Evaluacin en el laboratorio (in vitro) del sistema inmune. Instituto Superior de Ciencias Mdicas. Departamento de Inmunologa Autores: Dr.

Antonio Gonzlez Griego, Esp. 2do Grado, Prof. Titular y Principal Inmunologa Dra. Victoria Ramrez Albajs. Esp. 2do Grado Prof. Instructor Inmunologa Dra. Victoria E. Gonzlez Ramrez. Esp, 2do Grado Prof. Auxiliar Inmunologa Dr. Josu Acosta Acosta, Esp, 2do Grado Prof. Auxiliar Inmunologa. Lic. Antonio Melchor Rodrguez, Prof. Auxiliar Inmunologa. ATD. Adonay Martnez Perera INTRODUCCIN La mayora de las inmunodeficiencias frecuentemente solicitan atencin clnica debido a un aumento en la incidencia o severidad de enfermedades infecciosas ms all de lo que es considerado "normal." Estas enfermedades tambin pueden presentarse clnicamente con sntomas que no se originan de trastornos de rganos o clulas directamente relacionados al sistema inmune. La evaluacin del laboratorio de inmunodeficiencia sospechada es guiada por las circunstancias particulares de la presentacin del paciente, como la edad de ataque de enfermedad, la naturaleza de las infecciones (viral, bacteriano, mictico) y cualquier sntoma o signo no inmunolgico asociado. Las pruebas normalmente usadas se revisarn; estas pruebas deben ser suficientes para la evaluacin inicial de la mayora de casos de deficiencia inmune que se originan de trastornos linfocitarios [1]. El diagnstico definitivo frecuentemente requiere mtodos moleculares especializados que no estn disponibles generalmente en todos los laboratorios. Un directorio de gentica molecular y otro especializado para inmunodeficiencias puede encontrarse en internet en: http://bioinf.uta.fi/IDdiagnostics [2]. INMUNIDAD CELULAR La inmunidad celular especfica es mediada por clulas T, y los defectos que afectan a estos linfocitos justifican las deficiencias inmunes ms severas. Debido a que la produccin de anticuerpos requiere la funcin intacta de las clulas T, la mayora de las alteraciones de las clulas T llevan a inmunodeficiencias combinadas (celular y humoral). Cualquier nio que presenta enfermedades virales y/o bacterianas recurrentes o severas o las infecciones oportunistas en el primer ao de vida requiere evaluacin de nmero y funcin de clulas T. Consideraciones similares se aplican a los adultos con estos tipos de infecciones. En el grupo de edad peditrico, la mayora de los casos son debidos a deficiencias inmunes congnitas. Las causas secundarias mas importantes estn relacionadas con trastornos del metabolismo proteico (no ingestin, trastornos digesto-absortivos, dficit en

sntesis o aumento en prdidas), otras causas de trastornos secundarios son infeccin por VIH y iatrognicas debido a terapia de enfermedades auto inmunes, trasplantes y enfermedades malignas. El hemograma completo con diferencial debe realizarse en todos los casos. Se establecen bien rangos normales para las poblaciones de clulas (linfocitos) en nios y adultos [3,4]. En muchas enfermedades, las poblaciones celulares son inicialmente normales, disminuyendo posteriormente. El conteo diferencial de clulas sanguneas establece la presencia o ausencia de linfopenia, lo cul ayuda grandemente al diagnstico. Sin embargo, un solo hallazgo de linfopenia debe interpretarse con cautela, ya que las linfopenias transitorias frecuentemente se encuentran en una variedad de enfermedades infecciosas comunes [5]. Por otro lado, no deben ignorarse linfopenias significativas, ya que estas pueden ser la primera evidencia de sndrome de inmunodeficiencia celular [6]. Tambin es de sealar que el conteo linfocitario normal en infantes es mas alto que en nios mayores y adultos debido a la migracin de linfocitos inmunocompetentes de los rganos linfoides centrales (mdula y timo) a los rganos linfoides perifricos constitutivos (bazo y ganglios linfticos) y de ellos al sistema de piel y asociado a mucosas (respiratorias, digestivas y genitourinarias). En un infante con cualquier infeccin significativa y un conteo total de linfocitos < 3,000 cel /mm cbico, est indicada la citometra de flujo. Una linfopenia persistente requiere investigacin extensa de funcin inmune. La determinacin de subpoblaciones de linfocitos por citometra de flujo Es apropiada en la evaluacin inicial de todos los pacientes con infecciones oportunistas o linfopenias severas o persistentes [7]. Las infecciones oportunistas no son evidentes tempranamente entre los pacientes con variantes ms ligeras de sndromes de inmunodeficiencias combinadas. Estos nios frecuentemente tienen infecciones bacterianas recurrente como sinusitis, neumonas o se presentan como casos severos de infecciones comunes de la niez; estas consideraciones se aplican de modo similar a los adultos. La mayora de estos pacientes se pueden detectar inicialmente con un hemograma con diferencial, medida de inmunoglobulinas de suero y sobre todo con respuestas de anticuerpos especficos a pruebas cutneas in vivo. Cuando estas pruebas no son diagnsticas de un sndrome particular o cuando estn presentes marcadas anormalidades, el anlisis de subconjuntos de los linfocitos por citometra de flujo debe emprenderse. Mtodo Para el anlisis por citometra de flujo, las clulas de la sangre son mezcladas con anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos que se unen como ligandos a receptores de superficie de clulas que distinguen varias categoras

