UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

AO DE LA INVERSIN PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD ALIMENTARIA

LABORATORIO N 2: Mtodos cromatogrficos y de separacin en la determinacin de aminocidos y protenas

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

CURSO: DOCTOR:

BIOQUMICA Dra. Qco. Fco. Violeta Morin Garrido M.Sc. Dr. Carlos Holgun M.

ALUMNO:

Ian Gallardo Bayona

III CICLO 2013

MTODOS CROMATOGRFICOS Y DE SEPARACIN EN LA DETERMINACIN DE AMINOCIDOS Y PROTENAS

A. CROMATOGRAFIA En un mtodo analtico de separacin de sustancias de una mezcla, estas sustancias pueden ser coloreadas, no coloreadas, gases compuestos volatilizables. Partes del Sistema Cromatrogrfico: Fase Fija: Es la parte donde se realiza la separacin del componente, puede ser papel silicagel, gas inerte, etc. Fase Mvil: Es el solvente que a travs de la fase fija va a eludir arrastrando con el soluto que se quiere separar. Caractersticas para la separacin: 1. 2. 3. 4. Peso del soluto Polaridad del soluto y solvente Afinidad al soluto por la parte fija Coeficiente de participacin. Fases de la Cromatografa: 1. Extraccin: Procesamiento de la muestra para extraer el principio activo por mtodos fsicos. a. Mecnicos b. Solubilidad Concentracin: Aplicando solventes orgnicos voltiles. Cromatograma propiamente dicho: Poner la muestra para su recorrido a travs de la fase fija. Revelado: Usar sustancias patrones, densitmetro y reactivos apropiados.

2. 3. 4.

Existen diferentes tipos de cromatografa entre las que tenemos: a) Cromatografa de papel (Mono y Bidimansional) b) Cromatografa de sapafina c) Cromatografa de gas d) Cromatografa de particin o reparto e) Cromatografa de exclusin molecular sphadex f) Cromatografa de intercambio idneo g) Cromatografa de columna h) Cromatografa por electroforesis i) Cromatografa de exclusin molecular Procedimientos de separacin

Las protenas de disolucin muestran cambios profundos de su solubilidad en funcin: 1. El pH 2. Fuerza inica (precipitacin por salado) 3. Propiedades dielctricas del disolvente 4. Temperatura Estas variables que son reflejo del hecho de que las protenas son electrolitos de peso molecular muy grande, pueden utilizarse para separar mezclas de protenas, ya que cada protena posee su composicin en aminocidos caractersticos, la cual determina su comportamiento como electrolito. Precipitacin Isoelctrica La solubilidad de la mayor parte de protenas globulares se halla profundamente incluida por el pH del sistema, casi todas las protenas globulares muestran un mnimo de solubilidad aunque el pH al que ello ocurre vara de una protena a otra. El pH al que una protena muestra un mnimo de solubilidad es su pH Isoelctrico definido como aquel valor del Ph al que la molcula no posee carga elctrica. Ejemplo: Ovoalbmina (huevo) pH 4.6, ureasa pH 5m en estas condiciones no existe repulsin electrosttica entre molculas de protenas vecina y tiende a coalecer y precipitar, sin embargo, cuando los valores del pH est por encima o por debajo del punto Isoelctrico, todas las molculas de protenas poseen carga elctrica nota del mismo signo. Por dicha razn se repelan mutuamente impidiendo la coalescencia de molculas para formar agregados insolubles. Puesto que las diferentes protenas poseen valores de pH Isoelctrico diferentes, con frecuencia pueden separarse una de otra, mediante precipitacin Isoelctrica, cuando el pH de una mezcla de protenas se ajusta al pH isoelctrico de uno de sus componentes. La mayor parte o casi todo el componente precipitarn que dando solucin las protenas cuyos valores de Ph isoelctrico se hallen por encima o por debajo de aquel, la protena Isoelctrica precipitada permanece en su conformacin nativa y puede radisolverse en un medio a pH apropiado y concentracin salina adecuada. B. METODOS PRACTICOS EN LA DETERMINACIN DE PROTEINAS Y AMINOACIDOS B.1 OBJETIVOS Los objetivos de esta prctica son: 1. Que el alumno utilice el mtodo cromatogrfico de capa fina para separar e identificar las propiedades fsico qumico de los aminocidos en muestras patrones y problemas. 2. Que el alumno identifique el Pi, en el cual la ovoalbmica puede ser separado de una muestra biolgica, y explique en que se fundamentan los mtodos de separacin de protenas.

