Enzimologa

CINTICA ENZIMTICA

CINTICA

Los experimentos de cintica examinan la relacin que existe entre la cantidad de producto (P) Formado en la unidad de tiempo, [P]/t (donde es el smbolo universal de cambio), de acuerdo a las condiciones experimentales bajo las cuales se realiza la reaccin. La base de la mayora de las determinaciones cinticas es la observacin de como la velocidad (v), de una reaccin vara directamente con la concentracin de cada una de las sustancias que actan como reactivos para producir el producto. Esta observacin es expresada por medio de una ecuacin de velocidad. Por ejemplo, la ecuacin de velocidad para la conversin, no enzimtica, de un sustrato (S) a un producto por una reaccin de isomerizacin sera:

Constante de Velocidad
La ecuacin anterior refleja el hecho de que la velocidad de la reaccin depende de la concentracin de sustrato [S] El smbolo k es llamada constante de velocidad e indica la relacin proporcional entre [S] y la cantidad de producto producido por unidad de tiempo, es decir indica la relacin que existe entre la [S] y la velocidad de la reaccin. Cada reaccin, bajo determinadas condiciones, presenta una constante de velocidad caracterstica. Las unidades en que se expresa la constante de velocidad (k) sern s-1

Virtualmente todas las reacciones qumicas, incluyendo las catalizadas por enzimas, se desarrollan contra una barrera energtica que separa los reactivos de los productos. Esta barrera, llamada Energa Libre de Activacin, esta constituida por la diferencia entre la energa de los reactivos y un intermediario de alta-energa cuya formacin es requerida para la transformacin de reactivos a productos. Por ejemplo en la reaccin:
A T* B

La conversin del reactivo A al producto B requiere suficiente energa para que el reactivo A adquiera una conformacin intermedia de alta energa que precede a su conversin en producto y que se ha denominado Estado Activado o Estado de Transicin T*

Estado de Transicin

Energa Libre de Activacin

El punto mximo en esta figura expresa el valor de la Energa Libre de Activacin, es decir, la diferencia en energa libre entre el(los) reactivo(s) y el estado de transicin en donde se ha formado el intermediario de alta energa necesario durante la conversin de reactivos a productos. El alto valor de esta energa libre de transicin, para la formacin de este estado de alta energa, es lo que propicia que las reacciones qumicas no catalizadas sean frecuentemente demasiado lentas.

Velocidad de la Reaccin
Para que puedan reaccionar, las molculas deben contener suficiente energa para sobrepasar la barrera que impone el alcanzar el estado de transicin. En ausencia de un catalizador, en nuestro caso en ausencia de una enzima, la cantidad de molculas en una poblacin de reactivos que pueden poseer esta energa es muy pequea y la capacidad de formar producto es igualmente demasiado pequea. Por lo tanto la velocidad de la reaccin esta determinada por el nmero de molculas con energa suficiente para alcanzar el estado de transicin. En general, mientras menor sea la energa de activacin y ms molculas puedan alcanzarla, la velocidad de la reaccin ser mayor. De esto depende el enorme valor que tienen las enzimas en los sistemas biolgicos.

Las enzimas permiten que las reacciones se realicen a la velocidad adecuada dentro de las condiciones que prevalecen dentro de la clula, estableciendo una va de reaccin alternativa con una energa de activacin bastante ms pequea que la requerida en la va no catalizada de reaccin. Las enzimas no cambian las energas libres de los reactivos ni de los productos, ni tampoco cambian el punto de equilibrio de la reaccin. Las enzimas aceleran notablemente la velocidad con la cual dicho equilibrio de reaccin ser alcanzado.

CINTICA
La cintica se refiere al estudio de la velocidad de cambio de reactivos a productos durante una reaccin qumica La velocidad se refiere al cambio en la concentracin de reactivos o productos por unidad de tiempo La tasa de cambio (rate) se refiere al cambio total en las concentraciones por unidad de tiempo Velocidad inicial es el cambio en la concentracin de reactivos o productos inmediatamente despus de que la reaccin se inicia, es decir cuando la reaccin es lineal.

