el grado o valor de polarizacin.

109

Luz tungsteno Polarizador

Emisin del haz de luz Luz azul en un nico plano polarizada

Suero positivo

Direccin del haz de luz azul polarizada incidente Suero negativo Direccin del haz de luz azul polarizada incidente

Direccin del haz de luz verde emitida

Direccin del haz de luz verde emitida

Antgeno marcado con fluorescencia. (Luz verde) Anticuerpo

Durante el tiempo que la molcula conjugada con fluorescena permanece excitada, rota a una determinada velocidad, produciendo una diferencia entre plano de polarizacin que la excita (plano de excitacin) y el plano de polarizacin que emite (plano de emisin), sta diferencia se cuantifica y se determina utilizando una frmula. Expresin de los resultados: unidades de milipolarizacin (mP) del suero frente al antgeno. Clculo de las unidades de mp de cada muestra. mP = ( Iv (Ih x G) / (Ih x G) x 1000 Iv = intensidad vertical de la luz Ih = intensidad horizontal de la luz G = Factor de polarizacin

Ejemplos de los antgenos ms utilizados:

El polisacrido O-: Extrado a partir del LPS de cepas lisas de bacterias gram negativas. Estos antgenos son especficos para cada serotipo y se obtiene a partir de la purificacin del LPS. Ej.: Brucella sp. Salmonella sp.

110

Estructura de LPS

Pptidos: Slo puede utilizarse pptidos de bajo peso molecular (que no superen los 20 kDa), para que no interfiera su tamao en una menor rotacin del antgeno-trazador libre. Equipamiento * El SENTRY (Diachemic corporation) es un instrumento computabilizado para determinar las unidades de milipolarizacin (mP) del suero problema. Presenta una ranura para el acoplamiento del tubo de ensayo. Este aparato lee una muestra por vez en tubos de 10mm x 75mm. Es transportable al campo y puede funcionar una hora sin fuente externa de energa. * El POLARION (Tecan) Tambin es un lector de polarizacin pero adaptado para la lectura de microplacas de 96. Puede leer hasta 1500 muestras por hora.

Metodologa Protocolo FPA 1) Agregar 10l de la muestra (generalmente suero del animal a evaluar) a 1 ml de buffer. 2) Leer el blanco 3) Agregar 10 l de antgeno marcado 4) Incubar no menos de 2 minutos 5) Realizar la lectura de las muestras ya sea en tubos o en multiplacas. 6) Como dato orientativo, las muestras con lecturas de 10 mP mayores al control negativo son consideradas positivas

111

Esquema de la tcnica. Utiliza como ejemplo el Ag O de Brucella sp.

Ventajas: Es fcil de realizar y los resultados se obtienen rpidamente. Implica solamente 2 pasos. Es una tcnica de alta sensibilidad y especificidad. Permite el procesamiento de varias muestras a la vez. Suspensiones turbias tales como leche, sueros lipmicos y yemas de huevo o soluciones coloreadas como sueros hemolizados o sangre entera, no interfieren en la lectura de las muestras

Citotoxicidad
Introduccin La citotoxicidad es un mecanismo efector de las clulas del sistema inmune que permite eliminar clulas infectadas o alteradas del organismo o clulas de microorganismos u organismos invasores. Varios tipos celulares, receptores y mecanismos estn involucrados en este mecanismo. Su evaluacin permite conocer el nivel de proteccin frente a enfermedades infecciosas de origen viral, capacidad de eliminar clulas alteradas por procesos tumorales, etc. Hay dos condiciones indispensables para que cualquier mecanismo citotxico mediado por clulas se lleve a cabo: 1- viabilidad de las clulas efectoras 2- contacto estrecho entre la clula efectora y la clula blanco. La lisis de la clula blanco (o clula diana) es la consecuencia de la reaccin citotxica. Cuando se encara el anlisis de un fenmeno de este tipo es necesario contar, en primer lugar, con un mtodo apropiado para evaluar la muerte de la clula blanco.

112

Por ejemplo, si se trata de una bacteria o un parsito, es posible observar microscpicamente su destruccin o la inhibicin de su capacidad para proliferar en medios de cultivo adecuados, luego de su contacto con la clula efectora. En cambio, si la clula blanco es una clula tumoral o normal, pueden utilizarse colorantes vitales como naranja de acridina o azul tripn (trypan blue) para poner en evidencia la lisis, ya que estos colorantes tienen la particularidad de teir nicamente a las clulas muertas. Asimismo, es posible recurrir a alguna caracterstica metablica particular que pueda asociarse con la viabilidad de la clula blanco utilizada en la reaccin. Por ejemplo, si se trata de una clula secretora, medir su capacidad para liberar un determinado producto de secrecin. El mtodo ms difundido para el estudio de los mecanismos citotxicos es el de la incorporacin de sustancias radiactivas a las clulas blanco. La destruccin de estas clulas permite que la sustancia radiactiva se libere al medio y pueda ser cuantificada fcilmente. Las sustancias radiactivas deben cumplir ciertos requisitos para ser utilizadas: Deben incorporarse a las clulas blanco en cantidades compatibles con los sistemas de microrreacciones. No deben liberarse al medio espontneamente. Su liberacin al medio debe tener correlacin directa con el efecto ltico producido Una vez liberadas al sobrenadante, no deben ser reutilizables en forma significativa por las clulas restantes. El agente radiactivo ms utilizado es el Na251CrO4 (dicromato de sodio) que tiene la ventaja adicional de poner de manifiesto rpidamente el efecto citotxico. Para el caso de bacterias o parsitos que no incorporan 51Cr o que lo liberan en forma espontnea, se usan bases nitrogenadas radiactivas, como por ejemplo la 3H-Timidina (timidina tritiada) que se incorpora a los cidos nucleicos o la 35S-Metionina que se incorpora a las protenas. Mecanismos de Citotoxicidad Los mecanismos de citotoxicidad pueden clasificarse de acuerdo a los requerimientos del sistema, en: Mecanismos de citotoxicidad especficos: Si es necesaria la sensibilizacin previa del animal del cual provienen las clulas blanco (por ejemplo, citotoxicidad por LT o ADCC). Mecanismos de citotoxicidad innatos: Si funcionan sin necesidad de sensibilizacin previa (por ejemplo. citotoxicidad por clulas NK o por complemento). Mecanismos de citotoxicidad especficos Linfocitos T: Los mecanismos citotxicos mediados por linfocitos T son de gran importancia para la defensa del individuo contra las infecciones causadas por virus y contra parsitos intracelulares. Tienen participacin, adems, en el rechazo de los transplantes y de ciertos tumores. Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpos (CCDA o ADCC): Algunas clulas pueden ejercer citotoxicidad cuando se unen con un anticuerpo ya ligado al antgeno sobre la clula blanco a travs de los receptores para Fc (CD16). Este proceso se denomina citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. La funcin de CCDA est comprometida en procesos de inmunidad contra tumores, en el rechazo de transplantes, en procesos de destruccin de bacterias, parsitos y clulas infectadas por virus. La reaccin citotxica se inicia con el reconocimiento de los anticuerpos que recubren a la clula blanco por parte de la clula efectora, a travs de receptores para el fragmento Fc de la Ig. En la mayor parte de los casos, el anticuerpo que participa en la CCDA es de la clase IgG y, por consiguiente, los receptores para Fc (FcR) presentes en la membrana de las clulas efectoras intervinientes son los receptores para el Fc de la IgG (FcR). Sin embargo, ciertos

113

linfocitos con FcR para IgA (FcR) y los polimorfonucleares neutrfilos, son capaces de mediar CCDA contra clulas blanco sensibilizadas con IgA. Adems, los monocitos y los polimorfonucleares eosinfilos que expresan FcR para IgE (FcR) inducen la destruccin de clulas recubiertas con IgE. Este ltimo sistema tiene relevancia en la inmunidad contra parsitos. Mecanismos de citotoxicidad innatos Clulas NK: El sistema inmune presenta poblaciones linfocitarias que tienen la capacidad innata de lisar cierto tipo de clulas tumorales y clulas infectadas por virus. Este fenmeno citotxico, descrito alrededor del ao 1970, se conoce como citotoxicidad natural killer o actividad NK. Para que se lleve a cabo no es necesaria sensibilizacin previa de las clulas efectoras. La actividad NK no se ve influida por la exposicin previa al antgeno por parte del individuo del cual provienen estas clulas. Citotoxicidad generada por complemento: Este mecanismo, a diferencia de los detallados anteriormente, no est producido por la accin de clulas efectoras sino por la activacin del complemento. Citotoxicidad celular inducida por IL-2 Se ha demostrado que el tratamiento in vitro de linfocitos perifricos con IL-2 (ex vivo), adems de favorecer la citotoxicidad T y NK, induce una actividad citoltica sobre un grupo de clulas denominadas clulas LAK (por la sigla en ingls de clulas Killer activadas por linfoquinas). Se cree que estas clulas pertenecen al linaje de las NK, aunque an no estn bien definidas. stas son capaces de lisar una gran variedad de clulas tumorales, incluso muchas que no son sensibles a clulas NK. La activacin de clulas ex vivo de pacientes oncolgicos ha sido una de las propuestas teraputicas ensayadas en humanos. Evaluacin de la funcionalidad celular por medio de reacciones de citotoxicidad mediadas por LT citotxicos. El primer paso de una determinacin de citotoxicidad comprende la obtencin de los linfocitos T citotxicos especficos. stos pueden encontrarse pre-estimulados en el husped y deben ser expandidos in vitro. Los linfocitos T citotxicos no pueden ser detectados habitualmente en sangre perifrica sin una estimulacin previa para ampliar el nmero de clulas activas por medio de la expansin clonal, a menos que el individuo se encuentre en el perodo de actividad de una infeccin viral. Cuando se requiere medir la reactividad de los linfocitos T citotxicos, generalmente es necesario estimular a las clulas efectoras in vitro con el antgeno especfico. Para ello, se cocultivan las clulas mononucleares obtenidas de sangre perifrica con el antgeno en forma soluble o con clulas irradiadas que expresan el antgeno de inters. Los linfocitos T citotxicos se cosechan despus de 5 a 7 das de cultivo. La tcnica ms frecuentemente empleada para determinar citotoxicidad utiliza la liberacin de 51 Cr debida a la lisis de la clula blanco. Las clulas efectoras son puestas en contacto con las clulas blanco marcadas radiactivamente con 51Cr, durante 4 hs de incubacin. La radiactividad liberada es directamente proporcional a la lisis celular producto de la citotoxicidad. Si bien la liberacin de 51Cr es un procedimiento ampliamente utilizado para detectar citotoxicidad, en los ltimos aos se han desarrollado mtodos colorimtricos, fluormetricos y ms recientemente por quimioluminiscencia, tendientes a reemplazar el material radiactivo y aumentar la sensibilidad. Metodologa: 1. Marcacin de la clula blanco con dicromato de sodio (51Cr): Las clulas debern encontrarse en fase logartmica de crecimiento. - Centrifugar la suspensin celular y resuspender el precipitado en dicromato de sodio marcado.

114

- Incubar 60 min a 37C con agitacin suave. - Lavar con medio de cultivo y resuspender las clulas marcadas a la concentracin deseada. 2. Medicin de la actividad citotxica por medio de un ensayo de liberacin de 51Cr: La relacin entre clulas blanco y clulas efectoras es un factor importante a tener en cuenta. Generalmente las evaluaciones se realizan con diferentes proporciones de clulas blanco y clulas efectoras (por ej. 1:50). - Sembrar en una placa de cultivo de 96 pocillos, clulas efectoras y clulas blanco (no olvidar los controles). - Centrifugar las placas para aumentar el contacto entre las clulas e incubar a 37C por 4 hs en estufa gaseada con CO2 al 5%. - Recoger el sobrenadante para la posterior medicin de radiactividad en contador de centelleo. Medicin de liberacin espontnea (cpm espontneas): En los cultivos de clulas blanco (sin clulas efectoras), se mide la liberacin espontnea del 51 Cr fijado durante la marcacin. Medicin de la mxima liberacin de marca (cpm mximas): A los co-cultivos de clulas efectoras + clulas blanco se agrega un detergente (Tritn X-100) que solubiliza las membranas plasmticas de las clulas produciendo la liberacin total del 51Cr fijado durante la marcacin. Clculo del porcentaje de lisis especfica: (cpm experimentales cpm espontneas) Lisis especfica = (cpm mximas - cpm espontneas) Las cpm espontneas no deben superar el 20% de las cpm mximas para que la prueba sea vlida. En algunas ocasiones es conveniente expresar los resultados como unidades lticas (UL), correspondientes a un determinado porcentaje de lisis. Frecuentemente se utiliza el 30% o el 50%. Para ello se grafica el porcentaje de lisis en funcin de la relacin clulas efectoras: clulas blanco. Pruebas para determinar citotoxicidad de clulas Natural Killer (NK) La actividad NK se mide generalmente en ensayos de liberacin de 51Cr, utilizando una metodologa similar a la utilizada para linfocitos T citotxicos. Si la evaluacin se realiza en seres humanos, se utiliza como clulas blanco una lnea celular denominada K562 que son clulas tumorales humanas. Cuando se realiza la evaluacin en un sistema murino, generalmente se utilizan como clulas blanco las clulas de la lnea Yac 1, que provienen de un linfoma murino inducido por el virus Moloney. Como fuente de clulas efectoras se utiliza una suspensin celular de bazo. Para evaluar la actividad NK en perros se utiliza una lnea celular de adenocarcinoma canino, CTAC. En todos los casos, la metodologa utilizada es similar a la descripta para linfocitos T citotxicos. Reaccin de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo Clnicamente, el ensayo de CCDA es til en la evaluacin funcional de clulas efectoras inmunocompetentes, por ejemplo, en pacientes con cncer en tratamiento inmunolgico. Otra aplicacin importante de la CCDA es la evaluacin de anticuerpos contra aloantgenos, clulas tumorales o virus. La CCDA se utiliza para estudiar sueros de los pacientes que recibirn un trasplante o que padecen una infeccin viral. A continuacin se describe un mtodo para medir actividad efectora de CCDA en clulas mononucleares de sangre perifrica, empleando clulas blanco marcadas con 51Cr. X 100