B.2 REACTIVOS 1. Fase Mvil para cromatografa de papel Metano-H20 Piridina (8020-4).

2. Fase fija papel de filtro. 3. Solucin de aminocidos: Arginina 1% en Ma(OH) a pH neutro. Asprtica 1% hasta disolucin. Histidina 1% hasta disolucin 4. Solucin de Ninhidrina Ninhidrina 0.1% Colidina 2 ml cido Actico glacial 10 ml. Cap. 100 ml en Etanol. 5. cido actico 1 N: Tomar 60 ml. de cido actico glacial, densidad 1.06, pureza 96% y diluir hasta 100 ml. Con agua destilada. 6. Solucin de casena en acetato de sodio 0.1 N 7. Sal de fenolftalena. 8. Na (OH) 10% B.3 DISEO EXPERIMENTAL 1. Cromatografa de papel a. Les ser dado un papel Whatman N-1 cortado en tiras de 15 x 25 cm. Aproximadamente, manipula el papel por las esquinas evitando agarrarlo en lo posible, colquele sobre un papel limpio. b. Engrape un hilo a la parte superior del papel Whatman. c. Con un lpiz marque el punto de origen, trazando una lnea, sta debe estar por encima de la altura del solvente. d. Aplique utilizando los tubos capilares las diferentes muestras segn muestra el esquema (no toque el papel con los dedos).

HILO MUESTRA A B C.

PATRONES EN HCL DE 3 AMINOACIDOS Nota: Para aplicar la muestra toque el papel levemente con el tubo capilar puesto verticalmente. Retire el tubo cuando la mancha halla alcanzando unos 3 mm. de dimetro. Una vez seca la mancha repita la aplicacin dos veces ms. Coloque el papel en la cmara dejando que el borde inferior quede sumergido 1 2 cm. en el solvente. Deje el papel en posicin rectal asegurando los hilos a los lados de la cinta adherida.

e. f.

g. h. i. j. k. l.

Una vez que la muestra haya corrido, sacar el papel. Marque el lmite de migracin del frente del solvente. Seque los papeles en un horno. Roce sobre los cromatogramas la solucin reveladora de Ninhidrina colidina-cido actico glacial. Caliente el papel en un horno a 100C hasta que aparezca las manchas de los aminocidos. Calcule el Rf de cada mancha y haga identificacin tentativa de los aminocidos, comparando los Rf, obtenidos con la muestra problemas. Rf = distancia del punto de origen al centro de la mancha distancia del punto de origen al frente del solvente.

2. Determinacin del punto Isoelctrico de la protenas Procedimiento: Marcar una serie de tubos del 1 al 9. En el tubo 1, medir 3.2 ml. De cido actico 1N y 6.8 ml. De agua destilada. Medir 5 ml. De agua destilada en cada uno de los otros 8 tubos. Sacar 5 ml. de solucin del tubo 1 y agregarlo al tubo 2. Mezclar. Sacar 5 ml. Del tubo 2 y transferir al tubo 3, etc., continuando del mismo modo hasta completar la serie. En el tubo 9, una vez efectuada la mezcla se sacan 5 ml. De solucin que se eliminan. Agregar rpidamente 1 ml. De solucin de casena en acetato de sodio 0.1 N a cada tubo. Mezclar el instante por inversin. Observar despus de 30 minutos, anotar en el cuadro el Ph de cada tubo (ver nota al final) Calentar ligeramente cada uno de los tubos y apreciar el efecto sobre la solubilidad. Agregar 1 gts. de fonoltalena y mezclar. Agregar Na (OH) al 10% gts. a gts, agitando hasta la aparicin de un color rosado y observar el efecto sobre la solubilidad.

2.- DESARROLLO DE LA PRCTICA DE LABORATORIO 1. DISEO EXPERIMENTAL a) CROMATOGRAFA EN PAPEL: Les ser dado un papel Whatman N-1 cortado en tiras de 15*25 cm. Aproximadamente, manipule el papel por las esquinas evitando agarrarlo en lo posible, colquelo sobre un papel limpio. Engrape un hilo a la parte superior del papel Whatman. Con un lpiz marque el punto de origen, trazando una lnea, esta debe estar por encima de la altura del solvente. Aplique utilizando los tubos capilares las diferentes muestras segn el esquema (no toque el papel con los dedos).

