LAPORAN PRAKTIKUM

REKAYASA BIOPROSES

Materi Asisten

: Kinetika Reaksi Enzimatis : Edi

Tanggal : 22 Maret 2012

OLEH: YUSRINA RAKHMAH P051114031/BTK

BIOTEKNOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2012

Kinetika reaksi enzimatik enzim -amilase terhadap substrat amilum

Yusrina Rakhmah
Mahasiswa Pascasarjana Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor

Abstrak Amilase merupakan enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis pati menjadi gulagula sederhana, seperti maltosa, maltotriosa, dan glukosa. Amilase merupakan biokatalisator yang mempercepat jalannya reaksi tampa ikut bereaksi. Kinetika reaksi enzimatik enzim -amilase terhadap substrat amilum dilakukan dengan mengukur kecepatan reaksi enzim amilase terhadap substrat amilum pada beberapa konsentrasi substrat, yaitu 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, pada pH (7) dan suhu tetap (90-95 oC), serta menghitung Km dan Vmax enzim. Nilai Km yang diperoleh pada praktikum kali ini
adalah 0,4892, menunjukkan bahwa enzim -amilase mempunyai afinitas rendah terhadap substrat, sehingga kesetimbangan reaksi kearah E + S. V max atau kecepatan maksimum dari reaksi enzimatis ini diperoleh dengan nilai 12,64 ppm/menit, yang artinya pada enzim -amilase dapat mengubah substrat amilum menjadi glukosa sebesar 12,64 ppm tiap menitnya. Kecepatan laju reaksi enzimatik dipengaruhi oleh kadar

substrat dan enzim. Pada penambahan substrat sampai jumlah tertentu dengan jumlah enzim yang tetap akan mempercepat reaksi enzimatik sampai mencapai maksimum. Namun penambahan substrat selanjutnya tidak akan menambah kecepatan reaksi. Kata kunci: enzim -amilase, substrat, kinetika enzim.

1 1.1

Pendahuluan

merupakan menjadi merupakan

enzim gulagula polisakarida

yang sederhana. menjadi

Latar Belakang Amilase merupakan enzim Amilase

mengkatalisis reaksi hidrolisis pati Amilase mengubah karbohidrat yang maltosa (alfa dan beta) ataupun
YUSRINA RAKHMAH/P05114031/BTK

yang penting dalam bidang pangan dan bioteknologi.

glukosa seperti enzim secara karena

(glukoamilase). tanaman, amilase

Amilase dan

sehingga sifat protein masih melekat pada dalam enzim. jumlah Enzim dibutuhkan sebagai menjadi sedikit, reaksinya

dapat diperoleh dari berbagai sumber binatang telah mikroorganisme. Saat ini sejumlah diproduksi Penggunaan cepat kondisi dikendalikan 2010). amilase berbagai Untuk dapat sumber komersial. mudah

biokatalisator,

sangat cepat dan berulang ulang. Enzim dapat bekerja didalam sel (endoenzim) membentuk dan diluar sel (ektoenzim). Enzim bekerja dengan kompleks substrat sebelum membentuk produk. Reaksi enzimatik merupakan reaksi spesifik yang dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain suhu, pH, tekanan, substrat dan jenis reaksinya. Pada praktikum ini, suhu dan pH dibuat tetap untuk menetapkan nilai Km dan aktivitas tertinggi dari enzim -amilase. Laju kinetika enzim dapat diukur berdasarkan konsentrasi pengambilan dapat reaksi penurunan substrat contoh dan yang selama

mikroba dianggap lebih prosepektif tumbuh, dan dapat enzim menghasilkan lingkungan produksi (wordpress.com, menggunakan