115

Metodologa: 1. Sensibilizacin y marcacin de las clulas blanco: - Se lavan las clulas tres veces con medio de cultivo. Antes del ltimo lavado se dividen en dos alcuotas iguales. - A una de las alcuotas se le agrega el antisuero. Este antisuero ha sido previamente calentando a 56C por una hora, procedimiento que inactiva los factores del complemento. A la otra alcuota se la toma como control sin suero. - Se agrega dicromato de sodio marcado (51Cr) y se incuba a 37C por 30 min. - Se lavan las clulas tres veces con medio de cultivo para retirar el cromo radiactivo no incorporado. 2. Medicin de la actividad de CCDA por un ensayo de liberacin de 51Cr: - Se prepara una suspensin de clulas efectoras, se hacen diluciones seriadas (1:2, 1:4, 1:8) y se siembran en una placa de 96 pocillos, con los correspondientes controles. - Se agregan clulas blanco incubadas con y sin anticuerpos, marcadas con 51Cr. - Se centrifugan las placas para aumentar el contacto entre las clulas y se incuban a 37C por 4 a 18 hs. en estufa gaseada con CO2 al 5%. - Luego de la incubacin, los cultivos se vuelven a centrifugar a mayor velocidad y se levanta el sobrenadante, que se analiza en un contador de centelleo lquido. Las cpm determinadas en el sobrenadante corresponden al radiactivo liberado por la ruptura celular. Medicin de la mxima liberacin de marca (cpm mximas): A los co-cultivos de clulas efectoras + clulas blanco recubiertas con anticuerpos y clulas efectoras + clulas blanco sin recubrir con anticuerpos, se agrega un detergente (Tritn X-100) que solubiliza las membranas plasmticas de las clulas produciendo la liberacin de 51Cr. Medicin de liberacin espontnea (cpm espontneas): A los cultivos de clulas blanco recubiertas con anticuerpos y clulas blanco sin recubrir con anticuerpos (ambos sin clulas efectoras), se mide la liberacin espontnea del 51Cr fijado durante la marcacin. Clculo del porcentaje de lisis especfica: (cpm experimentales cpm espontneas) Lisis especfica = (cpm mximas - cpm espontneas) El porcentaje de lisis especfica debe calcularse para las clulas blanco recubiertas por anticuerpos y paralelamente para las clulas no recubiertas por anticuerpos. El porcentaje de CCDA se calcula restando al porcentaje de lisis especfica de las clulas recubiertas con anticuerpos, el porcentaje de lisis encontrado para las clulas blanco sin recubrir. Bibliografa 1. Bamford, A.I; Adair, B.M.; Foster, J.C. Primary cytotoxic response of bovine peripheral blood leukocytes to parainfluenza Type 3 virus infection. 1995. Veterinary Immunology and Immunopathology. 45: 85-95 2. Fainboim, L; Satz, ML; Jennifer, J. 1999. Introduccin a la Inmunologa Humana. 387 pp. 3. Margni, R.A. 1996 Inmunologa e Inmunoqumica Fundamentos. Ed. Interamericana. 976 pp. 4. Podack, E.R. Functional significance of two cytotoxic T lymphocites. 1995. Journal of Leukocyte Biology. 57: 548-552 5. Gondolf C, Burkhardt E, Failing K, Stitz L. A new colorimetric method for measuring cellmediated cytotoxicity in dogs. Vet Immunol Immunopathol. 1996 Dec; 55(1-3):11-22. X 100

116

Tcnicas para la deteccin de anticuerpos maternales

Una adecuada proteccin contra enfermedades infecciosas que pueden comprometer la vida del neonato depende de la presencia de al menos 400800 mg/dl de Igs transferidas pasivamente. Valores de 200 a 400 mg/dl indican falla parcial en la transferencia pasiva y menores a 200 mg/dl son indicativos de falla total en la transferencia pasiva de la inmunidad materna. En los dos ltimos casos nos encontramos con neonatos hipogammaglobulinmicos. Estos valores son vlidos para bovinos y equinos, especies en las cuales el tipo de placentacin que poseen (placentacin completa), impide la transferencia de Acs a travs de esta va. Por lo tanto, el consumo de calostro durante las primeras horas de nacido favorece la sobrevida del neonato. El xito de la transferencia pasiva no puede evaluarse sino hasta las 18 horas despus del nacimiento, cuando se completa la parte esencial de la absorcin de anticuerpos. Es fundamental, entonces, asegurar al neonato la ingesta de calostro de buena calidad y en cantidad suficiente, o si fuera necesario, elegir un mtodo de suplementacin adecuado (suero) que le permita adquirir anticuerpos. Existen diferentes mtodos que nos permiten al veterinario detectar si en cada ternero o potrillo, hubo (o no) ingestin de calostro y absorcin de inmunoglobulinas. Las pruebas de laboratorio que se utilizan miden protenas en el suero del neonato y pueden clasificarse en: Pruebas cuantitativas Pruebas semicuantitativas Pruebas cualitativas Pruebas cuantitativas a) Inmunodifusin radial o tcnica de Mancini Es la tcnica de referencia. Permite conocer la concentracin de Igs y a la vez reconocer clases y subclases de Igs. La desventaja es el tiempo de lectura, de 18 a 24 horas (Ver captulo sobre tcnicas de interaccin secundaria en esta gua). b) Prueba de sulfato de zinc La tcnica se basa en la capacidad de los iones pesados de dicha sal de unirse al Fc de las Igs y hacerlas precipitar. Es un procedimiento rpido y econmico, ya que slo utiliza una solucin de sulfato de zinc que se mezcla con el suero del animal. El resultado puede evaluarse a simple vista (cualitativamente) comparando la turbidez existente en el tubo de ensayo que contiene el suero del neonato con el tubo que contiene el suero de su madre. Una menor turbidez en el tubo del neonato indica falla en la transferencia pasiva de anticuerpos. Las Igs del recin nacido se pueden cuantificar mediante la lectura en espectrofotmetro a 620nm, previa realizacin de una curva de calibracin con sueros patrones de concentraciones conocidas. c) Electroforesis La electroforesis clsica de protenas sricas sobre cellogel (tiras de acetato de celulosa) es una tcnica rpida y relativamente sencilla, que permite la posterior cuantificacin de las protenas por densitometra (Ver captulo correspondiente en esta gua). d) ELISA Esta es una tcnica de interaccin primaria, altamente sensible y especfica. (Ver captulo correspondiente en esta gua). Pruebas semicuantitativas a) Prueba de ltex o aglutinacin pasiva Es una tcnica confiable y rpida. Las partculas de ltex se cubren con anticuerpos anti IgG de la especie en estudio. Al mezclarse con el suero problema, si ste tiene IgG calostrales,

117

los anticuerpos anti-IgG adheridas a las partculas de ltex se unen a las IgGs del suero y determinan que las partculas de ltex aglutinen. Esta prueba se efecta en 10 minutos aproximadamente. El tiempo que tarda en producirse la aglutinacin es indicativo del estado de proteccin, ya que la concentracin de Igs es proporcional al tiempo de lectura; cuanto ms rpido aparece la aglutinacin, mayor es la concentracin de Igs en el suero. A modo de ejemplo, si aglutina en 2 minutos, indica buen estado de proteccin. b) Prueba de sulfito de sodio Es una tcnica similar a la prueba de precipitacin con sulfato de zinc. La presencia, ausencia o ligera turbidez producida por el sulfito de sodio que precipita las Igs se determina a ojo desnudo. Es una tcnica confiable en bovinos. Cada suero es probado con 3 soluciones con concentraciones del 14, 16 y 18% de reactivo. Las soluciones de concentracin inferior a 14% no producen turbidez alguna y las concentraciones superiores a 18% pierden sensibilidad. La presencia (+), la ausencia (-) o la ligera turbidez (+/-), son los parmetros para estimar el rango de concentracin de Igs en el suero, mediante una tabla de valores ya estipulado.

Concentracin de Igs (mg/ml) 0a1 Menos de 5 4a5 6 a 12 12 a 18 Ms de 15

Solucin de sulfito de sodio 14% +/+ 16% +/+ + + 18% + + + + +

c) Refractometra Utiliza un refractmetro que permite medir el ndice de refraccin de la luz al incidir sobre una gota de suero. Braun y Tennat relacionaron el nivel de gammaglobulinas en suero con la concentracin de protenas totales determinadas por refractometra. Esto le permiti clasificar el riesgo del recin nacido.
Concentracin de Protenas totales (g/dl) Menos de 4,9 5 a 5,4 5,5 a 6,9

Nivel de inmunidad alto riesgo riesgo medio bajo riesgo

d) Dosaje de protenas totales En forma indirecta pueden ofrecernos datos de valor sobre el nivel de gammaglobulinas totales, teniendo en cuenta que stas constituyen del 18 al 22% de las protenas totales y que del 90 al 97% de las gammaglobulinas plasmticas corresponden a las Igs. Las tcnicas de dosaje de protenas son de uso ms comn en el laboratorio de diagnstico clnico son:

118

Tcnica de Biuret Tcnica de Lowry Tcnica de Bradford

Pruebas cualitativas a) Prueba del glutaraldehdo Esta prueba determina si hubo o no falla en la transferencia pasiva, basndose en la coagulacin de las gammaglobulinas por el agregado de glutaraldehdo (no permite cuantificar las Igs). La tcnica consiste en colocar en un tubo de ensayo 0,5 ml de suero y agregar una gota de reactivo, agitar y controlar la gelificacin cada 10 minutos durante el trmino de una hora. El tiempo se toma desde la adicin del reactivo (minuto o tiempo cero). La reaccin es positiva cuando se forma un gel slido (cogulo) luego de la adicin del reactivo. Esto se visualiza inclinando el tubo unos 45, verificando que el contenido no se vuelque, es decir, que el suero se haya gelificado.
Tiempo de reaccin Concentracin aproximada de IgG (mg/dl) Mayor de 800 Interpretacin Buena trasferencia calostral Valor normal. Falla parcial de trasferencia calostral. Animal en riesgo potencial. Falla total de trasferencia calostral. Animal en alto riesgo.

Entre 0 y 10 minutos

Entre 10 y 60 minutos

De 400 a 800

Mayor de 60 minutos

Menor de 400

Se deben tener algunas precauciones para realizar esta prueba: El suero utilizado no debe estar hemolisado, ya que la hemlisis puede conducir a resultados falsos, al aumentar la reaccin de coagulacin. La prueba debe realizarse a temperatura ambiente (20 25C). Bibliografa 1. Ing. Gabriela Catalani, Dr Guillermo Berra, Sra Ana Mate. Calostro: Rol en la crianza de terneros. Deteccin de Inmunidad. INTA Castelar. 2. Tizard, I. Inmunologa Veterinaria. 4 Edicin. Interamericana. M.C.Graw Hill 1995. 3. Margni, R. Inmunologa e inmunoqumica. 5 Edicin. Panamericana 1996. 4. Fernandez, A.S.; Padola, N.L; Estein, S.M. Veterinaria Argentina. Bs.As. Argentina. Vol XII. N 116. Agosto 1995. Pg.420 425. 5. Aldridge BM, McGuirk SM, Lunn DP. Effect of colostral ingestion on immunoglobulin-positive cells in calves.Vet Immunol Immunopathol 1998 Mar 18; 62(1):51-64. 6. Belknap EB, Collins JK, Ayers VK, Schultheiss PC Experimental infection of neonatal calves with neurovirulent bovine herpesvirus type 1.3. Vet Pathol 1994 May;31(3):358-65. 7. Kohara J, Hirai T, Mori K, Ishizaki H, Tsunemitsu H Enhancement of passive immunity with maternal vaccine against newborn calf diarrhea. J Vet Med Sci 1997 Nov;59(11):1023-5. 8. Yoo D, Lee J, Harland R, Gibbons E, Elazhary Y, Babiuk LA Maternal immunization of pregnant cattle with recombinant VP8* protein of bovine rotavirus elicits neutralizing antibodies to multiple serotypes. Colostral neutralizing antibody by rotavirus VP8*. Adv Exp Med Biol 1997;412:405-11.

119

9. Bradshaw BJ, Edwards S. Antibody isotype responses to experimental infection with bovine herpesvirus 1 in calves with colostrally derived antibody. Vet Microbiol 1996 Nov;53(12):143-51. 10. Balzs Mayer, Zsuzsanna Kis, Gyz Kajn, Lszl V. Freny. The neonatal Fc receptor (FcRn) is expressed in the bovine lung. Vet Immunol. Immunopathol. 98 (2004) 85 89. 11. Yaofeng Zhao, Imre Kacskovics, Zhihui Zhao. Presence of the di-leucine motif in the cytoplasmic tail of the pig FcRn chain. . Vet Immunol. Immunopathol. 96 (2003) 229 233. 12. Blum, J.W., Hammon, H. Livestock Production Science 66 (2000) 151- 159.