NOTA: Para aplicar la muestra tocar el papel levemente con el tubo capilar puesto verticalmente. Retire el tubo cuando la mancha halla alcanzando unos 3 mm. De dimetro. Una vez seca la mancha repetir la aplicacin dos veces ms. Coloque el papel en la cmara dejando que el borde inferior quede sumergido 1 2 cm. En el solvente. Dejar el papel en posicin rectal asegurando los hilos a los lados de la cinta adherida. Una vez que la muestra haya corrido, sacar el papel y marcar el lmite de migracin de frente del solvente. Secar los papeles en un horno. Rociar una solucin reveladora, Ninhidrina-colina-acido actico glacial. Calentar el papel en un horno a 100 C hasta que aparezcan las manchas de los aminocidos. Calcular el Rf de cada mancha, y haga la identificacin tentativa de los aminocidos, comparando los Rf, obtenidos con la muestra problemas. Nota:

2. EXPERIMENTACIN Y OBSERVACIONES SEGUNDA PARTE CROMATOGRAFA EN PAPEL: Antes que todo analizamos el porqu se da el fenmeno de arrastre de las protenas, en debate, se concluy que las causas son: El peso molecular La polaridad La disolvencia

Ahora pasamos en s al experimento: 1. Tenemos en primer lugar la muestra: En dos crisoles se chancaron dos tipos de hojas, una verde y otra roja (carotenos), para extraer, las protenas en dos pequeos frascos. Se preparo tambin un tercer frasco con una muestra de la mezcla de ambos lquidos, el cual actuar como el desconocido.

2. Ahora procedemos a echar la gota del lquido obtenido sobre la fase fija, que es papel filtro de celulosa. La fase fija se marca de la siguiente manera:

Frente del solvente: se marca despus de realizado el efecto de arrastre. Lnea de inicio: se marca antes de echar las gotas para que todas estn a una misma altura.

3. Ahora colocamos la fase de solvente, que constituye la fase mvil: se usa generalmente metanol o piridina. Y procedemos a utilizar el efecto de arrastre y dejamos que el rastro cromtico de las protenas suba. En este punto ya se marca el frente del solvente. 4. Ahora se proceden a realizar las medidas correspondientes

5.5 cm

2.5 cm

2cm

2cm

2.5c m

5. Ya con las medidas calculamos la Resolucin de Frente de cada mancha, las cuales representan los pigmentos. El resumen en el siguiente cuadro:

Muestra A

Resolucin de frente 2.2

SEGUNDA PARTE DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELCTRICO DE LAS PROTENAS

a) Marcar una serie de tubos del 1 al 9 b) En el tubo 01, medir 3.2 ml. de acido actico 1N y 6.8 ml. de agua destilada. c) Medir 5 ml. de agua destilada en cada uno de los 8 tubos restantes. d) Sacar 5 ml. de solucin del tubo 01, y agregarle al tubo 02, mezclar. e) Sacar 5 ml. del tubo 02 y transferir al tubo 03, continuar as hasta el tubo 09, al final se eliminan 5 ml. f) Agregar 1 ml. de ALBMINA en acetato de sodio 0.1N, mezclar. g) Observar el efecto en la solubilidad en cada tubo. h) Despus de 30 anotar el pH. i) Agregar 1 gota de fenoftalena y mezclar. j) Agregar Na(OH) al 10%, agitar hasta la aparicin de un color rosado y observar el efecto sobre la solubilidad.

Tenemos:

3,2 ml de cido actico 1 N + 6,8 ml de agua destilada = 10ml de disolucin Como a los dems tubos ya tienen 5 ml de agua destilada, con cada traspaso de un tubo a otro va quedando 10 ml en cada tubo, con una concentracin a la mitad de cido PRIMERO

3,2 ml de 6,8 ml de agua cido destilada actico 1 N

5 ml de agua destilada

2 9

8 SEGUNDO

5m l 5ml de agua destilada 1 8 9 2

TERCERO ALBMINA en acetato de sodio 0.1N 1ml cada uno

5 ml de solucin de agua y cido actico de mayor a menor concentracin cida

POR LTIMO

Usemos la Ecuacin de Henderson-Hasselbalch, teniendo que: Pk (a) = 4.7 As para el tubo N 3, por ejemplo: N Acido 5ml Sal 1 ml

Hacemos el clculo para todos los tubos:

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9

[CH3COOH] = meq [1 N] 1.6 ml * 1N =1.6 meq 0.8 ml * 1N = 0.8 meq 0.4 ml * 1N = 0.4 meq 0.2 ml * 1N = 0.2 meq 0.1 ml * 1N = 0.1 meq 0.05 ml * 1N = 0.05 meq 0.025 ml * 1N = 0.025 meq 0.0125 ml * 1N = 0.0125 meq 0.00625 ml * 1N = 0.00625 meq