La derivacin de la primera ecuacin de velocidad para una reaccin catalizada por enzimas fue derivada en 1903 por Henri y se bas en los siguientes supuestos:

E + S

ES

E + P

1. La enzima es un catalizador (propuesto por Berzelius en 1835-1837). 2. La enzima y el sustrato reaccionan rpidamente para formar un complejo enzimasustrato (propuesto en 1902 por Brown) 3. Slo 1 sustrato y un complejo enzima-sustrato estn involucrados, y el complejo ES se rompe directamente para formar E libre y producto. 4. La enzima, el sustrato y el complejo enzima-sustrato estn en equilibrio, esto es la velocidad a la cual ES se disocia a E + S es mucho ms rpida que la velocidad a la cual ES se rompe para formar E + P. 5. La [S] es mucho mayor que la [E], de modo que la formacin del complejo ES no altera la [S]. Los parntesis cuadrados [] indican concentraciones. 6. La velocidad de la reaccin est limitada por el rompimiento del complejo ES para formar E libre y P (etapa limitante). 7. La velocidad es medida durante tiempos muy cortos, de modo que la velocidad de la reaccin reversa es insignificante

Otras condiciones para la cintica de tipo Michaelis-Menten

Para que la cintica enzimtica responda a lo propuesto por Michaelis-Menten, algunas condiciones secundarias, pero importantes, deben ser mantenidas durante la reaccin:
La Temperatura, la fuerza inica, el pH, y otras

constantes fsicas que puedan afectar la velocidad de la reaccin deben permanecer constantes Cada molcula de enzima debe actuar en una molcula de sustrato en cada ocasin La enzima debe permanecer sin ninguna modificacin, ni en su estructura, ni en su concentracin, durante todo el tiempo que dure la determinacin de la reaccin.

ECUACIN DE MICHAELIS-MENTEN

La ecuacin de Michaelis-Menten describe como vara la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas de acuerdo a la concentracin de sustrato: Para utilizar la ecuacin de Michaelis-Menten deben asumirse diferentes cosas:

Las concentraciones relativas de E y S: La concentracin de sustrato ([S]) es mucho mayor que la concentracin de enzima ([E]), de manera que la proporcin de sustrato fijo a la enzima es siempre relativamente pequea. La reaccin esta en equilibrio: [ES] no cambia durante el tiempo (la reaccin se asume en equilibrio de flujos), es decir, la velocidad de formacin de ES es igual a la velocidad de su transformacin en E + S y en E + P). Velocidad Inicial: Deben usarse velocidades iniciales (vo). Esto significa que la velocidad de la reaccin debe determinarse tan pronto como el sustrato y la enzima son mezclados. En dicho tiempo, la concentracin de productos es despreciable y, por lo tanto, la reaccin inversa de productos a sustratos puede ser ignorada.

Las enzimas aumentan las velocidades de las reacciones qumicas sin ser alteradas en el proceso de conversin de reactivos a productos Esta conducta define, precisamente, a un catalizador Las enzimas aumentan las velocidades de reaccin disminuyendo la cantidad de energa requerida para formar un complejo reactivo, activado, competente para formar productos Esto ocurre por medio de la formacin de un complejo entre la enzima y el sustrato (ES)

La velocidad a la cual ocurre la reaccin (1) es consecuencia de lo siguiente: El nmero posible de choques entre S y E, que es directamente proporcional al producto de sus concentraciones [S][E] El nmero de choques por un tiempo determinado capaces de producir reaccin, el cual ser proporcional al nmero de choques posibles As pues, la velocidad de la reaccin ser proporcional a [S][E]: Velocidad1 (v1) = k1 [S][E] En donde k1 es la constante de velocidad

La velocidad a la cual ocurre la inversa de la reaccin (1) puede deducirse del siguiente modo: Una determinada cantidad de E liberar cierta cantidad de S durante el tiempo en que la reaccin progresa La velocidad de la reaccin inversa ser entonces directamente proporcional a ES Velocidad2 (v2) = k2 [ES] En donde k2 es la constante de velocidad

La velocidad a la cual ocurre la reaccin (2) puede deducirse del siguiente modo: Una determinada cantidad de E1 producir cierta cantidad de P durante un tiempo definido de la reaccin La velocidad de produccin de P ser entonces directamente proporcional a [E1] Velocidad3 (v3) = k3 [ES] En donde k2 es la constante de velocidad

Cintica de Michaelis-Menten (1)

Para explicar la relacin observada entre la velocidad inicial (v0) y la concentracin inicial de sustrato ([S]0) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacin del producto, liberando la enzima libre:

