A R T I G O T C N I C O C I E N T F I C O

Produo e Caracterizao de Microesferas de Quitosana Modificadas Quimicamente

Marco A. Torres, Rodrigo S. Vieira, Marisa M. Beppu, Cesar C. Santana Faculdade de Engenharia Qumica, UNICAMP Resumo: Microesferas de quitosana podem ser empregadas na rea de biomaterias, em processos biotecnolgicos e como adsorventes. Neste trabalho, foi empregada a tcnica de atomizao e coagulao para produo dessas microesferas, que permitiu o controle dos parmetros de operao e por conseqncia a obteno de microesferas de tamanho e faixas de tamanho especficos. Aps a sua obteno, as microesferas foram modificadas quimicamente com objetivo de estudar as resistncias trmica, mecnica e qumica. Para isso foram empregadas trs rotas distintas: a-) reticulao com glutaraldedo; b-) reticulao com epicloridrina e c-) acetilao. As microesferas preparadas apresentaram distribuio de tamanho da ordem de 140 m com desvio padro de 11,9 m. Aps as modificaes qumicas, as microesferas apresentaram temperatura de degradao trmica em torno de 300 C, aumento da estabilidade qumica soluo de HCl, e diminuio da resistncia mecnica. Palavras-chave: Quitosana, microesferas, atomizao, modificao qumica. Production and Characterization of Chemically Modified Chitosan Microspheres Abstract: Chitosan microspheres can be used as biomaterial, in biotechnology processes and as adsorbents. This work is concerned with the production of chitosan microspheres using spraying and coagulation processes, which allows us to control the operating parameters and to produce chitosan microspheres of several ranges and sizes. The microspheres were modified chemically in order to study their thermal, mechanical and chemical resistance. The methods used were: 1) crosslinking with glutaraldehyde; 2) crosslinking with epichlorohydrin; 3) acetylation. The microspheres obtained presented mean particle size of 140 m and standard deviation of 11.9 m. The modified microspheres showed thermal degradation around 300 C, an increase of chemical stability using HCl solution and a decrease of mechanical resistance. Keywords: Chitosan, microspheres, spraying, chemical modification.

Introduo
A quitosana um aminopolissacardeo biodegradvel, hidroflico, no txico e biocompatvel obtido a partir da desacetilao alcalina da quitina[1-3]. Sua estrutura qumica formada pelos copolmeros -(14)- 2-amino 2-desoxiD-glicose e -(14)- 2-acetamida 2-desoxi-D-glicose com a presena de grupos amino e grupos hidroxila primrio e secundrio. A quitosana vem sendo estudada como biomaterial de potencial aplicao principalmente nas reas mdica e farmacutica[4-6]. Yamaguchi, et al.[7] observaram compsitos de quitosana e suas aplicaes na regenerao de nervos. Mi, et al.[8] realizaram estudos sobre a quitosana aplicada na liberao controlada de frmacos. crescente, tambm, a importncia da quitosana como adsorvente, em processos de recuperao e/ou de purificao de bioprodutos de alto valor agregado, como as protenas. Uma vantagem dessa utilizao est na disponibilidade da quitosana na natureza atravs da quitina, podendo ser facilmente encontrada, como subproduto da indstria pesqueira.

Devido sua natureza policatinica, quando a quitosana entra em contato com solues cidas possvel a sua moldabilidade nas mais diversas formas como membranas, esferas, gel, microesferas, etc. Recentemente, alguns artigos tm sido publicados descrevendo a preparao de microesferas de quitosana pelos mtodos de secagem por atomizao[9] e pelo mtodo de emulso[10] . Neste trabalho, as microesferas de quitosana foram preparadas a partir da tcnica de atomizao e coagulao. O mtodo utilizado simples, de fcil aumento de escala e bastante reprodutvel. Uma outra caracterstica importante da quitosana est na possibilidade de modificaes estruturais de modo a obter diversas formas de interao qumica e resistncia mecnica. As microesferas obtidas foram ento modificadas quimicamente, com objetivo de estudar o grau de desacetilao e as resistncias mecnica, qumica e trmica aumentando as suas possibilidades de aplicao. Foram escolhidas para isso trs rotas distintas: a-) reticulao com glutaraldedo, atravs do bloqueio dos grupos amino presentes na quitosana pelos grupos aldedos[11,12]; b-) reticulao com epicloridrina,

Autor para correspondncia: Marco A. Torres, Faculdade de Engenharia Qumica, UNICAMP, Caixa Postal 6066, CEP: 3083-970, Campinas, SP. E-mail: marco@feq.unicamp.br

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Figura 1. Estrutura molecular dos segmentos da cadeia das amostras, natural (a), reticulada com glutaraldedo (b), reticulada com epicloridrina (c) e acetilada (d).

atravs do bloqueio preferencial das hidroxilas[13,14] e c-) acetilao, diminuindo o grau de desacetilao da quitosana atravs da formao de pseudo-quitinas[15]. A Figura 1 mostra as possveis estruturas qumicas formadas aps o processo de reticulao e acetilao da quitosana. Aps preparao das microesferas de quitosana pelo mtodo de atomizao e coagulao e modificao pelas trs rotas as microesferas foram caracterizadas e avaliadas comparativamente segundo os mtodos de titulao potenciomtrica, espectroscopia de reflexo total atenuada no infravermelho, anlises trmicas por TGA e DSC, anlise mecnica por DMA e anlise de resistncia qumica ao cido HCl.

