Sntesis de RNA

Todos

los organismos vivos deben ser capaces de almacenar y preservar su informacin gentica. Todos los organismos vivos deben ser capaces de transmitir su informacin gentica a las generaciones siguientes y futuras. Todos los organismos vivos deben ser capaces de expresar la informacin gentica que contienen porque ella es la que lleva la informacin para la ejecucin y regulacin de todos los procesos que implica la vida.

Para que la informacin gentica almacenada en el DNA pueda realizar su funcin debe haber un mecanismo que le permita ser expresada o transmitida. Este mecanismo se inicia por la transcripcin de la informacin contenida en el DNA en una molcula que pueda ser leda y destruida segn sea conveniente para el funcionamiento celular. El Mecanismo de Complementaridad hace posible la cesin exacta de la informacin gentica transcribindola en una molcula de RNA cuya secuencia de bases es una copia exacta de una secuencia complementaria de DNA. El DNA mismo slo debe funcionar como molde y no debe ser alterado durante el proceso de transcripcin de manera que la informacin pueda ser conservada y leda una y otra vez sin modificaciones, cada vez que sea requerida para el mantenimiento de la homeostasis.

TRANSCRIPCIN
1) 2) 3) 4)

Aspectos generales Transcripcin en Procariotes Transcripcin en Eucariotes Mecanismos reguladores

Se refiere al sistema fundamental de mantenimiento y flujo de la informacin gentica en los organismos vivos.

La informacin gentica contenida en el DNA se mantiene mediante su capacidad de replicacin. La informacin contenida en el DNA se expresa: 1. Mediante el proceso de transcripcin, paso por el que la informacin se transfiere a una molcula de RNA mensajero (RNAm) 2. Mediante el proceso de la traduccin, el mensaje transportado por el RNAm se traduce a protena

Dogma Central de la Biologa Molecular (2)

Este esquema central de flujo de la informacin pronto fue

modificado, ya que en algunos virus cuyo material hereditario es RNA, la informacin se conserva o mantiene mediante replicacin del RNA. Adems, tambin se comprob que la informacin no va siempre del DNA hacia el RNA (DNARNA), en algunos casos la informacin puede fluir del RNA hacia el DNA (RNADNA), es decir sintetizar DNA tomando como molde RNA, teniendo lugar el fenmeno de la transcripcin inversa.

Transcripcin
Con la excepcin de los RNAs de ciertos virus, todas las

molculas de RNA se forman a partir de informacin almacenada permanentemente en el DNA. Durante la transcripcin, un sistema enzimtico convierte la informacin gentica de un segmento del DNA de doble cadena en una cadena de RNA con una secuencia complementaria a la de una de las cadenas del DNA. En la replicacin se copia el cromosoma entero, mientras que la transcripcin es ms selectiva. En un momento dado solo son transcritos genes o grupos de genes determinados y algunas regiones del genoma no son transcritas nunca. Secuencias reguladoras especficas indican el principio y el final de los segmentos de DNA que deben ser transcritos y designan que cadena de DNA se debe utilizar como molde.

Transcripcin = sntesis de RNA. En las bacterias la transcripcin y la traduccin tienen lugar en el citoplasma bacteriano y al mismo tiempo, son simultneas. En eucariontes la transcripcin tiene lugar en el ncleo y la traduccin en el citoplasma. En ambos casos necesita:
Una cadena de DNA que acte como molde. Enzimas: RNA-polimerasa. Ribonucletidos trifosfato de A, G, C y U. Cofactores y reguladores

Proceso, se realiza en tres fases:

Iniciacin Elongacin Terminacin.

Flujo de la informacin gentica en eucariotas

Transcripcin
RNA Polimerasa

Este proceso constituye un evento central en la expresin de la informacin gentica. Consiste en el copiado de la secuencia de la hebra con sentido de un gene para formar un transcrito de RNA complementario que transcriba con exactitud la informacin gentica contenida en el DNA. El proceso es catalizado por la RNA-Polimerasa dependiente de DNA, enzima que se encuentra presente en todos los tipos celulares. La bioqumica del proceso de transcripcin es relativamente sencilla, pero los mecanismos regulatorios que han sido desarrollados para el control de la transcripcin son complejos y muestran grandes variaciones.

La RNA polimerasa, enzima que cataliza la polimerizacin de los ribonucletidos debe tener las siguientes capacidades:
a)

b)

c)

d) e)

Reconocer las secuencias promotoras que marcan el inicio de la transcripcin, para lo que cuenta con la ayuda de los factores proteicos de transcripcin. Leer la hebra molde del DNA en sentido 3 5; lee la secuencia de bases y selecciona los ribo nucletidos trifosfatos, cuya base debe ser complementaria a la base del molde. Cataliza la formacin del enlace ster entre los nucletidos. La enzima cataliza la incorporacin del nucletido monofosfato a la cadena del RNA en formacin mediante un enlace ster. Al mismo tiempo utiliza la energa desprendida de su hidrlisis al liberar un resto de pirofosfato. Polimeriza invariablemente en sentido 5 3. Reconocer las secuencias de terminacin de la transcripcin.

Transcripcin: Biosntesis de RNA

Una de las dos cadenas que componen el DNA de un gene acta como molde para la sntesis de una cadena de RNA. Pero en el DNA hay secuencias gnicas distintas:
a)

b)

c)

Genes que se transcriben y se traducen: porque poseen informacin para la sntesis de protenas. Al transcribirse originan RNAm Genes que se transcriben pero no se traducen: por ejemplo aquellos que tienen informacin para la sntesis del RNAr y del RNAt, que colaboran en la sntesis de las protenas. Secuencias que ni se transcriben, ni se traducen pero son fundamentales como Secuencias gnicas reguladoras, indicando dnde y cuando se debe comenzar a transcribir el gene y dnde debe finalizar la lectura.

