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UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO


FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

Biologa Celular y Molecular Unidad 3: Biologa Molecular Ms. Pablo Chuna Mogolln
Trujillo Per

2009
EL DOGMA CENTRAL
El DNA desempea dos amplias funciones: la replicacin y la expresin. En primer lugar, el DNA tiene que ser capaz de autorreplicarse de tal manera que la informacin que se encuentre codificada en su estructura primaria se transmita de forma fidedigna a la descendencia. En segundo lugar, esta informacin tiene que ser expresada de forma que resulte til. La expresin gentica implica la transferencia de informacin mediante los procesos de transcripcin y traduccin La transcripcin es un proceso de transferencia de informacin en que se utiliza el mismo lenguaje de 4 letras de los cidos nucleicos; en el cual, una cadena de DNA se utiliza como molde para sintetizar una cadena de RNA, cuya secuencia es anloga a una de las cadenas del DNA original y complementaria de la otra. La traduccin es el flujo de informacin desde el RNA hasta las protenas. En este proceso el lenguaje de 4 letras de los cidos nucleicos tiene que ser transformado en el lenguaje de 20 letras de los aminocidos que constituyen las protenas. As pues, el flujo de la informacin gentica en una clula normal ser:

Como suele suceder, existen excepciones a la regla anterior, que se presentan slo en ciertos virus. a. Para algunos virus, el RNA viral se copia en RNA viral (replicacin de RNA).

b. Para otros virus, el RNA viral es copiado en DNA viral (sntesis de DNA dependiente de RNA o transcripcin inversa.

REPLICACION DEL DNA


1. DEFINICION: La replicacin es el proceso mediante el cual, a partir de una molcula de DNA doble hlice, se sintetizan dos molculas idnticas. La replicacin tiene lugar necesariamente cada vez que se divide una clula, ya que las dos clulas hijas han de tener exactamente, la misma dotacin gentica que la progenitora. 2. CARACTERISTICAS GENERALES: La replicacin del DNA tiene las siguientes caractersticas: a. Es semiconservadora: A partir de la doble hlice de una molcula de DNA se originan 2 molculas de DNA -dos dobles hlices-, ambas compuestas por una cadena original (preexistente) y una cadena nueva (recin sintetizada). Es decir, que las dos cadenas de la molcula progenitora se separan y sirven cada una de molde (template) para la sntesis de una nueva cadena hija complementaria, siguiendo la regla normal de apareamiento.

Fig. Mecanismo semiconservativo de la replicacin del ADN

b. Es bidireccional: Al abrirse la doble hlice se forma una estructura llamada burbuja de replicacin, cuyo tamao aumenta a medida que avanza la separacin de las dos cadenas de DNA, fenmeno que se produce en forma simultnea en los 2 extremos de la burbuja. Se establece, de esta manera, en cada uno de sus extremos, una estructura en forma de Y, llamada horquilla de replicacin-, cuyos dos brazos representan a las cadenas del DNA ya separadas y el tronco a la doble hlice en vas de separacin. As cada burbuja, tiene 2

horquillas de replicacin que a partir de ese punto de origen comn avanzan en ambas direcciones opuestas. Fig. Mecanismo de crecimiento de las cadenas del ADN. c. Es Asimetrica (semidiscontinua): Las dos cadenas del DNA son antiparalelas. Esto crea una dificultad durante la replicacin. Es que a nivel de cada horquilla de replicacin, conforme sus dos cadenas se separan, una presenta nucletidos corriendo en direccin 5 3 y la otra en direccin 35. La cadena hija que adopta como molde a la cadena progenitora que corre en direccin 3 5 se sintetiza en forma continua, al crecer en direccin 5 3, mediante el agregado de nucletidos en su extremo 3 a medida que avanza la horquilla de replicacin, y se denomina hebra gua o adelantada (leading strand). En cambio la otra cadena hija, cuyo molde es la cadena del DNA progenitora que corre en direccin 5 3 es sintetizada de un modo singular, ya que para poder crecer en esa direccin debe sintetizarse en direccin opuesta al avance de la horquilla de replicacin. El problema se supera haciendo de que la sntesis sea discontinua, lo cual significa que la nueva cadena se sintetiza de a pequeos fragmentos y se le llama hebra retrasada (lagging strand).