funcionales de linfocitos. El citmetro de flujo detecta la fluorescencia y se realiza el conteo porcentual de los distintos tipos de linfocitos. Es indispensable que el hemograma y diferencial se realicen en la muestra de sangre obtenida en el momento del anlisis de citometra de flujo, o el propio citmetro sea usado para determinar el nmero de los linfocitos. Este anlisis permite el clculo de los nmeros absolutos de cada subconjunto de linfocitos. Es posible que el porcentaje de un subconjunto particular sea anormal mientras el nmero total de clulas est dentro del rango normal, y vise-versa. Tabla 1 El anlisis de subconjuntos de linfocitos puede ser diagnstico en muchos casos de inmunodeficiencias y para varias formas de linfoma. En cabala 2 se resumen alteraciones en varias poblaciones del linfocitos en varias enfermedades que ocasionan deficiencia inmune. Tabla 2. Mientras ciertos defectos inmunes estn asociados con modelos caractersticos de subconjuntos de linfocitos, las poblaciones de linfocitos pueden parecer incluso ser completamente normales con evidencia clnica de trastornos inmunes significativos. Recprocamente, como con nmeros de linfocitos totales, los subconjuntos de los linfocitos pueden estar profundamente alterados por enfermedades infecciosas comunes y otros factores [5,8]. As, con propsitos diagnsticos, los datos de citometra de flujo deben ser considerados junto con las pruebas funcionales del sistema inmune. Prueba in vivo de respuesta inmune Esta prueba mide la respuesta al reto antignico de una inyeccin intradrmica de un antgeno al que un individuo ya ha sido expuesto (respuesta de memoria). Una respuesta positiva a la inyeccin del antgeno intradrmica requiere captacin y procesamiento de antgeno por las clulas presentadoras de antgeno, su interaccin con clulas T CD4+ colaboradoras, produccin del citoquinas por clulas T, y el reclutamiento subsiguiente y activacin de monocitos y macrfagos. As, la prueba cutnea es un indicador sensible de inmunidad celular intacta, pero los resultados negativos deben interpretarse con cautela. La respuesta es inestable en nios menores de un ao de edad (incluso con exposicin anterior al antgeno), y se suprime a menudo durante infecciones virales y bacterianas (incluso con organismos atenuados como en las vacunas combinadas contra sarampin, rubola y paperas). La reactividad tambin se deprime por drogas anti-inflamatorias (corticosteroides) y otros inmunosupresores (Ej.: ciclosporina). Mtodo Para la valoracin de respuestas a las pruebas cutneas, se puede usar inyeccin intradrmica de 0.1ml de toxoide tetnico (fluido, 10 LFU/mL, WyethAyerst), antgeno de paperas (Antgeno-MSTA de prueba cutnea de paperas, Connaught), y antgeno de Cndida (Antgeno de prueba cutnea de monilia, dilucin 1:200, Miles).

