CIRCULAR TCNICA N 6

ISSN 1517-5146 Dezembro, 2000

MTODOS

DE

ANLISE
NA

DE

TECIDOS VEGETAIS

UTILIZADOS

EMBRAPA SOLOS

Ciraca Arcangela Ferreira de Santana do Carmo Wilson Sant'Anna de Arajo Alberto Carlos de Campos Bernardi Marcelo Francisco Costa Saldanha

Solos

Copyright 2000. Embrapa Embrapa Solos. Circular Tcnica n 6 Reviso de Portugus Andr Luiz da Silva Lopes Tratamento editorial Jacqueline Silva Rezende Mattos Fotografia Claudio Lucas Capeche Capa Lipe Dias Normalizao bibliogrfica Maria da Penha Delaia Tiragem desta edio: 300 exemplares Embrapa Solos Rua Jardim Botnico, 1.024 22460-000 Rio de Janeiro, RJ Tel: (21) 2274-4999 Fax: (21) 2274-5291 E-mail: embrapasolos@cnps.embrapa.br Site: http://www.cnps.embrapa.br

Embrapa Solos Catalogao-na-publicao (CIP)

Mtodos de anlise de tecidos vegetais utilizados na Embrapa Solos / Ciraca Arcangela Ferreira de Santana do Carmo ... [et al.]. - Rio de Janeiro : Embrapa Solos, 2000. 41 p. (Embrapa Solos. Circular Tcnica; 6). ISSN 1517-5146 1. Planta - Nutrio. 2. Diagnose foliar. 3. Tecido vegetal - Anlise Mtodo. I. Carmo, Ciraca Arcangela Ferreira de Santana do. II. Arajo, Wilson Sant'Anna de. III. Bernardi, Alberto Carlos de Campos. IV. Saldanha, Marcelo Francisco Costa. V. Srie. CDD (21. ed.) 631.42

AUTORIA

Ciraca Arcangela Ferreira de Santana do Carmo Wilson SantaAnna de Arajo

1

Alberto Carlos de Campos Bernardi 1 Marcelo Francisco Costa Saldanha

2

1 2

Pesquisador da Embrapa Solos. Tcnico de Nvel Superior da Embrapa Solos. iii

SUMRIO

1 2 3 4 5 6 7 8 9

INTRODUO 1 FLUXOGRAMA DO LABORATRIO 3 AMOSTRAGEM 4 RECEBIMENTO DA AMOSTRA 5 PREPARO DAS AMOSTRAS 8 LAVAGEM DA VIDRARIA 10 SOLUBILIZAO (DIGESTO) 11 DETERMINAES ANALTICAS 15 UNIDADES E EXPRESSO DOS RESULTADOS 40

10 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 41

RESUMO

O crescente aumento da populao, e a conseqente expanso da demanda por alimentos, gera a necessidade de maior eficincia dos agrossistemas e maior produtividade das reas cultivadas. Esta eficincia ser sustentvel, se houver uma otimizao de recursos e insumos, buscando aumentos da produo atravs do manejo racional da fertilidade do solo e da nutrio de plantas sem ocasionar danos ao meio ambiente. Neste contexto, a diagnose foliar constitui-se em uma ferramenta extremamente importante para a avaliao e o monitoramento do estado nutricional das plantas. Assim sendo, a Embrapa Solos, consciente de suas atribuies em envidar esforos para a obteno de mximas produtividades com o mnimo de danos ambientais decorrentes da aplicao de fertilizantes e corretivos no solo, instalou em 1996, o laboratrio de tecidos vegetais, que atende os projetos de pesquisa da unidade e das instituies que fazem parte dos sistemas de pesquisas. Este trabalho relata os procedimentos analticos utilizados para a determinao dos principais nutrientes essenciais s plantas, realizados no laboratrio de anlise de tecidos vegetais da Embrapa Solos. Para cada mtodo sero apresentados os princpios, materiais e equipamentos, reagentes e solues e procedimentos. Termos para indexao: metodologias, diagnose foliar, nutrio de plantas, estado nutricional.

vii

ABSTRACT

Analytical Methods of Plant Tissue Used in Embrapa Solos

The continuous growth of population, allied with foodstuff requirement expansion, has begotten the need of a larger agrosystem efficiency and a larger be productivity if on cultivated as areas. as This input effectiveness will sustainable resources well

optimization befall, in order to increase production by wise usage of soil fertility and plant nutrition, without damaging the environment. In this context, leaf diagnosis is an extremely important tool on the evaluation and monitoring plants nutritional status. Considering this, Embrapa Soils, conscious of its responsibility on making efforts so as to obtain maximum productivity with a minimum environmental harm caused by soil fertilizers and correction products application, created, on 1996, the plant tissue laboratory, which attends its own research projects and the institutions belonging to the research system as well. This work shows the analytical procedures currently used on the determination of the main essential nutrients to the plants, performed at Embrapa Soils plant tissue laboratory. For each analysis methodology, theoretical principles, equipment and materials used, reagents and solutions will be shown. Index terms: analytical methodology, foliar diagnosis, plant nutrition, nutritional status.

ix

INTRODUO
O crescente aumento da populao e a conseqente expanso

da demanda por alimentos geram a necessidade de maior eficincia dos agrossistemas e maior produtividade das reas cultivadas. Esta eficincia ser sustentvel se houver uma otimizao de recursos e insumos, buscando aumentos da produo atravs do manejo racional da fertilidade do solo e da nutrio de plantas. Neste contexto, a diagnose foliar constitui-se em uma ferramenta extremamente importante para a avaliao e o monitoramento do estado nutricional das plantas. A diagnose nutricional, atravs da anlise de tecidos vegetais, tem se mostrado um guia til para o manejo dos nutrientes e realizada com os seguintes objetivos: diagnosticar visualmente; identificar causa de sintomas visuais observados no campo; mapear reas que apresentam suprimento no adequado de nutrientes; avaliar se um determinado nutriente aplicado foi absorvido pela planta; identificar interaes entre nutrientes; caracterizar a causa especfica de um problema nutricional; juntamente com a anlise de solo, orientar um programa racional de adubao e correo do solo. um problema nutricional no identificado