d. Es asincronica. Las bandas R (ricas en G-C) se replican durante la primera mitad de la fase S y las bandas G y Q (ricas en A-T) lo hacen durante la segunda mitad. e. Se produce sectorialmente. Se sintetiza a partir de mltiples sectores a lo largo de su molcula, cada uno de los cuales corresponde a un lazo. Por consiguiente cada unidad abarca al DNA comprendido entre los puntos de origen y de llegada del lazo a su base, es decir entre las SAR (scaffold associated regions).

f. Es monofocal (en procariotas) y multifocal (en eucariotas): La molcula de DNA en eucariotas, es enormemente larga. En consecuencia, la replicacin, para poder llevarse a cabo en un tiempo razonable, ha de ser multifocal, es decir, empezar por muchos puntos a la vez. Se ha comprobado que en el DNA de clulas de mamferos existen cerca de 50 000 a 100 000 replicones. En cambio la replicacin del DNA bacteriano es monofocal, es decir, existe un slo origen de replicacin. g. Se requiere de cebadores (primer). un cebador es un polmero que contiene el punto de crecimiento al que se irn aadiendo nuevos monmeros. h. La agregacin de desoxirribonucletidos es de a uno -por vez - en el extremo 3 OH de la cadena en crecirniento. i. Slo ocurre en el perodo S del ciclo celular . La replicacin del DNA ocurre con alta fidelidad dentro de un perodo de tiempo determinado en forma precisa dentro del ciclo celular 3. REQUERIMIENTOS GENERALES: La sntesis del DNA es muy compleja. Una de las razones es que en este proceso intervienen muchas enzimas diferentes, y no slo una DNA polimerasa. Otras enzimas y protenas inician la sntesis de pequeos cebadores de RNA que se unen al DNA monocatenario. Adems son precisas ciertas enzimas para eliminar estos cebadores de RNA de la cadena de desoxirribonucletidos en crecimiento, para rellenar las regiones dejadas libres por dichos cebadores, para unir los fragmentos entre s y para ir desenrollando la doble hlice de DNA. a. DNA Helicasa. Son enzimas que usan la energa de hidrlisis de ATP para moverse y separar las dos cadenas del DNA. La helicasa se sita en la horquilla d e replicacin por delante de la DNAPol y se encarga de eliminar los puentes de hidrgeno que unen las bases complementarias de las 2 cadenas de la doble hlice. b. Protenas SSB (Single- Strand binding). Es un tetrmero de subunidades de 19 Kd que se unen de forma cooperativa al DNA de hebra sencilla, que permiten estabilizar la porcin de DNA desenrrollada. c. Topoisomerasas. Son enzimas que disminuyen la tensin torsional que se produce en la doble hlice del DNA al separarse las dos cadenas por la accin de la helicasa. Las topoisomerasas, regulan el nivel de superenrollamiento de las molculas de DNA mediante un mecanismo que se cumple en tres pasos: (1) escisin de una o de ambas hebras del DNA, (2) paso de un segmento del DNA a travs de esta brecha, y (3) cierre de la brecha del DNA.

d. e.

Topoisomerasas tipo I: corta una de las cadenas de la doble hlice. Topoisomerasas tipo II (conocida tambin con el nombre de gyrasa): corta las dos cadenas del DNA. Requieren de la hidrlisis de ATP. La gyrasa es la diana de varios antibiticos. La novobiocina impide la unin del ATP a la gyrasa. El cido nalidxico y la ciprofloxacina, por el contrario dificultan la ruptura y empalme de las cadenas de DNA. Estos dos inhibidores de la gyrasa se emplean frecuentemente en el tratamiento de infecciones como las de las vas urinarias. Las topoisomerasas son enzimas esenciales en todos los organismos, estando involucradas en la replicacin, recombinacin y transcripcin. Las topoisomerasas tipo IV son capaces de desligar molculas de DNA, tales como las molculas hijas producidas en la replicacin las cuales estn unidas (catenadas). RNA primasa. Sintetiza cortos fragmentos de RNA (~ 3-12 nt) que son complementarios a una de las hebras del DNA molde. Este cebador es eliminado al final de la replicacin DNA Polimerasas (DNA pol). Son enzimas responsables de la sntesis de DNA Todas las DNA polimerasas requieren para su actividad lo siguiente: - Una cadena de DNA que sirva de molde - Una cadena cebadora o primer con un extremo 3 OH libre - Los 4 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) que son los sustratos, y - Mg2+ que es el cofactor para la DNApol. Las DNA Pol son procesivas. La procesividad se define como el nmero promedio de nucletidos aadidos antes de que la DNAPol se separe de la cadena molde. Catalizan la adicin de un desoxirribonucletido trifosfato (dNTP) complementario al extremo 3 OH de una cadena polinucleotdica en crecimiento. Todas las DNA polimerasas aaden los nucletidos en direccin 5> 3

