Tcnica histolgica que permite detectar protenas (antgenos) por medio de anticuerpos especficos y sistemas de deteccin enzimticos

Batera de anticuerpos monoclonales Sensibilidad de los sistemas de deteccin Recuperacin antignica

1. Batera de anticuerpos
Fc

COOH COOH

CADENAS PESADAS (g, m, a, d, e)

PAPANA
SS

CADENAS LIGERAS (k, l) NH2 NH2

Fab

Fab

Paratopo / Epitopo

Anticuerpo policlonal

Anticuerpo - especificidad

Anticuerpo policlonal

Ac. monoclonales

Khler G, Milstein C (1975)

Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity

Nature 256:495-7

Ac. monoclonales

Csar Milstein y George Khler (Premio Nobel 1984)

Anticuerpo monoclonal
LNEA CELULAR MIELOMA

FUSIN
ESPLENECTOMA
HBRIDOS

Anticuerpo - especificidad

Anticuerpo policlonal

Anticuerpo monoclonal

2. Sensibilidad
Sternberger LA, Hardy PH, Cuculis JJ, Meyer HG (1970) The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry. Preparation and properties of soluble antigen-antibody complex (horseradish peroxidase-antihorseradish peroxidase) and its use in identification of spirochetes J Histochem Cytochem 18:315-33

Sensibilidad

Hsu SM, Raine L, Fanger H

(1981) Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures J Histochem Cytochem 29:577-80

Sensibilidad
Bisgaard K, Lihme A, Rolsted H, Pluzek K-J (1993) Polymeric conjugates for enhanced signal generation in enzyme immunoassays Scand Soc Immunol XXIV Annual Meeting. University Aarhus

Sensibilidad
COMPLEJO POLMEROS DEXTRANO: POLMERO DEXTRANO AC. ANTI-ESPECIE PEROXIDASA
O-

DAB

DIAMINOBENCIDINA + H2O2

AC. PRIMARIO

3. Recuperacin antignica
Shi S-R, Key ME, Kalra KL (1991) Antigen retrieval in formalinfixed paraffin embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections J Histochem Cytochem 39:741-8

Recuperacin antignica

Shi S-R, Key ME, Kalra KL (1991) Antigen retrieval in formalinfixed paraffin embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections J Histochem Cytochem 39:741-8

Recuperacin antignica
Norton AJ, Jordan S, Yeomans P (1994)
Brief, high-temperature heat denaturation (presure cooking): a simple and effective method of antigen retrival for routinely processed tissues

J Pathol 173:371-9

Recuperacin antignica
Kawai K, Serizawa A, Hamana T, Tsutsumi Y (1994)
Heat-induced antigen retrieval of proliferating cell nuclear antigen and p53 protein in formalin-fixed, paraffin-embedded sections.

Pathol Int 44:759-64.

Citoplasmtico

Nuclear

Ki-67/MIB-1

Rec. estrgenos

Membrana

Espectrina

Membrana

LCA

Patrones especiales

HMB-45

Patrones especiales

CD 68

Racemasa

Patrones especiales

Hepatocito

Patrones especiales

CK-CAM 5.2

Patrones especiales

CD 57

Patrones especiales

CD 30

Patrones especiales

S-100

Citoqueratinas

Vimentina

Desmina

GFAP

Neurofilamentos

Diagnstico diferencial

Tumoracin gstrica

CK

LCA

Micrometstasis

HE

CK

Origen metstasis

HE

PSA

PSA

PAP

CK20+

CK7-

Tumores necrosados

HE

CD20

Benignidad / Malignidad

HE

CK 34bE12

Benignidad / Malignidad

Bcl 2

Factores pronstico / predictivos

RE

RP

MIB-1

HER2

Citologas

CK

LCA

Fijacin / Enmascaramiento de epitopos Concentracin del anticuerpo

Almacenamiento secciones / anticuerpo

Calidad del anticuerpo Deterioro reactivos

Controles positivos

1. Fijacin

HE Fijacin ptima: 24 h Fijacin adecuada: 6-72 h Penetracin formol (1 mm/h) Fijacin Fijacin: Reaccin del reloj (Burnett MG, 1982) Subfijacin peor que sobrefijacin

CD20

Control fijacin
VIMENTINA sin recuperacin antignica!