Mtodos de Anlise de Tecidos Vegetais utilizados na Embrapa Solos

Portanto, a utilizao da anlise foliar na avaliao nutricional das plantas pode revelar deficincias ou excessos de um ou mais nutrientes, permitindo que sejam realizadas as correes, evitando o comprometimento agrcolas. Assim sendo, a Embrapa Solos, consciente de suas atribuies em envidar esforos para a obteno de mxima produtividade com o mnimo de danos ambientais decorrentes da aplicao de fertilizantes e corretivos no solo, instalou, em 1996, o laboratrio de tecidos vegetais. At o momento tem realizado anlises atendendo necessidade dos projetos de pesquisa da unidade, como das instituies que fazem parte do sistema de pesquisa, como as universidades, principalmente no que se refere execuo de teses de mestrado e doutorado. Equipado com instrumental analtico atualizado, como da produtividade e da qualidade dos produtos

espectrmetro de emisso por plasma e analisador elementar para determinao simultnea de carbono e nitrognio totais por via seca, o laboratrio conta ainda com diferentes sistemas de purificao de gua (destilada, bi-destilada em quartzo e ultra pura). Paralelamente, vem calibrando, adequando e testando novos procedimentos analticos para utiliz-los na rotina, uma vez que os processos so dinmicos. Neste trabalho sero descritos os procedimentos analticos utilizados para a determinao dos principais nutrientes essenciais s plantas (N, P, K, Ca, Mg, S, B, Cu, Mn, Mo e Zn), realizados no laboratrio de anlise de tecidos vegetais da Embrapa Solos. Para cada mtodo sero apresentados os princpios, materiais e equipamentos, reagentes e solues, e procedimentos. As vidrarias no sero listadas, uma vez que so as comumente utilizadas em todos os laboratrios.

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FLUXOGRAMA DO LABORATRIO

Na Figura 1, encontra-se esquematizado o fluxograma das atividades do laboratrio de tecido vegetal, desde o preparo da amostra at os procedimentos analticos propriamente ditos.

Amostra

Preparo da amostra (lavagem, secagem e moagem)

Solubilizao Ntrico-perclrica

Solubilizao sulfrica

Solubilizao via seca

P Colorimetria (Amarelo vanadato)

K, Na Fotometria de chama

Ca, Mg Absoro atmica

S Turbidimetria

Cu, Fe, Mn, Zn ICP

N Kjeldahl

B Colorimetria (Azometina-H) Mo Colorimetria (Ditiol)

Figura 1. Fluxograma das anlises foliares na Embrapa Solos.

Conscientes de que o valor da anlise de plantas para a diagnose e monitoramento do estado nutricional depende no s da determinao analtica mais tambm da adoo de metodologias sistematizadas de amostragem e preparo da amostra, estes tpicos so brevemente enfocados neste trabalho, apesar de no fazerem parte da rotina do laboratrio.

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AMOSTRAGEM
A amostragem constitui-se em uma etapa importante na anlise

de plantas, podendo acarretar erros na interpretao dos resultados analticos e na identificao das limitaes nutricionais. Em geral, a fase onde ocorrem falhas com maior freqncia. Para garantir resultados que reflitam o estado nutricional da cultura, a amostra coletada deve ser representativa da populao, possibilitando assim, melhor interpretao. Nesta fase, devem ser observadas as instrues especficas da parte da planta a ser coletada, o estdio de desenvolvimento e a quantidade de material a ser coletado, uma vez que os resultados obtidos pela anlise qumica sero comparados com valores padres estabelecidos (valores crticos ou faixas de suficincia), para ento serem interpretados. As recomendaes tcnicas para amostragem de plantas encontram-se na literatura (Osaki, 1991, Malavolta et al. 1997 e Carmo et al. 1998).

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RECEBIMENTO DA AMOSTRA
As amostras recebidas pelo correio ou entregues diretamente

pelos interessados so rigorosamente identificadas atravs de protocolo e etiquetadas com o nmero do laboratrio. Por ocasio do recebimento da amostra preenchido um formulrio, que tem como objetivo subsidiar a interpretao dos resultados analticos (Figura 2).

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LASP Laboratrio de anlise de gua, solos e plantas

1. Identificao Data: Nome do proprietrio Nome da propriedade Endereo Telefone: Fax: e-mail: N . laboratrio:
o

Endereo para remessa dos resultados: Responsvel pela remessa

2. Descrio da amostra Cultura: Produtividade: Variedade: c Mdia c Perfilhamento c Frutificao Idade: N . de amostras: c Baixa ___________
o

c Alta Data da amostragem: Estdio de crescimento:

c Florescimento c Maturao c Outros _____________ c Limbo c Outros _____________

Material enviado:

c Incio Folha inteira (com pecolo) c

c Planta inteira Descrio de sintomas:

Sintomas em folhas:

c novas Avaliao do estado da cultura: c bom

c velhas mdio c

c ruim

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3. Caractersticas do plantio: Cultivo: Prticas: c Irrigao Ocorrncias: c Encharcamento Pulverizaes: c Seca c Pragas c Defensivos______________ c Doenas c Anlise solo c Adubao _________________ c Comercial c Domstico c Outros________

c Adubo foliar_____________

4. Descrio do local: Solo: Relevo: c Arenoso c Plano c Suave c Argiloso Cor_____________ c Baixada

c Acidentado

Cobertura vegetal predominante:

5. Nutrientes a serem analisados: N B P Cu K Fe Ca Mn Mg Zn S ________

6. Observaes:

Assinatura responsvel: _________________________________________

Figura 2. Formulrio de recebimento das amostras na Embrapa Solos.

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5 5.1

PREPARO DAS AMOSTRAS Lavagem

O ideal que as folhas sejam entregues ainda verdes ao

laboratrio, no mximo 2 dias aps a coleta. Quando no houver essa possibilidade, realiza-se a lavagem, somente para folhas verdes e vigorosas. As amostras inicialmente so lavadas com gua de torneira e gua ultra pura, posteriormente com detergente neutro, na concentrao de 1mLL-1, e novamente com gua ultra pura. No caso de amostras que receberam aplicao de defensivos agrcolas ou adubao foliar ou estiverem contaminadas com terra, alm do procedimento anterior, acrescenta-se a lavagem com uma soluo de HCl 30mLL-1, seguida de lavagem com gua desmineralizada. O tempo de contato das folhas com a gua ou com as solues descontaminantes deve ser sempre menor que 2 minutos, para se evitar as perdas dos nutrientes, principalmente o potssio.