La respuesta se mide 48 a 72 horas despus de la inyeccin. Induracin de ms de 5 mm es considerada positiva en todos los casos. En nios, induracin de ms de 2 mm se acepta a veces como positiva [7]. Eritema solo no indica una reaccin positiva. Las ventajas principales de la prueba cutnea son su facilidad y economa; es una prueba de la gran utilidad en muchos casos de sospecha de inmunodeficiencia celular. Si una prueba cutnea es negativa debe seguirse al paciente o repetir la prueba (a menudo siguiendo a una dosis de refuerzo), o realizar la medicin de poblaciones del linfocitos por citometra de flujo, combinada con ensayo in vitro de funcin de clulas T. El ensayo in vitro (particularmente la estimulacin con mitgenos) es menos sensible a interferencias durante enfermedades intercurrentes o por drogas. Estudios in vitro de funcin de clulas T Los estudios in vitro de funcin de clulas T miden la proliferacin de clulas T en sangre perifrica en respuesta a mitgenos (tales como fitohemaglutininas de lectinas de plantas, concanavalina A, o pokeweed mitogen) o a antgenos especficos (tales como toxoide tetnico o diftrico o antgenos de C. albicans). Tambin puede medirse la proliferacin en respuesta a linfocitos alognicos (Ej. Cultivos mixtos de linfocitos). En estas pruebas, las clulas mononucleares de sangre perifrica del paciente (linfocitos y monolitos purificados) se incuban con la sustancia de prueba o clulas durante tres a seis das. Durante las ltimas 24 horas del cultivo, se agrega timidina tritiada al medio. Las clulas en divisin (clulas de T) incorporan la timidita en su ADN. La magnitud de la proliferacin es determinada midiendo la toma de radioactividad por las clulas. La prueba se interpreta como negativa, parcial, o normal por comparacin con el control normal de linfocitos ensayado simultneamente. Muchos laboratorios tambin informan los resultados como ndice de la estimulacin (IE). sta es la proporcin de radioactividad (como cuentas por minuto, o CPM) con estmulo dividido por las CPM sin el estmulo (fondo). Respuesta a mitgenos La mayora de los mitgenos requieren clulas presentadoras de antgeno funcionales para la estimulacin de clulas T, aunque los mecanismos de presentacin y procesamiento de antgeno son evitados. Los mitgenos son estimulantes poderosos para las clulas T, y pueden evaluarse respuestas en los pacientes de cualquier edad, sin tener en cuenta el estado de la inmunizacin. Dependiendo del mitgeno (fitohemaglutinina o PHA es el mas frecuentemente usado) y el laboratorio, el rango de CPM informado para controles normales es aproximadamente 50,000 a 300,000 y el IE entre 10 y 200. Los resultados se interpretan comparando con los controles dando como normal (>50 por ciento del control), bajo (25 a 50 por ciento), muy bajo (10 a 25 por ciento), o ausente

(< 10 por ciento). Los resultados expresados como IE varan ampliamente entre los laboratorios. En general, un IE < 10 por ciento pueden ser considerados como ninguna respuesta. Proliferacin disminuida o ausente indica una alteracin seria de la funcin de las clulas T. Las respuestas a mitgenos estn deprimidas severamente en la inmensa mayora de los pacientes con inmunodeficiencia combinada severa o SIDA. En comparacin, la repuesta puede ser parcial o normal en los sndromes ms ligeros de inmunodeficiencia combinada, en deficiencia principalmente humoral, o en pacientes que reciben terapia inmunosupresora. Respuesta a antgenos especficos Los tests antgeno-especficos son ms sensibles que los ensayos de mitgenos como indicadores de defectos de funcin de cellas T, puesto que los mecanismos de activacin son ms complejo que para mitgenos. Estas pruebas requieren procesamiento del antgeno y clulas presentadoras de antgeno, pero el reclutamiento de clulas T efectoras (como ocurre in vivo con las pruebas cutneas de respuesta celular) no es necesario. Al igual que en las pruebas cutneas de respuesta celular in vivo, in vitro las pruebas de proliferacin de antgeno especficas no son tiles en infantes o otros pacientes que no han completado una serie primaria de inmunizaciones con la prueba cutnea. Los toxoides tetnico y diftrico y la monilia (Cndida) son antgenos frecuentemente usados para este ensayo. Puesto que solo un nmero pequeo de clulas responde, los cultivos deben mantenerse ms mucho tiempo, y la incorporacin de radioactividad es ms baja que para el estmulo del mitgeno. Se informan a menudo resultados expresados como CPM de 5,000 a 50,000; los resultados como ndice de estimulacin generalmente van de 4 a 50. Debido a la variacin muy grande en la frecuencia de clulas de T antgeno-especficas en la sangre de controles sanos, el ndice de estimulacin es a menudo muy importante para la interpretacin. En general, un ndice de estimulacin para un antgeno especfico >4 se considera adecuado. En muchos casos de deficiencia inmune combinada, las respuestas a antgenos especficos estn disminuidas o incluso ausentes mientras que las respuestas a mitgenos permanecen intactas. En deficiencia inmune secundaria, las respuestas a antgenos especficos se suprimirn tambin generalmente ms fcilmente que las respuestas a mitgenos. Como con la prueba cutnea, una inmunizacin de refuerzo seguido de un ensayo de proliferacin in vitro, puede detectar una respuesta significativa INMUNIDAD HUMORAL Una panhipogammaglobulinemia es un sello de la mayora de las formas de deficiencia inmune combinada severa. En otras deficiencias inmunes combinadas, as como en varias inmunodeficiencias predominantemente humorales, hay alteraciones caractersticas en el perfil de isotipos de inmunoglobulinas (Ig) que pueden ayudar en el diagnstico. Clnicamente, la