RNA Polimerasa

En bacterias, existe solamente una RNA polimerasa que es capaz de sintetizar todos los tipos de RNA, el ribosomal, el de transferencia y los mensajeros. En bacterias, con mucha frecuencia, los RNAm son polignicos o policistrnicos, de manera que un solo RNAm contiene informacin para la sntesis de varios polipptidos distintos. Habitualmente se trata de genes que comparten un sistema comn que controla su expresin (opern). En eucariontes hay diferentes polimerasas encargadas de sintetizar distintos tipos de RNA y el RNAm es usualmente monognico, solo transcribe la informacin para un solo poliptido.

Actividad Correctora
Un error en la replicacin del ADN puede transmitirse a todas las clulas que deriven por divisin de la clula afectada. Esto exige que durante la replicacin exista un mecanismo eficaz que corrija cualquier error que se haya podido introducir en la secuencia de bases del DNA. A diferencia de lo que ocurre con las DNA polimerasas, las RNA polimerasas o transcriptasas, habitualmente carecen de funcin "correctora de pruebas". Esta diferencia se debe:

1. 2.

los transcritos son cortos y la probabilidad de que uno de los RNA posea una alteracin es baja, y la vida media de los RNA es corta y pronto se vuelve a sintetizar otro RNA nuevo.

Por consiguiente no es grave que se transcriba un RNA con una alteracin ya que durar poco y ser remplazado pronto por otro nuevo sin la alteracin.

 A.

Estructura de la enzima B. Unin al molde C. Iniciacin de cadenas D. Elongacin de cadenas E. Terminacin de cadenas F. RNA polimerasas eucariotas

La RNA polimerasa, la enzima responsable de la sntesis de RNA dirigida por DNA, fue descubierta en 1960 por Samuel Weiss y Jerard Hurwitz (trabajando de manera independiente). La enzima une entre s los ribonucletidos trifosfato ATP, CTP, GTP y UTP, utilizando como molde secuencias especficas de DNA las cuales transcribe siguiendo el principio de complementaridad: la A del DNA empareja con U del RNA, la G con C, la C con G y la T con A Esta serie de reacciones es posible gracias a la energa producida por la liberacin de PP, y su hidrlisis posterior, durante cada una de las adiciones de nucletidos a la cadena de RNA.

Todas las clulas contienen RNA Polimerasa. En las bacterias, una variedad de esta enzima sintetiza todos los RNAs celulares, exceptuando los cortos cebadores que se utilizans en la replicacin del DNA. Varios bacterifagos sintetizan tambin RNA polimerasas que slo producen RNAs especficos de fago. Las clulas eucariotas contienen cuatro o cinco RNA polimerasas, cada una de las cuales sintetiza una clase diferente de RNA. En esta seccin consideraremos primero las caracteristicas del enzima de E. coli debido a que es la RNA polimerasa mejor caracterizada; otras RNA polimerasas poseen propiedades similares. Finalmente consideraremos las enzimas eucariotas.

Para cumplir con su funcin la RNA polimerasa:

1. Reconoce y se une a las localizaciones especficas o promotores de la molcula de RNA. Este proceso incluye aparentemente dos pasos, reconocimiento por la subunidad de elementos indicadores situados entre los lugares -40 a -70 y reconocimiento por el factor del promotor en la regin entre -10 a -35. Desenrolla parcialmente la molcula del DNA molde , gracias a su actividad intrnseca de helicasa, e inicia la transcripcin. Polimeriza algunas pocas molculas de ribonucletidos formando una especie de cebador que ser posteriormente alargado. Se desprende del complejo de iniciacin o de la subunidad Cataliza consecutivamente la elongacin de la cadena de RNA, al mismo tiempo que enrolla y desenrolla la doble cadena de DNA. Termina la transcripcin cuando encuentra la seal adecuada.

2. 3. 4. 5. 6.

RNA POLIMERASA DE E. COLI

La RNA polimerasa de E. coli cataliza la sntesis de todas las clases de RNA y es un complejo polipeptdico relativamente grande con un peso molecular de ~ 450 kD. La holoenzima (enzima completa) se compone de varias subunidades diferentes: 2, , , y . La fijacin del factor a la parte central activa de la enzima es transitoria y su presencia la hace capaz de seleccionar y unirse tanto a la hebra correcta, como al molde correcto en la estructura del DNA para iniciar la sntesis de RNA. Despus de que la polimerasa transcribe ~10 pares de bases, la subunidad es liberada. La enzima activa o enzima central (2, , y ) es la estructura que realmente lleva a cabo el proceso de polimerizacin del RNA. Las subunidades y constituyen el sitio activo para polimerizar los ribonucletidos trifosfato (NTPs) de acuerdo a la hebra molde del DNA.

 2 1

Estructura esquemtica de la RNA Polimerasa procariota en funcionamiento

Imagen del complejo transcripcional compuesto por DNA, RNA polimerasa y transcripto de RNA, obtenida por cristalografa de rayos X. En gris se muestra la estructura de la RNA polimerasa, en azul, el DNA que se usa como "molde" en la transcripcin, y en rojo, el RNA transcripto.

Factor

La interaccin de la subunidad , llamada tambin factor , con un promotor indica a la polimerasa que inicie la transcripcin de las secuencias especficas que constituye el molde de DNA a partir del sitio +1. Se han identificado varios tipos de factores con diferente selectividad. Por ejemplo, el factor 70 en E. coli, participa en la transcripcin de la gran mayora de los genes, mientras que 32 y 28 promueven la transcripcin de los genes de las protenas de choque trmico (heat schock genes) y del gene de la flagelina (protena importante en la estructuracin del flagelo) , respectivamente. En estos casos los exponentes indican el peso molecular del factor en kilodaltones.

La fijacin del factor a la parte central activa de la enzima es transitoria y su presencia la hace capaz de seleccionar y unirse tanto a la hebra correcta, como al molde correcto en la estructura del DNA para iniciar la sntesis de RNA. Despus de que la polimerasa transcribe ~10 pares de bases, la subunidad es liberada.

