REPLICACION DEL DNA

La informacin gentica se transfiere de padres a hijos mediante una replicacin (R) exacta de las molculas de DNA. Toda la informacin gentica contenida en una molcula de cido nucleico reside en su secuencia de bases. Por tanto, el papel principal de cualquier forma de R es duplicar la secuencia de bases de la molcula progenitora. Tanto si la clula tiene un nico cromosoma (procariota) como si tiene muchos (eucariota), la totalidad del genoma debe replicarse cada vez que la clula se divide. La R del genoma se lleva a cabo en forma de unidades discretas, cada una de las cuales recibe el nombre de replicn. Cada replicn se divide una sola vez durante el ciclo celular. Posee un origen, donde se inicia la R y un trmino, donde se para. Adems, posee todos los elementos necesarios para el control de la R. Una vez iniciada la R, sigue hasta que el replicn completo se ha duplicado. El cromosoma bacteriano constituye un nico replicn, as como cada plsmido e incluso cada virus. En estos casos la iniciacin en un nico origen promueve la R de todo el genoma. El cromosoma eucaritico contiene un gran nmero de replicones, cada uno de los cuales se replica una vez durante el ciclo celular, con lo cual, sus mecanismos de regulacin deben ser ms complejos (Figura 1). LA REPLICACION DEL DNA ES SEMICONSERVADORA La R del DNA implica que a partir de una molcula de DNA progenitora se obtienen dos molculas hijas idnticas a la original. Cmo se distribuyen las hebras de la molcula original entre las molculas hijas? Si las dos hebras de la molcula progenitora permaneciesen apareadas tras la R y las dos hebras recin sintetizadas se apareasen para formar la molcula hija, la R sera conservadora. Si, por el contrario, las hebras de DNA de la molcula progenitora se mezclan con hebras nuevas para formar las molculas hijas, la R sera semiconservadora. La respuesta a esta cuestin la dieron Matthew Meselson y Franklin Stahl en 1957. Cultivaron clulas de Escherichia coli en un medio con 15N, de manera que todo el DNA contena el istopo pesado. Este DNA con 15N resultaba ser un 1% ms denso que el DNA normal, que contiene 14N. As, si se centrifugan en un gradiente de densidad en cloruro de cesio (CsCl) formarn dos bandas diferentes (Figura 2). Las clulas que han crecido durante varias generaciones en presencia de 15N tienen prcticamente todo su DNA en la forma "pesada". A continuacin se transfieren estas clulas a un medio que contiene 14N y se les deja replicar una vez. Si la R fuese conservadora, el 50% del DNA extrado de estas clulas sera de la forma "pesada", y el otro 50% sera de la forma normal, de manera que el DNA extrado de estas clulas formara dos bandas en un gradiente de CsCl. En una R semiconservadora , cada molcula de DNA tendra una hebra normal y otra del tipo "pesado", de forma que en el gradiente de CsCl formara una nica banda en una posicin intermedia. Esto es exactamente lo que ocurre (Figuras 2

Replicacin 1

y 3). Si adems, desnaturalizamos este DNA y se centrifuga, las hebras por separado originan dos bandas distintas, una en la posicin que corresponde al 14N y otra en la posicin del 15N, lo que refuerza an ms la hiptesis semiconservadora (Figura 3). Otro sencillo experimento confirma esta hiptesis. Si se espera a la siguiente generacin de clulas crecidas con 14N y se centrifuga el DNA en el gradiente de CsCl se observan dos bandas, una correspondiente al DNA "ligero" (con 14N) y otra correspondiente al DNA hbrido (una hebra 15N y otra 14N) (Figuras 2 y 3). Por lo tanto, puede concluirse que la R del DNA es semiconservadora: cada una de las hebras progenitoras acta como molde para la sntesis de una nueva hebra, que a medida que se va sintetizando se une mediante puentes de hidrgeno con su progenitora. INICIACION DE LA REPLICACION Todas las molculas de DNA inician su ciclo de replicacin en una secuencia de bases determinada llamada origen de replicacin. La iniciacin se produce en el interior de la hlice, y al microscopio electrnico (ME), el aspecto que presenta la regin de R es la de un ojal o burbuja de replicacin en el interior de la fraccin del DNA que no se ha replicado (Figura 4). Una molcula circular de DNA que se est replicando recibe el nombre de estructura (theta), por su similitud con esa letra griega (Figura 5). En una molcula de DNA que se est replicando, la regin no replicada consiste en la doble hebra progenitora, que se abre en la regin replicada, donde se han formado las dos dobles hlices correspondientes a cada una de las molculas hijas (Figura 6). Esta disposicin de la estructura del DNA recibe el nombre de horquilla de replicacin (HR). La R puede ser unidirecional o bidireccional. En la unidireccional, una HR parte del origen y avanza a lo largo del DNA en un solo sentido. En la bidireccional, se forman dos HR que avanzan en sentidos opuestos. A simple vista no se puede saber si la R es uni o bidireccional. Para averiguarlo, se exponen las clulas que se estn replicando a concentraciones crecientes de [3H]-timidina, de forma que la base marcada radioactivamente se va incorporando al DNA recin sintetizado. El marcaje que se obtiene es ms o menos intenso en funcin de la concentracin de la base marcada. En la replicacin unidireccional, se observa un marcaje que va creciendo en intensidad a lo largo de la hebra que se est sintetizando de nuevo. En la R bidireccional, el marcaje va aumentando en intensidad en las dos direcciones, observndose un patrn simtrico en la intensidad del marcaje (Figura 7). Estos experimentos han demostrado que aunque en algunos casos la R puede ser unidireccional, lo normal es que sea bidireccional.