5.2

Secagem
O material posto para secar primeiramente ao ar, sobre

superfcie plstica limpa e sombra. Posteriormente, embalado em sacos de papel etiquetados e colocado para secar em estufa com circulao forada de ar em temperaturas variando de 65 a 70o C at atingir peso constante. A temperatura no ultrapassa 70o C, para se evitar a perda de nutrientes.

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5.3

Moagem
A moagem realizada em moinhos tipo Willey, com facas e

cmara de ao inoxidvel e com peneiras de 0,5 ou 1mm de dimetro (20-40 mesh ), visando assegurar a homogeneizao da amostra. No caso de materiais ricos em leos e resinas, faz-se a macerao em gral. As amostras com grande volume so trituradas previamente com picadeira ou moinho de martelo.

5.4

Armazenagem
O armazenamento das amostras realizado em sacos ou

frascos plsticos, identificados com o nmero do laboratrio.

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LAVAGEM DA VIDRARIA

Considerando que as determinaes realizadas no laboratrio de tecidos vegetais so de alta sensibilidade e que os trabalhos so de baixas concentraes de nutrientes, procedimentos devem ser adotados a fim de se evitar possveis contaminaes, que podem invalidar a anlise do material. Ento, cuidados especias so tomados, como o de separar a vidraria utilizada para determinadas rotinas especiais, com, por exemplo, lodo de esgoto, e na fase de exagamento dos tubos. Os seguintes procedimentos so utilizados na lavagem: lavar a vidraria em gua corrente por duas vezes; imergi-la em soluo de cido ntrico 5 a 10% (v/v); enxaguar abundantemente (18,3M cm1). em gua ultra pura

Quando os tubos de digesto apresentam resduos ou crostas, so inicialmente lavados em gua corrente e imersos em soluo de detergente neutro a 5%, escovados at a completa eliminao dos resduos e lavados com gua corrente. Em seguida, so imersos em uma cuba plstica, com soluo de cido ntrico a 5% (v/v) por aproximadamente 48 horas, seguido de enxge por vrias vezes, com gua ultra pura. As vidrarias no aferidas so colocadas para secar em estufa temperatura entre 50 e 60o C e as aferidos so secas ao ar, em local protegido da poeira.

6.1

Materiais e equipamentos
cubas plsticas e escovas de diversos tamanhos; estufa com controle de temperatura.

6.2

Reagentes e solues
detergente neutro; cido ntrico.

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11

SOLUBILIZAO (DIGESTO)

A decomposio do tecido vegetal, visando a determinao dos nutrientes essenciais s plantas, realizada por via seca ou atravs da solubilizao com cidos ntrico e perclrico.

7.1
7.1.1

Via seca
Princpio

A amostra de tecido vegetal incinerada em mufla eltrica a uma temperatura entre 500 e 550C. A cinza resultante dissolvida em soluo diluda cida de cido ntrico. O extrato resultante utilizado para determinao de B e Mo. 7.1.2 Materiais e equipamentos 7.1.3 mufla eltrica com controle de temperatura; balana analtica; cadinho de porcelana.

Reagentes e solues HNO 3 .

7.1.4

Procedimentos transferir 500mg de amostra para cadinho de porcelana; levar mufla eltrica com temperatura controlada; aumentar gradativamente a temperatura para 500 a 5500C, por 2 a 4 horas, at a obteno de cinza branca. A cinza resultante deste processo dissolvida em 25mL de HNO3 0,1mol L-1.

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7.2
7.2.1

Via mida
Solubilizao ntrico perclrica

7.2.1.1 Princpio As amostras so solubilizadas com cidos ntrico (65%) e perclrico (70%). Este mtodo realizado para determinao dos elementos P, K, Ca, Mg, S, Cu, Fe, Mn e Zn. 7.2.1.2 Materiais e equipamentos capela de exausto; balana analtica; bloco digestor para 40 tubos de digesto.

7.2.1.3 Reagentes e solues cido ntrico 65%; cido perclrico 70%.

7.2.1.4 Procedimentos transferir 500mg de material vegetal seco e modo para tubo digestor; adicionar 4,0mL de cido ntrico; deixar em repouso por aproximadamente 12 horas (digesto prvia); aquecer gradativamente at 120o C; permanecer nesta temperatura at cessar totalmente o desprendimento de NO 2 (vapor castanho). Nesta etapa, a

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matria orgnica encontra-se parcialmente digerida e o volume do cido ntrico reduzido metade do volume inicial; adicionar 2,0mL de cido perclrico; aumentar a temperatura gradativamente para 180o C; evitar neste processo o aquecimento elevado para no haver perdas, principalmente, de fsforo e enxofre; colocar pequenos funis, tampando o tubo digestor, a fim de no s evitar possveis perdas de HClO4, como tambm a secagem do extrato; manter a temperatura at se obter fumos brancos de HClO4 e o extrato se apresentar incolor; esfriar; completar o volume para 25mL com gua ultra pura.

7.2.2

Solubilizao sulfrica

7.2.2.1 Princpio Esta tcnica baseia-se na oxidao da matria orgnica, transformando o nitrognio orgnico em mineral (sulfato de amnio), atravs da ao do H2 SO4 e catalisadores a quente. 7.2.2.2 Materiais e equipamentos capela de exausto; balana analtica; bloco digestor.