En este esquema, k1, k2 y k3 son las constantes cinticas individuales de cada proceso y tambin reciben el nombre de constantes microscpicas de velocidad. Segn esto, podemos afirmar que: v1 = k1 [E] [S] v2 = k2 [ES] v3 = k3 [ES] Los parntesis cuadrados [] indican concentraciones

Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unido al sustrato (ES), de forma que la concentracin total de enzima, [ET], (que es constante a lo largo de la reaccin) es: [ET] = [E] + [ES] Como [E] = [ET] - [ES], resulta que: v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]

Este modelo cintico adopta la hiptesis del estado estacionario, segn la cual la concentracin del complejo enzima-sustrato es pequea y constante a lo largo de la reaccin. Por tanto, la velocidad de formacin del complejo enzima-sustrato (v1) es igual a la de su disociacin (v2+ v3): v1 = v 2 + v 3 Adems, como [ES] es constante, la velocidad de formacin de los productos es constante: v = v3 = k3 [ES] = constante.

Cintica de Michaelis-Menten (3)

Como v1=v2+v3, podemos decir que: k1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES] Despejando [ES], queda que:

En donde: Este enlace nos aporta una explicacin sobre las razones que hacen de la KM un parmetro cintico importante. Por lo tanto, en el estado estacionario, la velocidad de formacin del producto es:

Cintica de Michaelis-Menten (4)

Para cualquier reaccin enzimtica, [ET], k3 y KM son constantes. Vamos a considerar dos casos extremos:
A concentraciones de sustrato pequeas ([S] << KM) v = (k3

[ET]/KM) [S]. Como los trminos entre parntesis son constantes, pueden englobarse en una nueva constante, kobs, de forma que la expresin queda reducida a: v = kobs [S], con lo cual la reaccin es un proceso cintico de primer orden. A concentraciones de sustrato elevadas ([S] >> KM), v = k3 [ET]. La velocidad de reaccin es independiente de la concentracin del sustrato, y por tanto, la reaccin es un proceso cintico de orden cero. Adems, tanto k3 como [ET] son constantes, y nos permite definir un nuevo parmetro, la velocidad mxima de la reaccin (Vmax): Vmax = k3 [ET], que es la velocidad que se alcanzara cuando toda la enzima disponible se encuentra unida al sustrato.

Cintica de Michaelis-Menten (5)

Si introducimos el parmetro Vmax = k3 [ET] en la ecuacin general de la velocidad,

obtenemos la expresin ms conocida de la ecuacin de Michaelis-Menten:

A valores bajos de [S], la velocidad inicial, Vi, aumenta casi linealmente al aumentar [S]. Pero segn [S] aumenta, el incremento en Vi disminuye (formando una hiprbola rectangular). La asmptota de esta curva representa la velocidad mxima de la reaccin, designada Vmax La concentracin de sustrato que produce una Vi que sea igual a la mitad de Vmax se designa como constante de Michaelis-Menten, Km (llamada as por los investigadores que desarrollaron este estudio de la cintica enzimtica).

La mayora de las enzimas muestran cintica del tipo de Michaelis-Menten, en la cual la grfica de la velocidad inicial (vo) contra la concentracin de sustrato ([S]), es de tipo hiperblico.

Orden de Reaccin
Orden de Reaccin: Se refiere al nmero de molculas de reactivo
que deben estar presentes para producir un producto. Un S unimolecular S P es una reaccin de primer orden. Un 2S bimolecular 2S P es una reaccin de segundo orden. Un bimolecular S1 + S2 P es de segundo orden: de primer orden en S1 y de primer orden en S2.

El orden de la reaccin esta dado por los exponentes de las concentraciones de reactivos en la ley de velocidad. v = k[A]n n=0, orden cero (no depende de [A] n=1, primer orden n=2, segundo orden v = k[A]2[B] Segundo orden en A, primer orden en B, reaccin de tercer orden

Significado de Km
Km es una constante Km es una constante derivada a partir de constantes de velocidad: (k-1 + k2)/k1 Km es, siendo verdaderas las condiciones supuestas ciertas por Michaelis-Menten, una estimacin de la constante de disociacion del complejo ES para dar E + S, a partir de (k-1/k1) Km pequea significa ES en unin fuerte; Km alta significa ES en unin dbil

CINTICA DE TIPO MICHAELIS-MENTEN

Caractersticas de Km: la constante de Michaelis es caracterstica de cada enzima y su sustrato particular, y refleja la afinidad de la enzima por dicho sustrato. La Km es numricamente igual a la concentracin de sustrato a la cual se alcanza la mitad de la velocidad mxima de la enzima, Vmax. La Km no depende de la concentracin de la enzima.

