PRCTICA 1 y 2 Estudio del Estafilococo, Estreptococo y Neumococo Espcimen clnico: Pus (trada por los estudiantes) Secrecin faringea

(obtenida de estudiantes voluntarios) Esputo Cepa conservada de: Stafilococcus Aureus Streptococcus B Hemoltico Neumococos o Streptococcus Neumonae Materiales de Laboratorio: Mechero, asa de kolle, lmina porta, batera de coloracin Gram, microscopio ptico, isopos estriles. Medios de Cultivo: Agar manitol salado, Agar sangre, Agar DNA, Agar azida, Caldo biliado I. PROCEDIMIENTO Utilizando una asa de Kolle, previamente flameada, realizar la siembra del esputo por agotamiento en estra a las placas con Agar MS, Agar azida y Agar sangre. Con el isopo estril, tomar muestras de secrecin farngea y sembrarlo en la placa de Agar azida y Agar sangre. En una placa con Agar DNA hacer la siembra por puntura o dibujando una Z de la cepa Stafilococo. A partir del pus y la secrecin farngea (muestras del trabajo), efectuar extendidos en lminas porta objetos. Fijar la pelcula de muestra a fuego lento. Colocar la lmina con la materia de coloracin Gram, siguiendo la tcnica. Secar y observar al microscopio ptico, utilizando el objetivo de inmersin y una gota de aceite de cedro. Por sus caractersticas de agrupacin y coloracin identificar los estafilococos, estreptococos y neumococos, que se observan en el campo microscpico. Dibuje y coloree sus observaciones. Especies ms importantes de Stafilococcus humanos Especie Coagulasa positivos S. aureus Coagulasa negativos S. epidermidis S. saprophyticus S. haemolyticus S. hominis S. simulans S. capitis S. warneri' S. cohnii Area colonizada Fosas nasales, piel Fosas nasales, piel, axilas, odo externo, conjuntiva Tracto urinario bajo Axilas, piel Piel Piel Cabeza, brazos Piel Piel Capacidad patgena Muy frecuente Habitual Habitual Poco frecuente Poco frecuente Poco frecuente Rara Patgeno rara Rara

Estreptococos y sus enfermedades Neumona Snustis Otitis media Meningitis Bacteriema Faringitis Pioderma Fiebre reumtica Glomerulonefritis Meningitis neonatal Neumona neonatal Bacteriemia neonatal Sepsis posparto Infeccin urinaria Absceso abdominal Infeccin de heridas Endocarditis Caries dental Bacteriemia Endocarditis Absceso abdominal

S. pneumoniae (&)

S. pyogenes (*) (grupo A)

S. agalactiae (*) (grupo B)

Enterococcus (#) (grupo D)

Grupo virdans (&)

(*): -Hemolticos. gral. -Hemolticos (#): Algunos -Hemolticos y otros No -Hemolticos (&): No -Hemolticos

Diferenciacin de las especies de Estafilococos

ESPECIES S. Aureus CARACTERSTICAS Color de la colonia Hemlisis en agar sangre Crecimiento anaerobio Coagulasa Fermentacin de la amarillo blanco + + + + blanco +/+ + S. Epidermidis

S. Saprophyticus blanco +/+

glucosa Fermentacin del manitol Novobiocina + sensible sensible resistente

Algoritmo de identificacin de cocos Gram positivos

AGAR MANITOL SALADO

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciacin de estafilococos. Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patognicos a partir de muestras clnicas, alimentos, productos cosmticos y otros materiales de importancia sanitaria. Tambin, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halfilas de Vibrio, si no se dispone de medios apropiados (TCBS Medio, Medio Marino, etc.), aunque algunas especies pueden no desarrollar. Fundamento Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina. Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o prpura. Las colonias sospechosas, se repicarn en un medio sin exceso de cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa. En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentracin) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompaante, y el rojo fenol es el indicador de pH. Las bacterias que crecen en un medio con alta concentracin de sal y fermentan el manitol, producen cidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo. Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol. Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color. Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o prpura. Frmula (en gramos por litro) 1.0 Extracto de carne 10.0 Pluripeptona 10.0 d-Manitol 75.0 Cloruro de sodio 15.0 Agar 0.025 Rojo de fenol pH final: 7.4 0.2

Siembra Sembrar en superficie un inculo denso de la muestra. Incubacin De rutina: durante 18-24 horas a 35-37 C, en aerobiosis. La American Public Health Association (A.P.H.A) recomienda la incubacin durante 3 das a 32 C, en aerobiosis. Resultados Microorganismos Crecimiento Caractersticas de las colonias Excelente Amarilla Staphylococcus aureus Bueno Roja Staphylococcus epidermidis Inhibido Inhibido Escherichia coli Inhibido Inhibido Klebsiella pneumoniae Caractersticas del medio Medio preparado: rojo.