[ALBMINA] = meq [0.1 N] 1 ml * 0.1N= 0.1 meq 1 ml * 0.1N = 0.1 meq 1 ml * 0.1N = 0.1 meq 1 ml * 0.1N = 0.1 meq 1 ml * 0.1N = 0.1 meq 1 ml * 0.1N = 0.1 meq 1 ml * 0.1N = 0.1 meq 1 ml * 0.1N = 0.1 meq 1 ml * 0.1N = 0.1 meq

Ecuacin de HendersonHasselbalch

PH 3.5 3.8 4.1 4.4 4.7 5.0 5.3 5.6 5.9

Al encontrar el punto isoelctrico, procedemos a echar Na(OH), posteriormente medimos el pH con una gota del indicador Fenolftalena. Si se tie de rojo nos informar que es un medio cido, si resulta azul, entonces es bsico. Ahora completamos la tabla resumen de la prctica: N de tubos pH de cada tubo Enturbiamiento al mezclar Enturbiamiento o precipitado a 30 Solubilidad despus de calentar 1 3.5 NO NO 2 3.8 NO NO 3 4.1 NO NO 4 4.4 S NO 5 4.7 S NO 6 5.0 NO NO 7 5.3 NO NO 8 5.6 NO NO 9 5.9 NO NO

NO

NO

NO

+/-

NO

NO

NO

NO

INTERPRETACIN: Cuando el pH es bajo, los grupos ionizables estn protonado, y la carga neta de la protena es de signo positivo. Cuando el pH es alto, los grupos ionizables estn desprotonados, y la carga neta es de signo negativo. Entre amabas zonas, habr un pH en el cual la carga neta de la protena es nula. Es el pH isoelctrico o punto isoelctrico, y es caracterstico de cada protena. La solubilidad de una protena es mnima en su punto isoelctrico, ya que su carga neta es cero y desaparece cualquier fuerza de repulsin electrosttica que pudiera dificultar la formacin de agregados. El punto isoelctrico de la casena es de 4,6 4,7. La naturaleza opaca de los tubos 4 y 5 se debe a que la protena se ha desnaturalizado, ha perdido su funcin, pero no llega a precipitar. 3. 1. CUESTIONARIO TERICO PRCTICO

Qu entiende por cromatografa?

La cromatografa es uno de los principales mtodos para la separacin de especies qumicas estrechamente relacionadas en mezclas complejas. La cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra mvil. En todas las separaciones cromatogrficas la muestra se disuelve en una fase mvil, que puede ser un gas un lquido o un fluido supercrtico. Esta fase mvil se hace pasar a travs de una fase estacionaria inmiscible, la cual se mantienen fija en una columna o sobre una superficie slida. Las fases se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase mvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son retenidos con ms fuerza por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo; por el contrario los componentes que unen dbilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas discriminadas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente. 2. Diga tres aplicaciones de la cromatografa en muestras biolgicas Se usa para separar mezclas orgnicas complejas, compuestos organometlicos y sistemas bioqumicos. Se usa como mtodo para determinar cuantitativa y cualitativamente los componentes de la muestra. Tratamiento trmico. Algunas protenas son ms termoestables que otras; si ste es el caso, un buen mtodo para purificarlas es el tratamiento trmico. Las protenas desnaturalizadas tienden a agregarse; una centrifugacin diferencial ayudar a eliminarlas por sedimentacin. Eliminacin de clulas procariotas en caldos de cultivo: Una manera bastante empleada en Bioqumica para obtener enzimas es el cultivo de bacterias en medios lquidos. Independientemente de que el enzima sea intra o extracelular, el primer problema con el que nos encontramos es la presencia de bacterias en el medio. Precipitacin de protenas con sulfato amnico. La precipitacin salina es una tcnica muy empleada en purificacin enzimtica; presenta un alto rendimiento pero muy poca selectividad, por lo que suele ser utilizada en las etapas iniciales del proceso. Las protenas son polielectrolitos de superficie, por lo que al aadir al medio una sal, los iones de sta neutralizan las cargas de las protenas, llegndose a una situacin en la que, por no presentar carga neta, las protenas floculan.

3.