LAS ENZIMAS DE LA REPLICACION EN PROCARIOTAS

Replicacin 2

DNA-POLIMERASAS La creencia general era que el DNA no poda sintetizarse en ausencia de clulas. La bsqueda de un enzima que sintetizase el DNA la inici en 1955 Arthur Kornberg. Como consecuencia de este trabajo se aisl y caracteriz un enzima de E. coli capaz de sintetizar DNA en un sistema libre de clulas. Este enzima se llam DNA-polimerasa I (pol I), y consiste en un nico polipptido de peso molecular 103.000 que cataliza la polimerizacin de desoxinuclesidos trifosfato en DNA (Figura 8). Estos precursores son molculas ricas en energa (cada molcula posee una energa similar a la del ATP) de manera que proporcionan la energa necesaria para catalizar un proceso desfavorable en trminos de la termodinmica. La actividad polimerasa se desarrolla siempre en la direccin 5'3'. El proceso consiste en un ataque nucleoflico del grupo hidroxilo en posicin 3' de la hebra creciente sobre el fosfato en posicin 5' del desoxinuclesido trifosfato que se va a incorporar. En la reaccin se libera pirofosfato: d(NMP)n + dNTP d(NMP)n+1 + PPi

Pol I presenta dos requerimientos comunes a todas las DNA polimerasas (Figura 8). En primer lugar, necesita de un molde que gue la sntesis de la nueva hebra segn el principio de la complementariedad entre las bases. En segundo lugar, hace falta un cebador (primer). Un cebador es un pequeo segmento de DNA o de RNA de la nueva hebra que es complementario al molde y que tiene un grupo OH en posicin 3' al cual se le pueden aadir nuevos nucletidos. Este extremo 3' se llama extremo del cebador, y debe estar correctamente apareado para que comience la sntesis por pol I. Esto quiere decir que una parte de la nueva hebra debe estar ya colocada para que empiece a funcionar pol I. Ninguna DNA polimerasa puede iniciar la sntesis de una nueva hebra a partir de cero. Sin embargo, las RNA-polimerasas s pueden, y por esta razn los cebadores son casi siempre oligonucletidos de RNA. Pol I tiene otras propiedades. Presenta actividad exonucleasa 3'5' que le permite asegurar que cada nuevo nucletido aadido est correctamente apareado. Cuando pol I se encuentra con un error en el apareamiento de las bases se detiene su actividad polimerasa y se estimula se actividad exonucleasa en direccin 3'5' de manera que elimina la base mal apareada, y a continuacin reinicia su actividad polimerasa (Figura 9). Esta es la llamada funcin correctora de pol I, una actividad que es comn prcticamente a todas las DNA polimerasas. Pol I presenta tambin actividad exonucleasa 5'3'. Esta actividad permite que se sinteticen nuevas hebras, incluso cuando el molde est apareado con su complementaria. As, la pol I puede ir eliminando o degradando un segmento de DNA o de RNA apareado con el molde al mismo tiempo que lo reemplaza por DNA de nueva sntesis (Figura 10). La actividad exonucleasa 5'3' rene las siguientes caractersticas: tiene lugar tanto en nucletidos de DNA como en nucletidos de RNA el nucletido que se elimina debe estar correctamente apareado.