Una Km numricamente pequea, refleja una gran afinidad por el sustrato, ya que bajas concentraciones de sustrato son suficientes para saturar al 50% de la enzima es decir, para alcanzar la mitad de la velocidad mxima, Vmax. Una Km numricamente grande, refleja una baja afinidad de la enzima por su sustrato, ya que son necesarias grandes concentraciones de sustrato para saturar el 50% de la enzima.

 Vmax es una constante Vmax es la velocidad mxima terica de la reaccin pero, en realidad, nunca se alcanza Para alcanzar la velocidad mxima se requiere que [S] >> [E] y que TODAS las molculas de enzima estn unidas al sustrato. Vmax se alcanza asintticamente a medida que la concentracin de sustrato aumenta

Grfica de Dobles Recprocos o de Lineweaver-Burk

En la prctica la determinacin de la constante de

Michaelis-Menten (Km) y de la velocidad mxima a partir de una grfica hiperblica no nos proporciona un valor suficientemente preciso. Por esta razn, Lineweaver y Burk decidieron cambiar la ecuacin de Michaelis-Menten tomando los valores recprocos de la V y la [S] generando una grfica de dobles recprocos. Esto proporciona una grfica lineal del recproco de la velocidad contra el recproco de la concentracin de sustrato, que nos proporciona los valores exactos de la Km en el intercepto de la lnea en el eje de las abscisas y el valor exacto de la velocidad mxima (Vmax) en el intercepto del eje de las ordenadas

La Ecuacin de Michaelis-Menten

Puede ser simplemente transformada tomando los inversos de ambos miembros, lo cual nos proporcionar:

Separando los componentes del numerador en el segundo miembro de esta ecuacin, nos da:

Que se simplifica fcilmente para dar finalmente:

Ecuacin de Dobles Recprocos o de Lineweaver-Burk

Otras transformaciones grficas de la ecuacin de Michaelis-Menten

Grfico de Eadie-Hofstee
v v=V K max m [S]
Los valores obtenidos son mas precisos, porque no incluye el error intrnseco en el uso de valores recprocos

Vmax v

pendiente Inclinao = =-Km

Vmax Km v [S]

 Grfico de Hanes-Woolf
K [S] 1 m + = [S] v V V max max

[S] v Km Vmax -Km

pendiente = Inclinao

1 Vmax

[S]

Grfico de Eisenthal/Cornish-Bowden
No requiere de clculos

Vm Vmax v0(3) v0(2) v0(1)

K M K

-[S]3

-[S]2

-[S]1

Hay enzimas que no obedecen la ecuacin de MichaelisMenten. Se dice que su cintica no es Michaeliana. Esto ocurre con las llamadas enzimas alostricas, cuya grfica v contra [S] no es una hiprbola, sino una sigmoide (en forma de s) En la cintica sigmoidea, pequeas variaciones en la [S] en una zona crtica (cercana a la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reaccin.

Efecto del pH
Las enzimas, al ser protenas, poseen propiedades que son

muy sensibles al pH. De hecho, la mayora de las protenas slo son activas en un estrecho intervalo de pH, tpicamente entre 5 y 9. Esto es el resultado de los efectos del pH sobre una combinacin de factores:
(1) la fijacin del sustrato a la enzima, frecuentemente utilizando

enlaces electrostticos que dependen de la ionizacin de los participantes. (2) la actividad cataltica de la enzima, dependiente del estado de ionizacin de los aminocidos importantes localizados en el sitio activo de la enzima, as como de su estructura terciara y cuaternaria (3) la ionizacin del sustrato y (4) la variacin de la estructura proteica misma (normalmente, slo significativa a pH extremos).