Experimental
Estabelecimento de parmetr os do pr ocesso parmetros processo A esfericidade foi afetada (no nosso caso) pela distncia entre o bico de atomizao e a soluo coagulante. Distncias maiores permitiram diminuio do impacto entre o borrifo e a soluo de NaOH, com obteno de partculas mais esfricas[16]. Esse parmetro foi ento fixado em 30 cm. Durante a operao do sistema observou-se que o aumento da presso de nitrognio em relao vazo mssica da soluo de quitosana diminui o tamanho mdio das partculas. O resultado foi oposto quando aumentamos a vazo mssica da soluo de quitosana em relao presso de nitrognio. J o aumento da concentrao da soluo de quitosana diminui, por sua vez, a capacidade de quebra das gotas (atomizao), ou seja, aumenta
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o tamanho das partculas obtidas. A condio mais uniforme de distribuio do tamanho das microesferas de quitosana foi obtida a partir das seguintes condies: corrida utilizando-se soluo de quitosana na concentrao de 2,5 % em massa bombeada peristalticamente atravs da bomba Cole Parmer operando na vazo de 9,0 ml.min-1 e presso na linha de nitrognio de 2,5 kgf.cm-2 com temperatura constante de 25 C e abertura do bico de atomizao de 0,5 mm. Foi possvel verificar limitaes no aumento da presso de nitrognio e na vazo da soluo de quitosana. Valores acima de 2,5 kgf.cm-2 de presso de nitrognio causaram refluxo na corrente de entrada da soluo de quitosana. Valores acima de 9,0 ml.min-1 de vazo da soluo de quitosana diminuram a eficincia da atomizao, esta limitao est relacionada com o tamanho da cmara onde ocorre a atomizao. A concentrao da soluo de quitosana possui grande influncia na eficincia do processo, mas foi mantida em 2,5%, pois a sua diminuio afeta a condio de reatividade das microesferas dependendo da sua utilizao final. A variao da temperatura da soluo de quitosana teve inicialmente pouca influncia na vazo da soluo, j que para alterar as suas propriedades viscoelsticas necessrio um gradiente de temperatura superior a 20 C[17]. Pr eparao das micr oesferas de quitosana Preparao microesferas Inicialmente a quitosana foi solubilizada em soluo aquosa de cido actico, contendo 3% (v/v) de cido actico em gua Milli-Q. Para obteno das microesferas de quitosana foi utilizado o mtodo de atomizao e coagulao. As eta307

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Modificao qumica das micr oesferas microesferas As microesferas obtidas pela tcnica de atomizao e coagulao foram modificadas quimicamente com glutaraldedo, epicloridrina e anidrido actico. Na primeira rota, as microesferas foram reticuladas em soluo aquosa de glutaraldedo 0,75% em massa (5 g de microesferas midas em 50 ml de soluo de glutaraldedo), sem agitao, na temperatura ambiente por 2 h. Em seguida, as microesferas foram lavadas com gua Milli-Q para remoo do excesso de glutaraldedo. No processo de reticulao com epicloridrina, 5 g de microesferas midas foram imersas em soluo de epicloridrina na concentrao de 0,01 mol/L. A soluo utilizada foi preparada com 0,067 mol/L de NaOH. A soluo com as microesferas foi agitada durante 2 h na temperatura de 40 C. Em seguida, as microesferas foram lavadas com gua Milli-Q para remoo do excesso de epicloridrina. Na terceira rota, as microesferas foram modificadas usando soluo de 0,6 % em volume de anidrido actico em soluo de metanol, na temperatura ambiente e agitao contnua por 3 min. Em seguida, as microesferas foram lavadas com metanol para remoo do anidrido actico em excesso. As microesferas de quitosana foram ento separadas em: (a) microesferas sem modificao alguma (natural); (b) microesferas reticuladas com glutaraldedo; (c) microesferas reticuladas com epicloridrina e (d) microesferas acetiladas. Micr oscopia ptica Microscopia Para avaliao morfolgica das microesferas foi utilizado um microscpio ptico Leica DMLM. As microesferas, aps liofilizao, foram imersas em leo mineral para facilitar a disperso e conseqente visualizao. O aumento utilizado foi de 200 x. Distribuio de tamanho das micr oesferas microesferas A distribuio do tamanho das microesferas foi realizada em triplicata e obtida utilizando o equipamento Mastersize S. A tcnica consiste no espalhamento da luz (laser, com comprimento de onda de 488 nm) pelas partculas da amostra, sendo o tamanho inversamente proporcional ao desvio do ngulo da luz espalhada de acordo com a teoria Mie. Essa teoria permite descrever um objeto tri-dimensional (no nosso caso as microesferas) atravs de um nmero, utilizando para isso o modelo de uma esfera equivalente. T itulao potenciomtrica A quantidade de grupos amino protonveis foi determinada para cada amostra atravs de ensaios de titulao potenciomtrica. Nesse mtodo, uma quantidade conhecida de microesferas (sem modificao ou modificadas) adicionada uma soluo de HCl (0,02 equiv-g/L), permitindo o carregamento dos grupos protonveis (grupos amino). Em seguida, a soluo resultante titulada com uma soluo de NaOH (0,01 equiv-g/L). Com as curvas de titulao e os respectivos pontos de inflexo possvel determinar o percentual de grupos amino, conforme a Equao 1.
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Figura 2. Fluxograma da produo de microesferas.