Inmunoelectroforesis
La tcnica de inmunoelectroforesis combina la electroforesis y la inmunodifusin en gel de agar. El primer paso es la separacin de los componentes de la mezcla antignica por electroforesis en gel de agar. Si se usa una solucin amortiguadora alcalina, la mayora de las protenas se cargarn negativamente y migrarn hacia el nodo (polo positivo). Algunas molculas como las gammaglobulinas, que poseen un punto isoelctrico (PI) muy cercano al pH de la solucin amortiguadora utilizada, migran hacia el ctodo (polo negativo) debido al fenmeno conocido como movimiento electroendosmtico. Este efecto es producido porque el agar en un medio alcalino tiene carga negativa, lo que hace que el agua se cargue positivamente y migre hacia el ctodo arrastrando las molculas que se encuentran en solucin, sobre todo las que no tienen carga o poseen carga baja. Una vez terminada la separacin electrofortica, se coloca el antisuero en un canal cortado en el agar, paralelo a la direccin de la migracin electrofortica. Durante el perodo de incubacin, los antgenos que fueron separados electroforticamente y los anticuerpos del antisuero se desplazan en el gel de agar hasta encontrarse (al igual que en la inmunodifusin doble), para producir una banda o lnea de precipitacin. Cada lnea de precipitacin representa la reaccin de un antgeno con su respectivo anticuerpo. Materiales necesarios:Cuba de electroforesis Portaobjetos limpios y desengrasados Cmara hmeda Agar noble Solucin amortiguadora (Buffer Veronal pH 8,4-8,6) Soluciones de antgenos y de anticuerpos a valorar Procedimiento 1- Se colocan dos capas de agar sobre un mismo portaobjeto. La primera, denominada capa de impregnacin, contiene una solucin de agar al 2% (0,2 g de agar en 10 ml de solucin amortiguadora). Con un hisopo embebido en esta solucin, se cubre el portaobjetos tratando de formar una delgada capa y luego se deja secar. 2- Los portaobjetos (con la capa de agar de impregnacin seca) se colocan en posicin horizontal y sobre ellos se agregan 3 ml de una solucin de agar al 1% caliente. Se deja gelificar a temperatura ambiente. 3- Se efectan dos perforaciones en el agar: una con un molde circular (sacabocado) y otra estrecha y longitudinal. En este momento se extrae el agar slo de la perforacin circular. 4- En el recipiente de la unidad de electroforesis (cuba), se coloca la cantidad necesaria de solucin amortiguadora (Buffer Veronal pH 8.6). Los portaobjetos con el agar perforado se colocan en la cuba y se establece contacto entre la placa de agar y la solucin utilizando tiras de papel de filtro previamente humedecidas con la solucin amortiguadora (uno de los extremos de la tira se apoya sobre el agar y el otro se sumerge en la solucin amortiguadora). 5- Se conecta la cuba a la fuente de poder y se ajusta la corriente a razn de 10 voltios/cm. de gel 8 mAmp/portaobjeto durante 15 minutos para equilibrar el sistema.

120

6- Se desconecta el aparato. Las soluciones de antgeno se colocan en las perforaciones circulares de las placas de agar utilizando una pipeta Pasteur. Una de las muestras de antgeno deber estar teida con azul de bromofenol para indicar el desplazamiento (frente de corrida). 7- Se asegura que las tiras de papel de filtro estn bien colocadas y se conecta nuevamente el aparato, cuidando que la corriente sea correcta. 8- Cuando se observa que la muestra teida ha migrado lo suficiente hacia el nodo para una correcta separacin, se desconecta el aparato y se retiran los portaobjetos de la cuba. Se remueve el agar del canal para colocar el anticuerpo especfico. Esto debe hacerse con rapidez para evitar la difusin excesiva del antgeno. 9- Los portaobjetos se incuban en cmara hmeda durante 24 a 48 horas. Para una correcta interpretacin de los resultados, la capa de agar puede teirse de manera similar a la descripta para la tcnica de inmunodifusin doble. (Ver captulo sobre tcnicas de interaccin secundaria) Aplicaciones de la inmunoelectroforesis La inmunoelectroforesis permite separar e identificar antgenos o anticuerpos en una mezcla antignica debido a su diferente movilidad electrofortica, observndose el resultado por medio de la tincin de las bandas de precipitacin que se producen luego de la incubacin con el antisuero. Es una tcnica cualitativa y semicuantitativa, pues se puede estimar la concentracin de antgenos segn sean las caractersticas de las bandas de precipitacin respecto de la muestra testigo normal. En el caso de la inmunoelectroforesis en placa de agar, a mayor intensidad, longitud y cercana de las bandas al lugar de siembra del anticuerpo, mayor es la concentracin inicial del antgeno. En el diagnstico de laboratorio de las paraproteinemias, los resultados de la electroforesis de zona y de la inmunoelectroforesis debern ser combinados. As, por ejemplo: La presencia de un aumento franco o de una espiga en la regin gamma en una electroforesis sugiere fuertemente la presencia de una paraproteinemia monoclonal. No obstante, es necesario llevar a cabo una inmunoelectroforesis para determinar la clase de cadena pesada y de cadena liviana de la inmunoglobulina. La inmunoelectroforesis puede ayudar a distinguir si un aumento en las gammaglobulinas es policlonal o monoclonal. La disminucin o ausencia de inmunoglobulinas que se observa en diversos trastornos o deficiencias inmunolgicas, pueden ser analizados mediante esta tcnica. La inmunoelectroforesis permite la identificacin de cadenas livianas en la orina de enfermos con discracias de clulas plasmticas o trastornos autoinmunitarios, mediante anticuerpos anti kappa o antilambda especficos. De esta manera se puede confirmar la naturaleza monoclonal de la protena de BenceJones en el mieloma. Finalmente, la inmunoelectroforesis es til para identificar las protenas presentes en cantidades elevadas en el lquido cefalorraqudeo de pacientes con diversas enfermedades nerviosas.

121

Comparacin de un proteinograma con una inmunoelectroforesis.

122

Tcnica de inmunoelectroforesis: A) Gel de agar vertido y solidificado sobre un portaobjetos. Se han excavado una ranura para el antisuero y un pozo para el antgeno. B) El pozo para el antgeno se ha llenado con el suero en estudio.

C) Los componentes del suero son separados por electroforesis.

D) La ranura se llena con antisuero.

E) El suero y el antisuero difunden a travs del agar.

F) Se forman lneas de precipitacin. Cada lnea corresponde a un nico componente del suero.

Bibliografa 1. Morilla A. y Bautista C. R. Manual de Inmunologa Mxico: Editorial Diana 1 edicin, septiembre de 1986. Captulo 6. 2. Margni R. A. Inmunologa e Inmunoqumica. Fundamentos. Bs. As. : Editorial Mdica Panamericana 1 edicin, octubre de 1972. Edicin consultada: 5 edicin septiembre de 1996. Captulo I. 3. Inmunologa Bsica. Gua de trabajos prcticos. Fac. Cs. Veterinarias. Ao 2000. 4. Stites Daniel P. y Terr Abba I. Inmunologa Bsica y Clnica. Editorial El Manual Moderno S.A. de C. V. Mxico D.F. 7 edicin. 1993 Seccin II. Captulo 18.

123

Ejercicios y problemas de aplicacin 1) Realice un cuadro que incluya las clulas que intervienen en el sistema inmune innato indicando: receptores de membrana, mecanismos involucrados en su accin (fagocitosis, apoptosis, etc.), si actan o no como presentadoras de antgeno y patrn de migracin. 2) Complete el siguiente cuadro con los componentes humorales del sistema Inmune Innato. Clulas o tejidos que los producen Complemento (va alterna) Protenas de fase aguda IFN y Anticuerpos naturales Funciones

3) Se realiz un experimento en el cual se evalu la produccin de xido ntrico (ON) utilizando el reactivo de Griess. Para ello se obtuvo sangre con heparina de dos perros con las siguientes caractersticas: Canino 1: animal adulto de 3 aos de edad y el Canino 2: cachorro de tres das), se centrifug y se separ el halo de clulas mononuclares Estas clulas se incubaron con dos antgenos distintos: LPS y Staphylococcus sp inactivados con formol. Un tercer grupo de clulas a las que no se incub con antgeno se utiliz como control negativo. Los resultados se muestran en el siguiente grfico:
Canino 1
Nanomoles de Oxido ntrico
Nanomoles de Oxido ntrico

Canino 2
1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Control LPS 10ug/ ml Staphylococcus spp.

6 5 4 3 2 1 0 Control LPS 10ug/ ml Staphylococcus spp.

a) Indique mediante una tabla que respuesta en produccin de ON se obtuvo segn los estmulos indicados, en los dos animales. b) Compare los resultados obtenidos entre los animales. c) Proponga una hiptesis que pueda justificar las diferencias observadas. d) Disee un experimento para confirmar la hiptesis propuesta. 4) La Peritonitis pleuritis infecciosa felina (PPIF) es una infeccin de etiologa viral en la cual se desarrolla en el animal una intensa respuesta inflamatoria por parte del sistema inmune. Recientemente se descubri que la alfa glicoprotena cida (AGP), una protena de fase aguda, sufre un gran incremento en el suero de los animales afectados. En base a sus conocimientos analice las imgenes que corresponden a las electroforesis (EF) de suero de dos felinos distintos y responda:

124

Albmina

2 1

Paciente A a) b) c)

Paciente B

Que tcnica se utiliz para detectar el aumento en las protenas de fase aguda? Describa el fundamento Qu paciente sospecha que puede estar afectado de PPIF? Cul es el mecanismo inmunolgico por el cual aumentan las protenas de fase aguda? Cuales son los componentes en los cuales puede separarse un suero? Qu componente est alterado en este caso?

5) Durante una investigacin sobre mecanismos de fagocitosis implicados en la inmunidad frente a distintas bacterias, se realiza un experimento para determinar la importancia de la opsonizacin en cada caso. A estos fines, se cultivan las bacterias en dos medios distintos: plasma humano y RPMI (medio de cultivo). Luego se agrega a los medios un cultivo de clulas dendrticas -con actividad fagoctica- y se los deja interactuar por 1,5 horas. Por ltimo, se lleva a cabo el recuento del n de bacterias fagocitadas a travs de tincin con Giemsa de las clulas dendrticas y visualizacin de los microorganismos en su citoplasma. Los resultados obtenidos se representan en el siguiente grfico:

Pie de figura: Cuantificacin del nivel de ingestin de L. monocytogenes, por clulas dendrticas. Las bacterias fueron pre-incubadas con: A- Medio de cultivo, B- Suero decomplementado, C- complemento purificado, D- suero

125

completo. Los resultados se expresan como nmero de bacterias intracelulares por 100 clulas dendrticas luego de la tincin con Giemsa, a) Cules son los mecanismos de inmunidad evaluados? Qu fases de la fagocitosis est estudiando? b) Qu conclusiones puede extraer a partir de este experimento? c) Qu componentes del suero pueden haber actuado como opsoninas? Explique. 6) Un veterinario necesita purificar anticuerpos de tipo IgG presentes en el suero de un conejo para probar un nuevo tratamiento. a) Enumere y explique los pasos que debera seguir en la purificacin. b) Segn los resultados de SDS-PAGE que se muestran a continuacin: indique qu enzimas puede haber utilizado para el fraccionamiento de las IgG obtenidas. Esquematice la molcula de IgG e indique los PM de cada uno de sus componentes antes (To) y despus (Tf) de la digestin enzimtica.
PM 97 50 T0 Tf

30 25

7) Se desea estudiar el efecto de la presencia de anticuerpos especficos frente a Staphyloccus sp. en la fagocitosis de dicha bacteria. Como fuente de Igs, se cuenta con suero de un animal infectado, y de Igs purificadas a partir del mismo por diferentes mtodos. En las siguientes figuras se observa la corrida electrofortica y el SDS-PAGE de los 3 tipos de muestras de Igs que se poseen:
1 2 3 1 2 3

50 kDa

25 kDa

a) Las muestras 1, 2 y 3 corresponden a las fracciones: Igs purificadas por afinidad a protena G, suero e Igs obtenidas por precipitacin salina. Observando las figuras, qu imagen considera que podra corresponder a cada muestra y por qu? b) Cul de las 3 muestras usara para opsonizar las bacterias y realizar ensayo de fagocitosis. Justifique

126

8) Se evalu un nuevo kit diagnstico para virus rbico, para ello se seleccionaron 180 cobayos libres de patgenos especficos (LPE) a los que se dividieron en dos lotes de 90 animales cada uno. Los animales del lote N 1 se conservaron como negativos, mientras que los del lote N 2 fueron inoculados con virus rbico y presentaron las lesiones caractersticas en el 100% de los animales (positivos). El anlisis del suero de los 180 animales, a travs del nuevo kit diagnstico arroja los siguientes resultados: Lote N 1: 3 positivos y 87 negativos Lote N 2: 85 positivos y 5 negativos Realice un cuadro con los resultados y calcule la sensibilidad y especificidad del kit diagnstico. 9) La Paratuberculosis bovina es una enfermedad crnica y de difcil diagnstico que afecta a los bovinos. La prueba de oro para la confirmacin de esta enfermedad es el aislamiento del microorganismo causante (Mycobacterium paratuberculosis) a partir de muestras de animales sospechosos. Dado el lento desarrollo de este microorganismo, se hace necesario contar con otras pruebas que permitan un diagnstico ms rpido. A continuacin se transcribe una tabla de datos obtenidos por un equipo de investigadores que analiz el valor predictivo de un ELISA frente a un antgeno proteico de M. paratuberculosis como prueba diagnstica de rutina: Aislamiento positivo positivo ELISA comercial negativo total 3 2 5 negativo 0 75 75 Total 3 77 80

Calcule la sensibilidad (S) y la especificidad (E) de la prueba de ELISA y decida en funcin de estos parmetros, si la implementara o no como prueba diagnstica de rutina. 10) A partir de las siguientes muestras para el diagnstico de enfermedades infecciosas indique que tipo de Inmunofluorescencia realizara (directa o indirecta) y reactivos necesarios. Sospecha Rabia canina Leptospirosis canina Toxoplasmosis muestra Impronta de cerebro Sedimento urinario Suero IF Reactivos necesarios

11) La Pseudorrabia es una enfermedad infecciosa, producida por el virus de Aujeszky, que afecta principalmente a cerdos pudiendo transmitirse a otras especies. Se caracteriza clnicamente por trastornos nerviosos, respiratorios y reproductivos, siendo el prurito generalizado seguido de parlisis y muerte los signos caractersticos. El agente etiolgico pertenece a la familia Herpesviridae, presenta una cpside icosadrica que contiene glicoprotenas (GP) que son los principales componentes estructurales reconocidos por el sistema inmune y contra las que se producen grandes cantidades de anticuerpos. La deteccin de anticuerpos especficos contra el virus en un cerdo se considera sinnimo de infeccin y el animal debe ser separado de la poblacin sana. Para la prevencin de la enfermedad se utilizan vacunas que generan una respuesta inmune similar a la infeccin natural.