VIM / sin RA

VIM / mo

Battifora H, Am J Clin Pathol 96:669-71,1991

Enmascaramiento de epitopos

Sin RA

Microondas

Pit1

Recuperacin antignica
Seal Fondo

Sin RA

Microondas

CD20

Recuperacin antignica

1/10 (mO)

1/50 (sin RA)

DESMINA

Control recuperacin Ag
MIB1

Chan JKC, Adv Anat Pathol 5:314-25,1998

2. Concentracin

1/500

1/100

CK AE1-AE3

Concentracin insuficiente

1/500

1/100

CK AE1-AE3

Concentracin excesiva

Efecto prozona / Impedimento espacial

Concentracin ptima

Titulacin

1/100

1/50 1/100 1/200 1/500 1/1000 Mxima seal y mnimo fondo

Incremento inmunotincin

Sistemas estandarizados (Ac prediluidos)

Tiempo de incubacin del Ac primario: 20 30

Recuperacin antignica: No

pH 6,1

pH 9,0

Sistema de amplificacin de la seal (Linker)

3. Almacenamiento
Secciones

1 mes (TA)

1 mes (20C)

MIB1

Almacenamiento de secciones

Almacenamiento de bloques

RE (6F11)

RP (1A6)

Bloques de 1962

Almacenamiento del anticuerpo

Alicuotas (-20 C)

Almacenamiento del anticuerpo

Anticuerpo + Glicerol = Anticuerpo:Glicerol 1:1

Punto de congelacin < - 20 C

Almacenamiento del anticuerpo

IgA

IgG

Anticuerpos: 1988 (glicerol)

4. Calidad del anticuerpo

Clon / Laboratorio comercial

9A7 / Laboratorio A

9A7 / Laboratorio B

Receptor vitamina D

5. Deterioro reactivos
No sali nada!!!
DAB / H2O2
Fallo humano

Sist. deteccin

Sist. deteccin + Cromgeno

Qu hacer? Repetir encima

1 IHQ

2 IHQ

Actina msculo liso

6. Controles positivos

Control interno

Controles positivos

RE

HBsAg

Controles externos

Esto tiene que salir positivo!: Control

Artefactos

Difusin
Pigmentos Peroxidasa / biotina endgenas

Recuperacin antignica
Reactividad cruzada

Controles negativos

1. Artefactos

Efecto borde

Pliegues

2. Difusin

3. Pigmentos Hemosiderina

CD34

Vimentina

Melanina
Solucin

HMB 45 + Giemsa

HE
HMB 45: FA-Fast red

4. Peroxidasa / biotina endgenas

Peroxidasa
Solucin

Px - DAB

FA Fast red

Biotina endgena

C. negativo

C. negativo

MIB1

Biotina endgena

Receptor vitamina D

HBcAg

Biotina endgena
Solucin

LSAB

Polmero dextrano

5. Recuperacin antignica
Aparato

HPV Bao termosttico

HPV - Microondas

Recuperacin antignica
Tampn

F XIIIa

CD7

6. Reactividad cruzada

Ciclina D1

TTF1

Reactividad cruzada

MIB 1

Reactividad cruzada

CEA Glicoprotena biliar 1

7. Controles negativos
Interno

Tiroglobulina

Calcitonina

Control preadsorcin
10 nmol / mL

Control preadsorcin

Anti-serotonina

Anti-serotonina + serotonina

Confeccin macromatrices

No queda material!

Am J Clin Pathol 117:194-8, 2002

Mount Quick
(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA)

Necesidad de especializacin - Tcnicos fijos de IHQ

Valoracin microscpica de los resultados

Listado de controles positivos Formacin continuada
- Problemas - Controles de calidad