karbon, seperti molase, amilum, tepung jagung, tepung tapioka, dan sebagainya. Amilase sendiri adalah enzim yang merupakan biokatalisator yang mempercepat jalannya reaksi tampa ikut bereaksi. Pada umumnya enzim bekerja mengkatalis reaksi satu arah, meskipun ada yang mengkatalis reaksi dua arah. Enzim bekerja secara spesifik, karena sisi aktif enzim setangkup dengan permukaan subtrat tertentu. Umumnya enzim tidak dapat bekerja tanpa adanya suatu zat non protein tambahan yang disebut kofaktor. Enzim bersifat thermolabil, merupakan mudah senyawa rusak bila dipanaskan lebih dari 60C. Enzim protein,

dilakukan

berlangsung Kecepatan reaksi enzimatik

(Mangunwidjaja dan Suryani, 1994). juga dipengaruhi kadar enzim,

jumlah enzim yang terikat substrat (ES) dan konstanta Michaelis (Km). Km menggambarkan kesetimbangan disosiasi kompleks ES menjadi enzim dan substrat. Nilai Km kecil
YUSRINA RAKHMAH/P05114031/BTK

berarti enzim mempunyai afinitas tinggi sehingga terhadap ES substrat sangat maka mantap, reaksi 2.2; Cara Kerja 2.2.1 Pembuatan kurva standar Standar glukosa dibuat dengan menyiapkan larutan glukosa murni dengan konsentrasi 0,0 mg/mL sampai 0,35 mg/mL dengan selang 0,05. Sebanyak 1 mL dari masingmasing larutan glukosa murni dimasukkan ke dalam tabung reaksi 1.2 Tujuan Tujuan praktikum ini adalah untuk mempelajari kinetika reaksi enzimatik terhadap enzim substrat alpha-amilase amilum dan dan ditambah 3 mL pereaksi DNS. Larutan dipanaskan watch). akuades sama. divortex dalam air dibuat untuk kemudian mendidih dengan dengan diukur pada dengan dihomogenisasai kompleks

kesetimbangan

kearah kompleks ES. Apabila nilai Km besar berarti enzim mempunyai afinitas rendah terhadap substrat, sehingga kesetimbangan reaksi kearah E + S.

selama tepat 5 menit (gunakan stop Blanko dan Setelah mengganti sampel itu

menghitung Km dan V max enzim.

Metodologi

diperlakukan

2.1; Alat dan Bahan Alat yang digunakan pada praktikum ini waterbath (suhu 90 95oC), spektrofotometer, tabung reaksi, gelas ukur, timbangan, vortex, erlenmeyer, dan stop watch. Bahan yang digunakan untuk enzim -amilase, substrat (larutan amilum) dengan konsentrasi 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% dan 0,5%, buffer fosfat sitrat pH 7.00 50 mM, standar glukosa, pereaksi DNS (garam Na K tartat + NaOH + aquades + DNS).

absorbansinya spektrofotometer

panjang gelombang () 550 nm. Kurva standar dibuat dengan memplot data konsentrasi glukosa murni tabel. 2.2.2 Pengukuran kecepatan Enzim terhadap amilum reaksi -amilase substrat pada
4

(sumbu

X)

versus

absorbansinya (sumbu Y). Catat pada

YUSRINA RAKHMAH/P05114031/BTK

beberapa konsentrasi substrat Prinsip pengukuran kecepatan reaksi enzimatis ini ialah laju hidrolisa amilum diukur dari glukosa yang terbentuk oleh reaksi enzim -amilase terhadap substrast amilum. Sebanyak 10 mL substrat amilum dengan konsentrasi 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5% dibuat dengan melarutkan amillum sesuai konsentrasi pada buffer fosfat sitrat pH 7. Substrat tersebut diinkubasi pada suhu 90-95oC. Pada masingmasing tabung substrat tersebut ditambahkan larutan enzim + buffer (0,1 mL enzim ditambah 0,9 mL buffer fosfat sitrat pH 7, 50 mM, kemudian dipanaskan pada suhu 9095 C selama 5 menit). Campuran enzim substrat diinkubasi kembali pada suhu 90-95 C dan setiap 5
o o

menit sebanyak

diambil 1 mL. dalam

sampel Sampel air

tersebut ditambah 3 mL DNS, dipanaskan mendidih selama 5 menit dan diukur absorbansinya pada 550 nm. Catat pada Tabel 2. Kadar glukosa yang dibentuk oleh hasil hidrolisis amilum enzim diukur terhadap dengan substrat

memplotkan absorbansi pada kurva standar di atas (pekerjaan no. 1) dan dicatat pada Tabel 3.