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7.2.2.3 Reagentes e solues H2SO4 concentrado; Na2SO4 ; CuSO 4.5H2O; mistura cataltica: pesar 180g de Na2SO4 ; dissolver em aproximadamente 1L de gua ultra pura em balo aferido de 2L; adicionar 18g de CuSO 4 .5H2O; adicionar 600mL de H2SO 4 concentrado; deixar esfriar; completar o volume;

7.2.2.4 Procedimentos pesar 0,2g da amostra moda e seca em tubos para digesto de 50mL; adicionar 15mL de mistura cida de sulfatos; proceder digesto, por 1 hora ou mais em bloco digestor, aumentando a temperatura gradativamente at cerca de 335C; deixar esfriar, aps a completa digesto da matria orgnica, caracterizada por um lquido incolor ou levemente esverdeado; determinar o teor de nitrognio.

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8 8.1

DETERMINAES ANALTICAS Nitrognio

A determinao do nitrognio pode ser realizada atravs da solubilizao sulfrica seguida do mtodo semi-micro Kjeldahl ou com a amostra slida, no analisador elementar. Neste caso, determinado o N total. 8.1.1 Semi-micro Kjeldahl

8.1.1.1 Princpio Tcnica de solubilizao mida, seguida por destilao a vapor e titulao para a quantificao do NH4 . A solubilizao sulfrica (H2 SO4 + catalisadores) transforma protena e aminocidos do tecido vegetal em N-NH4+ que destilado e complexado em cido brico com indicador misto, e titulado com soluo padronizada de H2 SO4 diludo. 8.1.1.2 Materiais e equipamentos destilador semi-micro Kjeldahl; balana analtica.

8.1.1.3 Reagentes e solues cido brico a 20g L-1: pesar 20g de H3 BO3; adicionar 800mL de gua destilada, agitando at dissolver o sal;

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adicionar 15mL de verde de bromocresol a 0,1gL-1, 6mL de vermelho de metila a 0,1g L-1 e 2mL de hidrxido de sdio a 0,1mol L-1, aps dissoluo; completar para 1L com gua destilada;

verde de bromocresol 1gL-1: pesar 0,1g; dissolver em lcool etlico, completando o volume para 100mL;

vermelho de metila 1gL-1: pesar 0,1g; dissolver em lcool etlico, completando o volume para 100mL;

soluo estoque de H2 SO4: transferir 28mL de H 2SO 4 concentrado p., para balo volumtrico de 1L; completar com gua ultra pura;

soluo estoque de H2 SO4 0,014molL-1: adicionar 100mL da soluo estoque em balo volumtrico de 1L, completando o volume. Esta soluo deve ser padronizada com soluo de NaOH 0,01molL-1, preparada a partir de ampolas de TITRISOL;

NaOH 13 molL-1: pesar 520g de NaOH; dissolver em 1.000mL de gua ultra pura;

lcool etlico 99.

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17

8.1.1.4 Procedimentos destilao e titulao: transferir todo o extrato digerido para o destilador semimicro Kjeldahl; conectar um erlernmeyer de 50mL, contendo 10mL da soluo de H3 BO3 20gL-1 com a mistura de indicadores, na extremidade de refrigerao do destilador; adicionar gradativamente 10mL de NaOH 13molL-1 ao digerido; proceder destilao at atingir um volume de 30mL; retirar o frasco e titular com soluo de H2 SO4 0,014molL- 1, at a mudana da cor para rosa. Uma prova em branco deve ser levada conjuntamente com as amostras.

8.1.1.5 Clculo N-NH4 g kg -1 = ( VolA Vol B) x 1,4 Onde: VolA = volume de H2 SO4 gasto na amostra (ml); VolB = volume de H2 SO4 gasto na prova em branco (ml). 8.1.2 Analisador elementar

8.1.2.1 Princpio A tcnica baseia-se no mtodo de Pregal e Dumas, onde as amostras so queimadas em um ambiente de oxignio puro, e os gases resultantes desta combusto so carreados por hlio de alta pureza (um gs inerte) at a zona de deteco.

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8.1.2.2 Materiais e equipamentos analisador elementar Perkin-Elmer CHNS/OPEZ 400 Series.

8.1.2.3 Reagentes e solues oxignio de alta pureza; hlio de alta pureza.

8.1.2.4 Procedimentos As amostras, encapsuladas em cadinhos de estanho, so inseridas na zona de combusto do equipamento, e, na presena de excesso de oxignio e dos reagentes de combusto, so totalmente queimadas, formando os gases CO2, H2O e N2. Em seguida, so carreadas pelo gs inerte (He) at a zona de controle gasoso. Nesta rea, os gases formados so encerrados em uma cmara fechada, onde so rapidamente misturados e mantidos em condies controladas de presso, temperatura e volume. Aps a homogeneizao, a cmara de mistura despressurizada e os gases vo para uma coluna na zona de separao do instrumento. Nesta etapa, utiliza-se a tcnica de cromatografia frontal, onde h a reteno seletiva dos gases, de maneira a produzir um cromatograma de sinal estvel, por etapas, como se fossem degraus, em lugar dos picos. Os gases, ao sarem da coluna cromatogrfica, passam por um detetor de condutividade trmica na zona de deteco do aparelho, onde se mede, uma a uma, as mudanas da linha de base do gs carreador.

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19

8.2
8.2.1

Fsforo
Espectrometria com amarelo de vanadato

8.2.1.1 Princpio O nion H2PO4- reage com molibdato (MoO 42-) e vanadato (VO 32-), em meio cido, formando um complexo de colorao amarela que absorve a luz na regio de 420nm. 8.2.1.2 Materiais e equipamentos Espectrmetro UV-VIS.

8.2.1.3 Reagentes e solues H2SO4 ; (NH4)6 .MoO 24 ; (NH4)2 VO 3; curva analtica de P: preparar soluo de P, contendo 0,0; 5,0; 10,0; 15,0 e 20,0mgL-1 em H2SO4 0,2molL-1 ;

soluo de molibdato 50gL-1: dissolver 50g de (NH4 )6.MoO 24 p.a. em 800mL de gua quente; esfriar; completar o volume para 1.000mL com H2O;

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soluo de vanadato 2,5gL-1: dissolver 2,5g de (NH4)2 VO 3 p.a. em 500mL de gua quente; adicionar 350mL de HNO 3 65%; esfriar; completar o volume para 1.000mL com gua ultra pura; misturar em partes iguais as solues de molibdato e vanadato.