Tipos de RNA Polimerasas dependientes de DNA Polimerasa

Bacterias RNA Polimerasa Eucariotas (Ncleo) RNA Polimerasa I RNA Polimerasa II RNA Polimerasa III RNA Polimerasa IV (plantas) Eucariotas (Organelos) RNA Polimerasa Mitocondrial RNA Polimerasas Cloroplasto (mltiples)

Genes Transcritos
Todos los genes RNAr (excepto 5SRNAr) RNAm, RNAsno, RNAmi RNAt, 5SRNAr, RNAsn RNAsi (heterocromatina) Genes mitocondriales Genes del Cloplasto

RNA Polimerasa de E. coli

La forma de la enzima es irregular, de ~100 x 100 x 160 . Su caracterstica ms notable es una proyeccin digitiforme que rodea un canal cilndrico que tiene un dimetro de ~25 y una profundidad de 55 . El canal posee un tamao suficiente para acomodar unos 16 pares de bases de -DNA, lo que no es suficiente para explicar los 50 a 60 pares de bases de -DNA que se sabe que se encuentran asociados simultneamente a la RNA polimerasa durante la transcripcin. La subunidad contiene dos tomos de Zn+, que se piensa que participan en la funcin cataltica de la enzima. La enzima activa requiere tambin de la presencia de Mg2+.

Estructuras cristalinas de alta resolucin de la RNA Polimerasa II de levadura (derecha) y la RNA Polimerasa de Thermus thermophilus (izquierda) mostrando la similitud entre las estructuras principales de ambas enzimas.
Verde = Rpb1/ Azul violaceo = Rpb2/ Rojo = Rpb3/1 Amarillo = Pb11/2 Magenta = Rpb6/

La RNA Polimerasa es una de las mayores enzimas solubles conocidas, y su tamao de cerca de 100 de dimetro permite su visualizacin en micrografas electrnicas. Estas fotografas indican claramente que la RNA polimerasa se une a los promotores El gran tamao de la holoenzima del DNA.
1. 2. 3. 4.

deriva probablemente de sus varias y complejas funciones, que incluyen

la unin al molde la iniciacin de la cadena de RNA la elongacin de la cadena la terminacin de la cadena.

Etapas de la transcripcin:
Iniciacin en Eucariotas
1.

2.

Para que la RNA polimerasa transcriba los genes, existen en los genes eucariotas tres tipos de secuencias gnicas reguladoras: El promotor: es la regin ms prxima al inicio de la transcripcin y esta formada por la secuencia -25 TATA, -80CAAT y -120 GC. Los factores proteicos de transcripcin que se unen al promotor, conocidos como factores basales, ayudan a la RNA polimerasa a colocarse en el sitio de iniciacin del gen. Las secuencias potenciadoras (enhancers): situadas mucho ms lejos, entre -200 y -10000, a ellas se unen los factores activadores de la transcripcin, que cumplen dos funciones:
1.

2.

Desempaquetar la cromatina al disgregar los nucleosomas, y consiguen desenrollar la doble vuelta del ADN, para que la regin promotora quede accesible. Incrementar la velocidad de transcripcin.

3.

Las secuencias silenciadoras (silencers): se encuentran intercaladas entre las activadoras y a ellas se unen los represores, disminuyendo la velocidad de transcripcin.

HRE = Elemento Respuesta Hormonal TAFs = Factores asociados a TBP TBP = Protena fijadora de TATA A H = Factores basales de Transcripcin

La Transcripcin y la traduccin funcionan de manera acoplada en las bacterias Puesto que en las bacterias ambos procesos ocurren en el mismo compartimiento, la traduccin del mensajero por los ribosomas puede iniciarse tan pronto el extremo 5 del RNAm es accesible. Cuando el primer ribosoma se aleja funcionalmente del extremo 5 del RNAm, puede fijarse un segundo ribosoma y as sucesivamente.

En procariotas, el proceso completo de transcripcin y traduccin ocurre en minutos. En contraste, en los eucariotas el proceso completo puede tomar horas, o en algunos casos, meses, debido a que la sntesis del RNAm y la sntesis de protenas ocurren en compartimientos celulares separados. La Iniciacin de la Transcripcin es el punto en el cual es regulada la transcripcin de la mayora de los genes, tanto en procariotas como en eucariotas No obstante, puesto que la transcripcin y la traduccin estn desacopladas en los eucariotas, el control de la expresin gentica puede ocurrir en estos organismos a otros niveles, incluyendo el procesamiento del RNA transcrito, el transporte del RNAm al citoplasma y la estabilidad del RNAm en el citosol.

Representacin esquemtica de la RNA polimerasa de E. coli fija al DNA.

Elongacin

El DNA se desenrolla temporalmente durante la transcripcin. En todo momento durante el progreso de este proceso est desenrollado unos 17 pares de bases. La RNA Polimerasa se desplazan de izquierda a derecha a lo largo del DNA. El DNA se desenreda por delante y se vuelve a enredar por detrs a medida que se transcribe el RNA. A medida que el DNA se vuelve a enrollar, se desplaza el hbrido RNA-DNA y se expulsa la hebra de RNA. Nuevos nucletidos trifosfatos son llevados hacia el sitio activo de la RNA-Polimerasa para ser incorporados al RNA que se est sintetizando.

Unin al Molde

El RNA se sintetiza en direccin 5' 3' La sntesis de RNA se inicia, por lo general, nicamente en sitios especficos del molde de DNA. La RNA polimerasa se une a estos sitios de iniciacin a travs de secuencias de bases conocidas como promotores, que son reconocidas por el correspondiente factor . Un par de bases de una regin promotora o reguladora recibe una numeracin que puede ser positiva (downstream) o negativa (upstream), segn se encuentre respectivamente hacia 3' o hacia 5' del sitio de inicio de transcripcin. Por convencin el sitio de inicio de la transcripcin recibe el nmero +1 El promotor est formado por una secuencia 40 pb que est situada en el lado 5 (upstream) del sitio de inicio de la transcripcin.