Diga el fundamento de dos tipos de cromatografa Cromatografa en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar unos anlisis cualitativos ya que pese a no ser una tcnica muy potente no requiere de ningn tipo de equipamiento. La fase estacionaria est constituida simplemente por una tira de papel filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeas gotas de la solucin y evaporando el disolvente. Luego el disolvente empleado como fase mvil se hace ascender por capilaridad. Esto es, se coloca la tira de papel verticalmente y con la muestra del lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase mvil en el fondo. Despus de unos minutos cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al extremo se retira el papel y seca. Si el disolvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se vern las manchas de distinto color separadas. Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado. Hay varios factores de los cuales depende una cromatografa eficaz: la eleccin del disolvente y la del papel de filtro. Cromatografa de gases es una tcnica cromatogrfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos decromatografa, la fase mvil no interacta con las molculas del analito; su nica funcin es la de transportar el analito a travs de la columna. Existen dos tipos de cromatografa de gases (GC): la cromatografa gas-slido (GSC) y la cromatografa gas-lquido (GLC), siendo esta ltima la que se utiliza ms ampliamente, y que se puede llamar simplemente cromatografa de gases (GC). En la GSC la fase estacionaria es slida y la retencin de los analitos en ella se produce mediante el proceso de adsorcin. Precisamente este proceso de adsorcin, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de cromatografa tenga aplicacin limitada, ya que la retencin del analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elucin con colas. Su nica aplicacin es la separacin de especies gaseosas de bajo peso molecular. La GLC utiliza como fase estacionaria molculas de lquido inmovilizadas sobre la superficie de un slido inerte.

La GC se lleva a cabo en un cromatgrafo de liquidos. ste consta de diversos componentes como el gas portador, el sistema de inyeccin de muestra, la columna (generalmente dentro de un horno), y el detector.

4.

Diga 2 importancias de la separacin de protenas desde el punto de vista de aplicacin Biolgica. Separacin de componentes del plasma y cuantificacin nos permite ver valores normales y patolgicos Identificar un compuesto comparando con su patrn usando una concentracin conocida y su comportamiento cromatogrfico.

5.

Qu entiende por punto isoelctrico de la protena?

El punto isoelctrico es el pH al que una sustancia anftera tiene carga neta cero. El concepto es particularmente interesante en los aminocidos y tambin en las protenas. A este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula. Para calcularlo se deben utilizar los pKa. pI = (pKa1 +pKa2)/2 Las molculas complejas, tales como las protenas, se combinan con los iones hidrgeno y con otros iones presentes en la disolucin, dando lugar a la carga neta de la molcula. A la concentracin de iones hidrgeno, o al pH, para el cual la concentracin del ion hbrido de una protena es mxima y el movimiento neto de las molculas de soluto en un campo elctrico es prcticamente nulo, se le denomina punto isoelctrico. Sustancias isoeletronicas: Son tomos o iones que poseen el mismo nmero de electrones e igual configuracin electrnica. 6. Qu entiende por coagulacin, precipitacin y desnaturalizacin de las protenas. La coagulacin de las protenas es un proceso irreversible y se debe a su desnaturalizacin por los agentes indicados, que al actuar sobre la protena la desordenan por la destruccin de su estructura terciaria y cuaternaria.

Para ver la coagulacin de las protenas se puede utilizar clara de huevo, para conseguir ms volumen puede prepararse para toda la clase una dilucin de clara de huevo en agua, de forma que quede una mezcla an espesa.

 Precipitacin de protenas: El agua es el disolvente biolgico por excelencia. En disolucin acuosa, los residuos hidrofbicos de las protenas se acumulan en el interior de la estructura, mientras que en la superficie aparecen diversos grupos con carga elctrica, en funcin del pH del medio (Figura de la izquierda). En torno a los grupos cargados, los dipolos del agua se orientan conforme a la carga elctrica de cada grupo, de tal manera que la protena presenta una capa de solvatacin formada por el agua de hidratacin, que es el agua retenida por las cargas elctricas de la superficie de las protenas (En color rojo en la Figura derecha). Los AA polares sin carga tambin se disponen en la superficie, donde interaccionan con el agua mediante puentes de hidrgeno (Figura izquierda).

Cualquier factor que modifique la interaccin de la protena con el disolvente disminuir su estabilidad en disolucin y provocar la precipitacin. As, la desaparicin total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralizacin de las cargas elctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los puentes de hidrgeno facilitar la

agregacin intermolecular y provocar la precipitacin. La precipitacin suele ser consecuencia del fenmeno llamado desnaturalizacin. Desnaturalizacin de Protenas: Se llama desnaturalizacin de las protenas a la prdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptdica reducida a un polmero estadstico sin ninguna estructura tridimensional fija (Figura inferior).