f. Pirofosfatasa. Es una enzima que hidroliza el pirofosfato (PPi), lo que favorece que la reaccin pueda proseguir. g. DNA Ligasa. Cataliza la formacin de un enlace fosfodister entre el grupo 3-OH del extremo de una cadena de DNA con el grupo 5-fosfato del extremo de otra. h. Los 4 desoxirribonucletidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) i. DNA molde o template j. Cebadores primers TABLA 1. Protenas involucradas en la replicacin en clulas procaritas y eucariotas
PROCARIOTAS DNA Helicasa. Protenas SSB (Single- Strand binding). Topoisomerasas I y II (girasa) RNA primasa. DNA Polimerasas (DNA Pol): I, II y III Pirofosfatasa. DNA Ligasa DNA molde o template Cebadores Los 4 desoxirribonucletidos trifosfato: (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Mg++ Abrazadera RNAH asa EUCARIOTAS DNA Helicasa. Protenas RPA y RFC Topoisomerasas I y II RNA primasa. DNA Polimerasas (DNA Pol): ,, , , Pirofosfatasa. DNA Ligasa DNA molde o template Cebadores Los 4 desoxirribonucletidos trifosfato: (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Mg++ PCNA (Proliferating cell nuclear antigen) Nucleasa reparadora ORC (origin recognition complex)

4. ETAPAS La replicacin de una molcula de DNA puede dividirse en 3 etapas: iniciacin, elongacin y terminacin. Cada una de ellas se diferencia por las reacciones y enzimas que intervienen. 4.1. REPLICACION EN CELULAS PROCARIOTAS a. Iniciacin: La iniciacin de la replicacin del DNA en Escherichia coli empieza en el nico origen de replicacin (oriC). Ori C es una regin del cromosoma de 245 pb que tiene 2 conjuntos de secuencias conservadas: 3 repeticiones en tandm de una secuencia de 13 pb en un extremo del origen y 4 copias de una secuencia de 9pb distribuidas en orientaciones invertidas en el otro extremo del origen.

Fig. Secuencias consenso de origen de replicacin bacterial

La replicacin se inicia cuando una protena dnaA se une a la regin de origen que tiene las repeticiones de 9pb. Esta regin se enrolla alrededor del complejo dnaA . El complejo dnaA denatura las repeticiones dc 13 pb y forma un complejo abierto de 45 pb. Un complejo formado por las protenas dnaB y dnaC se unen a esta regin denaturada para formar un complejo precebador o (complejo prepriming). Las protenas dnaB y dnaC se unen a la dnaA para curvar y abrir la doble hlice. La protena dnaB es una helicasa que desenrolla el DNA doble hlice bidireccionalmente y crea dos horquillas de replicacin. A continuacin, la porcin desenrollada del DNA se estabiliza por las protenas SSB. El desenrollamiento del DNA circular en el origen provoca un superenrollamiento positivo, que debe desaparecer para que la replicacin pueda continuar. Esto se consigue gracias a la accin compensatoria de la DNA gyrasa. La dnaB desenrolla an ms el DNA. Esto permite la entrada de la primasa (dnaG). La primasa sintetiza un corto RNA cebador para iniciar la sntesis de la cadena lder en la primera horquilla de replicacin. La helicasa y la primasa, subsecuentemente, forman un complejo enzimtico mvil conocido como primosoma, el cual sintetiza RNA cebadores cada 1000-2000 nucleotidos en la cadena retrasada. b. Elongacin Los cebadores de las cadenas lder y retrasada son elongados por la DNA pol III, que es un complejo de mltiples subunidades. El holoenzima es un dmero porque las 2 cadenas del DNA parental deben replicarse en el mismo sitio y al mismo tiempo. Sin embargo, la cadena lder y la cadena retrasada se sintetizan de forma diferente. La cadena lder es sintetizada de forma continua por la polimerasa III, que no se disocia de la cadena molde a menos que se haya completado la replicacin. El modo en que se sintetiza la cadena retrasada es necesariamente ms complicado. Como ya se mencion