Observao: as duas solues so misturadas apenas na hora do uso. 8.2.1.4 Procedimentos pipetar 5,0mL do extrato da solubilizao ntrico-perclrica; completar o volume para 20mL com gua; adicionar 4mL da mistura dos reagentes; efetuar, aps 5 minutos, a leitura no espectrmetro a 420nm, construindo a curva analtica e estimando a concentrao de P no extrato solubilizado.

8.2.1.5 Clculo Pgkg

-1

= leitura em mg L-1 X 0,2

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8.3
8.3.1

Potssio e Sdio
Espectrometria de chama de emisso

8.3.1.1 Princpio O mtodo baseado na atomizao das partculas da soluo atravs da projeo da soluo sobre uma chama. H uma excitao dos tomos, isto , o deslocamento dos eltrons para nveis energticos mais elevados; quando os tomos voltam ao nvel energtico normal, h emisso da energia absorvida na forma de radiaes. Os tomos excitados dos nutrientes potssio e sdio, emitem luz a certos comprimentos de onda que so caractersticos para aquele elemento (entre 766 e 767nm para o K e 589 e 589,6nm para o Na). Como a intensidade da luz emitida por cada nutriente depende da concentrao de seus tomos, a medida possibilita sua determinao quantitativa. 8.3.1.2 Materiais e equipamentos fotmetro de chama; estufa com temperatura controlada; balana analtica.

8.3.1.3 Reagentes e solues KCl p.a; HClO4 ; NaCl; soluo estoque de K (1.000mg L-1 de K): dissolver 1,9067g de KCl p.a., seco em estufa a 100C por 2 horas, em gua ultra pura, completando o volume a 1.000mL;

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armazenar em frasco de polietieno sob refrigerao;

curva analtica de K: pipetar 0,8mL de HClO4 , 0,0; 1,0; 2,0; 3,0 e 5,0mL da soluo estoque (1.000mg L-1 de K), em bales volumtricos de 100mL, completando o volume com gua deionizada. Estas solues contm, respectivamente, 0,0; 10,0; 20,0; 30,0 e 50,0mgL-1 de K;

soluo estoque de sdio (1.000mgL-1 de Na): dissolver 2,5421g de NaCl p.a., seco em estufa a 200C por 24 horas, em gua ultra pura, completando o volume a 1.000mL; armazenar em frasco de polietieno sob refrigerao;

soluo padro de sdio (100mgL-1 de Na): transferir 100mL da soluo estoque 1.000mgL-1 de Na para balo de 1.000mL; completando o volume com gua ultra pura; armazenar em frasco de polietieno sob refrigerao;

curva analtica Na: pipetar, em bales volumtricos de 100mL, 0,8mL de HClO4 , 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0; 7,0 e 10,0mL da soluo estoque (100mgL-1 de Na), completando o volume com gua ultra pura. Estas solues contm, respectivamente, 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0; 7,0 e 10,0mgL-1 de Na.

Mtodos de Anlise de Tecidos Vegetais utilizados na Embrapa Solos

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8.3.1.4 Procedimentos para determinao de K diluir o extrato obtido na solubilizao ntrico-perclrica, para que a concentrao de K da soluo fique dentro da curva padro preparada. Geralmente, este extrato diludo 10 vezes, na proporo 1:9, usando uma parte de extrato para nove partes de gua ultra pura; calibrar o fotmetro com os padres 0 e 50mgL-1 K, respectivamente, para as leituras 0 e 100; proceder s leituras dos demais padres, quando aparelho estabilizar; proceder a leitura da curva analtica obtendo a respectiva equao e a leitura das amostras.

8.3.1.5 Procedimentos para determinao de Na a determinao de Na dever ser realizada diretamente no extrato obtido por solubilizao ntrico-perclrica; calibrar o fotmetro com os padres 0 e 10mgL-1 Na, respectivamente, para as leituras 0 e 100; realizar s leituras dos estabilizao do aparelho; demais padres, quando da

proceder a leitura da curva padro obtendo a respectiva equao e as leitura das amostras.

Observao: mesmo na chama de propano, pode haver ionizao do potssio. Para suprimir esse efeito, adiciona-se sdio nos padres e nas amostras, na concentrao de 0,1g L-1. 8.3.1.6 Clculo para determinao de potssio K g kg-1 = leitura em mgL-1 x 0,5

24

Mtodos de Anlise de Tecidos Vegetais utilizados na Embrapa Solos

8.3.1.7 Clculo para determinao de sdio Na g kg

-1

= leitura em mgL-1 x 50

8.4

Clcio e Magnsio

Os nutrientes so determinados por espectrometria de absoro atmica e, mais recentemente, por espectrometria de emisso atmica com induo de plasma (ICP), com bons resultados. 8.4.1 Espectrometria de absoro atmica

8.4.1.1 Princpio Na tcnica de espectrometria de absoro atmica (EAA), a soluo amostra aspirada e nebulizada em uma chama ar-acetileno ou xido nitroso-acetileno e convertida em vapor atmico. Alguns destes tomos sero termicamente excitados pela chama, mas a maioria deles permanecer em seu estado fundamental. Para serem excitados, estes tomos precisam absorver radiao especfica proveniente de uma lmpada de ctodo oco, que emite radiao no mesmo comprimento de onda que ser absorvido por eles, na chama. Os metais das solues aspiradas na chama a 2.000-2.500o C transformam-se em seu estado fundamental. O tomo de cada elemento qumico absorve a energia em um comprimento de onda definida. A quantidade de energia absorvida proporcional concentrao da soluo. No extrato resultante da oxidao do material vegetal pela digesto ntrico-perclrica, o Ca e o Mg so determinados por este mtodo, utilizando-se lmpada de ctodo oco. Para determinao destes elementos, necessria a adio de lantnio e estrncio para controlar a interferncia de ons como fosfato, sulfato e alumnio.

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8.4.1.2 Materiais e equipamentos espectrmetro de absoro atmica; lmpada de ctodo oco de Ca e Mg.