Estado nativo

Estado desnaturalizado

Cuando la protena no ha sufrido ningn cambio en su interaccin con el disolvente, se dice que presenta una estructura nativa. Cualquier alteracin de la estructura nativa que modifique su interaccin con el disolvente y que provoque su precipitacin dar lugar a una estructura desnaturalizada. En una protena cualquiera, la estructura nativa y la desnaturalizada tan slo tienen en comn la estructura primaria, es decir, la secuencia de AA que la componen. Los dems niveles de organizacin estructural desaparecen en la estructura desnaturalizada. La desnaturalizacin provoca diversos efectos en la protena:

cambios en las propiedades hidrodinmicas de la protena: aumenta la viscosidad y disminuye el coeficiente de difusin una drstica disminucin de su solubilidad, ya que los residuos hidrofbicos del interior aparecen en la superficie prdida de las propiedades biolgicas. Seale 3 mtodos de fraccionamiento de las protenas y fundamento en forma breve.

7.

La Electroforesis en Zona Libre:Un sistema de electroforesis capilar se constituye de un capilar baado dentro de dos recipientes de solucin tampn donde se encuentran dos electrodos entre los cuales se aplica una tensin. En general, el nodo est a la entrada del capilar donde se inyecta la muestra. El ctodo est a la salida, cerca del detector. El principio de la electroforesis capilar est basado sobre la separacin, bajo la influencia de un campo elctrico, de molculas cargadas o neutras, inyectadas en

un tubo capilar llenado de una solucin "tampn". La migracin de estas molculas se debe a la superposicin de dos fenmenos: la electro-migracin y el flujo electro-osmtico. El fraccionamiento de las protenas constitutivas de las gelatinas se realiza en electroforesis capilar en zona libre, a pH cido. En estas condiciones, la velocidad de migracin de una molcula est en funcin de su movilidad electrofortica, reflejando su relacin carga/tamao.

Cromato-enfoque: Es una tcnica cromatogrfica til en la separacin de protenas atendiendo a sus puntos isoelctricos. Bsicamente se trata de crear un gradiente de pH utilizando la capacidad de tamponado de un intercambiador inico; si un tampn ajustado a un determinado pH se pasa a travs de un intercambiador inico equilibrado a diferente pH, se crea un gradiente de pH. Las protenas unidas al intercambiador sern eludas de acuerdo con sus puntos isoelctricos. La tcnica proporciona gran resolucin y concentra la muestra. Centrifugacin: Esencialmente una centrfuga es un aparato que separa partculas que estn en solucin. En Biologa estas partculas pueden ser clulas, orgnulos subcelulares o macromolculas. Hay dos tipos de procesos de centrifugacin: centrifugacin preparativa, cuyo objeto es aislar partculas especficas, y centrifugacin analtica, con la que se pretenden estimar propiedades fsicas de alguna partcula en concreto: sus propiedades hidrodinmicas. El tubo se llena con un gradiente de densidad, formado mediante un gradiente de concentracin de un soluto adecuado. La muestra (aqu, una mezcla de protenas) se aplica sobre el gradiente y se comienza la centrifugacin. Las molculas sedimentan de acuerdo con su tamao, forma y densidad (todo ello determina su coeficiente de sedimentacin).

Los Mtodos de Fraccionamiento empleados por la Industria Farmacutica Los mtodos de fraccionamiento empleados por la industria farmacutica se basan en la crioprecipitacin y en la precipitacin fraccional de grupos de protenas con etanol fro en condiciones controladas y a baja temperatura. Bsicamente se han seguido dos esquemas principales: el mtodo Cohn-Oncley y el de Kistler-Nishmann. Ambos mtodos se basan en cinco variables: concentracin de etanol, pH, fuerza inica, temperatura y concentracin proteica. Variando la concentracin de alcohol y la constante dielctrica de la mezcla proteica se consigue una precipitacin selectiva de las protenas plasmticas. En cada fraccin separada se obtiene, tras purificaciones posteriores, una protena especfica con inters teraputico.
8. Cmo se clasifican las protenas?