Caja TATA o Caja de Pribnow

La holoenzima forma complejos muy fuertes con los promotores (constante de disociacin K lO-14M) y, por tanto, protege a los segmentos de DNA a los que se une de la digestin por DNasa 1. La regin comprendida entre los residuos -20 a +20 resulta protegida, durante la transcripcin, de la degradacin por DNasa 1. Las determinaciones de la secuencia de las regiones protegidas de numerosos genes de E. coli y de fagos han revelado una secuencia consenso para los promotores de E. coli. Su secuencia ms conservada es un hexmero centrado alrededor de la posicin -10, conocido como la Caja TATA o Caja de Pribnow (de David Pribnow, quien seal su existencia en 1975). Su secuencia consenso es TATAAT, donde las TA iniciales y la T final son altamente conservadas. Secuencias de bases de nmeros ms negativos, situadas ms hacia 5', alrededor de la posicin -35, tambin contienen una regin conservada, TCTTGACAT, la cual es ms evidente en promotores eficientes. El espacio entre las secuencias 10 y 35 y el punto inicial de la transcripcin es muy importante, deleciones o inserciones que cambian este espaciamiento son deletreas.

Los promotores bacterianos poseen dos secuencias consenso diferentes.

Su secuencia ms conservada es un hexmero centrado alrededor de la posicin -10, conocida como la caja TATA o caja de Pribnow. Su secuencia consenso es TAtAaT, donde las TA iniciales y la T final son altamente conservadas. Secuencias situadas alrededor de la posicin -35, tambin contienen una regin conservada, tcTTGACat, la cual es ms evidente en promotores eficientes. Las letras maysculas indican las bases ms conservadas (>50%), las minsculas las menos conservadas (<50%) La primera base transcrita esta marcada como +1. Los indicadores upstream y downstream son nomeclatura tradicional. El espacio entre las secuencias 10 y 35 y el punto inicial de la transcripcin es muy importante, deleciones o inserciones que cambian este espaciamiento son deletreas.

 La

holoenzima contacta con el promotor solamente alrededor de la caja de Pribnow y de la regin de -35. Los modelos indican que estos sitios protegidos se encuentran ambos sobre el mismo lado de la doble hlice, son por lo tanto elementos cis, lo cual sugiere que la RNA polimerasa se une a una sola de las hebras del promotor bihelicoidal.

Complejo Abierto
Los anlisis de huellas indican que la unin de la

holoenzima "funde" (en el sentido de que desenrolla a la doble hlice separando las cadenas) al DNA en una regin de 11 pb que se extiende del centro de la caja de Pribnow hasta justo despus del sitio de iniciacin (posiciones -9 a +2). La necesidad de formar este "complejo abierto" explica por qu la eficiencia del promotor tiende a disminuir conforme aumenta el nmero de pares de bases G-C en la caja de Pribnow; probablemente esto aumenta la dificultad para abrir la doble hlice en la forma necesaria para la iniciacin de la cadena (vale la pena recordar que los pares G-C son ms fuertes que los pares A-T).

Transcripcin
En Resumen, con extrema sencillez, el

proceso de transcripcin se puede estudiar como compuesta de tres procesos sucesivos:

La iniciacin La elongacin de la cadena y La terminacin

Iniciacin

La RNA polimerasa se desliza a lo largo del DNA hasta que encuentra la secuencia del promotor. Una vez que la enzima encuentra al promotor se produce, cerca de la caja de Pribnow, el desenrollamiento de una corta regin del DNA. La transcripcin empieza con la fijacin del primer nucletido trifosfato (usualmente ATP o GTP) al complejo de la RNA polimerasa. Entonces se produce un ataque nucleoflico del grupo 3'-OH del primer nucletido trifosfato sobre el segundo nucletido trifosfato (posicionado por enlaces de hidrgeno de acuerdo a la complementariedad con el DNA que sirve de molde) y se produce el primer enlace fosfodister. Puesto que los grupos fosfato del primer nucletido no participan en estas reacciones, el extremo 5 del transcrito primario termina en un grupo trifosfato. Cuando la secuencia de transcripcin alcanza unos 10 nucletidos, la conformacin de la RNA polimerasa cambia, el factor es liberado y la fase de iniciacin termina. Tan pronto la RNA polimerasa ha iniciado la transcripcin y ha dejado libre el sitio del promotor, este queda listo para ser ocupado por una nueva enzima e iniciar otro proceso similar de transcripcin de dicha regin del DNA.

Para iniciar la transcripcin la RNA polimerasa se fija sobre el DNA y se desliza sobre l buscando una secuencia de bases que funcione como un promotor adecuado e indique el extremo 5 de una secuencia de bases del DNA donde debe iniciarse la transcripcin:
a. b. c. d. El factor se fija a la secuencia 5-TATAAT-3, llamada caja TATA, uniendo la holoenzima a tal sitio, La actividad de la RNA pol desenrolla 17 pares de bases (pb) del DNA para formar el Complejo de Preiniciacin La RNA Pol forma el primer enlace fosfodister entre los dos primeros ribonucletidos que se aparean satisfactoriamente, iniciando la nueva cadena, sin la necesidad de un iniciador Una vez que se han formado los primeros enlaces fosfodister el factor se disocia, lo cual disminuye la afinidad de la polimerasa por el promotor y facilita el progreso de la RNA Pol a lo largo de la cadena del DNA sintetizando la cadena de RNA

Elongacin
El alargamiento de la cadena de RNA se realiza mediante la

incorporacin de nuevos ribonucletidos complementarios a la secuencia de bases del DNA

a. b. c. d.

La RNA pol, la porcin de DNA cuyas hebras se han separado y la cadena naciente de RNA forman la Burbuja de Transcripcin que se desliza a lo largo del DNA durante el proceso Los ribonucletidos son unidos a la cadena naciente de acuerdo a la ley de complementariedad, con la excepcin de que el uracilo se aparea con la adenina del DNA en lugar de la timina La enzima Topoisomerasa previene la ocurrencia de superenrollamiento tanto por delante, como por detrs del avance de la burbuja de transcripcin La RNA pol no tiene actividad de nucleasa y por lo tanto no posee la posibilidad de corregir los errores que se produzcan durante la transcripcin. De esto depende que la transcripcin sea un proceso mucho ms sujeto a errores que la replicacin.