AGAR SANGRE
Medio para propsitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerosos microorganismos. Con la adicin de sangre, el medio es til tanto para el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes a partir de una gran variedad de muestras, como para la observacin de reacciones de hemlisis. Tambin, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para preparar el medio agar chocolate. Fundamento La infusin de msculo de corazn y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, que permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, an de aquellos nutricionalmente exigentes. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentracin final de 5-10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano, y permite detectar hemlisis. Frmula (en gramos por litro) Infusin de msculo de corazn Peptona Cloruro de sodio Agar pH final: 7.3 0.2

375.0 10.0 5.0 15.0

Instrucciones Suspender 40 g del polvo en un litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar perfectamente hasta obtener una suspensin homognea. Calentar con agitacin frecuente y hervir 1 minuto. Esterilizar 20 minutos a 121C. Enfriar a 45-50C agregar sangre desfibrinada al 5%. Homogeneizar y distribuir en placas. Preparacin de la placa de Agar Sangre: aadir en forma asptica un 5% de sangre estril desfibrinada a temperatura ambiente, el agar debe estar a 45C. Preparacin de Agar Chocolate: despus de aadir la sangre y agitando frecuentemente se mantiene el medio de cultivo a 80C por 10 minutos hasta que adquiera un color pardo chocolatado. Siembra Por inoculacin directa del material en estudio, sobre la superficie del medio de cultivo. Incubacin El tiempo, temperatura y atmsfera de incubacin, dependern del microorganismo que se quiera aislar.

Resultados Microorganismos Crecimiento Hemlisis Abundante -E. coli Abundante Beta S. aureus Abundante Beta S. pyogenes Abundante Alfa S. pneumoniae Abundante Alfa S. pneumoniae Limitaciones -Las reacciones hemolticas de muchos microorganismos son diferentes al usar sangre de caballo respecto a la sangre de carnero, tal es el caso de algunas cepas de estreptococos grupo D, que producen beta hemlisis en el agar suplementado con sangre de caballo pero no en agar suplementado con sangre de carnero, y son mal clasificados como Estreptococos Grupo A al usar sangre de caballo. Caractersticas del medio Medio preparado: mbar. Medio preparado con 5% de sangre de carnero: rojo cereza.

AGAR DNA
Medio de cultivo utilizado para la deteccin de enzimas desoxirribonucleasas. Es especialmente til para la diferenciacin entre especies de estafilococos, as como para la diferenciacin de Serratia spp. de especies de Klebsiella y Enterobacter. Fundamento En el medio de cultivo, la triptena es la fuente de nitrgeno, aminocidos, y aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano. El cido desoxirribonucleico (ADN), se encuentra en grado altamente polimerizado, y es el sustrato de la enzima desoxirribonucleasa (DNAsa), la cual lo hidroliza. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico y el agar es el agente solidificante. Este medio de cultivo, permite diferenciar bacterias que poseen la enzima desoxirribonucleasa de aquellas que no la poseen. La presencia de la enzima, se puede detectar mediante el agregado de cido clorhdrico 1N. El cido desoxirribonucleico hidrolizado presenta transparencia, mientras que el cido desoxirribonucleico polimerizado, precipita y torna opacidad al medio de cultivo. Frmula (en gramos por litro) 20.0 Triptena Acido desoxirribonucleico 2.0 5.0 Cloruro de sodio 15.0 Agar pH final: 7.3 0.2 Siembra A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, sembrar un inculo denso, ya sea en estra o por la tcnica de spot. Incubacin En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 C. Cubrir la placa con cido clorhdrico 1N, y observar dentro de los primeros 5 minutos.