8.4.1.3 Reagentes e solues La203; HN03; TITRISOL; soluo de lantnio 1,14gL-1: transferir 1,14g de La203 para frasco de 1.000mL; adicionar soluo de HN03 100mLL-1 at total dissoluo do xido; completar o volume com gua ultra pura;

curva analtica de Ca e Mg: preparar, a partir da soluo TITRISOL de Ca e Mg 1.000mg L-1, solues com misturas de Ca e Mg: 0,0 e 0,0; 1,0 e 0,2; 2,0 e 0,4 e 4,0 e 0,8mgL-1, respectivamente, em solues cidas.

8.4.1.4 Procedimentos pipetar 1,0mL da soluo do extrato obtido atravs da digesto ntrico-perclrica, para copo de polipropileno; completar o volume para 20mL com gua ultra pura (alquota A); retirar 1,0mL da alquota A para tubo de ensaio; adicionar 4,0mL da soluo de lantnio a 1,14gL-1; determinar Ca e Mg no espectrmetro de absoro atmica.

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8.4.1.5 Clculos para determinao de Ca Ca g kg-1 = leitura mgL-1 x 5 8.4.1.6 Clculos para determinao de Mg Mg g kg-1 = leitura mgL-1 x 5

8.5
8.5.1

Enxofre
Turbidimetria

8.5.1.1 Princpio Este mtodo tem como base a turbidez provocada pela precipitao do on sulfato pelo cloreto de brio, na forma de sulfato de brio (BaSO 4 ). Essa turbidez quantificada espectrometricamente. Observao: a adio de gelatina ao cloreto de brio permite que o precipitado mantenha-se em suspenso. 8.5.1.2 Materiais e equipamentos espectrmetro UV-VIS.

8.5.1.3 Reagentes e solues BaCl2 p.a.; K2S04 p.a.; HCl p.a.;

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soluo estoque de S (contendo 1.000mgL-1 de S): pesar 5,434g de K 2S04 p.a., seco em estufa, dissolver em gua ultra pura; completar o volume para 1.000mL;

curva analtica de sulfato: adicionar, em bales volumtricos de 100mL, respectivamente, 0,0; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 4,0 e 5,0mL da soluo estoque de S; completar o volume com gua ultra pura;

soluo de HCl 6molL-1 (contendo 20mgL-1 de S): dissolver 0,1087gde K2SO4 , seco previamente estufa, em 200mL de gua ultra pura; adicionar 500mL de HCl p.a.; agitar at completa dissoluo do sal; completar o volume para 1.000mL com gua ultra pura. em

8.5.1.4 Procedimentos pipetar 2,0mL do extrato obtido na digesto; completar o volume para 20mL com gua deionizada; pipetar alquota de 10mL para tubo de 30mL, adicionando 1,0mL de HCl 6molL-1 e 0,5g de BaCl2; agitar vigorosamente por 30 segundos; efetuar leitura, aps exatos 5 minutos cronometrados, no espectrmetro, em comprimento de onda de 420nm ou no turbidmetro; construir a curva analtica e estimar a concentrao de S.

Observao: a leitura deve ser realizada impreterivelmente aps 5 minutos, uma vez que o precipitado de BaSO4 decanta-se rapidamente.

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8.5.1.5 Clculo S (mgL -1) = leitura mgL-1 x 0,5

8.6

Cobre, Ferro, Mangans e Zinco

Os nutrientes cobre, ferro, mangans e zinco so determinados por espectrometria de absoro atmica e, mais recentemente, por Espectrometria de Emisso Atmica com Induo de Plasma (EEA-ICP). 8.6.1 Espectrometria de absoro atmica

8.6.1.1 Princpio O tecido vegetal solubilizado pela via mida (ntricoperclrica) e a determinao dos elementos realizada diretamente no extrato por espectrometria de absoro atmica. As interferncias qumicas ou de ionizao so desprezveis neste mtodo. 8.6.1.2 Materiais e equipamentos espectrmetro de absoro atmica; lmpada de ctodo oco de Cu, Fe, Mn E Zn; balana analtica.

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8.6.1.3 Reagentes e solues HCl; H2SO4 p.a.; CuSO4.5 H2O; Fe(NH4 )2(SO)4 (sulfato ferroso amoniacal); ZnSO 4 .7H2O; MnSO 4 .H2 O; HNO 3 ; HClO4 ; padro TITRISOL; soluo padro de cobre (contendo 100mg L-1 de Cu): dissolver 0,393g de CuSO 4 .5 H2O em soluo de HNO 3 0,2M (9mL de HNO 3 concentrado por L de gua);

curva analtica de cobre: transferir alquotas de 0,0; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,5 e 2,0mL para bales volumtricos de 100mL, a partir da soluo de 100mg L-1 de Cu; adicionar 10,0mL de HClO4 2,5molL-1 (149,5mL de HClO4 concentrado por L de H2O ultra pura); completar o volume com H2O ultra pura. Estas solues contm de 0,0 a 2,0mgL-1 de cobre;

soluo estoque de ferro (contendo 100mgL-1 de Fe): pesar 0,702g de Fe(NH4 )2(SO)4 .6H2O; sulfato ferroso amoniacal

dissolver em 50mL de H 2O ultra pura que contenha 10,0mL de H2 SO4 concentrado; completar o volume para 1.000mL com H2O ultra pura;

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soluo estoque diluda de ferro (contendo 10mgL-1 de ferro): dissolver 10,0mL da soluo estoque; completar o volume para 100mL com H2O ultra pura;

soluo estoque de zinco (contendo 100mgL-1 de zinco): pesar 0,440g de ZnSO 4 .7H2O; dissolver em soluo de HNO3 0,2molL-1, completando o volume para 1.000mL, com esta soluo. Pode-se tambm usar o Zn metlico (10mgL-1) ou padro TITRISOL;

curva analtica de zinco: transferir, a partir da soluo estoque de 100mgL-1 de zinco, alquotas de 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 3,0mL para bales volumtricos de 100mL; adicionar 10,0mL de HClO4 2,5molL-1; completar o volume com H2O ultra pura;

soluo estoque de mangans (contendo 100mgL-1 de Mn): pesar 0,308g de MnSO 4 .H2O; dissolver em soluo de HNO3 0,2molL-1, completando o volume para 1.000mL. Pode-se usar Mn metlico ou padro TITRISOL;

curva analtica de mangans: transferir, a partir da soluo padro estoque de 100mg L-1 de mangans, alquotas de 0,0; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 e 15,0mL para os mesmos bales volumtricos de 100mL em que se colocou as solues padro de uso de Cu, Fe e Zn; adicionar 10,0mL de HCl04 2,5molL-1; completar o volume com H20 deionizada. Estas solues

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contm, respectivamente, de 0,0 a 15,0mgL-1 mangans. 8.6.1.4 Procedimentos proceder s leituras no extrato espectrmetro de absoro atmica; ntrico-perclrico

de

no

construir as curvas analticas e estimar as concentraes de cobre, ferro, mangans e zinco.