La actividad enzimtica vara con el pH El pH ptimo es aquel al cual la

enzima manifiesta su mayor actividad y frecuentemente refleja el pH al cual la enzima funciona dentro del organismo. El pH de mayor actividad vara para diferentes enzimas. Por ejemplo, la pepsina, una enzima digestiva del estmago, muestra su pH ptimo a pH <2, mientras que otras enzimas, diseadas para funcionar a pH neutro, seran desnaturalizadas si se someten a condiciones tan drsticamente cidas

Es necesario recalcar, sin embargo, que el trmino "pH ptimo" no tiene una significacin fsico-qumica bien definida. Es mejor, en general, referirse a un rango de pH favorable para una reaccin dada. Este rango depende no slo de la naturaleza de la enzima particular, sino tambin del substrato y de la concentracin de ste, de la estabilidad de la enzima, de la temperatura y de la extensin del periodo de reaccin.

Los segmentos de la izquierda y de la derecha de la curva de campana obtenida, en donde la actividad enzimtica es menor que en el pH ptimo, representan las curvas de titulacin de los cadenas laterales de los residuos de aminocidos que forman parte del sitio activo de la enzima. El punto de inflexin a pH 4.2 refleja el pKa del residuo 25, cistena, y el de pH 8.2 el pKa de la His-159. La enzima slo es activa cuando estos grupos se encuentran como un par inico tiolato - imidazolium.

Efecto del pH
Como ocurre con las protenas, las enzimas poseen un punto

isoelctrico al cual su carga libre neta es cero. El pH del punto isoelctrico, como regla, no es igual al pH al cual se observa actividad mxima. El pH ptimo de las enzimas varia ampliamente; la pepsina, que existe en el medio cido del estmago, tiene un pH ptimo de alrededor de 1,5, mientras que la arginasa tiene un pH ptimo de 9,7. Sin embargo, la gran mayora de las enzimas tienen un ptimo entre pH 4 y 8, muchas de ellas alrededor del pH fisiolgico del organismo, ~7.3 - 7.4. Algunas enzimas muestran una amplia tolerancia a los cambios del pH, pero otras trabajan bien slo en un rango estrecho. Cualquier enzima que se someta a valores extremos de pH, se desnaturaliza. Esta sensibilidad de las enzimas a la alteracin del pH es una de las razones por la que la regulacin del pH del organismo es controlada celosamente y explica por qu las desviaciones de la normalidad pueden implicar graves consecuencias.

pH ptimo

Es necesario recalcar, sin embargo, que el trmino "pH ptimo" no tiene una significacin fsico-qumica bien definida. Es mejor, en general, referirse a un rango de pH favorable para una reaccin dada. Este rango depende no slo de la naturaleza de la enzima particular, sino tambin del substrato y de la concentracin de ste, de la estabilidad de la enzima, de la temperatura y de la extensin del periodo de reaccin.

Efecto de la temperatura sobre las enzimas

Puesto que la estructura proteica es la que determina la actividad

enzimtica, cualquier causa que perturbe esta estructura puede llevar a una prdida de actividad. Aunque el rango general de temperaturas adecuadas para las reacciones enzimticas es muy estrecho, los cambios ligeros suelen tener una considerable influencia. Al aumentar la temperatura, la velocidad de reaccin aumenta y, para casi todas las enzimas, un incremento de 10C duplica e incluso triplica la velocidad de reaccin. Por otro lado, sin embargo, ese mismo aumento de temperatura acelera tambin la inactivacin de la enzima por desnaturalizacin trmica. Para muchas enzimas la regin de inactivacin trmica est muy prxima de la temperatura ptima. La velocidad de inactivacin trmica depende tambin del pH, fuerza inica y del estado fsico de la enzima

 Todas las reacciones qumicas son afectadas por la temperatura. A mayor temperatura, mayor velocidad de reaccin. La velocidad de reaccin aumenta porque hay ms molculas con suficiente energa para llegar al estado de transicin. Las velocidades de las reacciones catalizadas por enzimas tambin aumentan con la temperatura . Pero, las enzimas son protenas y se desnaturalizan a temperaturas altas Cada enzima posee una temperatura ptima a la cual opera con mayor eficiencia Puesto que las enzimas son protenas, su temperatura ptima depende tambin del pH y de la fuerza inica. Si la temperatura de operacin se eleva ms all de la temperatura ptima, la actividad de muchas enzimas desciende bruscamente. Las temperaturas ptimas de muchas enzimas se encuentran cercanas a la temperatura normal del organismo de donde proceden. Por ejemplo, la temperatura ptima de la mayora de las enzimas en el hombre es cercana a 37C.