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los nucletidos se eliminan de uno en uno a partir del extremo 5'. se puede eliminar ms de un nucletido por cortes sucesivos. empieza a actuar en una muesca siempre que haya un grupo fosfato en 5'.

La actividad polimerasa 5'3' y la exonucleasa 5'3' pueden actuar simultneamente en una hebra. As, cada vez que la actividad exonucleasa elimina un nucletido del extremo 5', la actividad polimerasa lo reemplaza por otro. Como la pol I no puede formar un enlace entre el OH en 3' y el fosfato en 5', nunca se podrn "soldar" los dos fragmentos para formar una sola hebra de DNA, sino que lo que se produce es un desplazamiento de la muesca (Figura 10) en la direccin de la sntesis del DNA (nick translation). De esta forma es como se eliminan los RNA cebadores en el proceso de replicacin. Esta actividad es caracterstica de pol I y juega un papel fundamental tanto en la replicacin como en la reparacin del DNA, como veremos ms adelante. En E. coli pol I es responsable del 90% de la actividad DNA-polimerasa. Sin embargo, empezaron a acumularse evidencias en contra del hecho de que pol I fuese responsable de la R del cromosoma bacteriano. Primero, este enzima aade nucletidos a una velocidad de 600 nucletidos por minuto, demasiado lento en comparacin con la velocidad de R de la clula. Segundo, se han descrito otros genes necesarios para la R, por lo tanto, pol I no acta sola. Tercero, en 1969 John Cairns aisl un mutante bacteriano con el gen de la DNA polimerasa I alterado y que produca una polimerasa inactiva. Estas clulas eran viables. A principio de la dcada de los 70 se descubrieron otros dos enzimas implicados en la sntesis de DNA. Estos enzimas se llaman DNA-polimerasa II (pol II) y DNA-polimerasa III (pol III), para distinguirlos del enzima descubierto por Kornberg (DNA-polimerasa I o pol I) (Figura 11). Las clulas pueden seguir creciendo en ausencia de pol I o de pol II, pero nunca en ausencia de pol III. Pol III es la principal enzima de la R en E. coli. Es mucho ms compleja que pol I y consiste en un complejo enzimtico donde se pueden encontrar al menos 10 subunidades distintas, y cada una est presente en ms de una copia. A este complejo se le suele llamar holoenzima de pol III (Figura 12). El complejo tiene actividad incluso en ausencia de alguna de sus subunidades, y an queda mucho por averiguar sobre su funcionamiento. Entre sus caractersticas podemos destacar las siguientes: Necesita tambin de un molde y de un cebador. No acta en una muesca ni sobre DNA monocatenario con cebador. Slo acta cuando en el DNA de doble hebra se produce un hueco de unos 100 nucletidos, como los que se forman en la HR. Posee actividad exonucleasa 3'5', por lo que puede efectuar correcciones en el DNA recin sintetizado. Slamente tiene actividad exonucleasa 5'3' en DNA de una hebra.

La funcin de pol II an no est muy clara, aunque parece que est relacionada con la reparacin del DNA tras haber sido sometido a alteraciones por mtodos qumicos o fsicos.

Replicacin 4

Las polimerasas no pueden unir un OH en 3' y un fosfato en 5', de forma que no puede producir hebras hijas continuas. La unin de estos grupos la realiza la DNA-ligasa. Este enzima cataliza la formacin de un enlace fosfodister entre el grupo OH del extremo 3' de una hebra y el extremo 5'-fosfato de otra (Figura 13). Slamente acta cuando: (1) ambos extremos pertenecen a dos nucletidos adyacentes, (2) los dos nucletidos estn correctamente apareados y (3) existe un aporte de energa, generalmente en forma de ATP. AVANCE DE LA HORQUILLA DE REPLICACION La molcula de DNA consta de dos hebras antiparalelas: mientras que una de ellas discurre en la direccin 5'3', la otra lo hace en la direccin opuesta 3'5'. Sin embargo, las cadenas nuevas de DNA slo se pueden sintetizar en la direccin 5'3' porque las DNA-polimerasas slo pueden catalizar la adicin de nuevos nucletidos en el extremo que contiene el grupo hidroxilo libre en posicin 3' de un DNA ya existentente. En una HR, una de las hebras (la llamada hebra gua) se replica en la direccin adecuada 5'3'. La otra hebra (hebra retardada) debe crecer de otra manera. En 1968, Reiji Okazaki sugiri que en la hebra retardada el DNA se formaba mediante fragmentos cortos (entre 1000 y 2000 nucletidos) que despus se unan gracias a una DNA-ligasa que cataliza la formacin de un enlace covalente fosfodister entre el extremo 3' de una cadena de nucletidos y el extremo 5' de otra (Figura 14). Estos fragmentos cortos reciben el nombre de fragmentos de Okazaki. Esta hiptesis se enfrenta con un serio problema: Cmo puede iniciarse la sntesis en varios puntos sin que haya un cebador?. Posteriores investigaciones demostraron que: los fragmentos de Okazaki suelen presentar cortas secuencias (entre 4 y 12 nucletidos) de RNA en el extremo 5'. la RNA polimerasa, a diferencia de la DNA-polimerasa puede comenzar la sntesis de un RNA sin que haya un cebador. la DNA-polimerasa puede aadir un desoxirribonucletido al extremo 3' de un RNA.