Se clasifican en: 1. HOLOPROTENAS Formadas solamente por aminocidos 2. HETEROPROTENAS Formadas por una fraccin protenica y por un grupo no protenico, que se denomina "grupo prosttico

HOLOPROTENAS Globulares Prolaminas:Zena (maza),gliadina (trigo), hordena (cebada) Gluteninas: Glutenina (trigo), orizanina (arroz). Albminas:Seroalbmina (sangre), ovoalbmina (huevo), lactoalbmina (leche) Hormonas: Insulina, hormona del crecimiento, prolactina, tirotropina Enzimas: Hidrolasas, Oxidasas, Ligasas, Liasas, Transferasas...etc. Colgenos: en tejidos conjuntivos, cartilaginosos Queratinas: En formaciones epidrmicas: pelos, uas, plumas, cuernos. Elastinas: En tendones y vasos sanguneos Fibronas: En hilos de seda, (araas, insectos) HETEROPROTENAS Glucoprotenas Ribonucleasa Mucoprotenas Anticuerpos Hormona luteinizante De alta, baja y muy baja densidad, que transportan lpidos en la sangre. Nucleosomas de la cromatina Ribosomas Hemoglobina, hemocianina, mioglobina, que transportan oxgeno Citocromos, que transportan electrones

Fibrosas

Lipoprotenas Nucleoprotenas Cromoprotenas

Criterios Fsicos

El criterio fsico ms utilizado es la solubilidad. As se distinguen 1. albminas: protenas que son solubles en agua o en disoluciones salinas diludas 2. globulinas: requieren concentraciones salinas ms elevadas para permanecer en disolucin 3. prolaminas: solubles en alcohol 4. glutelinas: slo se disuelven en disoluciones cidas o bsicas 5. escleroprotenas: son insolubles en la gran mayora de los disolventes Criterios Qumicos

Desde un punto de vista qumico, existen dos grandes grupos de protenas: 1. protenas simples: formadas exclusivamente por a-aminocidos, como es el caso de la ubiquitina, una proteasa intracelular formada por 53 AA.
2.

protenas conjugadas: que contienen adems de la cadena polipeptdica un componente no aminoacdico llamado grupo prosttico, que puede ser un azcar, un lpido, un cido nucleico o simplemente un in inorgnico. La protena en ausencia de su grupo prosttico no es funcional, y se

llama apoprotena. La protena unida a su grupo prosttico es funcional, y se llama holoprotena (holoprotena = apoprotena + grupo prosttico). Son protenas conjugadas la hemoglobina, la mioglobina, los citocromos, etc. En la figura inferior derecha se representa el citocromo c, donde el grupo prosttico (representado en color verde) es el grupo hemo. Criterios Estructurales

En cuanto a su forma molecular, podemos distinguir: 1. protenas globulares: la cadena polipeptdica aparece enrollada sobre s misma dando lugar a una estructura ms o menos esfrica y compacta.
2.

protenas fibrosas: si hay una dimensin que predomina sobre las dems, se dice que la protena es fibrosa. Las protenas fibrosas, por lo general, tienen funciones estructurales. Criterios Funcionales

Desde un punto de vista funcional se distinguen: 1. protenas monomricas: constan de una sola cadena polipeptdica, como la mioglobina.
2.

protenas oligomricas: constan de varias cadenas polipeptdicas. Las distintas cadenas polipeptdicas que componen una protena oligomrica se llaman subunidades, y pueden ser iguales o distintas entre s. Un ejemplo es la hemoglobina, formada por 4 subunidades, cada una representada de distinto color en la figura inferior.

9. Diga 8 funciones de las protenas

FUNCION ENZIMATICA La gran mayora de las reacciones metablicas tienen lugar gracias a la presencia de un catalizador de naturaleza proteica especfico para cada reaccin. FUNCIN HORMONAL Las hormonas son sustancias producidas por una clula y que una vez secretadas ejercen su accin sobre otras clulas dotadas de un receptor adecuado. RECONOCIMIENTO DE SEALES QUMICAS La superficie celular alberga un gran nmero de protenas encargadas del reconocimiento de seales qumicas de muy diverso tipo (figura de la izquierda). Existen receptores hormonales, de neurotransmisores, de anticuerpos, de virus, de bacterias, etc. FUNCIN DE TRANSPORTE En los seres vivos son esenciales los fenmenos de transporte, bien para llevar una molcula hidrofbica a travs de un medio acuoso (transporte de oxgeno o lpidos a travs de la sangre) o bien para transportar molculas polares a travs de barreras hidrofbicas (transporte a travs de la membrana plasmtica).