127

Un grupo de investigacin gener, por tcnicas de ingeniera gentica, una variante de la cepa de campo a la que denomin GPp 7 (-). Esta variante es idntica a la cepa de campo, excepto que carece de una de las glicoprotenas de superficie, la GP7. Disee un ELISA donde se pueda diferenciar animales sanos no vacunados de vacunados y de infectados (No olvide los controles) 12) Al final de la prueba de ELISA se agrega una solucin cida (o alcalina, dependiendo del protocolo) Cul es el objetivo? 13) Cmo sera el esquema de un ELISA diseado para detectar la presencia del virus de la Influenza equina en muestras de secreciones nasales? Indique los reactivos que necesitara. 14) Los siguientes datos son los resultados de un ELISA de tres gatos sospechosos de padecer VIF. Los nmeros expresan el promedio de los valores de densidad ptica de cada muestra leda a 450 nm. Las densidades pticas comprendidas en el rango de 0.300 a 0.499 indican valores indeterminados; en estos casos se deben repetir los estudios.

Control Positivo 1.689

Control Negativo 0.153

PACIENTE A 0.055 B 0.412 C 1.999

Responda: a) Cul seria su informe sobre cada uno de los pacientes? b) Qu sucedera si se hubiese omitido por error el agregado de los sueros, y los otros pasos se hubiesen realizado correctamente? c) Qu sucedera si no se hubiese lavado el conjugado Anti-inmunoglobulinas felinas antes del agregado del sustrato? d) Por qu repetira los resultados en el paciente B? En qu momento lo hara? 15) La anemia infecciosa equina es una enfermedad de etiologa viral de los caballos, de carcter crnico, con aparicin de episodios agudos febriles, marcada depresin y debilitamiento. El contagio se produce a travs de vectores hematfagos que transportan el virus en forma mecnica desde los animales enfermos a los sanos. El diagnstico se realiza por la identificacin de anticuerpos precipitantes en el suero de los animales infectados, test de Coggins. Usted tiene un laboratorio de diagnstico y realiza esta prueba de forma rutinaria. Un colega tom muestras de sangre de tres caballos y se las remite para su anlisis. Ag: antgeno P: control positivo P 1-2-3: muestras

1 Ag P 3

128

Analice los resultados explicando a que se deben las bandas observadas y como las interpreta. Indique Qu informara sobre estos animales? 16) La campaa nacional de erradicacin de la brucelosis bovina se basa en dos pilares: la vacunacin de todas las terneras entre los 3 y 8 meses de edad (los machos no se vacunan) y la posterior identificacin de los animales infectados y su segregacin del rodeo. La vacunacin se lleva a cabo con una cepa viva atenuada de Brucella abortus denominada cepa 19. Para identificar los animales infectados se realiza diagnstico serolgico a la totalidad de las hembras mayores de 18 meses de vida y los toros mayores de 6 meses. a) Explique el fundamento de la prueba de aglutinacin. b) Explique por qu el diagnstico serolgico se realiza a diferentes edades segn sean hembras o machos. 17) La leucosis bovina es una enfermedad inmunosupresora que afecta al ganado y es producida por un retrovirus. El SENASA acepta como prueba de diagnstico de rutina a la inmunodifusin doble en placa con un antgeno estandarizado altamente conservado entre las cepas de este virus. Responda: Analice las variaciones esperables en la sensibilidad y la especificad de esta prueba diagnstica de esta prueba si sustituimos el antgeno empleado por: a) Otro antgeno viral de alta variabilidad entre cepas debido a una gran frecuencia de mutacin. b) Otro antgeno viral compartido que se expresa tanto en la superficie del virus de la leucosis como en la de otros virus emparentados. . 18) Un canino hembra de 8 meses de edad presenta convulsiones. El veterinario, entre otras pruebas, solicita serologa de toxoplasmosis al momento de la primera consulta y quince das despus. El laboratorio realiza las pruebas de inmunofluorescencia indirecta (I.FI.) y aglutinacin directa (A.D.) y obtiene los siguientes resultados: Da 0 Da 15 I.F.I: 1/512 I.F.I: 1/2048 A.D: 1/128 A.D: 1/512

a) Por qu los titulos informados son diferentes? b) Analice si hubo conversin serolgica y explique el por qu de su respuesta 19) Con el objetivo de estudiar el efecto de la inmunizacin pasiva frente al desafo viral se obtuvieron sueros inmunes frente al virus del Sarampin de diferentes cepas de ratones y se utilizaron para inmunizar pasivamente un grupo homogneo de ratones de la cepa Balb/c. Los ratones tenan dos semanas de vida y se les aplic una dosis de 150ul de suero. Se evalu la supervivencia de los ratones luego del desafo a) Cules fueron los resultados al da 2, al da 9 y al da 17? Realice un cuadro. b) En que consisti en control negativo y para que lo realiz?

129

c) Admitiendo que las diferencias observadas entre los tratamientos son estadsticamente significativas Cmo interpreta los resultados?

% supervivencia

Cuadrados negro: ratones tratados con suero proveniente de cepa Balb/c Cuadrados blanco: ratones tratados con suero proveniente de cepa CBA Tringulos blancos con borde negro: ratones tratados con suero de ratn normal 20) En la prueba de fijacin de complemento se inactivan los sueros antes de evaluarlos, cul es el objetivo? Y cmo se realiza? Adems, el suero en estudio debe estar completamente libre de hemlisis y de contaminaciones. Por qu? 21) En 1974 Peter Doherty y Rolf Zinkernagel realizaron el siguiente experimento: Infectaron cepas de ratones BALB/c y CBA con virus de la linfocoriomeningitis murina (LCMV). Siete das despus tomaron clulas de bazo de estos ratones y evaluaron su habilidad para lisar clulas blanco infectadas con el virus (midieron el grado de lisis por la liberacin del radioisotopo 51Cr por parte de las clulas blanco). a) Explique los mecanismos celulares y las molculas involucradas en esta evaluacin. b) En base a los resultados: Explique qu demostraron con este experimento. Lisis de clula blanco Cepa dadora de Clula efectora Clula blanco BALB/c inmune BALB/c no inmune CBA inmune CBA no inmune BALB/c inmune BALB/c no inmune CBA inmune CBA no inmune BALB/c BALB/c BALB/c BALB/c CBA CBA CBA CBA Infectadas + + No infectadas -

130

22) Haga un cuadro en el que se comparen los siguientes mecanismos de citotoxicidad celular: fagocitosis, actividad NK, ADCC, lisis por complemento. Mencione la clula blanco, la clula y/o mediadores qumicos efectores, mecanismo de reconocimiento y de lisis. 23) Para evaluar una vacuna BCG recombinante, se procedi a la inoculacin de ratones BALB/c y se evalu el porcentaje de lisis especfica utilizando diferentes tratamientos: Medio de cultivo solo (), Anti-CD4 () y Anti-CD8 () Se realiz una estimulacin previa in vitro con un pptido y luego se la evalu sobre clulas blanco que expresan el mismo pptido. Explique los mecanismos celulares y las molculas involucradas en esta evaluacin. Explique los resultados en las diferentes proporciones de clulas.

24) Como se denominan los Ac. dirigidos contra los antigenos eritrocitarios en una transfusin? (alo iso idio) 25) Luego de una castracin, un potrillo recibe antibiticos y suero antitetnico para prevenir complicaciones postquirgicas. Unos meses despus el potrillo es vendido y su nuevo dueo decide vacunarlos contra el ttanos. Ante la informacin de que el potrillo ya ha recibido una dosis de suero antitetnico, el veterinario actuante decide darle slo una dosis de vacuna y suprimir el refuerzo, argumentando que el suero antitetnico ya recibido funcionara como primer estmulo para el sistema inmune. Est de acuerdo con la actuacin del veterinario? Justifique 26) a) Analice el cuadro y explique qu pasar con el potrillo en cada caso b) En caso que sea necesario realizar una transfusin: Cual seria segn su criterio el donante indicado: - madre - padre - otro Justifique en cada caso.

131

madre 2 paricin

27) La Arteritis Viral Equina es una enfermedad respiratoria que puede causar abortos en yeguas preadas. Se transmite por va area y venrea, y cura espontneamente dejando inmunidad duradera. En los machos, el virus puede acantonarse en el tracto reproductor transformando al animal en portador sano, que elimina virus con los fluidos seminales. La enfermedad es endmica en Estados Unidos y Europa, donde se utiliza una vacuna a virus vivo atenuado como herramienta profilctica. En nuestro pas es una enfermedad extica de la que se han registrado algunos brotes en los ltimos aos como consecuencia de la importacin de semen infectado. Los dueos de los haras afectados solicitan que se importe y se aplique la vacuna de USA, que ha dado muy buenos resultados. a) Si usted fuera responsable del organismo de control sanitario nacional, permitira la utilizacin de dicha vacuna? Por qu? De no permitirlo, proponga un plan profilctico alternativo. 28) Las vacunas a subunidades proteicas pueden ser obtenidas por tcnicas de biologa molecular. Utilizando clonacin en un vector de expresin (el plsmido: PRsetA este vector agrega a la proteina una cola de histidinas) se obtuvo en un cultivo de bacterias E. coli la siguiente protena perteneciente a una secuencia de Mycobacterium paratuberculosis. Los cultivos de E. coli se analizaron por la tcnica de SDS-PAGE.

132

En la calle 1 se observa las protenas de los cultivos de E. coli sin transformar y en la calle 2 las protenas de los cultivos de E. coli transformadas con el plsmido. En la calle 3 se observan los patrones de PM. En las calles 4, 5, 6 y 7 se observan las eludos de la columna de Nquel. a) Cul es el fundamento de la metodologa utilizada para la purificacin proteica? b) Segn los resultados de las corridas, considera que la purificacin fue efectiva? Justifique. 29) Un grupo de investigadores est intentando desarrollar una vacuna contra leptospirosis bovina a subunidades, cuentan con aislamientos de las serovariedades de la zona y con sueros de bovinos infectados. a) Qu metodologa les propondra para la identificacin de protenas compartidas por las distintas serovariedades? b) Una vez identificados las protenas compartidas Cmo podran seleccionar aquellas que son ms inmunognicas para los bovinos? 30) Para ahorrar material descartable un veterinario carga en la misma jeringa una dosis de vacuna antirrbica (virus inactivado) y una de moquillo (virus atenuado). Es correcto inmunizar con 2 antgenos distintos el mismo da? Y administrarlos en la misma jeringa? Por qu? 31) Un veterinario haba odo decir que la va ideal para la inmunizacin es la puerta de entrada natural del patgeno y saba que el virus de la Fiebre Aftosa ingresa por va aergena. Juntando estos conocimientos, se propuso evaluar el efecto de la aplicacin en spray de la vacuna covencional antiaftosa (virus inactivado) sobre las vas reas. Para esta evaluacin, dividi en dos grupos losa animales de un campo en el que trabajaba; a la mitad le aplic la vacuna por la va convencional y con la otra mitad emple el sistema de spray. Unos meses despus un brote de aftosa afect a la gran mayora de los animales vacunados con el sistema de spray, sin provocar alteraciones entre los animales vacunados de la manera convencional. a) Le parece correcto vacunar con spray slo a la mitad de los animales disponible para evaluar la eficacia del sistema? Por qu? b) Cmo explicara los resultados obtenidos por este colega? 32) Usted debe elegir entre dos vacunas atenuadas para vacunar a todos los cerdos del pas contra la gastroenteritis transmisible. Una contiene el virus completo y otra el virus completo ms una protena extraa (la betagalactosidasa) Desde el punto de vista epidemiolgico, qu vacuna le parece mejor? Justifique 33) Un laboratorio entiende que, por haber formulado una vacuna a virus atenuado con un vehculo a base de agua destilada estril apirgena no debe realizar un control de inocuidad. Est usted de acuerdo?

133

34) Un cerdo ingresa al pas desde un rea de USA libre de Pseudorrabia. Como los anticuerpos contra el virus de la Pseudorrabia son protectores, se decide administrarle una dosis de suero hiperinmune anti-pseudorrabia al momento del ingreso al pas. Al llegar al establecimiento de destino el veterinario propone esperar unas semanas para vacunarlo contra la enfermedad. Le parece correcto este proceder? Justifique 35) Cuando aparece un foco de una enfermedad extica es imperioso el control de dicho foco para evitar la diseminacin de la enfermedad. Entre las medidas sanitarias que se adoptan en estos casos se encuentran el rifle sanitario y la vacunacin en anillo de todos los animales susceptibles que habitan las zonas lindantes a la de la aparicin del foco. Qu tipo de vacuna eligira para aplicar en uno de estos casos: a) vacuna a virus vivo atenuado b) vacuna a virus inactivado c) vacuna a subunidades? Justifique su eleccin 36) A un pueblo llega un nuevo veterinario que sostiene la teora de que es mejor no vacunar contra el virus del moquillo debido a que, adems de no producir 100% de proteccin, esta vacuna induce reacciones adversas en algunos de los animales vacunados. Debido a su prdica, muchos dueos de perros dejan de vacunar contra este patgeno. Al cabo de unos aos aparece en el pueblo un brote de moquillo que afecta principalmente a los perros no vacunados, pero tambin a algunos que s haban sido vacunados. Cuando el veterinario es confrontado como responsable del brote, aduce que despus de todo el tena razn, ya que tambin haban enfermado los animales inmunizados. a) Si usted fuera una autoridad sanitaria con jurisdiccin en dicho pueblo, cmo respondera a la aseveracin del veterinario? 37) A una clnica veterinaria llega a consulta una perra recientemente preada. Su duea est preocupada porque la perra nunca fue vacunada y una vecina le coment que los cachorros se podan morir de parvovirosis. La mujer quiere saber cmo proceder. a) Usted qu le aconsejara como veterinario? Si decide vacunarla, indique qu tipo de vacunas utilizara y por qu? 38) Un cachorro de 2 meses recibi 2 dosis de vacuna contra Parvovirus y Moquillo. Sus dueos lo sacan de paseo por la plaza y a la semana el perro comienza a manifestar signos compatibles con Parvo/Moquillo. Se presentan los dueos en la veterinaria con la queja, alegando que la vacunacin recibida por su mascota no haba sido correcta, ya que a pesar de haber recibido 2 dosis de vacuna el cachorro se haba enfermado. Tienen razn estos dueos? Cmo argumenta su respuesta? 39) La Rabia es una enfermedad neurolgica de origen viral. Cuando un animal se infecta, el virus se disemina por va neurgena hacia el encfalo, donde produce las lesiones causantes de la sintomatologa de la enfermedad. Teniendo en cuenta estas consideraciones: a) Proponga una tcnica diagnstica que permita confirmar la etiologa rbica frente a la muerte de un animal con signos clnicos compatibles. b) Esquematice la metodologa propuesta. c) Indique reactivos y equipamiento necesarios. 40) Para la elaboracin de suero antitetnico se recurre a la inoculacin de equinos, debido entre otras razones a los grandes volmenes de suero que producen estos animales. a) Qu antgenos inoculara y cmo diseara el plan de inoculacin del equino en cuanto al n de dosis y al intervalo temporal entre las mismas? Por qu? b) Qu tcnica utilizara en los equinos inoculados para evaluar la respuesta frente al antgeno? c) Qu tipo de inmunidad podra conferir la administracin a otro animal del antisuero producido?

