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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA CARRERA DE QUMICO FARMACUTICO BILOGO LABORATORIO DE GENTICA CLNICA

REPORTE DE LA PRCTICA 5: IDENTIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS

INTEGRANTES DEL EQUIPO 6:

Baez Ramrez Oliveria Araceli Osorio Garca Alexander Prez Saucedo Salvador

Marzo del 2013

PRCTICA 5: IDENTIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS

OBJETIVO Que el alumno extraiga por mtodos fisicoqumicos, identifique y cuantifique los cidos nucleicos de una muestra de sangre venosa humana por espectrofotometra y densitometra de las bandas en un gel de agarosa.

INTRODUCCIN Hay diferentes tcnicas que permiten obtener cidos nucleicos con alto grado de pureza. Las ms utilizadas suelen incluir una etapa de ultra centrifugacin en gradientes de CsCl o una cromatografa de intercambio inico. Sin embargo, muchas aplicaciones de laboratorio no necesitan un grado de pureza tal que justifique incluir estas tcnicas (laboriosas y/o caras) en los protocolos de purificacin. PRECIPITACIN DE CIDOS NUCLEICOS La precipitacin de los cidos nucleicos permite su purificacin y concentracin. Se basa en la simultnea neutralizacin de las cargas negativas (mediante el aadido de sales), y deshidratacin de la molcula (mediada por el agregado de alcoholes, tpicamente etanol o isopropanol), lo cual lleva a su precipitacin. La precipitacin es un fenmeno reversible (mediante la disolucin en soluciones acuosas) y no debe ser confundido ni con la desnaturalizacin (potencialmente reversible) ni con la degradacin (irreversible) de los mismos. En la mayora de los casos cuando se trabaja con ADN es importante realizar una cuantificacin de la cantidad con la que se dispone. La cuantificacin del ADN se puede llevar a cabo por estimacin de la intensidad de una banda en geles de agarosa en el que el ADN es teido por algn colorante como Bromuro de Etidio, Syber Green o Gel Red, obien mediante tcnicas de espectrofotometra de luz ultravioleta. Los dobles enlaces conjugados de las bases nitrogenadas hacen que los cidos nucleicos absorban luz ultravioleta (UV). El espectro de absorcin caracterstico de ADN presenta un mximo a ~ 260 nm. Si bien el coeficiente de extincin de un cido nucleico en particular depende de la secuencia de nucletidos, algunas reglas empricas permiten estimar la concentracin a partir del valor de A260 nm. As, una unidad de absorbancia a 260 nm corresponde aproximadamente a una concentracin de 50 g/mL de ADN doble hebra,40 g/mL de ARN o 33 g/mL de fragmentos cortos de ADN monohebra. En las preparaciones de cidos nucleicos, son frecuentes las impurezas de naturaleza proteca. Dado que los aminocidos aromticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV, la presencia de protenas lleva a sobrestimaciones de la concentracin de cidos nucleicos. Una vez que se ha realizado la extraccin de ADN es necesario revisar la integridad y la cantidad del mismo, esto se efecta mediante la separacin por electroforesis en geles de agarosa o de poliacrilamida. La agarosa es ms comnmente utilizada puesto que no es txica. A los valores de pH en los cuales usualmente se trabaja con cidos nucleicos, los grupos fosfato confieren carga neta negativa a estas molculas. En la electroforesis en geles de agarosa, las molculas de ADN lineales migran segn su tamao y se pueden visualizar mediante tincin. La velocidad de migracin est determinada por varios parmetros, algunos de los cuales son detallados a continuacin.

Tamao del ADN. Las molculas de ADN lineal de doble hebra migran a travs del gel a velocidades que son inversamente proporcionales al log del nmero de pares de bases. Dado que la carga del ADN est dada por los grupos fosfato y que por cada par de bases hay dos grupos fosfato, la relacin carga/masa es la misma para molculas de ADN de diferente tamao. Pero, debido a la friccin que impone la malla del gel de agarosa, las molculas de mayor tamao sern retardadas respecto a las de menor tamao. Concentracin de la agarosa. Un fragmento de ADN lineal migra a diferentes velocidades dentro de geles con diferentes concentraciones de agarosa. Conformacin del ADN. El ADN circular cerrado de doble hebra superenrollado (forma I), el circular relajado con un corte en una de las hebras (forma II) y la forma lineal (forma III) que tengan idntico peso molecular y misma secuencia van a migrar a distinta velocidad en los geles de agarosa. Las movilidades relativas de las tres formas dependen primariamente de la concentracin de agarosa, pero tambin estn influidas por otros factores como la corriente elctrica aplicada, la fuerza inica del buffer y de la cantidad del colorante presente Corriente aplicada. A bajo voltaje, la velocidad de migracin de los fragmentos lineales es proporcional al voltaje aplicado. Sin embargo a medida que la fuerza del campo elctrico aumenta, la movilidad de los fragmentos de ADN de alto peso molecular se incrementa menos. Por lo tanto el intervalo efectivo de separacin en los geles de agarosa disminuye a medida que el voltaje es incrementado. Otros factores. La direccin del campo elctrico, la composicin de bases de los fragmentos a analizar, la temperatura y la composicin del buffer de electroforesis.