FUNCIN ESTRUCTURAL Las clulas poseen un citoesqueleto de naturaleza proteica que constituye un armazn alrededor del cual se organizan todos sus componentes, y que dirige fenmenos tan importantes como el transporte intracelular o la divisin celular. FUNCIN DE DEFENSA La propiedad fundamental de los mecanismos de defensa es la de discriminar lo propio de lo extrao. En bacterias, una serie de protenas llamadas endonucleasas de restriccin se encargan de identificar y destruir aquellas molculas de DNA que no identifica como propias (en color blanco en la figura de la derecha). FUNCIN DE MOVIMIENTO Todas las funciones de motilidad de los seres vivos estn relacionadas con las protenas. As, la contraccin del msculo resulta de la interaccin entre dos protenas, la actina y la miosina. El movimiento de la clula mediante cilios (foto de la izquierda) y flagelos (figura de la derecha) est relacionado con las protenas que forman los microtbulos. FUNCIN DE RESERVA La ovoalbmina de la clara de huevo, la lactoalbmina de la leche, la gliadina del grano de trigo y la hordena de la cebada. FUNCIN REGULADORA Muchas protenas se unen al DNA y de esta forma controlan la transcripcin gnica. De esta forma el organismo se asegura de que la clula, en todo momento, tenga todas las protenas necesarias para desempear normalmente sus funciones. Estructural Como las glucoprotenas que forman parte de las membranas. Las histonas que forman parte de los cromosomas El colgeno, del tejido conjuntivo fibroso. La elastina, del tejido conjuntivo elstico. La queratina de la epidermis. Enzimatica Son las ms numerosas y especializadas. Actan como biocatalizadores de las reacciones qumicas y puedes verlas y estudiarlas con detalle Hormonal Insulina y glucagn Hormona del crecimiento Calcitonina Hormonas tropas Defensiva Inmunoglobulina Trombina y fibringeno Transporte Hemoglobina Hemocianina Citocromos Reserva Ovoalbmina, de la clara de huevo Gliadina, del grano de trigo Lactoalbmina, de la leche

10. En que se fundamenta la Electroforesis? La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas (protenas o cidos nucleicos) sobre la base de su tamao molecular y carga elctrica. Los cidos nucleicos ya disponen de una carga elctrica negativa, que los dirigir al polo positivo, mientras que las protenas se cargan con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente del peso molecular. Para la separacin se usa un gel de agarosa o poliacrilamida (fibras cruzadas, como una malla). Al poner la mezcla de molculas y aplicar un campo elctrico, stas se movern y debern ir pasando por la malla, por la que las pequeas se movern mejor, ms rpidamente. As, las ms pequeas avanzarn ms y las ms grandes quedarn cerca del lugar de partida. 11. En que se fundamenta la cromatografa de exclusin? Tambin llamada de filtracin en gel o cromatografa de permeacin en gel, se basa en la diferencia de penetracin de las molculas en los poros de la fase estacionaria debida a que la separacin obtenida depende del tamao de la molcula. El tiempo de elucin es proporcional al peso molecular de los mismos, por lo que no es muy usada con los compuestos de alto peso molecular. Este tipo de separacin por tamao difiere de las dems tcnicas de cromatografa en que no existen interacciones fsicas o qumicas entre el analito y la fase estacionaria. Es una tcnica reproducible, escalable y rpida. La fase fija est formada por partculas polimricas o de slice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las molculas de pequeo tamao. Las molculas de tamao grande se excluyen totalmente y son eluidas en primer lugar, mientras que las de pequeo tamao tienen acceso a todo el volumen poroso y son las ltimas que se eluyen; de esto se deduce que el volumen disponible para las molculas pequeas es mayor que para las grandes. Por lo tanto las molculas se eluyen por su tamao decreciente. En resumen los factores que determinan la separacin de las molculas son el tamao del poro, el tamao de la partcula y el flujo de elucin. Los diferentes tipos de partculas usadas deben ser estables, mecnica y qumicamente, tener bajo contenido en grupos inicos, uniformidad de poro y tamao. Los compuestos pueden ser derivados de dextranos, derivados de agarosa, derivados de acrilamidas y esferas de vidrio. Hay diferentes tamaos de partcula para un gel: a menor tamao mayor resolucin y menor gasto en la columna. Esta tcnica se emplea en la separacin de protenas de alimentos, determinacin de glucosa y fructosa en zumos de fruta, etc.

BIBLIOGRAFA

es.wikipedia.org/wiki/Cromatografa www.ub.es/biocel/wbc/tcnicas/cromatografia html.rincondelvago.com/cromatografa http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cromatografia.htm http://www.arrakis.es/~rfluengo/proteinas.html http://www.arrakis.es/~lluengo/pproteinas.html#GlossClasi http://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis http://biologia.uab.es/biocomputacio/treballs02-03/A_Ramos/2d.html http://www.ugr.es/~quiored/lab/oper_bas/crom.htm http://www.monografias.com/trabajos7/amin/amin.shtml http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa http://www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes/Practicas/Medicina http://www.monografias.com/trabajos15/proteinas/proteinas.shtml