134

d) Explique ventajas y desventajas de la administracin del antisuero a otro animal. 41) En la Clnica veterinaria, es recibido un paciente canino con signos de anemia aguda severa. Entre las pautas iniciales de manejo, el profesional actuante decide instaurar una hemotransfusin. Dada la urgencia del caso y considerando que el animal no haba recibido transfusiones previas se decide recurrir a Lucy, mascota de la veterinaria, como donante de sangre . El paciente comienza a manifestar vmitos, hipertermia y signos compatibles con un shock incipiente. Explique: a) Qu mecanismos inmunolgicos podran estar involucrados? b) Cmo se podra confirmar el diagnstico? c) Cmo se podra haber prevenido el agravamiento del caso? 42) El virus de la linfocoriomeningitis murina infecta, entre otras, a las clulas dendrticas. En ellas disminuye la expresin de molculas de MHC clase II, CD40 y CD80. Cules sern las consecuencias de esta accin en el desarrollo de la respuesta inmune contra el virus? Explique. 43) Usted trabaja en un laboratorio y lo consultan porque una empresa desea exportar plasma bovino. Para ello la aduana le exige un anlisis cualitativo del mismo. Usted en su laboratorio slo posee los siguientes reactivos: Anti IgG bovina marcada con fluorescena. Anti plasma bovino. Anti IgA bovina marcada con fosfatasa alcalina. Con sus conocimientos sobre tcnicas Inmunolgicas y con los reactivos que usted posee: Qu tcnica puede usted realizar que le permita determinar si lo que se est exportando es plasma bovino? Explique brevemente cmo la realizara. 44) Estoy desarrollando una vacuna inactivada para caninos y quiero efectuar una prueba de potencia. a) Cul es la especie de eleccin? b) Qu caractersticas debern tener los animales en los que se lleve a cabo la prueba? c) Cmo disea y evala la prueba? 45) Los potrillos son susceptibles de padecer neumona por Rhodococcus equi. Esta es una bacteria intracelular facultativa, que se aloja en los pulmones y causa lesiones que suelen llevar a la muerte. Al estudiar las causas de la marcada susceptibilidad de los potrillos, se encontr que los animales jvenes tienen deficiencia de IFN gamma, lo que afecta su respuesta inmune. a) Describa alguna tcnica in vitro que le permita demostrar la diferencia en la produccin de IFN gamma. b) Cmo se ver afectada la respuesta inmune a esta bacteria por la deficiencia de IFN gamma? 46) Un perro de cinco aos de edad sufre una herida el ojo. Tiempo despus, presenta lesiones oculares resistentes a la teraputica convencional. Este animal no tena historia previa de enfermedad autoinmune. Se le detectan anticuerpos contra antgenos de la retina en suero. Por qu normalmente un individuo no tiene anticuerpos contra antgenos de la retina en suero? Por qu se podran haber desarrollado en este caso?

135

47) Dentro de las patologas del tracto digestivo que afectan a los terneros neonatos, la Rotavirosis es una de las ms relevantes. Este virus ingresa al organismo por va oral e infecta los enterocitos de las vellosidades intestinales, generando las lesiones responsables del cuadro de diarrea observado. Responda: a) Qu mecanismos efectores del sistema inmune consideran que tendrn mayor importancia para lograr una respuesta inmune efectiva frente a Rotavirus? b) Proponga un modelo de vacunacin para la prevencin de esta enfermedad en terneros neonatos, explicando qu tipo de vacuna, justifique. 48) Se presenta a consulta una gata siamesa de 5 aos de edad con 5 cachorros de los cuales 1 estaba muerto y otros 2 presentaban decaimiento e ictericia. El veterinario sospecha de isoeritrlisis neonatal. a) Qu le preguntara a los dueos (anamnesis)? b) Qu tcnicas utilizara para comprobar sus sospechas? 49) El diagnstico de la tuberculosis se realiza por la intradermorreaccin con PPD. Un grupo de investigadores desea mejorar el diagnstico de bovinos infectados, para ello realizan la intradermorreaccin de las proteinas recombinantes E6/C10 (de Myobacterium tuberculosis) a bovinos infectados. La lectura se realiz a las 72 hs. Aquellos que presentaban un aumento de 5mm de dimetro o ms, se los consider como positivos.

a) b) c) d)

Describa cmo se obtienen las proteinas recombinantes. Cul es el objetivo buscado al realizar intradermorreaccin a bovinos con PPD? Qu grupo/s control faltara/n? Qu tipo de hipersensibilidad es esta intradermorreaccin? Cmo se produce? e) Interprete los resultados 50) Un grupo de investigadores estudi la respuesta de memoria de clulas T humanas en individuos con antecedentes de infeccin por dengue, para una evaluacin posterior de la antigenicidad de protenas virales inmunodominantes para su empleo en el diseo de futuros inmungenos. Para esto se incubaron clulas mononucleares de sangre perifrica de individuos inmunes (expuestos) a dengue y un grupo de individuos controles no expuestos. a) Cul fue el experimento llevado a cabo? b) Describa la tcnica y su fundamento c) Cules son las clulas que los investigadores pretenden evaluar? d) Por qu se seleccionaron individuos previamente expuestos al antgeno? 51) Los individuos positivos (con anticuerpos frente al Dengue) fueron seleccionados a travs de la tcnica de ELISA, y se los consideraba como tal a aquellos que presentaban ttulos en suero mayor o iguales a 256. a) Describa el tipo de ELISA utilizado, materiales, fundamento y controles.

136

b) Indique las diluciones de uso de los sueros, teniendo en cuenta que ttulos > 256 son considerados positivos y la dilucin final de uso fue de 1/2048. Cmo realiza las diluciones teniendo en cuenta que el volumen a utilizar es de 20 l de suero? 52) Un paradigma clsico de la inmunologa plantea que para que ocurra cambio de isotipo en los anticuerpos es condicin sine qua non la presentacin del antgeno a un linfocito T helper (LTh) por parte de una clula presentadora de antgeno (CPA). En el presente trabajo se present un modelo animal, ratones BALB/c, de respuesta inmune frente a dos antgenos tpicos. Se utiliz dextran como Ag T independiente y seroalbmina bovina como Ag T dependiente, y se estudi la respuesta analizando los isotipos de los anticuerpos producidos. Se utilizaron 12 ratones BALB/c machos y 12 ratones BALB/c hembras de entre 5 y 8 semanas de edad y fueron divididos en dos grupos de 12 animales c/u (6 machos y 6 hembras) Los animales fueron inoculados intraperitonealmente con seroalbmina bovina el grupo 1 y con Dextran el grupo 2, los das 1 (preinmune), 7,14 y 28 (A la vez se tomaron muestras de sangre del seno venoso retroorbital). Los ensayos para evaluar respuesta inmune se realizaron mediante un ELISA y los sueros utilizados en una dilucin 1/250 Responda: a) Qu isotipos deberan evaluarse para conocer la respuesta inmune primaria y secundaria? b) Establezca los pasos del ELISA utilizado c) Si la dilucin utilizada fue siempre la misma Cmo se evaluaron los niveles de Ac. medidos en este trabajo? d) Grafique la respuesta primaria y secundaria esperable para ambos antgenos, indicando el isotipo predominante. Si existen diferencias, A que las atribuye? e) Analice los grficos de deteccin de anticuerpos frente a ambos antgenos. Encuentra diferencias? Explique f) Qu control agregara?

137

53) Una Cabaa vende un torito a un establecimiento ganadero. Para prevenir la Fiebre de los transportes, antes de subir al camin, el torito recibe una vacuna contra IBR y Pasteurella multocida (principales agentes causales de la enfermedad). Cinco das despus de llegar a destino el torito muere sbitamente. La necropsia se realiz inmediatamente, se observaron lesiones compatibles con neumona. Durante la anamnesis se inform que el animal recibi 2 dosis de vacuna contra IBR hace 1 ao, no as contra Pasteurella. Se sospecha de Fiebre de los transportes Se toman muestras y se envan al laboratorio. Los resultados son concluyentes. La muerte se debi a una infeccin aguda por P. multocida, sin participacin del virus de IBR. Discuta a) 1 Qu muestras envi al laboratorio? b) 2 Qu estudios solicit? Descrbalos y fundamente su eleccin c) 3 Cmo debieron ser los resultados para asegurar que la muerte del animal se debi a una pasteurelosis aguda y que el virus de IBR no puede ser acusado de toricidio d) 4 Qu medidas se deberan haber tomado para evitar esta muerte? 54) La produccin industrial de pollos para carne se ve afectada por la ocurrencia de diferentes enfermedades virales (Bronquitis infecciosa, Gumboro, New Castle, etc) que se transmiten muy rpidamente entre los pollos de un galpn de engorde Las gallinas transfieren anticuerpos en forma pasiva a sus pollitos a travs del huevo, que lo protegen contra enfermedades especficas durante un perodo variable de tiempo (hasta un mximo de 40 das) si stas fueron correctamente inmunizadas. Para evaluar la eficacia de esa transferencia se emplea la tcnica de ELISA indirecto. Se toman muestras de sangre de 30 cada 10.000 aves. De acuerdo a los valores de D.O. obtenidos (en relacin directa con la concentracin de anticuerpos especficos contra la enfermedad en cuestin) se elaboran histogramas de frecuencia segn rangos de D.O. establecidos por estudios estadsticos. De acuerdo a la distribucin de las D.O. obtenidas se establece el grado de proteccin o status inmunitario del lote frente a esa enfernedad y se anticipa o retrasa el momento de vacunacin activa para mantener las aves en un alto status inmunitario durante todo el perodo de produccin (45 60 das). Densidad Optica 0 0.20 0.21 0.40 0.41 0.60 0.61 0.80 0.81 1.00 Grupo 1 2 3 4 5

138

1.01 1.20 1.21 1.40 1.41 1.60 1.61 1.80 1.81 2.00

6 7 8 9 10

a) Describa la tcnica empleada. b) El Diseo empleado: Corresponde a una tcnica cualitativa, semicuantitativa o cuantitativa? c) Los grficos representan los histogramas de frecuencias de D.O. obtenidas de muestras de suero de 4 grupos diferentes de pollitos bb que ingresaron a galpones de engorde. Realice comparaciones sobre el status inmuntario de cada lote y sobre la necesidad, cantidad y tipo de vacunas convencionales a emplear en cada lote.
cantidad de muestras
cantidad de muestras

20 15 10 5 0 1 13

17

8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 4 5 5

6 3

10

10

Grupo 1

Grupo 2

cantidad de muestras

15 10 5 0 1 2 3 4 5 6

13 9 8

cantidad de muestras

10 8 6 4 2 0 1 2 3

7 4

8 6 3 2

10

10

Grupo 3

Grupo 4

55) Se sabe que el Virus de la Inmunodeficiencia Felina (VIF) infecta a los linfocitos T CD4+, causando una deplecin de los mismos y que en esta infeccin, la relacin CD4:CD8 de linfocitos circulantes constituye un factor pronstico. Los siguientes grficos corresponden a la corrida en un citmetro de flujo de la muestra de sangre de un paciente felino recin diagnosticado. Para marcarla se emplearon 3 anticuerpos: anti CD3 (maracador de LT), anti CD4 y anti CD8; cada uno marcado con un fluorocromo distinto.

139

Teniendo en cuenta que la relacin CD4:CD8 esperada para un felino sano es aproximadamente 2:1, analice e interprete estos resultados:

SSC-Height ->

Linfocitos
CD8: 19% CD4: 10%

Los grficos CD8 vs. CD3 y CD4 vs. CD3 fueron construidos considerando solamente los eventos incluidos en la regin linfocitaria (gate linfoide)

56) Un grupo de cientficos est investigando la respuesta inmune de porcinos frente al virus de la Peste Porcina (VPP). En este problema se muestran los resultados de uno de sus ensayos, donde realizaron una prueba de linfoproliferacin de sangre perifrica de animales infectados con el virus. Emplearon como estmulo linfoproliferativo una solucin de virus inactivado. a) Analice los resultados expresados en la siguiente tabla y proponga un diseo (muestras empleadas, controles, reactivos) para el ensayo realizado. Indice de Estimulacin (IE) Animal Infectado Animal NO infectado 17,3 15,5 9,1 1,8

Clulas SIN estmulo Clulas + ConA Clulas + VPP

140

b) Luego, evaluaron las citoquinas producidas por los LT CD4+ proliferados usando la citometra de flujo.

Expresin intracitoplasmtica de citoquinas en LT CD4+ de porcinos vacunados contra la Peste Porcina. Se representa CD4FITC en eje Y y las respectivas citoquinas en el eje X. Los grficos A representan clulas no estimuladas (control de produccin basal de citoquinas); los grficos C corresponden a clulas estimuladas in vitro con una solucin viral inactivada a) Qu informacin puede extraer de los grficos presentados? b) En los grficos de il-2 e IFN, qu tipo celular cree que est representando la nube de puntos CD4-? c) Qu conclusiones piensa que el equipo de investigacin pudo haber extrado analizando el perfil de citoquinas encontradas?