Estabilidad Trmica
El aumento de temperatura acelera tambin la inactivacin de la enzima por desnaturalizacin trmica. Para muchas enzimas la regin de inactivacin trmica est muy prxima de la temperatura ptima. La velocidad de inactivacin trmica depende de la enzima, pero tambin del pH, fuerza inica y del estado fsico de la enzima

Efecto de la Ionizacin
Las velocidades iniciales de muchas

reacciones enzimticas en funcin del pH muestran curvas en forma de campana. Estas curvas reflejan la ionizacin de ciertos restos de aminocidos que han de encontrarse en un estado de ionizacin determinado a fin de que haya actividad enzimtica.

Inhibidor:
Efector que hace disminuir la actividad enzimtica, a travs de interacciones con el centro activo u otros centros especficos (alostricos). Esta definicin excluye todos aquellos agentes que inactivan a la enzima a travs de desnaturalizacin de la molcula enzimtica De esta forma, habr dos tipos de inhibidores: I. Isostricos: ejercen su accin sobre el centro activo II. Alostricos: ejercen su accin sobre otra parte de la molcula, causando un cambio conformacional con repercusin negativa en la actividad enzimtica.

Inhibidores Enzimticos
Los inhibidores enzimticos son molculas que se unen a

enzimas y disminuyen su actividad. La unin de un inhibidor puede impedir la entrada del sustrato al sitio activo de la enzima y obstaculizar que la enzima catalice su reaccin correspondiente. La unin del inhibidor puede ser reversible o irreversible. Normalmente, los inhibidores irreversibles reaccionan con la enzima de forma covalente y modifican su estructura qumica a nivel de residuos esenciales de los aminocidos necesarios para la actividad enzimtica. En cambio, los inhibidores reversibles se unen a la enzima de forma no covalente, dando lugar a diferentes tipos de inhibiciones, dependiendo de la manera como el inhibidor se une a la enzima o al complejo enzima-sustrato.

Inhibidores Enzimticos
Los inhibidores enzimticos usados dentro de la clula estn

implicados en la regulacin del metabolismo. Por ejemplo, las enzimas en una ruta metablica pueden ser inhibidas por los productos resultantes de sus respectivas rutas. Este tipo de retroalimentacin negativa retarda el flujo a travs de la ruta cuando los productos comienzan a acumularse y es una manera importante de mantener la homeostasis en una clula. Otros inhibidores enzimticos celulares son protenas que se unen especficamente e inhiben una enzima importante. Este mecanismo puede ayudar a controlar enzimas que pueden ser dainas para la clula, como las proteasas o nucleasas. Un buen ejemplo es el inhibidor de la ribonucleasa, que se une a esta enzima en una de las interacciones protenaprotena ms fuertes conocidas.

Inhibicin Enzimtica
Competitiva
El Inhibidor se fija en el sitio activo de la enzima. La inhibicin es

reversible puesto que altas concentraciones de sustrato compiten con el inhibidor. Depende de las afinidades relativas de la enzima por su sustrato y por el inhibidor. La Km aumenta, la Vmax permanece sin cambios

No-competitiva
El Inhibidor se fija en un sitio diferente al sitio activo de la enzima.

Un-competitiva o Anti-competitiva

El complejo ESI (Enzima-Sustrato-Inhibidor) no puede formar productos. Concentraciones altas de sustrato no son competidoras. La Km no se modifica, la Vmax disminuye

El inhibidor es capaz de fijarse nicamente una vez que el

complejo ES est ya formado y el cambio en la conformacin de la enzima le proporciona un sitio para su fijacin. Tanto la Km como la Vmax disminuyen

S I E ES

Inhibicin Competitiva E+P

Ki = [E] [I] [EI]

EI

Se define una constante de equilibrio de disociacin del inhibidor:

Caractersticas: - Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas - A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibicin - Por lo general, el inhibidor competitivo es un anlogo qumico del substrato. - El inhibidor es tan especfico como el substrato

Por tanto, en la inhibicin competitiva,

1. El efecto cintico del inhibidor es el aumento aparente de la Km que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki) 2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor 3. Cuanto ms pequeo sea el valor de Ki mayor ser la potencia del inhibidor competitivo. 4. Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas; 5. el complejo EI no es productivo

S I E S EI I ES E+P
Inhibicin No Competitiva

ESI

El inhibidor no se fija en el sitio activo, y lo hace indistintamente a la enzima libre E y al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI ni el complejo ESI son productivos