anteriormente, la cadena retrasada se sintetiza de modo discontinuo -en fragmentos (de Okasaki), de modo que la polimerizacin en sentido 5 3 conduce a un crecimiento neto en sentido 3 5. Esto se puede conseguir mediante la formacin de un bucle en el molde de la hebra retrasada. De este modo, el molde de la cadena retrasada atravesara el centro activo con actividad polimerasa de una subunidad de la polimerasa III en el mismo sentido que el molde de la cadena lder lo hace en la otra subunidad. La DNA polimerasa III tiene que abandonar el molde de la cadena retrasada despus de haber aadido unos 1000 nucleotidos a esta cadena. Entonces se forma un nuevo buc1e, y se sintetiza de nuevo un pequeo fragmento de RNA cebador (de10nucluotidos) para iniciar la sntesis de otro fragmento de Okasaki. Una vez que los cebadores de la cadena retrasada han sido elongados por la DNAPol III, ellos son removidos por una ribonucleasa RNAHasa y la DNA Pol I, los espacios (gaps) que quedan son rellenados por la DNA pol I. Esta enzima tiene actividad polimerasa 5 3, 3 5 exonucleasa (proofreading) en una sola cadena polipeptdica. La exonucleasa 5 3 remueve los cebadores, mientras que la polimerasa funciona simultneamente llenando los gaps con DNA por elongacin del extremo 3 del fragmento de Okasaki adyacente. El enlace fosfodister final entre los fragmentos es catalizado por la DNA ligasa La DNAPol III se caracteriza por su elevadsima progresividad, potencia cataltica y fidelidad. La holoenzima DNAPol III, el primosoma y la helicasa estn asociadas fsicamente en un gran complejo llamado replisoma, el cual sintetiza DNA a una tasa de 1000 pares de bases/seg. c. Terminacin La replicacin en E. coli finaliza cuando una horquilla de replicacin se encuentra con el otro lado del cromosoma circular en el lugar de terminacin, la regin ter. Existen 6 sitios terminadores de 20 pb casi idnticos. Cada secuencia ter evita una progresin posterior de una de las horquillas de replicacin cuando se une una protena de unin ter (TBP).. Una vez que la replicacin es completada, los dos cromosomas hijos permanecen entrelazados (catenados). Ellos son desligados por la topoisomerasa IV, una DNA topoisomerasa tipo II.

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4.2. REPLICACION EN EUCARIOTAS Las eucariotas tienen numerosos cromosomas lineares, cada uno con muchos sitios donde empieza la replicacin, simbolizados como oriR. El sitio oriR estudiado en eucariotas son llamadas secuencias de replicacin autnoma (ARSs). Ellos se parecen al sitio oriC bacteriano en que ellos consisten de dos regiones que se unen a un distinto set de protenas que desestabilizan la doble hlice. En la regin A se unen factores transcripcionales tales como EF2, as como la topoisomerasa, helicasa y la RNA primasa. El ADN de los orgenes de replicacin se hallan asociados a un complejo de protenas llamadas ORC (origin recognition complex). El ORC es requerido durante la activacin de los orgenes de replicacin. Al comienzo de la fase S, ORC recluta a otras protenas por ejemplo la denominada MCM (minichromosome meintenance proteins) y cdc6 (cell division cycle)- con las cuales integra un complejo mayor llamado pre-RC (pre replication complex). Este cataliza el inicio de la replicacin despus de ser inducido por el factor SPF (S-phase promoting factor), este tambin es llamado FPR (factor promotor de la replicacin). Las enzimas son similares a aquellas involucradas en la replicacin del DNA bacteriano. La DNA topoisomerasa II est involucrada en aliviar superenrollamientos positivos en el DNA, mientras que una helicasa desenrolla las dos cadenas. Hasta la fecha se han identificado mas de una docena de DNA pol eucariotas, siendo las mas comunes; las DNA pol: , , , , y .. TABLA 2. DNA Polimerasas de clulas eucariotas . LOCALIZACIN FUNCION PRINCI PAL Ncleo Replicacin del DNA nuclear Ncleo Reparacin del DNA nuclear Ncleo Replicacin del DNA nuclear Mitocondria Replicacin del DNA mitocondrial Ncleo Reparacin del DNA nuclear