Elongacin

Una vez que se libera el factor y la afinidad del complejo de la polimerasa por el promotor disminuye, se inicia la fase de elongacin. La RNA polimerasa fija algunas protenas accesorias y se convierte en un activo complejo de transcripcin. Segn la sntesis procede en la direccin 5' > 3 (downstream), el DNA se va desenrollando por delante de la llamada burbuja de transcripcin (el segmento en el cual el DNA permanece desenrollado transitoriamente mientras progresa el avance del Complejo Enzima-DNA-RNA transcrito) La actividad desenrolladora de la RNA polimerasa produce superenrollamiento por delante de la burbuja de transcripcin y subenrollamiento por detrs, que sern resueltos por la actividad de la Toposiomerasa. La incorporacin de nucletidos continuar hasta que la actividad de la enzima encuentre una seal de final de la transcripcin.

Elongacin
Segn la RNA polimerasa avanza, mantiene separadas las

dos hebras del DNA formando una burbuja de transcripcin caracterstica que progresa al mismo tiempo que la doble hlice del DNA se desenrolla enfrente de ella y se vuelve a enrollar atrs. Al mismo tiempo que avanza, la polimerasa proteje un espacio, o huella, de cerca de 30 pb en la secuencia del DNA contra el ataque por endonucleasas. Este espacio, o huella, comprende tanto la burbuja de transcripcin como algo de la doble hlice del DNA en ambos extrremos de la burbuja. Dentro de la burbuja de transcripcin una hebra del DNA sirve como molde para la sntesis de RNA complementario por apareamiento de bases.

El sitio cataltico de la polimerasa tiene un subsitio fijador de sustratos en donde los nucletidos trifosfato entrantes (NTP) son fijados por la enzima y seleccionados por su apareamiento complementario con los nucletidos en la hebra molde del DNA. Tambin tiene un subsitio fijador del producto, en el cual est localizado el extremo 3-OH del RNA en crecimiento.

En este subsitio, durante la reaccin de crecimiento, se remueve un pirofosfato del NTP sustrato y se forma un enlace fosfodister con el extremo 3-OH del ltimo nucletido incorporado a la cadena de RNA. La hidrlisis subsecuente del pirofosfato facilitar la reaccin y producir energa suficiente para producirla El ion Mg2+ fijo en el sitio activo de la enzima ayuda aumentando la nucleofilicidad del grupo 3-OH y/o estabilizando la carga negativa del grupo pirofosfato liberado. La transcripcin, como la duplicacin del DNA, procede invariablemente en la direccin 5 3.

La adicin de cada uno de los nuevos nucletido trifosfatos se acompaa de un cambio en la posicin del sitio activo de la polimerasa que avanza una posicin a lo largo del molde de DNA. Como resultado de este avance, el hbrido DNARNA mantiene un tamao constante de 9-12 pares dentro de la burbuja de transcripcin, pero el RNA aumenta una base en su crecimiento y el camino a seguir disminuye una base para llegar al final. Este ciclo de aumento en la cadena de RNA contina de una manera progresiva de manera que se forme una cadena de RNA que responda fielmente a la regla de complementariedad de bases con la hebra molde del DNA.

Las secuencias de terminacin contienen palndromos. El RNA transcrito en una seal palindrmica del DNA produce un segmento inestable en forma de orquilla. Aparentemente esta estructura produce que la actividad de la polimerasa se interrumpa o se retarde y se rompa parcialmente el hbrido RNA-DNA.

Terminacin independiente de (rho). En este tipo, varios residuos

El factor se fija directamente al RNA y no a la RNA polimerasa.

de uridina (~6) continan la estructura de la orquilla. Puesto que las interacciones U-A son dbiles, estas cortas secuencias de U-A en el hbrido promueven la disociacin del RNA recientemente transcrito de su molde de DNA. Terminacin dependiente de . El factor (una enzima que cataliza el desenrollamiento de las dobles hlices RNA-DNA, mediante la utilizacin de ATP) promueve la disociacin del complejo de la RNA polimerasa y la separacin del hbrido RNA-DNA.

Terminacin

La finalizacin del proceso de transcripcin de una regin especfica del DNA, se realiza cuando la RNA pol atraviesa por donde existe una seal de terminacin de la transcripcin Este proceso requiere con frecuencia de la actividad de algunos factores llamados factores (rho)

Molculas maduras de RNAr y RNAt son producidas a partir de largos transcritos por procesamiento postranscripcional. El genoma de E. coli contiene varias repeticiones de los genes para los 16S, 23S, and 5S RNAr, todos estos genes forman parte de un opern. El transcrito es un RNA 30S policistrnico que debe ser procesado. Inicialmente el RNA 30S policistrnico es metilado y despues segmentado por varias RNAsas en varios segmentos ms pequeos. Segmentacin posterior, por otras RNAsas, producir el RNA maduro del tamao adecuado. Este mismo RNA policistrnico produce algunas molculas de RNAt durante el procesamiento. Los dems RNAt son producidos a partir de otros transcritos primarios por un procesamiento similar en el que intervienen varias RNAsas. En el ltimo paso del procesamiento del RNA un nmero importante de bases son modificadas mediante varios tipos de actividad (desaminacin, metilacin y reduccin).

Procesamiento del RNA Ribosomal en E. coli.

Cada opern de RNAr codifica un transcrito primario que contiene una copia de cada uno de los RNA ribosomales 16S, 23S, y 5S rRNAs. Cada transcrito codifica tambin por uno o dos RNAt llamados espaciadores y hasta por dos RNAt en el extremo final del transcrito. El procesamiento incluye un gran nmero de reacciones de hidrlisis catalizados por RNAsas (identificadas en la figura por letras o nmeros) y varios procesos de splicing. Es adecuado hacer notar que la RNAsa marcada P, es una ribozima.

Desplazamiento

El ncleo de la enzima, que no se une al promotor de manera especfica, se une estrechamente al DNA bicatenario (la constante de disociacin del complejo es K 5 x lO-12M y su vida media es ~60 min). Por el contrario, la enzima se une al DNA no promotor de una manera comparativamente ms dbil (K 1O-7M y vida media > 1 s). Aparentemente, la subunidad permite que la holoenzima se desplace rpidamente a lo largo de una hebra de DNA buscando el promotor correspondiente a la subunidad de que se trate. Una vez que se ha iniciado la transcripcin y la subunidad ha sido liberada, la fuerte unin entre el ncleo de la enzima y el DNA estabiliza el complejo ternario enzimaDNA-RNA.