141

GUIA DE LECTURA PARA UN TRABAJO CIENTFICO MODELO Texto: Fernndez B., Jolly A., Colavecchia S., Fernndez E., Mundo S.L. 2011. Efecto de la infeccin de Mycobacterium avium paratuberculosis en la produccin de anticuerpos bovinos. In Vet 13(1):9-17. Esta gua fue pensada para acercarlos a la lectura del trabajo mencionado, que es un artculo publicado recientemente en la Revista InVet, editada semestralmente por nuestra Facultad y en la que se nuclean publicaciones cientficas de diversas reas de la veterinaria. Los docentes de Inmunologa Bsica estamos convencidos de que adquirir competencias de lectura e interpretacin de trabajos cientficos es fundamental para ustedes, dadas las exigencias de actualizacin que la actividad profesional veterinaria supone en cualquiera de sus mbitos. Adems, en la medida que se familiaricen con este tipo de textos, podrn difundir en un futuro sus propias experiencias y los nuevos conocimientos que generen, a travs de la escritura de nuevas publicaciones cientficas. Particularmente en esta clase, la lectura del trabajo elegido les permitir abordar algunas de las principales tcnicas de Interaccin Primaria antgeno-anticuerpo desde una perspectiva diferente a la planteada en la Gua de lectura y trabajos prcticos de nuestra materia. Podrn reflexionar sobre la aplicacin de la tcnica de ELISA a partir de este caso real, evaluar la metodologa empleada, y analizar la manera en que los autores del trabajo muestran los resultados que obtuvieron. Antes de centrarnos en la lectura del trabajo, analicemos rpidamente cmo es la estructura general de este tipo de texto. Podran mencionar cmo se denominan las partes principales que aparecen con una secuencia dada en l? Primero est el Ttulo, seguido de los nombres de los autores y la/s institucin/es a la/s que pertenecen, luego aparecen el Resumen (en espaol y en ingls), una Introduccin, los Materiales y Mtodos empleados, los Resultados y la Discusin de los mismos, las Conclusiones y por ltimo, los Agradecimientos y la Bibliografa citada. Ahora, una a una irn leyendo las partes del texto y podremos detenernos para analizar detalles de su estructura, comunes a todos los trabajos cientficos, y del contenido particular que en este trabajo se presenta: El Ttulo suele guardar relacin con la problemtica investigada, los objetivos y la pregunta de investigacin. En este caso, el ttulo nos sita en la enfermedad en estudio (la paratuberculosis, producida por Mycobacterium avium subp. paratuberculosis - Map -) y en la especie animal en la que se abord su estudio: bovinos. Tambin nos dice que el trabajo se va a centrar en el anlisis de la respuesta inmune de anticuerpos generada en animales que padecen esta infeccin. Debajo del ttulo, figuran los Autores del trabajo y su Filiacin. Como pueden ver, en este caso son investigadores de dos Ctedras de nuestra Facultad. Otra informacin de los autores que puede incluirse es un mail de correspondencia (aqu aparece en el pie de pgina), que permite a los lectores la posibilidad de contactarse con los autores del trabajo. El Resumen es una parte muy importante de una publicacin cientfica. En l se presenta de manera sinttica los objetivos, mtodos, resultados, y conclusiones del trabajo. Generalmente, cuando uno realiza una bsqueda bibliogrfica en bases de datos internacionales en la web, el resumen es a lo que primero se accede para leer. En funcin de la informacin que los resmenes nos proveen es que decidimos qu trabajos de todos los que se enlistan como resultado de nuestra bsqueda sobre un tema en particular son los que nos interesara leer en su versin completa. A veces, como es aqu el caso, el resumen aparece tanto en el idioma oficial de la revista como en ingls, a los fines de incrementar la difusin del mismo dentro de la comunidad que podra tener inters en leerlo. Si se fijan, al finalizar el resumen aparece una serie de Palabras clave. stas tienen que ver con la esencia de la investigacin y ayudan a la localizacin del artculo en los buscadores de bibliografa, funcionando estas palabras clave como motores de bsqueda.

142

 Ahora s nos sumergimos en el cuerpo del texto, a travs de su Introduccin. En este apartado, en general se presenta la problemtica abordada y su contextualizacin, los antecedentes, objetivos del estudio, la pregunta de investigacin, la/s hiptesis y la justificacin. En este trabajo, la enfermedad estudiada es la paratuberculosis. En relacin a ella, vamos a referirnos a algunos conceptos que aqu aparecen implcitos pero que sera bueno tener presentes: La enfermedad en cuestin es causada por una micobacteria. Si recuerdan estas bacterias son de vida intracelular, y por lo tanto el sistema inmune tendr que combatirlas valindose principalmente de sus mecanismos celulares (perfil Th1, con produccin de IFN, activacin de macrfagos, citotoxicidad mediada por linfocitos CD8+ y clulas NK). En el tercer prrafo, los autores nos cuentan que parece existir una relacin entre el estadio de la infeccin y el tipo de respuesta inmune predominante en el animal. Si necesitan revisar los conceptos generales relacionados con los perfiles de la respuesta inmune, pueden remitirse a: FAINBOIM, L. y GEFFNER, J. 2005. Introduccin a la inmunologa humana. 5ta ed., Ed. Mdica Panamericana. Cap. 9 y 10. Como cierre de la Introduccin, se menciona el objetivo que persiguieron al realizar esta investigacin: la evaluacin y caracterizacin de la presencia de anticuerpos, tanto a nivel sistmico (en suero) como local (en materia fecal) en bovinos en distintos estadios de paratuberculosis. Seguramente habrn notado la aparicin de nmeros, en formato de superndice al finalizar algunas de las frases. Estos nmeros nos llevan al apartado final: Bibliografa, e identifican los trabajos previos en que se basa aquello que los autores estn afirmando en esa frase. Por ejemplo, en el primer prrafo, la frase que dice La enfermedad causa notables prdidas econmicas en la produccin agropecuaria.() nos conduce a las citas 19 y 20. Si leen los ttulos de esos dos trabajos en la Bibliografa, podrn darse cuenta de que en ellos se abord el estudio del impacto econmico de esta enfermedad y es seguramente en base a los resultados que esos autores encontraron que los autores de este trabajo enuncian esa afirmacin. A continuacin se presentan los Materiales y Mtodos, es decir el diseo experimental general, el origen de las muestras estudiadas, los procedimientos metodolgicos y las tcnicas empleadas. Esta seccin suele estar a su vez subdividida en segmentos, cada uno con un subttulo, que hacen referencia a distintas metodologas aplicadas y que pretenden organizar la informacin de manera ms clara para el lector. Debera contener toda la informacin necesaria como para que otro investigador pudiera, a partir de esos datos, reproducir los experimentos planteados en el trabajo. Si vemos cmo est organizada en este caso, el primer apartado que contiene es Animales y muestras, donde nos cuentan la cantidad de animales estudiados, cul fue el criterio de clasificacin aplicado para considerarlos sanos o infectados; y a su vez, dentro de esta categora, cmo se los subdividi en asintomticos, sintomticos y sintomticos en fase terminal. Si leyeron este apartado con atencin, habrn notado que se hace referencia al estado de los bovinos con respecto a otra enfermedad que no es la paratuberculosis: la tuberculosis. La aclaracin de que los animales controles provienen de campos libres de tuberculosis surge de que al ser ambas enfermedades producidas por micobacterias, la respuesta inmune inducida por la infeccin con una de ellas podra generar interferencias o reacciones cruzadas con el diagnstico inmunolgico de la otra. En el apartado siguiente Deteccin de anticuerpos especficos en sueros frente al PPA por ELISA, los autores detallan el protocolo empleado, especificando los reactivos utilizados y los laboratorios que los produjeron. Ustedes cuentan con una descripcin general de esta tcnica en la Gua de Lectura y Trabajos Prcticos de la materia (pginas 53 a 62). Si el antgeno usado para realizar este ELISA no les resulta familiar, vuelvan al ltimo prrafo del apartado anterior del trabajo, donde se explica qu es. Aqu tambin se explicita cul fue el criterio para considerar positivo/sospechoso/negativo un resultado obtenido, explicando de qu manera se estableci el valor de corte.

143

En Aislamiento e identificacin de Map a partir de materia fecal nos detallan cmo realizaron este procedimiento. Hay que tener en cuenta que si bien el objetivo de este trabajo es focalizar en la respuesta inmune humoral inducida durante esta infeccin, la confirmacin del diagnstico de paratuberculosis en los animales no puede realizarse slo mediante el estudio de la respuesta inmune especfica. Es por esto que para clasificar certeramente a un bovino como infectado se necesita encontrar al microorganismo en muestras tomadas de l, ya sea logrando su crecimiento en un medio de cultivo o identificando la presencia de un fragmento de ADN exclusivo de esta bacteria (IS900) mediante la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), que utilizando secuencias de cebadores (primers) especficos para dicho segmento, puede amplificarlo hasta lograr concentraciones detectables a partir de una muestra tomada del animal. Los apartados que siguen, Produccin de IgG3 bovina recombinante y Caracterizacin de los anti-isotipos de IgG, los vamos a pasar por alto en esta ocasin. Bsicamente, hacen referencia al origen de los reactivos empleados para la identificacin de los diferentes isotipos de inmunoglobulinas bovinas estudiadas: IgM, IgG total, IgG1, IgG2 e IgG3. Ms adelante en la cursada, volveremos sobre este trabajo para poder profundizar en estos puntos (produccin de antgenos con vectores de expresin, planes de inmunizacin, produccin de sueros hiperinmunes) que hoy exceden el lmite de los conocimientos que hasta ahora poseen. En Isotipos de inmunoglobulinas por ELISA nos cuentan qu determinaciones hicieron: por un lado evaluaron los niveles de anticuerpos totales en suero y materia fecal; y por otro los niveles de anticuerpos, totales o por isotipos, especficos frente a paratuberculosis. Pero de qu manera se vinculan los niveles totales de anticuerpos con esta enfermedad? Otros autores describieron previamente que en los estadios terminales de la paratuberculosis se produce un cuadro de hipoproteinemia (niveles circulantes de protenas totales por debajo del rango normal para la especie), derivado de la malabsorcin que las lesiones granulomatosas producidas por esta enfermedad generan en la pared intestinal, limitando la asimilacin de nutrientes de la dieta. Entonces, en este caso, los autores quisieron evaluar si en aquellos bovinos con hipoproteinemia (en Animales y Muestras de Materiales y Mtodos explican cmo los detectan) los niveles totales de anticuerpos, que tambin son protenas circulantes, estaban o no afectados. El ltimo apartado de Materiales y Mtodos hace referencia al Anlisis Estadstico, indicando qu programa se emple y qu estadsticos se aplicaron para analizar los diferentes resultados obtenidos. Ahora s aparecen los Resultados. En esta seccin se muestran, en forma verbal y grfica, los hallazgos resultantes de la investigacin y su interpretacin ms directa y el anlisis estadstico de los mismos. Teniendo en cuenta la aclaracin que realizamos sobre la metodologa, el segundo apartado titulado Produccin de IgG3r y caracterizacin de los anti-isotipos de IgG bovinos como as tambin la Figura 1, no sern analizados en esta ocasin. Focalcense en la lectura de los otros apartados y en el anlisis de la informacin contenida en las tablas y en Figura 2. Se describen los resultados obtenidos en relacin a la caracterizacin de la respuesta de anticuerpos en los bovinos en diferentes estadios de la infeccin estudiados. En la Figura 2, los autores nos demuestran, a travs de un grfico de barras, los valores de IgM e IgG totales y Map-especficos obtenidos por ELISA a partir del suero y la materia fecal de los animales evaluados. Mientras que en la Tabla 2, de doble entrada, nos encontramos con la concentracin relativa de los diferentes isotipos de IgGespecfica a Map encontrados en cada uno de los grupos de bovinos evaluados. Bajo el ttulo de Discusin se suele presentar la interpretacin ms extensiva de los resultados y la reflexin sobre el logro de objetivos, si se respondi o no a la pregunta de investigacin, si se refut o no la hiptesis. En general, proyecta los alcances del nuevo conocimiento generado y puede proponer nuevas lneas de investigacin. En este trabajo vemos cmo se comparan algunos resultados obtenidos con otros ya publicados por otros autores. Por ejemplo, en la primer frase Nuestros resultados muestran (), en contraposicin al estudio realizado en pequeos rumiantes3.. Tambin en esta seccin

144

se suele incluir las hiptesis que los autores elaboran para explicar aquellos resultados anmalos o no esperados, si es que los hubiera. Este es el caso en el prrafo que dice La IgM es una inmunolgobulina pentamrica que posee alta avidez pero poca afinidad. Por lo tanto, los altos niveles de IgM obtenidos en los bovinos controles podran deberse a reacciones cruzadas con otras micobacterias25. Puesto que no es esperado que animales que no estn infectados (ni que tampoco han tenido contacto vacunal) con el microorganismo en cuestin posean altos niveles de anticuerpos especficos, los autores enuncian esta hiptesis que explicara el hallazgo. Los prrafos que comienzan por Son pocos los trabajos () y La IgG2 e IgG3 () hacen referencia a cuestiones relacionadas con los apartados que hemos omitido en este lectura, a los fines de no generar confusiones. El ltimo prrafo de las discusin menciona el hallazgo que los autores del trabajo consideran ms destacable: () el predominio de la IgG3 especfica en los animales asintomticos(); que, recordemos, era la categora de animales ms difcil de diagnosticar en esta enfermedad. Este hallazgo los lleva a plantear como proyeccin de su lnea de investigacin el ()desarrollar un ELISA diagnstico utilizando PPA como antgeno y antisuero frente a IgG3 bovina recombinante() Esta nueva prueba podra mejorar la identificacin de los bovinos con infeccin subclnica y en un futuro poder ser incorporada en los planes de control de paratuberculosis en los rodeos. Como reflexin final, pensemos cmo de esta manera una investigacin bsica habra generado un nuevo conocimiento que podra transferirse a la prctica profesional veterinaria, aportando una herramienta que mejorara el diagnstico de esta enfermedad en los rodeos bovinos. Las Conclusiones pretenden resumir en pocas palabras los resultados ms relevantes encontrados. La Bibliografa es el listado de fuentes documentales utilizadas para el sustento de la investigacin y que aparecen referenciadas en el cuerpo del artculo. Cada revista, en sus normas editoriales, especifica los lineamientos para la presentacin de las referencias. No es la idea leerlas sino, dirigirse puntualmente a alguna de ellas si al aparecer citada en el texto nos interesa profundizar ms en ese tema o tener acceso a la fuente original de informacin. Finalmente, llegamos a la seccin de Agradecimientos, la cual suele ser opcional. Aqu los autores se refieren a quienes les han aportado ayuda: tcnica, para realizar alguna de las metodologa (en nuestro trabajo, seran los agradecimientos a L. Gilardoni y L. Goldman); material, por ejemplo cuando algn otro investigador facilita un reactivo o alguna muestra que fue obtenida en otro centro de investigacin); econmica, mencionando a las instituciones que, a travs del otorgamiento de subsidios de investigacin, han financiado la investigacin (en nuestro texto, sera la referencia a los subsidios de UBA-SeCyT). Tambin puede incluirse un agradecimiento a alguna persona que haya participado en la lectura y revisin crtica del manuscrito previamente a su remisin a la revista (en este caso, el agradecimiento al Dr. Fernando Paolicchi).