MTODOS A) EXTRACCIN DEL ADN

1) Extraer 3mL de sangre venosa en tubos heparina. 2) Adicionar 5mL de agua doble destilada esteril. 3) Mezclar suavemente hasta la lisis completa de los eritrocitos.

6) Incubar durante 1hr.

37C

5) Eliminar sobrenadante y resuspender el boton en 80 L en amortiguador de lisis con pronasa.

4) Centrifugar a 5000 rpm durante 10 minutos.

7) Adicionar 320L de acetato de sodio 375mM.

8) Incubar nuevamente a 37C por 1h.

9)Adicionar 480L de la mezcla de fenol:cloroformo:alcohol isoamilico (25:24:1) y agitar vigorosamente en vortex durante 5 min.

12) Centrifugar a 13 000 rpm durante 15 min. a 4C.

11) Separar la fase acuosa y adicionar el mismo volumen de isopropanol previamente enfriado a -20 C.

10) Centrifugar a 13000 rpm dureante 5 min. a T ambiente.

13) Eliminar sobrenadante.

el

14) Adicionar un volumen de 980L de alcohol etilico al 80% en agua bidestilada.

15) Almacenar en congelacin y cuando se ocupe poner a temperatura ambiente.

17) Secar los tubos en un termociclador a 37C.

16) Eliminar sobrenadante

el

Para la muestra de ARN se realizaron tambin los pasos 15-17.

B) HIDRATACIN Y CUANTIFICACIN DEL ADN Y ARN POR ESPECTROFOTOMETRA 1) Hidratar las muestras con 30 L de agua bidestilada esteril y mezclar.

2) Colocar en 2 tubos eppendorf 2 L de ADN y ARN puro y adicionar 200 L de agua bidestilada estril (dilucin 202/2).

3) Leer la absorbancia de las muestras a 260 y 280 nm.

4) Calcular la concentracion de ADN y ARN.

CLCULOS Absorbancia260nm x 50 g x factor de dilucin Concentracin ADN (g/L) = ----------------------------------------------------------1000 L

Absorbancia260nm x 40 g x factor de dilucin Concentracin ARN (g/L) = ----------------------------------------------------------1000 L

C) ELECTROFORSIS DEL DNA Y DEL RNA

De cada dilucin de DNA y RNA 202/2 mezclar 10 L con amortiguador de carga de azul de metileno.

Colocar en 2 pozos en un gel de agarosa.

Visualizar el gel en el transiluminador.

Correr la electroforsis horizontal a 120 V por 2 horas con amortiguador de corrimiento TBE.

RESULTADOS 1) CUANTIFICACIN DEL ADN TABLA 1. Resultados por equipo de las absorbancias a 260 y 280 nm, concentracin y coeficiente Abs260/Abs280 para el ADN y ARN, as como promedios de las concentraciones, en muestras de sangre venosa. Abs 260 Conc. EQUIPO nm (g/L) 1 0,737 3,722 2 0,926 4,676 3 0,572 2,889 4 0,706 3,565 5 0,245 1,237 6 0,419 2,116 7 0,534 2,697 8 0,474 2,394 9 0,589 2,974 10 0,359 1,813 11 0,503 2,540 Promedio 2,784 DNA RNA Abs 280 Abs 260 Conc. Abs 280 nm Abs260/Abs280 nm (g/L) nm Abs260/Abs280 0,437 1,686 0,808 3,264 0,434 1,862 0,624 1,484 1,132 4,573 0,597 1,896 0,388 1,474 0,681 2,751 0,446 1,527 0,481 1,468 0,579 2,339 0,383 1,512 0,207 1,184 0,330 1,333 0,220 1,500 0,319 1,313 1,631 6,589 1,061 1,537 0,392 1,362 0,602 2,432 0,422 1,427 0,355 1,335 1,33 5,373 0,863 1,541 0,419 1,406 0,62 2,505 0,454 1,366 0,276 1,301 0,525 2,121 0,393 1,336 0,357 1,409 0,683 2,759 0,473 1,444 3,276