deficiencia de anticuerpos ms frecuentemente resulta en infecciones seno pulmonares recurrentes y severas con cepas bacterianas encapsuladas. Medida de inmunoglobulinas del suero La medida rutinaria de IgG, IgA, e IgM es til en todos los casos de deficiencias de anticuerpos sospechados, y en nios mayores de un ao de edad, la medicin de subclases de IgG puede considerarse pero puede ser polmico. La medicin de IgE tambin debe realizarse puesto que los niveles sricos pueden alterarse en modelos caractersticos que pueden ayudar en el diagnstico. La medida en suero de IgD no es til para el diagnstico de deficiencia inmune. Medida en suero del ttulo de los anticuerpos especficos La medida en suero de niveles de anticuerpos especficos (normalmente IgG) en respuesta a la inmunizacin intencional o a la infeccin natural es el mejor acercamiento para determinar la integridad de la inmunidad humoral por dos razones: Clnicamente el deterioro significativo en respuestas de anticuerpos especficos puede ocurrir con niveles sricos normales de Ig. Respuestas normales a la inmunizacin pueden ocurrir con niveles subnormales de Igs totales o de sus subclases.

Como con las respuestas in vitro a antgenos por las clulas T, una exposicin anterior (previa) al inmungeno es necesaria para la medicin en suero de niveles de anticuerpos especficos tiles. Los antgenos normalmente empleados son aqullos usados en la inmunizacin primaria. stos incluyen toxoides tetnico y la diftrico y el polisacrido capsular del hemfilus influenzae tipo B (HIB), y los polisacridos capsulares tipo especficos de pneumococcus. En casos en los que los resultados son equvocos, una dosis de inmunizacin de refuerzo (booster) con medicin repetida cuatro semanas mas tarde, puede ser til. Aunque el HIB y los antgenos capsulares del neumococo son polisacridos, las vacunas actuales conjugan esta mitad a varias molculas de protena como toxoide diftrico (Hibtiter, Lederle-Praxis; Prohiba, Connaught; Prevnar, WyethAyerst) y la protena de la membrana exterior complejo de meningococo (Pedvaxhib, Merck). Por consiguiente, la medida de anticuerpos al polisacrido capsular, o a los subtipos del neumococo contenidos en Prevnar (una vacuna del pneumococco), evala los mismos mecanismos de la respuesta inmune que ocurren en otras respuestas a antgenos proteicos. Las interacciones celulares que llevan a la produccin de anticuerpos antipolisacridos difieren de aqullas de la respuesta humoral a antgenos proteicos. Aunque los detalles de estas diferencias no son completamente entendidos, est claro que la deficiencia selectiva a antgenos carbohidratos existe. Para la valoracin de respuestas a antgenos de polisacridos, la medicin de ttulos de anticuerpos a varios serotipos de neumococo

(Pneumovax 23, Merck; Pnu-imune 23, Lederle) puede ser til en adultos y nios de ms de dos aos (la respuesta no es confiable en nios menores). Las isohemaglutininas son anticuerpos generados en respuesta a polisacridos de la flora intestinal que tiene reaccin cruzada con antgenos de los eritrocitos de los grupos A y B. Ellos generalmente aparecen en la sangre a los seis meses de edad. La determinacin de niveles de isohemaglutininas puede ser til en nios mayores que no tienen el tipo de sangre AB [9]. Generalmente se considera que la respuesta a la vacuna es el indicador ms confiable de funcin inmune humoral intacta. Los mtodos para determinar niveles sricos de inmunoglobulinas incluyen nefelometra, turbidimetra, inmunodifusn radial, mtodos inmunoenzimticos y radioinmunoensayo. El mtodo usado depende del laboratorio y de la clase o subclase de anticuerpo que se va a medir. Se usan mtodos similares para la medicin de ttulos de anticuerpos antgeno-especficos. Los laboratorios pueden determinar sus propios rangos de referencia, o usar datos proporcionados por fabricantes de reactivos comerciales. Sobre todo con respecto a niveles sricos de inmunoglobulinas, es crtico que los rangos normales de referencia usados estn ajustados a la edad. Tablas 3 y 4 resumen anormalidades de laboratorio de inmunidad especfico celular y humoral en varios desrdenes de inmunodeficiencias humorales y combinadas severas. DETECCIN DE PORTADOR DE ANOMALAS GENTICAS Detectar la presencia de portar anomalas genticas en los padres de nios inmunodeficientes es crtico para el consejo exacto con respecto al riesgo de concebir en el futuro nios afectados. La determinacin del estado de portador en padres tambin puede ayudar en el diagnstico de formas particulares de inmunodeficiencia, particularmente en inmunodeficiencias unidas al cromosoma X, caso en que aproximadamente la mitad de las madres son portadoras. Anlisis de inactivacin del cromosoma X Temprano en el desarrollo de embriones hembras, las clulas al azar inactivan uno de los dos cromosomas X (materno o paterno), un proceso llamado lionizacin. Todas las clulas que se desarrollan seguidamente retienen el mismo modelo de inactivacin. Como resultado, aproximadamente la mitad de las clulas de hembras totalmente-desarrolladas tienen inactivado el cromosoma de X materno, y la mitad del cromosoma X paterno. Si uno de los cromosomas X porta un defecto gentico que previene el desarrollo de un tipo particular de clula, entonces todas las clulas supervivientes de un linaje particular inactivarn slo el cromosoma "malo". Como un ejemplo, los linfocitos B en la agammaglobulinemia unida al X no pueden desarrollar precursores que inactiven el cromosoma X "bueno". As, los portadores de la mutacin gentica tendrn linfocitos B en que slo el cromosoma X "malo" es inactivado. Esto se llama inactivacin de cromosoma X