Hasil

Hasil pembuatan kurva standar glukosa diperoleh absorbansi dari setiap konsentrasi dalam grafik glukosa Tabel kurva yang 1. standar ditunjukkan Sedangkan

glukosa, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1.

Tabel 1

Absorbansi (sumbu Y) pada setiap konsentrasi glukosa murni (sumbu X). Absorbansi 550 nm Ulangan 1 Ulangan 2 Rata-rata 0,031 0,024 0,0275 0,060 0,056 0,0580 0,098 0,091 0,0945 0,148 0,151 0,1495 0,194 0,193 0,1935
YUSRINA RAKHMAH/P05114031/BTK

Konsentrasi Glukosa (mg/L) 50 100 150 200 250

300 350

0,229 0,313

0,269 0,321

0,2490 0,3170

Gambar 1 Hasil

Kurva Standar Glukosa setiap Grafik 5 menit, selama dari 30

pengukuran

absorbansi dengan panjang gelombang () 550 nm pada berbagai konsentrasi amilum yang dihidrolisis oleh amilase Tabel 2

menit,ditunjukkan pada Tabel 2. absorbansi beberapa konsentrasi amilum selama 30 menit ditunjukkan dalam Gambar 2.

Absorbansi 550 nm pada berbagai konsentrasi amilum yang dihidrolisis oleh amilase setiap selang 5 menit. Amilum 0,1% 0,367 0,361 0,378 0,396 0,412 0,436 0,426 Absorbansi 550 nm (nm) Amilum Amilum Amilum 0,2% 0,3% 0,4% 0,456 0,465 0,686 0,435 0,554 0,510 0,487 0,563 0,373 0,489 0,961 0,499 0,498 0,413 0,585 0,498 0,707 0,583 0,476 0,748 0,299 Amilum 0,5% 0,743 0,739 0,526 0,527 0,554 0,527 0,536

Waktu (menit) 0 5 10 15 20 25 30

YUSRINA RAKHMAH/P05114031/BTK

Gambar 2

Absorbansi pada beberapa konsentrasi amilum selama 30 menit.

Sedangkan konsentrasi glukosa yang diperoleh dari hasil hidrolisis oleh amilase terhadap berbagai konsentrasi substrat amilum setiap 5 menit, selama 30 menit, ditunjukkan Tabel 3

pada Tabel 3. Grafik konsentrasi glukosa pada beberapa konsentrasi amilum selama 30 menit ditunjukkan pada Gambar 3.

Konsentrasi glukosa yang diperoleh dari hasil hidrolisis oleh amilase terhadap berbagai konsentrasi substrat amilum setiap selang 5 menit. Konsentrasi Glukosa (mg/mL) Amilum Amilum Amilum 0,2% 0,3% 0,4% 493 502 723 472 591 547 524 600 410 526 998 536 535 450 622 535 744 620 513 785 336

Waktu (menit) 0 5 10 15 20 25 30

Amilum 0,1% 404 398 415 433 449 473 463

Amilum 0,5% 780 776 563 564 591 564 573

YUSRINA RAKHMAH/P05114031/BTK

Gambar 3

Konsentrasi glukosa pada beberapa konsentrasi amilum selama 30 menit. konsentrasi substrat (s) amilum.