Combinando todas estas observaciones se desarroll un modelo para la R del DNA que en la hebra retardada segn el cual: La R comienza gracias a la accin de un enzima llamado primasa que cataliza la formacin de un RNA cebador (Figura 15). La pol III inicia la sntesis de DNA en el extremo del cebador y prosigue en direccin 5'3', creando los fragmentos de Okazaki. Estos fragmentos debern unirse para formar una hebra contnua. Para ello habr que eliminar las cortas secuencias de RNA, reemplazarlas por DNA y unir los fragmentos.

Replicacin 5

Cuando pol III llega al RNA cebador del fragmento de Okazaki sintetizado previamente, no puede continuar, ya que (1) no tiene actividad exonucleasa en direccin 5'3', y (2) no puede unir el grupo hidroxilo en 3' con un grupo trifosfato en posicin 5'. La DNA-ligasa tampoco puede actuar, ya que (1) en el extremo correspondiente al cebador hay un grupo trifosfato en posicin 5', y (2) en lugar de un desoxirribonucletido hay un ribonucletido. Pol I, por el contrario, s puede continuar la sntesis, ya que tiene (1) accin polimerasa en la direccin 5'3' y (2) accin exonucleasa tambin en direccin 5'3'. Por lo tanto es pol I la encargada de ir eliminando los nucletidos del RNA cebador y reemplazarlos por DNA. De este modo, la muesca se va transladando hasta encontrarse con el fragmento de DNA. En este punto ya puede actuar la DNA-ligasa para unir los dos fragmentos de Okazaki en una sola hebra de DNA (Figura 16).

En resumen, en la hebra gua, el DNA se sintetiza de manera continua, mientras que en la hebra retardada el DNA se sintetiza de manera discontinua. Este modelo que se ha descubierto en E. coli, se cumple probablemente en otros organismos, y recibe el nombre de replicacin semidiscontinua. PROBLEMAS TOPOLOGICOS DURANTE LA REPLICACION Durante la R, las dos hebras de la doble hlice de DNA deben separarse, al menos de forma transitoria, para que las bases de la hebra que acta como molde y los nuevos nucletidos que se van a incorporar a la cadena creciente establezcan los puentes de hidrgeno correspondientes. Sin embargo, la doble hlice de DNA es muy estable en condiciones normales gracias a las interacciones hidrofbicas y a los puentes de hidrgeno entre sus bases. La unin entre las dos hebras es tan fuerte que se requieren temperaturas de hasta 90C para separarlas en el tubo de ensayo. Las DNA polimerasas slo pueden copiar el DNA cuando la hebra molde se encuentra separada de su complementaria. Por lo tanto, se necesitan protenas adicionales que ayuden a abrir la doble hlice. Dos tipos de protenas contribuyen a realizar esta misin, que adems requiere considerable energa. El desenrollamiento lo realizan las enzimas llamadas helicasas, que hidrolizan 2 molculas de ATP por cada par de bases que desenrollan (Figuras 17 y 19). As van dejando en su camino dos hebras sencillas de DNA. Las DNA helicasas utilizan la energa de la hidrlisis del ATP para desplazarse a lo largo de un DNA de hebra sencilla, y all donde encuentren una zona con estructura de doble hlice, desenrollan la doble hlice para seguir desplazndose (Figura 19). Para evitar que las regiones separadas vuelvan a unirse o que formen puentes de hidrgeno intracatenarios, las hebras sencillas del DNA se unen a una protena que en E. coli se llaman protena ssb (Figuras 18 y 19). Las protenas ssb (single strand binding proteins) se unen fuertemente tanto al DNA monocatenario como entre s y desestabilizan la doble hlice dejando accesibles sus bases para que puedan servir de molde durante la replicacin. Estas protenas no pueden abrir una doble hlice, pero