S E I ES E+P
Inhibicin Anticompetitiva

ESI
El inhibidor slo puede fijarse al complejo ES; el complejo ESI no es productivo

Inhibicin por Sustrato

La inhibicin por sustrato y por producto es donde el sustrato o el

producto de una reaccin enzimtica inhiben la actividad enzimtica. Este tipo de inhibicin puede seguir cualquier tipo de patrn de inhibicin y es frecuentemente de gran importancia en la regulacin del metabolismo celular. En la inhibicin por sustrato hay una disminucin progresiva de la actividad a altas concentraciones de sustrato. Esto puede indicar la existencia de dos sitios de unin entre sustrato y enzima. Cuando hay poco sustrato, se ocupa el sitio de alta afinidad y sigue la cintica normal. Sin embargo, a altas concentraciones, el segundo sitio de inhibicin se ocupa, inhibiendo a la enzima. La inhibicin por parte del producto es a menudo una caracterstica reguladora en el metabolismo y puede ser una forma de retroalimentacin negativa.

Aplicaciones de los inhibidores

Los inhibidores enzimticos pueden ser encontrados en la naturaleza, pero tambin son diseados y producidos como parte de la industria, la farmacologa y la bioqumica. En el ser humano, los inhibidores enzimticos son utilizados principalmente como frmacos en el tratamiento de diversas enfermedades. Los venenos naturales son a menudo inhibidores enzimticos que han evolucionado para defender a una planta o animal contra sus depredadores. Estas toxinas naturales incluyen algunos de los compuestos ms venenosos conocidos hasta hoy. Los inhibidores artificiales son a menudo utilizados como insecticidas (como el Malathion), herbicidas (como el Glifosato) o desinfectantes, (como el Triclosn).

Regulacin Enzimtica
La regulacin enzimtica depende profundamente de cada

proceso, cada clula, cada momento del metabolismo, pero en general pueden precisarse algunos mecanismos generales de regulacin Por control de la expresin gentica para obtener ms o menos enzima activa La enzima existe en una forma inactiva (zimgeno) que debe ser modificada, primariamente por hidrlisis La enzima debe ser covalentemente modificada para aumentar o disminuir su actividad, la forma ms comn es por fosforilacin o desfosforilacin Secuestracin, la enzima no se encuentra en el sitio adecuado para desempear su funcin Por regulacin alostrica, tanto positiva como negativa.

Enzimas Reguladas
En todos los organismos y, prcticamente, en todas las vas

metablicas, el control rpido en la escala de segundos o menos puede ser alcanzado mediante la modulacin reversible de la actividad de determinadas enzimas, llamadas enzimas reguladas. En este concepto, se pueden definir las enzimas reguladas, como aquellas cuya actividad puede ser modificada rpidamente por varios tipos de efectores, permitiendo que la clula se adapte a las exigencias cambiantes del metabolismo celular En la mayora de los casos estas enzimas reguladas ocupan pasos claves, o limitantes, en los senderos metablicos. El mecanismo ms sencillo es que las enzimas reguladas cambien rpidamente en relacin con la concentracin de sus sustratos, o de los productos que su actividad origina, activacin por sustrato, inhibicin por producto.

Alosterismo
El fenmeno conocido como alostera o alosterismo es

el responsable del control reversible de la actividad de una gran variedad de las enzimas reguladas Muchas enzimas reguladas experimentan transiciones alostricas entre el estado (R) activo y el estado (T) inactivo. Estas enzimas poseen un segundo sitio de fijacin, alejado del sitio activo. Este segundo sitio es llamado sitio regulador, o sitio alostrico Un activador o inhibidor alostrico, tambin llamado en general, efector alostrico, puede fijarse a este segundo sitio y producir un cambio conformacional en la enzima reguladora. Este cambio conformacional es transmitido al sitio activo de la enzima y modifica su actividad.