145

InVet. 2011, 13(1): 9-17 ISSN 1514-6634 (impreso) ISSN 1668-3498 (en lnea)

ANTICUERPOS BOVINOS EN PARATUBERCULOSIS ARTCULO DE INVESTIGACIN

Efecto de la infeccin de Mycobacterium avium paratuberculosis en la produccin de anticuerpos bovinos

Effect of the infection with Mycobacterium avium paratuberculosis on the production of bovine antibodies
Fernndez, B. 1.; Jolly, A.1; Colavecchia, S.1; Fernndez, E.2; Mundo S.L.1
1

Ctedra de Inmunologa, 2 Ctedra de Clnica de Rumiantes, Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad de Buenos Aires. Chorroarn 280 (1427) Buenos Aires.

RESUMEN
La paratuberculosis es una enfermedad granulomatosa crnica intestinal, causada por Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis, que afecta a los rumiantes. El objetivo del trabajo fue caracterizar la respuesta inmune humoral sistmica y local de bovinos infectados. Se estudiaron once bovinos, seis infectados (asintomticos, sintomticos y terminales) y cinco controles. Se determinaron los niveles de inmunoglobulinas totales y se cuanticaron los subisotipos de IgG especcos a paratuberculosis en suero y materia fecal por ELISA. Los niveles de inmunoglobulinas totales en sueros fueron similares. Sin embargo, se evidenciaron aumentos signicativos de IgM e IgG totales, e IgG-especca en materia fecal de los sintomticos. La IgG1 especca fue predominante en sueros de bovinos sintomticos y terminales. La IgG3 fue la inmunoglobulina especca de mayor cantidad detectada tanto en suero como en materia fecal de los asintomticos. Nuestros resultados muestran que la infeccin no afecta la produccin de inmunoglobulinas totales. El aumento de inmunoglobulinas en materia fecal podra relacionarse con la lesin de la mucosa intestinal. El predominio de IgG1 se corresponde con el cambio de perl a Th2 en el periodo sintomtico. El hallazgo de incrementos de IgG3 especca en asintomticos sugiere el estudio de este isotipo para poder mejorar su identicacin. Palabras clave: (paratuberculosis), (bovino), (anticuerpos).

Correspondencia e-mail: Silvia Mundo smundo@fvet.uba.ar Recibido: 26-05-2011 Aceptado: 20-07-2011 * Premio Estmulo a la Investigacin Cientca 2010 en la categora graduados de la Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Buenos Aires.

InVet Vol. 13 N 1, 2011

FERNNDEZ, B.; JOLLY, A.; COLAVECCHIA, S.; FERNNDEZ, E.; MUNDO S.L.

SUMMARY
Paratuberculosis, caused by Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis, is a chronic granulomatous enteric disease affecting ruminants. Our aim was to characterize systemic and local humoral responses of infected cows. Eleven cows were studied: six naturally infected (asymptomatic, symptomatic and terminal) and ve control. Total IgM and IgG and paratuberculosis-specic IgG subisotypes, from feces and serum, were assessed by ELISA. No differences were detected on the levels of total immunoglobulins in sera. Symptomatic cows showed signicative higher level of totals IgM and IgG, and specic-IgG in feces. IgG1 was the highest from sera of symptomatic and terminal. IgG3 was the highest specic immunoglobulin in sera and feces of asymptomatic. Our results showed total immunoglobulins levels in serum are not modied by the infection. The increment of immunoglobulins in feces could be caused by the lesions of intestinal mucosa. The predominance of IgG1 in symptomatic period is related to the change toward Th2 prole. The use of anti-IgG3 could improve the identication of asymptomatic cows. Key words: (paratuberculosis), (bovine), (antibodies).

INTRODUCCIN
La paratuberculosis es una patologa crnica intestinal que afecta a los rumiantes y es causada por el Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map)10. La enfermedad causa notables prdidas econmicas en la produccin agropecuaria19; 20. La infeccin se produce por ingestin de calostro, leche o materia fecal de animales eliminadores de bacterias. Los animales infectados atraviesan un largo estadio subclnico durante el cual eliminan pequeas cantidades de Map por leche y heces en forma intermitente. Su identicacin es dificultosa, se utilizan principalmente kits que evalan la produccin de intefern gamma por linfocitos en cultivo22. En algunos bovinos, por causas todava inciertas, la forma subclnica avanza hacia el perodo clnico, que se caracteriza por la aparicin de diarrea profusa, mala absorcin de nutrientes y prdidas de protenas. En ese momento hay un cambio de perl de la respuesta inmune de Th1 (celular) a Th2 (humoral)1;6;7, lo que conlleva a un aumento de inmunoglobulinas (Ig) circulantes facilitando el diagnstico serolgico de la enfermedad. En la especie bovina, al perfil Th1 se lo relaciona con las IgM e IgG2, mientras que al Th2 se lo asocia con IgG1 e IgA8. Sin

embargo, el papel funcional de los isotipos de anticuerpos (Ac) an no ha sido totalmente dilucidado. Se describe al isotipo IgG1 como crtico para bloquear bacterias y toxinas en el sitio de infeccin, y al IgG2 se lo relaciona principalmente con el incremento de la fagocitosis mediada por neutrlos frente a las infecciones bacterianas agudas. El papel de los Ac en la proteccin frente a micobacterias ha sido reevaluado, demostrando que los Ac juegan un rol importante en la respuesta inmune frente a micobacterias2;11;24. Nuestro grupo ha demostrado un incremento en la asociacin del Map con la clula blanco de la infeccin (el macrfago bovino) luego de la opsonizacin con IgG1 especca frente a la bacteria entera o a la protena p34 recombinante. Adems, se detect un incremento en la activacin celular y la formacin del granuloma17. En este contexto, se plantean como objetivos del presente trabajo la evaluacin de la respuesta inmune humoral local y sistmica de bovinos en distintos estadios de paratuberculosis.

MATERIALES Y MTODOS

Animales y muestras
Se estudiaron 11 bovinos adultos: 6 provenientes de rodeos infectados con paratuberculosis y 5 bovinos controles (C)

10

InVet Vol. 13 N 1, 2011

ANTICUERPOS BOVINOS EN PARATUBERCULOSIS

provenientes de campos libres de paratuberculosis y tuberculosis de la provincia de Buenos Aires. De cada bovino se obtuvo 10 ml de sangre sin anticoagulante y materia fecal (MF). El suero se fraccion y congel a -20C hasta el momento de utilizacin. Las MFs fueron fraccionadas para realizar el cultivo y los ELISAs (se homogeniz 10 gr de MF y 10 ml de PBS Tween 20 al 0,05%, se centrifugaron varias veces a n de obtener las muestras lo ms lmpida posible15. Luego fueron fraccionadas y congeladas a -20C hasta el momento de uso). Los bovinos fueron clasificados segn: rodeo de origen; presencia de signos clsicos de la enfermedad; niveles de protenas sricas (evaluados por refractometra); deteccin de anticuerpos especcos en sueros frente al Antgeno Protoplasmtico de Map (PPA); aislamiento e identicacin de Map a partir de materia fecal.

Se observaron todos los cultivos una vez por semana durante 18 semanas. En aquellos casos que crecieron colonias de bacterias con las caractersticas esperadas, se identic el IS900 por PCR9. Para ello se utilizaron las secuencias de primers diseadas por Mundo18 y Collins5. Map ATCC 19698 y M. phlei ATCC 11758 fueron utilizadas como cepas controles.

Produccin de IgG3 bovina recombinante

Para obtener la IgG3 bovina recombinante (IgG3r) se cultivaron21 las E. coli BL21 pLysS transformadas con un plsmido obtenido en nuestro laboratorio17. Se realiz la puricacin parcial de las protenas a travs de una columna de Nquel (His*Bind Resin, Novagen, Darmstadt, Germany). Posteriormente se realiz la dilisis de las protenas puricadas. Las bacterias E. coli BL21 (BL21-pRSET A) transformadas con el plsmido pRSET A sin inserto fueron procesadas y denominadas como extracto de E. coli (EEc).

Deteccin de anticuerpos especcos en sueros frente al PPA por ELISA

Se utilizaron placas de 96 hoyos sensibilizadas con 2g/hoyo PPA (Allied Monitor Inc., Missouri, USA). Para evitar reacciones cruzadas con otras micobacterias, se pre-adsorbieron los sueros con Mycobacterium phlei (M. phlei) inactivada por calor (crecida en nuestro laboratorio). El sistema de revelado empleado fue un anticuerpo anti-IgG bovina en conejo conjugado a peroxidasa (Cappel, Fountain, USA) (anti-IgG-HRP). Para interpretar los valores de densidad ptica (DO) obtenidos se calcul el valor de corte (VC) sumando al promedio de los sueros controles negativos, dos desvos estndares. A partir de los resultados se clasic cada suero como: negativo (menor al VC), sospechoso (con densidades pticas entre el VC y 1,5 el VC) y positivo (mayor a 1,5 el VC).

Caracterizacin de los anti-isotipos de IgG.

Para el estudio de IgG1 e IgG2 se utilizaron reactivos comerciales: anti-IgG1 bovina en ovino conjugado a peroxidasa (Bethyl inc., Montgomery, USA), anti-IgG2 bovina monoclonal en ratn (Sigma-Aldrich Co., USA.), anti-IgG de ratn conjugado a peroxidasa (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., Pennsylvania, USA). Mientras que para evaluar la IgG3 se utiliz el suero de conejo anti-IgG3r obtenido previamente en nuestro laboratorio17, y el anti-IgG de conejo en cabra conjugado a peroxidasa (Kirkegaard & Perry Laboratorios, inc. Maryland, USA). El suero de conejo anti-IgG3r fue preadsorbido con BL21-pRSET A en medio lquido (a una densidad ptica660nm de 2) y EEc en medio slido (en placas de 96 hoyos) con el n de disminuir la cantidad de Ac anti-E.coli. La determinacin de las reacciones cruzadas se realiz por Inmunoblot y ELISA, utilizando los patrones comerciales IgG1 e IgG2 (Bethyl

Aislamiento e identicacin de Map a partir de materia fecal

Se cultiv la MF de los bovinos problema en medio Herrold con huevo, piruvato y micobactina (Allied Monitor Inc., Missouri, USA), a n de conrmar el diagnstico12;16.

InVet Vol. 13 N 1, 2011

11

FERNNDEZ, B.; JOLLY, A.; COLAVECCHIA, S.; FERNNDEZ, E.; MUNDO S.L.

inc., Montgomery, USA), IgG3r, suero de un bovino normal y EEc.

Produccin de IgG3r y caracterizacin de los anti-isotipos de IgG bovinos

La puricacin permiti obtener la IgG3r acompaada de una pequea cantidad de protenas contaminantes provenientes de la E. coli (Figura 1A). La pre-adsorcin del suero de conejo anti-IgG3r disminuy notablemente la cantidad de Ac anti-E. coli (Figura 1B). La evaluacin del reconocimiento de E. coli por el anti-IgG3r mediante ELISA demostr que, al pre-adsorber el suero, la DO obtenida pas de 1.01 (suero sin pre-adsorber) a 0.16 (suero pre-absorbido). La lectura de los Inmunoblots revel la existencia de reacciones cruzadas entre IgG3r con IgG1 e IgG2, ya que el anti-IgG3r preadsorbido reconoce a las tres subclases de IgG bovina (Figura 1B). Por otro lado, los antiisotipos comerciales (anti-IgG1 y anti-IgG2) slo reconocieron el patrn correspondiente (IgG1 e IgG2 respectivamente, resultados no mostrados). Por la tcnica de ELISA se observ que el reactivo comercial anti-IgG2 reconoce la IgG3r y el antisuero anti-IgG3r pre-adsorbido reconoce IgG2 (patrn comercial). Sin embargo, estas reacciones cruzadas son siempre con menor intensidad que al reactivo correspondiente (Figura 1C).

Isotipos de inmunoglobulinas por ELISA

Niveles de Igs totales. Se sensibilizaron hoyos con 50l de los sueros diluidos 1/6000 (IgM) y 1/20000 (IgG), y de las MFs sin diluir (IgM) y 1/100 (IgG). Se utilizaron los siguientes Ac conjugados a peroxidasa: anti-IgM bovina en ovino (Bethyl inc., Montgomery, USA) y anti-IgG-HRP. Niveles de Igs especcas a Map. Los hoyos fueron sensibilizados con una cepa de referencia de origen bovino totalmente caracterizada y secuenciada denominada K1014 (gentilmente cedida por el Dr. Raul Barletta). Esta cepa se cultiv en medio 7H9 lquido y fue inactivada por calor en nuestro laboratorio. Se utilizaron 50l de K10 a una DO660nm de 0,4.

Anlisis Estadstico
Para analizar los resultados se utiliz el software estadstico Stastistix 8.0 (Analitical Software, Tallahasee, USA). Para la comparacin de los niveles (DO) o cantidad de isotipos (g/ ml) entre grupos, se realiz el anlisis de varianza (ANOVA). Los niveles de signicacin fueron jados en un 5%. Se determin la homogeneidad de varianza y se realiz el Test de Dunet como anlisis post-ANOVA.