Dari persamaan yang diperoleh dari konsentrasi glukosa pada beberapa konsentrasi amilum selama 30 menit, dapat dinyatakan bahwa y = ax + b, dimana a adalah slope dan dapat dinyatakan sebagai kecepatan reaksi Tabel 4 (v) dari masingmasing

Apabila a adalah kecepatan reaksi (v) dan b adalah substrat (s), maka dengan pengalihan dapat persamaan diperoleh MichelisMenten tabel 4.

data seperti yang dapat dilihat pada

Nilai kadar substrat amilum (s) terhadap kecepatan reaksi enzimatis (v) dan pengalihan persamaan MichelisMenten (1/s dan 1/v). v(ppm/menit) 12,8930 7,0357 35,8930 -28,6790 -36,3210 data yaitu persamaan pengalihan dengan untuk 1/s 10,0000 5,0000 3,3333 2,5000 2,0000 1/v 0,0776 0,1421 0,0279 -0,0349 -0,0275

s (%) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Dari persamaan dibuat lagi

proses reaksi enzimatis amilase terhadap substrat amilum sehingga diperoleh kurva seperti yang terlihat pada Gambar 4.
YUSRINA RAKHMAH/P05114031/BTK

menggunakan nilai 1/s dan 1/v, mendapatkan nilai Km dan Vmax dari

Gambar 4 Dari

Kurva reaksi enzimatis amilase terhadap substrat amilum. gambar 4. diperoleh glukosa dengan persamaan, sebagai berikut: Dimana, gelombang y merupakan 550 nm, dan nilai x

persamaan yaitu y = 0.0387x 0.0791 dimana nilai a = 0.0387 dan nilai b = 0.0791. Dari pengalihan persamaan MichelisMenten, yaitu: maka, dapat diketahui bahwa nilai b = dan nilai a = . Sehingga dari persamaan tersebut dapat diperoleh bahwasanya nilai Vmax adalah 1/b dimana nilai b adalah -0.0791, maka nilai Vmax = 12,64 ppm/menit, sedangkan nilai Km dapat diketahui dengan metode subtitusi nilai Vmax ke persamaan 0,4892. nilai a = Km/Vmax, sehingga , maka nilai Km adalah

absorbansi dari glukosa pada panjang merupakan konsentrasi glukosa. Dari persamaan ini, maka dapat diperoleh kadar glukosa yang dibentuk oleh hasil hidrolisis enzim terhadap konsentrasi substrat amilum dengan memplotkan absorbansi gambar 3. Dari hasil grafik konsentrasi glukosa pada beberapa konsentrasi amilum selama 30 menit diketahui bahwa, meningkat konsentrasi seiring namun dapat lama glukosa waktu peningkatan dilihat dari beberapa amilum pada persamaan, seperti pada

Pembahasan

fermentasi, amilum. Ini

Berdasarkan hasil pembuatan kurva standar glukosa diperoleh absorbansi dari setiap konsentrasi

tersebut juga dipengaruhi konsentrasi penurunan garis linier yang terjadi pada konsentrasi amilum 0,4% dan
YUSRINA RAKHMAH/P05114031/BTK

0,5%. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi produk. Menurut Mangunwidjaja dan Suryani (1994), pada reaksi dikatalisis enzim, laju kinetik pada konsentrasi substrat yang rendah merupakan garis lurus dan akan terhambat atau bahkan hilang pada konsentrasi tinggi. Reaksi enzimatik merupakan reaksi spesifik yang dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain suhu, pH, tekanan, substrat dan jenis reaksinya. Pada 950C proses inkubasi dalam untuk aktivitas praktikum ini digunakan suhu 90ditujukan mengoptimalkan substrat yang lebih substrat yang tinggi dapat menghambat laju pembentukan