Resultados Positivo: halo claro, transparente alrededor del crecimiento bacteriano. Negativo: el medio se observa opaco. Microorganismo Enzima DNAsa + S. aureus + S. aureus S. epidermidis K. pneumoniae + S. marcescens E. cloacae Limitaciones: Las placas no pueden ser reutilizadas luego del agregado del cido clorhdrico. Caractersticas del medio: Medio preparado: mbar.

AGAR AZIDA
Medio adecuado para el aislamiento de estreptococos y estafilococos de diversos materiales, debido a que la azida sdica inhibe la flora Gram negativa. Adicionado con sangre, este medio es adecuado para estudiar reacciones de hemlisis. Fundamento Este medio puede ser usado para los aislamientos primarios de estafilococos y estreptococos a partir de materiales diversos de importancia sanitaria, compuestos de una flora mixta. La presencia de pluripeptona y extracto de carne, proveen nutrientes para el desarrollo de microorganismos, an de aquellos con exigencias nutricionales. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. A la concentracin empleada, la azida de sodio ejerce un efecto bacteriosttico solamente sobre los microorganismos Gram negativos, favoreciendo el desarrollo de los Gram positivos. Frmula (en gramos por litro) 10.0 Pluripeptona 3.0 Extracto de carne 5.0 Cloruro de sodio 0.2 Azida de sodio 15.0 Agar pH final: 7.2 0.2 Siembra Por inoculacin directa del material en estudio, sobre la superficie del medio de cultivo. Incubacin De 24 a 72 horas a 35-37 C. Resultados Microorganismos Crecimiento Inhibido Escherichia coli Bueno S. aureus Bueno E. faecalis Bueno S. pneumoniae Bueno S. pyogenes Caractersticas del medio Medio preparado: mbar. Medio preparado con 5% de sangre: rojo cereza.

CALDO BILIADO 2% VERDE BRILLANTE

Este medio est recomendado para el recuento de coliformes totales y fecales, por la tcnica del nmero ms probable. Fundamento En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepcin de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentacin de la lactosa con produccin de cido y gas. Frmula (en gramos por litro) Bilis de buey deshidratada 20.0 10.0 Lactosa 10.0 Peptona 0.0133 Verde brillante pH final: 7.2 0.2 Siembra a.- Para el anlisis de coliformes totales en muestras fluidas, sembrar por triplicado: 10 ml en caldo doble concentracin y 1ml y 0,1 ml en caldo simple concentracin. Nmero Volumen de la muestra Volumen de medio Concentracin de tubos del medio 10 ml 10 ml Doble 3 1 ml 10 ml Simple 3 0.1 ml 10 ml Simple 3 b.- Para el anlisis de coliformes totales en muestras slidas (alimentos, cosmticos, frmacos), efectuar diluciones seriadas 10-1, 10-2 y 10-3 y sembrar cada dilucin por triplicado en medio de cultivo simple concentracin. Nmero de tubos 3 3 3 Dilucin dela muestra 10-1 10-2 10-3 Volumen de la muestra 1 ml 1 ml 1 ml Volumen de medio 10 ml 10 ml 10 ml Concentracin del medio Simple Simple Simple

c.- Para anlisis de coliformes fecales, a partir de cada tubo positivo en el test presuntivo de coliformes totales (proveniente de Verde Brillante y Bilis 2% Caldo Mac Conkey Caldo Lauril Sulfato, utilizando la tcnica del NMP), o a partir de colonias presentes en diferentes medios, que se presume sean coliformes, transferir una ansada a un tubo con Verde Brillante y Bilis al 2% caldo fresco, incubando a 45 +/- 0.5 C y otra en Agua Triptona con incubacin a 35-37 C, para detectar la produccin de indol.

Incubacin a- Para de coliformes totales: a 35-37 C durante 24 horas. b- Para coliformes (fecales): a 44.5-45.5 C durante 24 horas. Resultados -Positivo: presencia de gas. Con el nmero de tubos positivos, calcular el nmero ms probable. El resultado se expresa por gramos 100 ml de producto -Negativo: ausencia de gas. Microorganismos Crecimiento Gas Indol# + +* +* Escherichia coli + + -* Enterobacter spp. + +* -* Klebsiella pneumoniae + Salmonella typhimurium Variable Bacterias no fermentadores de lactosa + - Staphylococcus aureus +* -* 10-25% de cepas negativas o positivas # a partir de Agua Triptona Caractersticas del medio Medio preparado: verde esmeralda, transparente