no al azar. Si los dos cromosomas X maternos pueden ser distinguidos por marcadores genticos unidos al gen afectado, entonces el modelo de inactivacin del cromosoma de X en varios tipos de clulas puede estudiarse [10]. Estos anlisis pueden aplicarse a las madres de nios varones afectados para distinguir casos espordicos de los casos heredados (donde hay duda), y para proporcionar consejo gentico a las hermanas hembras de madres de nios afectados y a la descendencia hembra de portadores. Determinando que forma(s) de marcador (es) estn asociadas con el gen defectivo en el portador, tambin es posible establecer el origen del cromosoma X en fetos masculinos. Los anlisis similares son tiles con otros desrdenes de inmunodeficiencias unidas al X como el sndrome de Wiskott-Aldrich, e inmunodeficiencias severas combinadas unidas al X. REFERENCIAS 1. Detrick, B, Hamilton, RG, Rose, NR (Eds). Manual of Clinical Laboratory Immunology, 6th Edition. ASM Press, Washington, DC 2002. 2. Samarghitean, C, Valiaho, J, Vihinen, M. Online registry of genetic and clinical immunodeficiency diagnostic laboratories, IDdiagnostics. J Clin Immunol 2004; 24:53. 3. Comans-Bitter, WM, de Groot, R, van den Beemd, R, et al. Immunophenotyping of blood lymphocytes in childhood: reference values for lymphocyte subpopulations. J Pediatr 1997; 130:388. 4. Shearer, WT, Rosenblatt, HM, Gelman, RS, Oyomopito, R. Lymphocyte subsets in healthy children from birth through 18 years of age: The Pediatric AIDS clinical trials group P1009 study. J Allergy Clin Immunol 2003; 112:973. 5. Laurence, J. T-cell subsets in health, infectious disease, and idiopathic CD4+ T lymphocytopenia. Ann Intern Med 1993; 119:55. 6. Kalman, L, Lindegren, ML, Kobrynski, L, et al. Mutations in genes required for T-cell development: IL7R, CD45, IL2RG, JAK3, RAG1, RAG2, ARTEMIS, and ADA and severe combined immunodeficiency: HuGE review. Genet Med 2004; 6:16. 7. Bonilla FA. Combined B- and T-cell deficiencies. In: Manual of Clinical Laboratory Immunology, 6th Edition, Detrick, B, Hamilton, RG, Rose, NR (Eds), ASM Press, Washington, DC 2002. p.819. 8. Shearer, WT, Rosenblatt, HM, Gelman, RS, et al. Lymphocyte subsets in healthy children from birth through 18 years of age: the Pediatric AIDS clinical trials group P1009 study. J Allergy Clin Immunol 2003; 112:973. 9. Fong, SW, Qaqundah, BY, Taylor, WF. Developmental patterns of ABO isoagglutinins in normal children correlated with the effects of age, sex, and maternal isoagglutinins. Transfusion 1974; 14:551. 10. Hinds, H, Craig, IW, Chen, ZY, et al. Carrier detection in X-linked immunodeficiencies. II: An X inactivation assay based on differential methylation of a line-1 repeat at the DXS255 locus. Immunodeficiency 1993; 4:213.