ini antara lain maltosa, maltotriosa, dan glukosa. Pada praktikum ini, suhu dan pH dibuat tetap untuk menetapkan nilai Km dan aktivitas tertinggi dari enzim -amilase. Laju kinetika enzim diukur berdasarkan penurunan konsentrasi substrat dan pengambilan contoh yang dapat reaksi Pada dilakukan selama reaksi berlangsung. Kecepatan substrat dan laju enzim. enzimatik dipengaruhi oleh kadar penambahan substrat sampai jumlah tertentu dengan jumlah enzim yang tetap akan mempercepat sampai Namun selanjutnya reaksi enzimatik maksimum. substrat mencapai penambahan tidak akan

menambah kecepatan reaksi. Kecepatan juga reaksi enzimatik enzim, dipengaruhi kadar

enzim -amilase. Enzim amilase pada umumnya memiliki aktivitas kerja pada kisaran suhu 250C sampai 950C (Poliana dan MacCabe, 2007). Enzim amilase molekul molekul akan pati memotong (karbohidrat), yang ikatan glikosidik -1,4 pada sehingga terbentuk molekulkarbohidrat lebih pendek (Rodriguez, et al., 2007). Hasil dari pemotongan enzim

jumlah enzim yang terikat substrat (ES) dan konstanta Michaelis (Km). Km menggambarkan kesetimbangan disosiasi kompleks ES menjadi enzim dan substrat. Nilai Km kecil berarti enzim mempunyai afinitas tinggi sehingga terhadap ES substrat sangat maka mantap, reaksi kompleks

kesetimbangan

kearah kompleks ES. Apabila nilai

YUSRINA RAKHMAH/P05114031/BTK

10

Km besar berarti enzim mempunyai afinitas rendah terhadap substrat, sehingga kesetimbangan reaksi kearah E + S. Nilai Km yang diperoleh pada praktikum kali ini adalah 0,4892. Ini menunjukkan bahwa nilai Km besar yang berarti enzim -amilase mempunyai afinitas rendah terhadap substrat, sehingga kesetimbangan reaksi kearah E + S. Vmax atau kecepatan maksimum dari reaksi enzimatis ini diperoleh dengan nilai 12,64 ppm/menit yang artinya pada enzim -amilase dapat mengubah substrat amilum menjadi glukosa sebesar 12,64 ppm tiap menitnya.

Kesimpulan bahwa substrat kecepatan dan

yang laju enzim.

dapat reaksi Pada

diambil dari praktikum ini adalah enzimatik dipengaruhi oleh kadar penambahan substrat sampai jumlah tertentu dengan jumlah enzim yang tetap akan mempercepat sampai Namun selanjutnya reaksi enzimatik maksimum. substrat mencapai penambahan tidak akan

menambah kecepatan reaksi.

Nilai Km yang diperoleh pada praktikum kali ini adalah 0,4892, menunjukkan bahwa enzim

amilase mempunyai afinitas rendah

terhadap substrat, sehingga kesetimbangan reaksi kearah E + S. V max atau kecepatan maksimum dari reaksi enzimatis ini diperoleh dengan nilai 12,64 ppm/menit, yang artinya pada enzim -amilase dapat mengubah substrat amilum menjadi glukosa sebesar 12,64 ppm tiap menitnya.

Kesimpulan

. Daftar Pustaka Mangunwidjaja, D., dan A. Suryani. 1994. Teknologi bioproses. Swadaya. Jakarta. Poliana, J., MacCabe A. P. 2007. Industrial Enzymes; Structure, Function, and
YUSRINA RAKHMAH/P05114031/BTK

11

Applications. Dordrecht: Springer. Halaman 20-22. Rodriguez, V. B., Alamenda E. J., Gallegos J. F. M., Requena A. R., Lopez A. I. G., Cabral J. M. S., Fernandes P., Fonseca de L. I. P. 2006. Modification of the activity

of an a-amylase from Bacillus licheniformis by several surfactants. Electron J Biotechnol 9 (5). Wordpress.com. 2012. Amilase. http://ptp2007.wordpress.com/2008/0 5/15/ amilase/. Diakses pada tanggal 28 Juni 2012

YUSRINA RAKHMAH/P05114031/BTK

12