Iniciacin
La RNA polimerasa como holoenzima, es decir con el factor , se une inicialmente al promotor para formar un complejo reversible, llamado cerrado puesto que el DNA permanece formando su doble hlice de bases apareadas. Este complejo experimenta una transicin estructural a la forma llamada abierta, en la cual aproximadamente 18 pb del DNA, alrededor del punto inicial de la transcripcin, se funden (las dos hebras de la doble hlice se separan) para exponer la hebra que servir de molde para la sntesis del RNA. La transcripcin parece ser favorecida por la existencia de un superenrollamiento negativo de la regin del promotor, la cual requiere el empleo de una cantidad menor de energa libre para la separacin de las dos hebras del DNA. Asimismo las regiones ricas en AT tambien requieren menos energa para iniciar su fusin. La formacin del complejo abierto es generalmente irreversible

Iniciacin
Una vez que la holoenzima ha iniciado la transcripcin

del RNA, el factor se disocia del complejo enzimaDNA-RNA, y as puede unirse a otro ncleo para formar un nuevo complejo de iniciacin. La base 5'-terminal de los RNAs procariticos es casi siempre una purina, siendo la A ms frecuente que la G. La reaccin de iniciacin de la transcripcin es la unin de dos nuclesidos trifosfato en la reaccin: pppA + pppN pppApN + PPi Los RNAs bacterianos, por tanto, poseen grupos 5'trifosfato terminales.

Dos antibiticos emparentados, la rifamicina B producida por Streptomyces mediterranei, y su derivado semisinttico, rifampicina, inhiben especficamente el inicio de la transcripcin por RNA polimerasas procariotas, aunque no la catalizada por RNA polimerasas eucariotas. Esta selectividad, y su elevada potencia (la RNA polimerasa bacteriana es inhibida en un 50 % por concentraciones 2 x lO-'M de rfampicina), han hecho de estos dos antibiticos dos agentes bactericidas de aplicacin mdica contra bacterias gram-positivas y la tuberculosis. Sin embargo, una vez que ha tenido lugar la iniciacin de la cadena de RNA las rifamicinas no tienen efecto alguno sobre el proceso de elongacin posterior. Por esta razn las rfamicinas son herramientas de investigacin muy tiles debido a que permiten que el proceso de transcripcin sea diseccionado en sus fases de iniciacin y de elongacin.

El crecimiento de la cadena de RNA se hace en la direccin 5' 3. Esta conclusin, primero establecida midiendo la incorporacin de marcaje radiactivo en el RNA utilizando 32P(ATP), queda corroborada por la observacin de que el antibitico cordicepina, que es un anlogo de la adenosina que carece de un grupo 3'-OH, inhibe la sntesis del RNA bacteriano. Su adicin al extremo 3' del RNA, cosa esperada si el crecimiento es en la direccin 5' 3', evita que el RNA contine alargndose. La cordicepina no tendra este efecto si el crecimiento de la cadena fuera en la direccin opuesta, ya que no puede unirse a un extremo 5' del RNA.

Elongacin
La transcripcin probablemente sobre enrolla al DNA. La elongacin de la cadena de RNA requiere que el molde de DNA bicatenario sea abierto en el punto de sntesis de RNA, de manera que la cadena con sentido pueda ser transcrita a su hebra de RNA complementaria. Durante este proceso, la cadena de RNA forma cortos segmentos bicatenarios hbridos RNA-DNA, aunque slo de manera transitoria. Esto se deduce de la observacin de que la transcripcin deja intacto al DNA bicatenario original, con la liberacin de RNA de cadena sencilla. La "burbuja" de DNA no apareado de los complejos de iniciacin abiertos se desplaza aparentemente a lo largo del DNA junto con la RNA polimerasa. Esto podra ocurrir de dos maneras:

(a) La RNA polimerasa sigue la ruta marcada por la hebra con sentido a lo largo de la doble hlice de DNA, con lo que el transcrito acabara envolviendo al DNA una vez por cada vuelta del dplex. El RNA no se desenrollara espontneamente en un tiempo razonable del largo DNA. (b) El RNA se desplaza en lnea recta al mismo tiempo que el DNA gira por debajo. En este caso, el RNA no se enrollara alrededor del DNA, sino que el DNA situado por delante de la burbuja de transcripcin se sobreenrollara a medida que sta va avanzando, y se ira desenrollando por detrs

Superhelicoicidad

Si la RNA polimerasa acompaa a la hebra molde en su ruta helicoidal alrededor del DNA, ste no ganar ms superhelicoicidad debido a que el dplex de DNA nunca ser desenrollado en ms de una vuelta, sin embargo, el transcrito de RNA se enrollar en torno al DNA, una vez por cada vuelta del dplex. Este modelo no es posible debido a que no parece probable que la maraa de DNA y RNA sea deshecha de manera sencilla. El RNA no se desenrollara espontneamente en un tiempo razonable del largo DNA, a menudo en forma circular, y no existen topoisomerasas conocidas que aceleren este proceso,

Segundo Mecanismo
Si la RNA polimerasa se desplaza en linea recta mientras que es el DNA el que rota, entonces el RNA y el DNA no se enredarn, en lugar de ello, las vueltas de hlice del DNA sern empujadas hacia adelante de la burbuja de transcripcin en movimiento, de forma que el DNA situado por delante de la burbuja quedar enrollado ms fuertemente (cosa que promueve el sobre enrollamiento positivo), mientras que el DNA situado por detrs de la burbuja ser desenrollado de forma equivalente (y esto promueve el sobre enrollamiento negativo; obsrvese que el nmero de ligamiento del DNA completo permanece inalterado). Este modelo est apoyado por las observaciones de que la transcripcin de plsmidos en E. coli mutantes para la girasa (incapaces de relajar sobre enrollados positivos) genera plsmidos sobre enrollados positivamente, mientras que un experimento similar en mutantes para la topoisomerasa 1 (incapaces de relajar sobre enrollados negativos) genera plsmidos sobre enrollados negativamente,

Terminacin

Las micrografas electrnicas sugieren que el DNA contiene sitios especificos en los cuales se detiene la transcripcin. Las secuencias de terminacin de la transcripcin de varios genes de E. col comparten dos caracteristicas:
1. Una serie de 4 a 10 pares A-T consecutivos, con la A sobre la cadena molde. El RNA

transcrito acaba dentro o justo despus de esta secuencia. 2. Una regin rica en G + C con una secuencia palindrmica (de simetra doble) que precede inmediatamente a la serie de pares A-T, que obliga al transcrito de RNA ha adquirir una forma de orquilla

Las secuencias de terminacin antes indicadas inducen la terminacin espontnea de la transcripcin.