Isotipos de inmunoglobulinas totales y especcas a Map en sueros y MFs

Niveles de IgM. Los resultados se muestran en Figura 2. Se detect un leve aumento de IgMs totales y especcas a Map en los sueros de los infectados, especialmente en los IS en relacin al C, aunque el anlisis estadstico no permiti identicar estas diferencias como signicativas. En MF los niveles fueron bajos en relacin a los del suero. Sin embargo, el comportamiento fue similar al del suero. Se evidenci un incremento en los niveles de IgMs totales en IS e IT, siendo slo signicativa la diferencia entre los C y el IS. Niveles de IgG. Los resultados se muestran en la Figura 2. Se determinaron niveles similares de IgG totales en sueros de los distintos grupos.

RESULTADOS

Clasicacin de los grupos de animales infectados

El origen, sinologa y los resultados de niveles de protenas sricas, de reactividad frente a PPA en suero y el aislamiento e identicacin de Map en materia fecal se muestran en la Tabla 1. Estos resultados permitieron clasicar a este grupo en infectados asintomticos (IA), infectados sintomticos (IS) e infectados terminales (IT).

12

InVet Vol. 13 N 1, 2011

ANTICUERPOS BOVINOS EN PARATUBERCULOSIS

Tabla 1. Clasicacin de los grupos de bovinos. Grupo C (control), IA (infectado asintomtico), IS (infectado sintomtico), e IT (infectado terminal). protenas sricas (g/dl) 6,60,5 8,20,3 7,31,1 4,70,3 ELISA PPA Sospechoso + + Cultivo de MF + +

Grupo C (n=5) IA (n=2) IS (n=2) IT (n=2)

Campo de origen + + +

Signos + +

PCR + +

Figura 1. Produccin de IgG3r y caracterizacin de los anti-isotipos de IgG bovinos. A. Produccin de IgG3r. SDS-PAGE al 12%. Calle 1 IgG3r expresada por Clon 36; Calle 2 IgG3r puricada; Calle 3 E. coli BL21 transformadas con el plsmido pRSET A sin inserto (EEc). B. Caracterizacin del anti-IgG3r. Inmunoblot. Antgenos: Calle 1 IgG2; Calle 2 IgG1; Calle 3 suero bovino; Calle 4 EEc; Calle 5 IgG3r. Se utiliz el anti-IgG3r como anticuerpo primario. C. Reacciones cruzadas de los anti-isotipos de IgG. ELISA.

Se observ un incremento estadsticamente significativo en los niveles de IgG Map especca en los sueros de los bovinos IS e IT. Llamativamente, la cantidad de IgG especca a Map en sueros de IA fue menor que en los C. En MFs se evidenciaron comportamientos similares entre IgG totales y especcas. As mismo se detectaron altos niveles en IS e IT (IgG total y especca), siendo signicativa la diferencia entre el IS y el C.

Isotipos de IgG especficas a Map: Los resultados se muestran en Tabla 2. Niveles de IgG1: Se observaron incrementos signicativos en los niveles de IgG1 de sueros de IS e IT. Mientras que slo se detect IgG1 especca en MF del grupo sintomtico (14,8 3 g/ml).

InVet Vol. 13 N 1, 2011

13

FERNNDEZ, B.; JOLLY, A.; COLAVECCHIA, S.; FERNNDEZ, E.; MUNDO S.L.

Figura 2. Niveles de IgM e IgG totales y Map-especcas en sueros y materias fecales evaluados por ELISA. Tabla 2. Anlisis de isotipos de IgG en sueros y materias fecales, expresados en g/ml. Grupos Suero C IA IS IT *p<0.05 <0.08 2.070.1 679.21* 1160.33* IgG1 MF <0.08 <0.08 14.83* <0.08 Suero 3.40.7 10.22.8* 14.10.7* 10.43.7* IgG2 MF <0.08 <0.08 0.090.0 <0.08 Suero <0.08 18.58.8* 17.56.7* 19.514* IgG3 MF 9.20.8 10.30.8 18.913 <0.08 IgG1/IgG2 Suero <0.02 0.2 48 112

Niveles de IgG2. Se identic un aumento signicativo en los sueros de todos los animales infectados (IA, IS e IT). En MF slo pudo ser detectado en el grupo sintomtico y en baja concentracin (0,090.0 g/ml). Mientras que en el resto de los bovinos los niveles fueron menores a 0.08 g por ml correspondiente al lmite de deteccin de la tcnica. Niveles de IgG3. Se determin un incremento signicativo en los sueros de los bovinos infectados mostrando adems cantidades similares entre ellos. En MF, los infectados IA e IS mostraron niveles similares a los detectados en suero.

DISCUSIN
Nuestros resultados muestran que la infeccin con Map afecta los niveles de

protenas sricas sin modicar la produccin de anticuerpos totales en suero, en contraposicin al estudio realizado en pequeos rumiantes3. Por otro lado, se pudo observar un incremento de los niveles de IgM e IgG totales en materia fecal coincidiendo con el periodo clnico sintomtico (IS). La IgM es el isotipo indicador de respuesta activa, slo esperable en infecciones agudas o re-agudizaciones de infecciones crnicas. Este aumento de IgM en MF podra ser posible por la lesin intestinal y la re-estimulacin de nuevos clonos de linfocitos B como respuesta a la re-infeccin endgena caracterstica de ste periodo. La IgM es una inmunoglobulina pentamrica que posee alta avidez pero poca anidad. Por lo tanto, los altos niveles de IgM obtenidos en los bovinos controles podran deberse a reacciones cruzadas con otras micobacterias25.

14

InVet Vol. 13 N 1, 2011

ANTICUERPOS BOVINOS EN PARATUBERCULOSIS

Estos resultados coinciden con trabajos nuestros previos sobre bovinos infectados18. El aumento de IgG especca a Map en sueros de bovinos sintomticos y terminales est acompaado de incrementos de todas las sub-clases de IgG, principalmente de IgG1. Esta ltima parecera ser la Ig predominante en suero en estas etapas de la enfermedad tal como se han descripto previamente13;17. Los animales asintomticos presentaron niveles basales de IgGs Map -especficas en sueros. Esto podra deberse al tipo de respuesta inmune que predomina en esta etapa (celular). Los altos niveles de IgG1 especficos encontrados en materias fecales de bovinos sintomticos coinciden el predominio de este isotipo en la mucosa intestinal en bovinos normales4. La respuesta de tipo Th2 no es tan clara dado que la IgG2 especca en suero aument en todos los bovinos infectados y los niveles son similares. Sin embargo, al analizar la relacin IgG1/IgG2 se observa un incremento de dicha relacin, coincidente con el avance de la patologa (asintomticos, sintomticos, terminales). Estos resultados concuerdan con los expresados por Estes y Brown (2002) y Vanden Bush (2003). Son pocos los trabajos que estudiaron la IgG3 en bovinos infectados con Map17. Y a nuestro entender, este es el primer trabajo que describe a la IgG3 bovina en mucosas. Se encontr un aumento de este isotipo en sueros de todos los bovinos infectados. Los niveles fueron levemente superiores a los hallados para IgG2 y parecera tener una cintica similar a la de IgG2. La deteccin de IgG3 Map-especca en MF del grupo control podra deberse a reacciones cruzadas con micobacterias intestinales no patgenas. La IgG2 e IgG3 poseen cadenas pesadas similares; razn por la cual Butler4 las clasic como IgG2a e IgG2b. La IgG3r producida para este trabajo, incluye regiones compartidas, lo que justica las reacciones cruzadas encontradas. Sin embargo, se han encontrado diferencias entre los niveles de IgG2 e IgG3 en sueros

y MFs estudiados, mostrando el poder de discriminacin del reactivo (anti-IgG3r). Es de destacar el predominio de la IgG3 especca en los animales asintomticos. Dado que el diagnstico serolgico utilizado de rutina falla en la identicacin de este grupo, se sugiere la utilizacin de un reactivo especco anti-IgG3 para mejorar su deteccin. En este sentido, nuestro prximo objetivo ser desarrollar un ELISA diagnstico utilizando PPA como antgeno y antisuero frente a IgG3 bovina recombinante.

CONCLUSIONES
En el presente trabajo se determin que la infeccin con Map no modica los niveles de Igs totales sricas. Se corrobor el predominio de IgG1 en sueros de bovinos sintomticos y terminales. Se identic IgG1 especca en materia fecal de los sintomticos. Se detect IgG3 en sueros y materias fecales de animales asintomticos y sintomticos. Se demostr que los reactivos desarrollados en nuestro laboratorio permitieron ampliar el conocimiento de la respuesta inmune humoral especca a paratuberculosis.

AGRADECIMIENTOS
Se agradece a los veterinarios L. Gilardoni y L. Goldman por su apoyo tcnico, y al doctor F. Paolicchi por sus aportes tericos en el presente trabajo. Esta investigacin fue nanciada por los subsidios UBA-SeCyT v038 y v023.

BIBLIOGRAFA
1. Abbas B., Riemann H.P. IgG, IgM and IgA in the serum of cattle naturally infected with Mycobacterium paratuberculosis. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 1988; 11:171-175. 2. Abebe F. y Bjune G. The protective role of antibody responses during Mycobacterium tuberculosis infection.Clin. And Experimental Immunology. 2009; 157: 235-243. 3. Begara-McGorum I.; Wildblood L.A.; Clarke C.J. Early immunophatological events in experimental ovine

InVet Vol. 13 N 1, 2011

15

FERNNDEZ, B.; JOLLY, A.; COLAVECCHIA, S.; FERNNDEZ, E.; MUNDO S.L.

paratuberculosis. Vet. Immunol. Immunophatol.. 1998; 63: 265-287. 4. Butler J.E.; Kehrli M.E. Immunocytes and immunoglobulins in milk. In Mucosal Immnology 3rd edition Ogra PL;Mesteckyme J; Lamm ME; Strober W; McGhee JR; Bienenstock J,. Academic Press, New York. 2004. 5. Collins D.M., Stephens D.M., de Lisle G.W. Comparison of polymerase chain reaction tests and faecal culture for detecting Mycobacterium paratuberculosis in bovine faeces. Vet Microbiol. 1993; 36(3-4):289-99. 6. Coussens P.M., Verman N., Coussens M.A., Elftman M.D., McNulty A.M. Cytokine gene expression in peripheral blood mononuclear cells and tissues of cattle infected with Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis: evidence for an inherent proinflammatory gene expression pattern. Infect Immun. 2004; 72(3):1409-22. 7. Coussens P.M. Model for immune responses to Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in cattle. Infect Immun. 2004; 72(6):3089-96. 8. Estes D.M., Brown W.C. Type 1 and type 2 responses in regulation of Ig isotype expression in cattle. Vet. Inmunol. and Inmunop. 2002; 90: 1-10. 9. Green E., Tizard M., Moss M., et al. Sequence and characteristics of IS900, an insertion element identied in a human Crohn`s disease isolate of Mycobacterium paratuberculosis. Nucleid Acids Res. 1989; 17:9063-9073. 10. Harris N.B., Barletta R.G. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in veterinary medicine. Clin. Microbiol. Rev. 2001; 14 (3):489512. 11.Jolly A., Colavecchia S.B., Fernndez B., et al . Antibodies induced by lipoarabinomannan in bovines: characterization and effects on the interaction between Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and macrophages in vitro. Vet. Med. Int. 2011: 1-8. 12. Jorgensen JB. 1982. An improved medium for culture of Mycobacterium paratuberculosis from bovine faeces. Acta Vet Scand. 23(3):325-35.

13. Koets A.P., Rutten V.P., de Boer M., Bakker D., Valentin-Weigand P., van Eden W. Differential changes in heat shock protein-, lipoarabinomannan-, and puried protein derivative-specic immunoglobulin G1 and G2 isotype responses during bovine Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection. Infect. Immun. 2001; 69, 3:1492-1498. 14. Li L. Bannantine JP, Zhang Q, Amonsin A, May BJ, Alt D, Banerji N, Kanjilal S, Kapur V. The complete genome sequence of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 102(35):12344-9. 15. Marcoppido, G.A. Anticuerpos pasivos lactognicos: moduacin de la respuesta inmune y capacidad protectora frente a la diarrea por Rotavirus en un modelo ternero. Tesis Doctoral. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad de Buenos Aires. 2007. 16. Merkal R.S., Richards W.D. Inhibition of fungal growth in the cultural isolation of mycobacteria. Appl Microbiol. 1972; 24(2):205-7. 17. Mundo, S.L., Fontanals A.M., Garca M., et al. Bovine IgG1 antibodies against Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis protein p34-cx improve association of bacteria and macrophages. Vet Res. 2008; 39(1):6. 18. Mundo S.L. Tesis Doctoral. Facultad de Farmacia y Bioqumica. Universidad de Buenos Aires. 2005. 19. Paolicchi F. Paratuberculosis: aspectos clnicopatolgicos y su impacto en la produccin (Parte 1). XXXII Jornadas Uruguayas de Buiatra, 2004, p. 127, Paysand, Uruguay. 20. Passucci JA y col. Anlisis econmico del saneamiento de paratuberculosis en un rodeo de cra bovina. Revista Argentina de Produccin Animal. 2007; 27(supl. 1): 337-8. 21. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva YorK, USA. 1989. 22. Stabel J.R. Cytokine secretion by peripheral blood mononuclear cells from cows infected with Mycobacterium paratuberculosis. Am. J. Vet. Res. 2000; 61:754760.

16

InVet Vol. 13 N 1, 2011

ANTICUERPOS BOVINOS EN PARATUBERCULOSIS

23. Vanden Bush, Rosenbusch R.F. Characterization of the immune response to Mycoplasma bovis lung infection. Veterinary Immunology and Immunopathology. 2003: 94: 2333. 24. Williams A., Reljic R., Naylor I., et al . Passive protection with immunoglobulin A antibodies against tuberculous early infection of the lungs. Immunology. 2004; 111:328333.

25. Yokomizo Y., Merkal R.S., Lyle P.A., Enzymelinked immunosorbent assay for detection of bovine immunoglobulin G1 antibody to a protoplasmic antigen of Mycobacterium paratuberculosis, Am. J. Vet. Res. 1983; 44:22052207.

InVet Vol. 13 N 1, 2011

17