Replicacin 6

ayudan a las protenas que s la abren porque estabilizan las zonas de DNA de hebra sencilla (Figura 19). Segn va avanzando la HR, la doble hlice progenitora debe desenrollarse. Cada 10 pares de bases que se replican en la HR corresponden a una vuelta completa de la doble hlice alrededor de su eje. El desenrollamiento de la doble hlice implica un problema topolgico: o bien las dos hebras hijas van girando la una sobre la otra a medida que van creciendo, o bien es la zona sin replicar la que gira. Si la molcula estuviese en disolucin y completamente extendida, lo ms sencillo sera que la parte no replicada girase rpidamente sobre s misma (Figura 20). El problema es an ms grave en las molculas circulares de DNA, ya que no hay un extremo libre que permita la rotacin de la zona no replicada, por lo que se produce un superenrollamiento de la parte no replicada, que puede llegar a impedir el avance de la HR. En realidad, es poco probable que la totalidad de la parte no replicada del cromosoma est girando contnuamente y a gran velocidad, ya que el material gentico est superempaquetado en un volumen muy pequeo y adems este giro requerira gran cantidad de energa. Una solucin alternativa a este problema la aportan las DNA-topoisomerasas (tambin llamadas DNA-girasas). Las topoisomerasas rompen un enlace fosfodister de una de las hebras de DNA y forman una muesca en una de las hebras (Figura 21). Esta incisin permite que la parte de la doble hlice anterior a la muesca gire libremente alrededor de la otra hebra y que as se libere la tensin topolgica acumulada durante el avance de la HR. As, la R tiene lugar de forma que nicamente gira un corto segmento de la hlice (el que est justo por delante de la HR y antes de la incisin). La accin de la topoisomerasa es reversible, ya que una vez eliminada la tensin topolgica, los dos extremos de la hebra cortada vuelven a unirse. Esta unin debe producirse antes de que la HR llegue a ese punto porque si no, se perdera una de las hebras hijas (Figura 21).

LA REPLICACION EN PROCARIOTAS
Estudios in vitro sobre la R del DNA en E. coli permiten dividir el proceso en 3 etapas: iniciacin, elongacin y terminacin. 1.- INICIACION Las HR se originan en unas secuencias especiales del DNA llamadas origen de la R. El origen de la R en E. coli se llama oriC y consiste en una secuencia de 245 pares de bases muy conservada entre las bacterias. Entre 20 y 40 copias de una protena iniciadora (la protena DnaA) se unen a zonas concretas del origen de R, formando un gran complejo proteico. La protena DnaA se une a una zona del origen oriC especialmente rica en pares de bases A-T, que se desnaturaliza fcilmente para crear una regin local donde las dos hebras de la doble hlice parental de DNA se separan para servir de molde para la R. En este momento, DnaB y DnaC se unen a esta regin. DnaB es una helicasa que separa las hebras en ambas direciones, creando dos HR. DnaB tambin es capaz de activar a la protena DnaG (una primasa) par aque comience la sntesis de los RNA cebadores. Una girasa deshace la tensin

Replicacin 7

topolgica causada por la helicasa DnaB y las protenas ssb se unen a las zonas de DNA de hebra sencilla estabilizando esta conformacin y evitando que se renaturalice la doble hlice (Figura 22). Todo este conglomerado de protenas, necesarias todas ellas para que se produzca la R forman una macroestructura denominada primosoma, y tiene un tamao tan grande que ha podido ser observado al microscopio electrnico. 2.- ELONGACION La sntesis del DNA es diferente en cada una de las hebras de la HR. En la hebra gua la R es continua: la primasa sintetiza un RNA cebador, al que la pol III va aadiendo desoxirribonucletidos a medida que avanza la HR. En la hebra retardada el DNA se sintetiza de forma discontnua, mediante los llamados fragmentos de Okazaki (Figura 16). Esta forma de R recibe el nombre de replicacin semidiscontinua. 3.- TERMINACION En el cromosoma circular de E. coli, las dos HR deben encontrarse en algn punto. Se sabe poco sobre esta etapa, pero parece ser que para que las dos molculas de DNA se separen hace falta la intervencin de una DNA-topoisomerasa especial.