Terminacin

Sin embargo, existen otros sitios de terminacin que carecen de similitudes obvias con stas, y que son incapaces de formar horquillas fuertes; estos sitios requieren la participacin de una protena conocda como factor rho para la terminacin de la transcripcin.

Se ha dicho que el factor rho distingue los RNAms que estn siendo traducidos activamente de aquellos que se encuentran relativamente libres de ribosomas (cabe recordar que en procariotas los ribosomas se unen a los RNAms nacientes poco tiempo despus de la iniciacin de su transcripcin), y que por tanto hace que la traduccin continuada del RNAm naciente sea dependiente de su utilizacin funcional.

Transcripcin en Eucariotas

Es bastante ms complejo que en procariotas, debido principalmente a que: existen varias RNA polimerasas, la formacin del complejo de preiniciacin y la necesidad de procesar el RNA sintetizado. Se conocen 3 RNA pol que catalizan la transcripcin de los genes en los eucariotas
a. b.

c.

RNA pol I transcribe los genes para los RNAs de 28s, 18s, y 5.8s. Esta actividad se localiza en el nuclolo. RNA pol II es la responsable de la transcripcin de los genes que codifican para el RNAm, que codificarn para la sntesis de protenas RNA pol III es la responsable de la transcripcin de los genes que codifican para los RNAt y para el RNAr de 5s

Factores de Transcripcin

Los factores generales de transcripcin (GTFs) que se fijan a los promotores en los eucariotas son funcionalmente semejantes al factor s de los procariotas.
a.

b. c.

La protena fijadora a TATA (TBP), reconoce la caja TATA del promotor en los genes de tipo II (los que son transcritos por la RNA pol II) y se fija a ella en un proceso de gran especificidad. Recluta despus otros factores de transcripcin para formar un complejo. La RNA pol II es incorporada a este complejo para formar el complejo de pre-iniciacin Adems del TBP, otros factores de transcripcin son ms selectivos y especficos y se incorporan al complejo dependiendo del gene de tipo II que ser transcrito, lo cual regula la transcripcin de dichos genes.

Complejo de Iniciacin

El complejo de iniciacin en eucariotas consiste de la RNA polimerasa II, dependiente de DNA, un conjunto de factores basales de transcripcin (TFIIX, X = A H). Primero, el factor TFIID se fija al promotor. TFIID, es un gran complejo de numerosas protenas que contiene una protena con gran afinidad por la caja-TATA (TBP, TATA box binding protein) y algunos factores asociados denominados TAFs (TBP-associated factors). La Polimerasa se fija a este complejo central con la ayuda del factor TFIIB. Antes de que se inicie la transcripcin se requiere la participacin de otros factores de transcripcin, incluyendo a TFIIH que tiene actividad de Helicasa y separa las dos hebras del DNA durante la elongacin En conjunto son requeridas unas 35 protenas diferentes para la formacin del complejo de iniciacin. Pero esto no es suficiente para que se inicie la transcripcin. Se requieren adicionalmente seales positivas que deben ser emitidas por factores transactivantes, integrados por el complejo coactivador/mediador y transferidos al complejo basal.

Procesamiento del RNA

1.

2.

3.

Supresin de los intrones del RNAhn (RNA heterogneo nuclear), de manera de dejar slo los exones para que sean utilizados en la sntesis de protenas. Esto se realiza dentro del ncleo en las estructuras llamadas espliceosomas Fijacin de una extremo ad hoc, llamado casquete, gorra o cachucha (cap), formado por una 7-metil guanina- trifosfato en el extremo 5 del RNA que promueve la traduccin del RNA y lo protege contra las exonucleasas. Casi todos los RNAs terminan downstream en una estructura de nucletidos AAUAA que induce la adicin de una larga cola de poli A que protege el mensaje de la actividad de exonucleasas.

Restructuracin del DNA

En los eucariotas, el DNA se encuentra bloqueado por Histonas (formando cromatina) y es po lo tanto imposible que pueda ser transcrito sin mecanismos especiales de regulacin. En los eucariotas son, pues, las histonas las que desempean el papel de represores. Para que la transcripcin pueda siquiera iniciar, la cromatina debe ser primero re-estructurada. En el estado de reposo, el extremo amino-terminal de residuos de lisina en las histonas no estn acetiladas. En este estado, que puede ser producido por la actividad de Histona-Desacetilasas, el nucleosoma es completamente estable. Se requiere la interaccin de activadores y protenas reguladoras con sus elementos de control que permita la fijacin de complejos coactivadores con actividad de Histona Acetiltransferasa. Esta interaccin realiza la acetilacin de extremos de lisina en las histonas y relaja la estructura nucleosomal de manera que la formacin del complejo basal de iniciacin transcripcional pueda ser efectuada.

Fosforilacin de la Polimerasa
La seal efectiva para iniciar la transcripcin consiste de la fosforilacin mltiple de un dominio en el extremo carboxi-terminal de la Polimerasa. En su forma fosforilada, la Polimerasa puede liberarse del complejo basal, junto con algunos de los factores de transcripcin, e iniciar la sntesis de lo que ser el RNAhn (RNA heterogneo nuclear).