TIPO Polimerasa Polimerasa Polimerasa Polimerasa Polimerasa

En las clulas eucariotas la polimerasa se encuentra formando un complejo con la primasa, y parece funcionar en conjuncin con la primasa para sintetizar pequeos fragmentos de ARNADN durante la sntesis de la cadena retrasada. La polimerasa entonces puede sintetizar tanto la cadena lder como la retrasada, actuando para extender los cebadores de ARN-ADN inicialmente sintetizados por el complejo polimerasa -primasa. Adems la polimerasa puede rellenar los espacios entre los fragmentos de okasaki despus de la eliminacin del cebador.

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Una clase de protenas necesarias para la replicacin se unen con las DNA pol, aumentando la actividad de las polimerasas y manteniendolas unidas al molde de DNA para que continen la sntesis de la nueva hebra de DNA. Tanto las polimerasas y estn asociadas a dos tipos de protenas accesorias que sitan a la polimerasa en el cebador y mantienen su asociacin estable con el molde. Las protenas de enganche de carga, factor de replicacin C (RFC) especificamente reconocen y se unen al DNA de la zona de unin entre el cebador y el molde. Las protenas de enganche deslizante, antigeno nuclear de proliferacin celular (PCNA) se unen adyacente a las proteinas de enganche de carga, formando un anillo alrededor del DNA molde. El anillo formado mantiene la asociacin de la polimerasa con su su molde durante la replicacion, permitiendo la sntesis ininterrumpida de miles de nucleotidos de DNA. Las proteinas de union al DNA monocatenario, el factor de replicacin (RPA) estabilizan la hebra molde de DNA desenrollada por la helicasa, manteniendola en un estado de hebra unica extendida para que sea copiada por la DNA polimerasa. Los cebadores son eliminados por una nucleasa reparadora y su lugar lo ocupa una pieza equivalente de DNA, sintetizada por la DNAP- . El proceso culmina al actuar la DNA ligasa.

Como la DNA polimerasa solo puede agregar nucletidos al extremo 3-OH de una cadena de DNA preexistente, genera un serio problema en las molculas de DNA lineales. Cuando una cadena retrasada se encuentra el final de la molcula de DNA y se elimina el ltimo cebador por la exonucleasa 5 3, el hueco final no puede ser rellenado porque no existe extremo 3 al que unir desoxirribonucleotidos. En consecuencia, las moleculas de DNA lineales corren peligro de producir moleculas de DNA hijas ms pequeas cada vez que se repliquen. El problema se resuelve incorporando secuencias de DNA altamente repetitivos, o telomeros. Estos telomeros consisten en secuencias cortas repetitivas con un alto contenido en la base G en la cadena 5-3 (secuencia TTAGGG en cromosomas humanos). Una DNA pol, denominada telomerasa puede catalizar la formacin de copias adicionales de la secuencia telomerica, compensando de esta manera el acortamiento gradual que tiene lugar en ambos extremos del cromosoma durante la replicacin del DNA.

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REPLI CACI ON EN PROCARI OTAS

presenta las

Requerimientos Caractersticas

Etapas

Bidireccional

Topoiso_ merasa

Protenas SSB

ADN polimerasa

Abrazadera

ADN de orgenes de replicacin

Inicio

eliminan tensiones en

Re qu ier e

Semiconservativa

Asimtrica

dexosirribonucletidos Mg++ cadenas de ADN molde


separadas por

DNA Pol III

DNA Pol II
sintetizan en direccin

DNA Pol I

sintetiza

Asincrnica

5---->3

Sectorial

Cadena atrasada

Cadena continua se agrega nucletidos a extremo 5 Elongacin

Monofocal

Requiere cebadores
sintetizada por

ADN helicasa

Fragmentos de okasaki
se unen por

Elimina los cebadores


se unen

ADN polimerasa I

Terminacin

por

Primasa

ADN ligasa

agrega desoxirribo_ nucletidos

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