LA REPLICACION EN EUCARIOTAS
En este caso, la R es ms compleja, debido al gran tamao del cromosoma y a la compleja organizacin del DNA en nucleosomas. La velocidad de la HR en E. coli es de unos 105 nucletidos por minuto, con lo cual su genoma (3 x 106 pares de bases) se replica en unos 30 minutos. Las polimerasas de eucariotas son mucho ms lentas, con una velocidad entre 500 y 5000 nucletidos por minuto. Como una clula animal tpica tiene 50 veces ms DNA que una bacteria, el tiempo de R en eucariotas sera unas 1000 veces ms que en E. coli (unos 21 das). Sin embargo, la clula humana, que contiene unos 3 x 109 pares de bases puede replicarse en unas 8 horas. Esto se debe a la presencia de mltiples orgenes de replicacin. (Figuras 1 y 4) Se calcula que puede haber hasta 50.000 HR en una clula eucariota. Este hecho implica adems que el nmero de copias de las molculas de DNA-polimerasa debe ser tambin mucho mayor. As, mientras que en E. coli hay entre 10 y 20 copias del holoenzima pol III, en una clula animal hay entre 20.000 y 60.000. En eucariotas, las secuencias de origen de la R se llaman secuencias de replicacin autnoma (SRA). En levaduras se han identificado unas 400 SRA, lo que quiere decir que cada cromosoma contiene ms de una. Tambin se han encontrado protenas que se unen especficamente a las SAR.

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En eucariotas tambin hay varios tipos de DNA-polimerasas. La R de los cromosomas nucleares la realizan la DNA-polimerasa y la DNA-polimerasa . DNA-polimerasa es un enzima con 4 subunidades y parece estar implicada en la sntesis de la hebra retardada, ya que presenta actividad primasa. DNA-polimerasa tiene dos subunidades y presenta actividad exonucleasa 3'5' (funcin correctora) y se piensa que es la responsable de la R de la hebra gua. Una tercera polimerasa, la DNA-polimerasa parece estar implicada en la reparacin del DNA. La funcin de las protenas ssb la desempea una protena llamada factor de replicacin A (FRA). La replicacin de la cromatina presenta dos problemas adicionales: la disociacin de DNA e histonas en la molcula progenitora, y la asociacin del DNA y las histonas en las molculas hijas. Cuando avanza la HR, debe haber algn mecanismo para (1) disociar el nucleosoma (NS) para poder replicar el DNA y (2) volver a reconstruir el NS una vez que el DNA se ha replicado. El modelo actualmente aceptado sugiere que durante la R el NS se divide en dos mitades dejando expuesto el DNA, de forma que la DNA-polimerasa puede utilizarlo como molde para la R (Figura 23). Cada vez que se replica el DNA de una clula eucariota hay que doblar la cantidad de histonas para formar la cromatina (Figura 24). Las nuevas histonas se asocian al DNA unos 5 minutos despus de haber pasado la HR. Por lo tanto, la sntesis de DNA y la sntesis de histonas deben estar sincronizadas para que en el momento de la R haya suficiente cantidad de histonas para formar la cromatina. Las histonas, a diferencia del DNA se replican de forma conservadora, es decir, los octmeros de la molcula progenitora no se disocian para volver a formarse con otras histonas recin sintetizadas. Hay otro aspecto que aclarar: Cmo se distribuyen los octmeros paternos entre las molculas hijas? Se distribuyen indistintamente entre las dos molculas hijas o estn localizados sobre una de ellas?. Para resolver esta cuestin se llev a cabo el siguiente experimento (Figura 25): Se aade cicloheximida a clulas en crecimiento, con lo cual se interrumpe la sntesis de protenas pero no la de DNA. La R del DNA contina a pesar de que no se sinteticen nuevas histonas. En este caso, la HR aparece con una de las molculas hijas asociada a histonas y con la otra "desnuda", es decir no asociada a histonas (Figura 25). Los octmeros de la molcula progenitora se asocian a una sla de las molculas hijas, que parece ser la hebra gua. Si la R es bidireccional, el punto donde se juntan los octmeros de histona marca el punto de origen de la R (Figura 25).

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