2) ELECTROFORSIS EN GEL DE AGAROSA Los pozos del RNA fueron del 1 al 11, y los pozos para el DNA fueron del 13 al 19. El equipo 6 ocup el pozo 6 para el RNA y el 18 para el DNA. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 13 14 15 16 17 18 19

12 3 4 5 6 7 8

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

DISCUSIN DE RESULTADOS 1) CUANTIFICACIN DEL ADN Y ARN A 260 NM

El valor promedio de la concentracin fue de 2,784 y 3,276 g/L para el ADN y el ARN, respectivamente, lo que indic que se obtuvieron mayores concentraciones de ARN que de ADN. De acuerdo a la tabla 2, la mayor concentracin de ADN fue de 4,676 g/L con un coeficiente Abs260/Abs280 = 1,484; y el mayor coeficiente para el ADN fue de 1,686 con una concentracin de 3,722 g/L; adems la muestra del equipo 6 present menor concentracin y coeficiente que stas muestras. La mayor concentracin de ARN fue de 6,589 g/L con un coeficiente Abs260/Abs280 = 1,537; y el mayor coeficiente para el ARN fue de 1,896 con una concentracin de 4,573 g/L. Por lo que tanto para el ADN

como para el ARN, en el primer caso se obtuvo una mayor concentracin pero una menor pureza, y en el segundo caso se obtuvo una menor concentracin pero mayor pureza. TABLA 2. Comparacin de las mayores concentraciones y coeficiente Abs260/Abs280 para el ADN y ARN, en muestras de sangre venosa. EQUIPO 1 2 6 ADN Conc. (g/L) 3,722 4,676 2,116 Abs260/Abs280 1,686 1,484 1,313 EQUIPO 2 6 ARN Conc. (g/L) 4,573 6,589 Abs260/Abs280 1,896 1,537

Asimismo se observ que los coeficientes fueron mayores para el ARN que para el ADN, para todas las muestras, lo que indic que su extraccin fue ms eficiente porque se obtuvo ms puro. Dado que los aminocidos aromticos absorben luz UV, la presencia de protenas lleva a sobrestimaciones de la concentracin de cidos nucleicos. Debido a que el mximo de absorbancia de las protenas se encuentra en ~ 280 nm, es posible estimar el grado de impurezas de origen proteico a partir del coeficiente A260/A280. La presencia de protenas en la muestra har que el cociente A260 nm/A280 sea menor que el esperado para cidos nucleicos puros. Para el ADN de doble hebra en soluciones de alta pureza se espera Abs260/Abs280 1,8, y para el ARN A260/A280 2,0. De acuerdo a la tabla 2, el coeficiente Abs260/Abs280 mximo para el ADN fue de 1,686, y para el ARN fue de 1,896; por lo que ninguna de las 11 muestras present alta pureza porque en todas hubo impurezas proteicas. 2) ELECTROFORSIS

La separacin por electroforesis en gel de agarosa se hace para revisar la integridad y la cantidad del ADN y ARN, y estas molculas migran hacia el nodo debido a su carga negativa. Su velocidad de migracin est determinada por el tamao del ADN, la concentracin de agarosa, la conformacin del ADN, corriente aplicada, la direccin del campo elctrico, la composicin de bases de los fragmentos a analizar, la temperatura y la composicin del buffer de electroforesis. Para el caso del DNA se observ que estaba desnaturalizado porque las muestras presentaron una franja sin bandas, y el ARN estaba ntegro porque todas las muestras corrieron normalmente, excepto la 13, 15 y 19.

CONCLUSIONES Se obtuvieron mayores concentraciones de ARN que de ADN. Tanto para el ADN como para el ARN se obtuvo una muestra con la mayor concentracin cido nucleico pero con menor pureza, y otra muestra con una menor concentracin pero con la mayor pureza, y la muestra del equipo 6 present menor concentracin y coeficiente que stas. Asimismo en todas las muestras el coeficiente Abs260/Abs280 fue mayor para el ARN que para el ADN, lo que indic que la extraccin del ARN fue ms eficiente porque se obtuvo ms puro, pero en ambos casos hubo impurezas proteicas por ser los coeficientes Abs260/Abs280 < 1,8 para el ADN y < 2 para el ARN.

Respecto a la electroforesis, el DNA estaba desnaturalizado porque las muestras presentaron una franja sin bandas, y el ARN estaba ntegro porque las muestras corrieron normalmente. Finalmente se cumpli el objetivo de extraer los cidos nucleicos por mtodos fisicoqumicos, identificarlos y cuantificarlo a partir de una muestra de sangre venosa humana por espectrofotometra y densitometra en un gel de agarosa.

BIBLIOGRAFA Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3 ed. Ed. Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001.