RNA Polimerasas Eucariticas

El ncleo eucariota contiene tres tipos de RNA polimerasas, que difieren en los RNAs que sintetizan:
RNA polimerasa I, localizada en el nuclolo, sintetiza los

precursores de la mayora de RNAs rbosomales. RNA polimerasa II, que est situada en el nucleoplasma, sintetiza los precursores del RNAm y de ciertos RNAs pequeos nucleares estables. RNA polimerasa III, que tambin est presente en el nucleoplasma, sintetiza los precursores del RNA ribosmico de 5S, de los RNAts y de una variedad de otros RNAs pequeos nucleares y citoslicos.

Adems de estas enzimas nucleares (que tambin son conocidas como RNA polimerasa A, B y C), las clulas eucariotas contienen RNA polimerasas mitocondriales y de cloroplastos que son independientes

Pre-iniciacin

Al contrario de la replicacin de ADN, durante el inicio de la transcripcin no se requiere la presencia de un cebador para sintetizar la nueva cadena, de ARN en este caso. Antes del inicio de la transcripcin se necesitan toda una serie de factores de transcripcin que ejercen de factores de iniciacin, que se unen a secuencias especficas de ADN para reconocer el sitio donde la transcripcin ha de comenzar y se sintetice el ARN cebador. Esta secuencia de ADN en la que se ensamblan los complejos de transcripcin se llama promotor. Los promotores se localizan en los extremos 5'-terminales de los genes, antes del comienzo del gen, y a ellos se unen los factores de transcripcin mediante fuerzas de Van der Waals y enlaces de hidrgeno. Los promotores tienen secuencias reguladoras definidas, muy conservadas en cada especie, donde las ms conocidas son la caja TATA (situada sobre la regin -10), con la secuencia consenso TATA(A/T)A(A/T); y la caja TTGACA (situada en el punto -35).

La formacin del complejo de transcripcin se realiza sobre el promotor TATA, all se forma el ncleo del complejo de iniciacin. Sobre la caja TATA se fija una protena de unin (TBP) junto con el factor de transcripcin TFII D (TF proviene del ingls: transcription factor). Despus, a ellos se unen otros factores de transcripcin especficos: TFII A, que estabiliza el complejo TFII D-ADN; los factores TFII B y TFII E se unen al ADN y el TFII F (una helicasa dependiente de ATP) y al final la ARN polimerasa. Todo ello forma un complejo que se llama complejo de preiniciacin cerrado. Cuando la estructura se abre por mediacin del factor de transcripcin TFII H, da comienzo la iniciacin.

Iniciacin

La ARN polimerasa simplemente se une al ADN y separa las hebras de ADN en colaboracin con otros cofactores permitiendo, de esta manera, el acceso de la ARN polimerasa al molde de ADN de cadena simple. Aunque la bsqueda del promotor por la ARN polimerasa es muy rpida, la formacin de la burbuja de transcripcin o apertura del ADN y la sntesis del cebador es muy lenta. La burbuja de transcripcin es una apertura de ADN desnaturalizado de 18 pares de bases, donde empieza a sintetizarse el ARN cebador a partir del nucletido nmero 10 del ADN molde de la burbuja de transcripcin. La burbuja de transcripcin se llama complejo abierto. La ARN polimerasa es una enzima formada por 5 subunidades: 2 subunidades , 1 subunidad , 1 subunidad ' y 1 subunidad que tiene como funcin la unin de ribonucletidos trifosfato. Cuando se forma el complejo abierto, la ARN polimerasa comienza a unir ribonucletidos mediante enlaces fosfodister, y una vez que se forma el primer enlace fosfodister, acaba la etapa de iniciacin y comienza la siguiente etapa.

Disgregacin del promotor

Una vez sintetizado el primer enlace fosfodister, se debe deshacer el complejo del promotor para que quede limpio para volver a funcionar de nuevo. Durante esta fase hay una tendencia a desprenderse el transcrito inicial de ARN y producir transcritos truncados, dando lugar a una iniciacin abortada, comn tanto en procariotas como eucariotas. Una vez que la cadena transcrita alcanza una longitud de unos 23 nucletidos, el complejo ya no se desliza y da lugar a la siguiente fase, la elongacin. La disgregacin del promotor coincide con una fosforilacin de la serina 5 del dominio carboxilo terminal de la ARN polimerasa, que es fosforilado por el TFII H (que es una protena quinasa dependiente de ATP)

Elongacin

La ARN polimerasa cataliza la elongacin de cadena del ARN. Una cadena de ARN se une por apareamiento de bases a la cadena de ADN, y para que se formen correctamente los enlaces de hidrgeno que determina el siguiente nucletido del molde de ADN, el centro activo de la ARN polimerasa reconoce a los ribonucletidos trifosfato entrantes. Cuando el nucletido entrante forma los enlaces de hidrgeno idneos, entonces la ARN polimerasa cataliza la formacin del enlace fosfodister que corresponde. A esto se le llama elongacin, la segunda etapa de la transcripcin del ARN.

Terminacin

Al finalizar la sntesis de ARNm, esta molcula ya se ha separado completamente del ADN (que recupera su forma original) y tambin de la ARN polimerasa, terminando la transcripcin. La terminacin es otra etapa distinta de la transcripcin, porque justo como el complejo de transcripcin se ha ensamblado activamente debe desensamblarse una vez que la elongacin se ha completado. La terminacin est sealizada por la informacin contenida en sitios de la secuencia del ADN que se est transcribiendo, por lo que la ARN polimerasa se detiene al transcribir algunas secuencias especiales del ADN. Estas secuencias son ricas en guanina y citosina, situadas en el extremo de los genes, seguidas de secuencias ricas en timina, formando secuencias palindrmicas, que cuando se transcriben el ARN recin sintetizado adopta una estructura en horquilla que desestabiliza el complejo ARN-ADN, obligando a separarse de la ARN polimerasa, renaturalizndose la burbuja de transcripcin. Algunas secuencias de ADN carecen de la secuencia de terminacin, en este caso poseen otra secuencia a la que se unen una serie de protenas reguladoras especficas que indican la terminacin de la transcripcin como el factor llamado rho.