8.6.1.5 Clculo Leitura mgL-1 x 60 (diluio) = Resultado mgL-1

8.6.2

Espectrometria de Emisso Atmica com Induo de Plasma (EEA-ICP)

O uso do plasma como fonte de excitao para a emisso atmica tornou-se muito importante em anos recentes. A tcnica de Plasma Acoplado Indutivamente com deteco por emisso atmica passou a ser comercialmente disponvel em 1974. 8.6.2.1 Princpio O acoplamento induzido no ICP causado pelo efeito de um campo eletromagntico que atua sobre um fluxo de argnio com trajetria, em geral, espiral ascendente, radial ao campo eletromagntico. O argnio flui atravs de um tubo de quartzo, ao redor do qual h uma espiral de rdio-freqncia, tipo um solenide, feita normalmente de cobre. A espiral energizada por um gerador de rdio-freqncia que opera na faixa entre 5 a 75MHz, com potncia entre 1 e 2kW, criando um campo eletromagntico alternado. O argnio que passa pelo tubo de quartzo submetido a este campo magntico fortssimo, de tal maneira

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que seus tomos entram em choque, produzindo ons de argnio, eltrons livres e calor. Neste ponto, o argnio passa a ser um gs condutor de energia, caracterstica que ele no possui temperatura ambiente. O acoplamento propriamente dito ocorre quando se energiza o fluxo de argnio a ponto de ser possvel a visualizao da tocha de argnio incandescente e azulada. Este acoplamento se d pela aplicao de uma centelha de Tesla ou centelha piloto (uma fasca como a de um aparelho Magiclick) ao fluxo de argnio energizado. O argnio rapidamente energizado, uma vez que a centelha aplicada perturba mais ainda o sistema, fazendo com que os choques interpartculas tornem-se mais intensos, e maior quantidade de energia seja liberada. Neste ponto, tem-se uma tocha de argnio estvel, com temperaturas entre 9.000 e 10.000K em seu centro. Esta fonte de excitao apresenta grandes vantagens sobre as outras tcnicas espectromtricas, uma vez que as temperaturas alcanadas propiciam maior nmero de transies eletrnicas que as outras tcnicas de mesmo tipo. Os instrumentos atuais, providos de dectetores no estado slido (CCD), so capazes de detectar e quantificar simultaneamente at 60 elementos, com concentraes tpicas entre 1 e 100 g L-1 com muita preciso. A alta temperatura do plasma elimina muitas das interferncias qumicas presentes na tcnica de chama e a maioria dos elementos so prontamente excitados. A tcnica adequada para determinao de todos os elementos essenciais s plantas, mesmo os que formam xidos (elementos refratrios), como boro e fsforo, e tambm para elementos difceis de serem excitados, como zinco e cdmio. 8.6.2.2 Reagentes e solues solues padro de Fe, Cu, Mn e Zn: concentraes de 1.000mgL-1.

8.6.2.3 Procedimentos A calibrao do equipamento feita a partir de padres mistos contendo concentraes crescentes dos elementos a serem analisados.

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Tais concentraes so estipuladas levando-se em considerao a concentrao dos elementos na soluo analtica (o extrato das amostras solubilizadas), de maneira que a curva analtica abranja a faixa de concentrao dos elementos nas amostras. Na Tabela 1, esto as concentraes dos elementos utilizadas na curva analtica.
Tabela1. Concentraes dos elementos utilizadas na curva analtica do EEA-ICP. Curva analtica (nm)** Padro #1 Fe Cu Mn Zn 1,0 (20)* 0,1 (2,0) 1,0 (20) 0,1 (2,0) Padro #2 5,0 (100) 0,2 (4,0) 2,0 (40,0) 0,2 (4,0) Padro #3 10 (200) 0,4 (8,0) 4,0 (80) 0,4 (8,0) 238,204 324,754 257,610 213,856

Elemento

-1 * Os valores entre parnteses referem-se ao volume, em L, de soluo 1.000mg L necessrios o preparo de 20,00mL de padro misto.

** (nm): comprimento de onda da linha principal do elemento.

Aps feita a calibrao e todos os ajustes necessrios, pode-se proceder leitura das amostras.

8.7
8.7.1

Boro
Azometina-H

8.7.1.1 Princpio Neste mtodo, a solubilizao realizada por via seca e a determinao baseada na formao de um complexo de colorao

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amarelo resultante da reao do cido brico com o reagente azometinaH e determinado espectrometricamente. 8.7.1.2 Materiais e equipamentos cadinho de porcelana; mufla; espectrmetro UV-VIS.

8.7.1.3 Reagentes e solues cido ascorbico-L; acetato de amnio; EDTA (sal sdico); cido actico glacial; azometina H; cido brico; HCl; soluo de cido ascrbico-L 10g L-1 : pesar 1g de cido ascrbico-L; dissolver em 100mL de gua ultra pura (Soluo A);

soluo tampo: pesar 500g de acetato de amnio e 30g de EDTA (sal bissdico); dissolver em 800mL de gua ultra pura; adicionar lentamente 250mL de cido actico glacial; homogeneizar;

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soluo de azometina H: dissolver 0,45g de azometina-H em 100mL da Soluo A.