Cofactor
rea de fijacin del cofactor

Efector Alostrico Positivo

Sitio alostrico Negativo Efector Alostrico Negativo

enzimas alostricas
Las enzimas alostricas son aquellas que, adems del

centro activo mediante el cual interactan con el sustrato, poseen otro centro de unin llamado centro alostrico mediante el cual interactan con otra molcula denominada efector o modulador (la palabra "alostrico" hace referencia a la existencia de ese "otro lugar"). La interaccin del modulador con el centro alostrico es tan especfica como lo es la interaccin del sustrato con el centro activo y tambin est basada en la complementariedad estructural. Las enzimas alostricas presentan pesos moleculares en general superiores a las de otras enzimas y en la mayor parte de los casos son protenas oligomricas, es decir estn formados por varias subunidades (normalmente en nmero par).

Efecto Alostrico
De gran importancia en el fenmeno de la actividad enzimtica es el hecho de que, en las enzimas, pueden existir dos (o cuando menos dos) sitios diferentes desde el punto de vista estreo- especfico y que, adems, estn en lugares distintos, muy alejados uno de otro. Uno de estos sitios es el centro activo, donde se fija el sustrato para dar origen a los productos de la reaccin y por lo tanto donde reside el aspecto funcional de la protena. El otro sitio se denomina sitio alostrico y en l puede acomodarse de manera complementaria - pero reversible - alguna sustancia llamada efector alostrico; al efectuarse esta unin se produce una alteracin discreta de la estructura de la protena, la transicin alostrica, que modifica la actividad biolgica de la protena, porque altera las propiedades del sitio activo. Es muy importante que el efector alostrico normal no tiene relacin qumica o metablica alguna con el sustrato de dicha enzima y que su accin tan especfica se debe a que altera de tal modo la conformacin de la protena que modifica su centro activo.

Moduladores Alostricos
Los moduladores alostricos pueden ser de dos tipos: unos estimulan la actividad de la enzima al unirse al centro alostrico, reciben el nombre de moduladores positivos o activadores; otros la inhiben y se llaman moduladores negativos o inhibidores. Los inhibidores alostricos no responden a ninguno de los modelos de inhibicin enzimtica estudiados en el apartado anterior. Las enzimas alostricas presentan siempre dos formas, una activa y otra inactiva, interconvertibles por efecto del modulador.

Moduladores Alostricos
Existen dos tipos de control alostrico: el control heterotrpico que se da cuando el modulador es una molcula diferente del sustrato, y el control homotrpico que se da cuando el modulador es el propio sustrato. En ambos casos el modulador puede ser positivo o negativo. Las enzimas con control homotrpico poseen dos o ms centros de unin para el sustrato; en ellos la interconversin entre las formas activa e inactiva depende de cuntos sean los centros de unin que estn ocupados por molculas de sustrato.

Enzimas Alostricas
Una enzima alostrica es una enzima cuya

actividad est regulada mediante un centro alostrico, que es un sitio, distinto del centro activo de la enzima, al que se une un regulador (llamado regulador alostrico) de manera reversible y no covalente. La unin de este regulador modifica la estructura tridimensional de la enzima y llega a afectar la configuracin del sitio activo, por lo que aumenta o disminuye su actividad, segn el caso.

Alosterismo
El alosterismo es una de las principales formas de regulacin en la clula debido a que puede producir cambios rpidos y fcilmente reversibles en la actividad de las enzimas (y, por lo tanto, en el metabolismo) sin depender de que el regulador tenga una estructura similar al sustrato de la enzima (lo que puede ayudar a coregular diferentes vas metablicas). Muchos frmacos actan unindose al sitio alostrico de las enzimas, como los inhibidores de la transcriptasa inversa no nuclesidos.

Reguladores alostricos de algunas enzimas

INHIBIDORES Glucogeno fosforilasa Fosfofructoquinasa Piruvato quinasa Isocitrato deshidrogenasa -cetoglutarato deshidrogenasa Fructosa 1,6 Bifosfatasa Glucogeno sintasa AcetilCoA Carboxilasa ATP, Glucosa ATP, Citrato ATP ATP ATP AMP, Fru2,6BiP AMP AMP, PalmitoilCoA ACTIVADORES AMP AMP, ADP, Fru2,6BiP ADP ADP ADP ATP ATP, Glucosa 6-P ATP, Citrato

La glucgeno fosforilasa posee, un sistema de regulacin alostrica que responde inmediatamente a las condiciones celulares en las que existe una baja carga energtica La glucosa y el ATP inhiben la glucgeno fosforilasa, desplazando su equilibrio alostrico hacia el estado tenso (T). El AMP activa nuevamente la enzima desplazando el equilibrio hacia el estado relajado (R)
ATP

AMP