Observao: esta soluo deve ser preparada semanalmente, armazenada em frasco escuro e conservada no refrigerador; soluo estoque de boro (50mgL-1 de B): dissolver 0,286g de cido brico em HCI 0,1molL-1; completar o volume com 1.000mL do mesmo; guardar em frasco plstico;

curva analtica: pipetar para bales volumtricos de 100mL 0,0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0ml da soluo estoque; completar o volume com HCI 0,1molL-1, guardando em frascos plsticos. Essas solues contm, respectivamente, 0,0; 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0, e 2,5mgL-1 de B;

cido clordrico 0,1molL-1: dissolver 8,3mL de HCl concentrado em 1.000mL gua ultra pura; guardar em frasco plstico.

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8.7.1.4 Procedimentos transferir para tubos de ensaio de polipropileno, uma alquota de 2,0mL do extrato proveniente da amostra; adicionar 2,0mL da soluo tampo; homogeneizar; adicionar 2,0mL da soluo de azometina H 4,5gL-1; agitar; transferir, aps 30 minutos, as solues avermelhadas para cubetas do espectrmetro; amarelo-

proceder s leituras em filtro azul, em 420nm, acertando o zero do aparelho com HCI 0,1molL-1; construir curva analtica; estimar a concentrao de B.

8.7.1.5 Clculo B mg kg-1 = Leitura mg L -1 x 25

8.8
8.8.1

Molibdnio
Espectrometria de absoro atmica

8.8.1.1 Princpio A solubilizao processa-se por via seca. O molibdnio complexado com o tiocianato de amnio em meio cido. O complexo solvel em metil iso-butil cetona. A determinao realizada por espectrometria de absoro atmica em chama de N2O-acetileno.

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8.8.1.2 Materiais e equipamentos espectrmetro de absoro atmica; lmpada de ctodo oco de Mo; queimador de xido nitroso-acetileno; mufla; banho-maria.

8.8.1.3 Reagentes e solues HCl; Tiocianato de amnio; Cloreto estanhoso; metil-iso butil cetona p.a; molibdato de sdio (Na2 MoO 4 2H2O p.a.); NaOH; soluo de HCl 6molL-1: pesar 560mL de HCl concentrado; dissolver em 1.000mL de gua ultra pura;

soluo de HCl 1,0molL-1: dissolver 86mL de HCl concentrado em 1.000mL de gua ultra pura;

soluo aquosa de tiocianato de amnio a 50gL-1: dissolver 25,0g do sal em 500mL de gua ultra pura;

soluo de cloreto estanhoso a 100mgL-1: dissolver 10g de SnCl2 2H20 com 20mL de soluo de HCl 6molL-1 por aquecimento;

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adicionar, aps esfriamento, 100mL de gua ultra pura; filtrar, se ficar turvo; preparar diariamente;

soluo estoque de molibdnio (contendo 100mgL-1 de Mo): dissolver 242mg de molibdato de sdio (Na2MoO 4 2H2O p.a.) em um pequeno excesso de NaOH 1molL-1; diluir a cerca de 450mL com gua ultra pura; acidular ligeiramente com HCl 1,0molL-1; diluir a 500mL;

soluo estoque diluda de molibdnio (contendo 0,5mgL-1 de Mo): diluir 5,0mL da soluo estoque (100mgL-1 de Mo) a 1.000mL com gua ultra pura;

curva analtica: transferir para funis de separao de 125mL, 1, 3, e 5mL da soluo contendo 0,5mgL-1 de Mo (0,5; 1,5 e 2,5 g de Mo); adicionar 10mL da soluo de HCl 6molL-1 e gua ultra pura at aproximadamente 45mL; adicionar 3mL de soluo de tiocionato de amnio a 50mgL-1; realizar a leitura, em filtro verde, em comprimento de onda de 470nm, acertando o zero com gua deionizada.

8.8.1.4 Procedimentos adicionar 3mL de soluo de tiocianato de amnio a 50gL-1 e 1mL de soluo de cloreto estanoso a 100gL-1, homogeneizando aps a adio de cada reagente;

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extrair o complexo por agitao durante 1 minuto, com 5mL de metil iso-butil cetona; separar a fase orgnica; proceder leitura no espectrmetro em escala expandida dez vezes, usando o solvente para acertar a leitura zero; usar chama de xido nitroso-acetileno.

8.8.1.5 Clculo x 0,20 Mo mg kg-1 = Leitura g L -1

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UNIDADES E EXPRESSO DOS RESULTADOS

As unidades utilizadas nesta publicao seguem as

recomendaes da Sociedade Brasileira de Cincia do Solo para a adoo do Sistema Internacional e tm o objetivo de uniformizao das mesmas (Cantarella & Andrade, 1992).

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

CANTARELLA, H; ANDRADE, J. C. O sistema internacional de unidades e a cincia do solo. Boletim informativo da Sociedade Brasileira de Cincia do Solo, Campinas, v. 17, n. 3, p. 91-102, 1992. CARMO, C. A. F. S. do; NOGUEIRA, A. R. A.; OLIVEIRA, A. S.; ALMEIDA, D. G.; FERNANDES, F. D.; PITTA, G. V. E.; CARLOS, G. M.; OLIVEIRA, H.; MAMO, J. B.; ARMELIN, M. J. A.; SALDANHA, M. F. C.; MYAZAWA, M.; SCRAMIM, S.; BARRETO, W. O.; RUFINI, Y. A. Tecidos vegetais. In: NOGUEIRA, A. R. A.; MACHADO, P. L. O.; CARMO, C. A. F. S. do; FERREIRA, J. R. (Ed.) Manual de laboratrios: solo, gua, nutrio vegetal, nutrio animal e alimentos. 1. Coleta, acondicionamento e preparo de amostras. So Carlos: EMBRAPA Centro de Pesquisa de Pecuria do Sudeste, 1998. p. 32 - 42. MALAVOLTA, E.; VITTI, G. C.; OLIVEIRA, S. A. Avaliao do estado nutricional das plantas: princpios e aplicaes. 2. ed. rev. e atual. Piracicaba: POTAFOS, 1997. 319 p. OSAKI, F. Calagem e adubao . 2. ed. atual. e aum. Campinas: Instituto Brasileiro de Ensino Agrcola, 1991. 503 p.