pas so mostradas na Figura 2. O sistema utilizado para a preparao das microesferas mostrado na Figura 3. A soluo concentrada de quitosana foi bombeada na vazo de 9,0 ml.min-1 utilizando uma bomba peristltica (Cole Parmer) atravs de uma linha de silicone at o bico de atomizao (Spraying System JBC) com abertura de 0,5 mm. A atomizao da soluo ocorreu a partir do contato com gs nitrognio sob presso de 2,5 kgf.cm-2 e foi dispersa em direo soluo de hidrxido de sdio NaOH 1 mol/L, permanecendo em contato e repouso com a soluo coagulante por 12 horas. As microesferas estabilizadas estruturalmente apresentam um aspecto branco opalescente, devido ao espalhamento de luz atravs dos seus poros. As microesferas foram ento drenadas utilizando-se peneiras de tamanho de malha de 0,035 mm e 0,150 mm com o intuito de selecionar o tamanho das microesferas. A frao intermediria foi ento lavada com gua deionizada e estocada em temperatura de 7 C.

Figura 3. Representao esquemtica da produo de microesferas de quitosana.

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(1) onde MNaOH a molaridade da soluo de NaOH (mols/L), V1 e V2 so os volumes de NaOH usados respectivamente para neutralizar o excesso de HCl e a amostra de quitosana protonada, 161 a massa molecular da unidade monomrica da quitosana e m a massa de amostra utilizada para a titulao em gramas. Infravermelho(FTIR - ATR) Infravermelho(FTIRNesse estudo foram realizadas anlises utilizando-se a tcnica de espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) acoplada a um elemento de reflexo total atenuada (ATR). O espectro foi varrido de 4000 a 400 cm-1 com resoluo de 16 cm-1. O equipamento utilizado foi FTIR da Nicolet Protg, com acessrio ATR de cristal de germnio. Anlises trmicas por TGA e DS C DSC As anlises trmicas foram realizadas para observao do comportamento e da estabilidade trmica de cada amostra. Devido especificidade das reaes fsico-qumicas que ocorrem numa banda definida de temperatura e velocidade, foi possvel ter informaes sobre a estrutura molecular. Para isso foi utilizado um analisador termogravimtrico TGA7 da Perkin-Elmer. Todas as amostras foram analisadas aps liofilizao. O aquecimento foi feito em uma razo de 10 C.min-1, em atmosfera dinmica de nitrognio na vazo de 25 ml.min-1. Os eventos trmicos foram registrados em funo da composio, estrutura do material e de sua histria trmica. Para isso foi utilizado um analisador trmico DSC 2920 TA Instruments. O aquecimento foi feito em uma razo de 10 C.min-1 at temperatura de 450 C, em atmosfera inerte de nitrognio, com vazo de 50 ml.min-1. Anlise mecnica por DMA No nosso caso, os ensaios mecnicos foram realizados com o objetivo de observar apenas a resistncia mecnica das amostras, variando a fora imposta amostra no decorrer do tempo. Durante os ensaios, a temperatura permaneceu constante em 25 C. Cada amostra, depois de ter sua dimenso medida, foi colocada em um dispositivo na forma de garras. As medidas ocorreram em funo da deformao observada a partir da compresso das amostras. A rampa de fora aplicada durante os ensaios foi de 0,01 N.min-1. As anlises foram realizadas com o uso do equipamento TA Instruments Dynamic Mechanical Analyser (DMA) 2980 no modo fora controlada. A valiao da r esistncia qumica resistncia A resistncia qumica ao cido HCl foi realizada utilizando o mesmo protocolo de determinao do grau de desacetilao da quitosana[18]. As microesferas individualmente so deixadas em repouso durante 24 hs em solues de HCl 0,2 mol/L. Sua solubilidade foi avaliada visualmente durante esse perodo. Os ensaios foram realizados em triplicata.
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Figura 4. Fotomicrografia das microesferas de quitosana sem modificao.

Resultados e Discusso
Apesar da fotomicrografia mostrada na Figura 4 ser para a condio inicial (a), as demais condies (b), (c) e (d) apresentaram resultados de esfericidade bastante similares natural independente da modificao realizada. A anlise de distribuio de tamanho das microesferas da Figura 5 mostrou um dimetro mdio em torno de 140 m. A anlise mostrou um desvio em relao mdia de 11,9 mm conforme os resultados da Tabela-1. A Tabela 2 apresenta valores do percentual de grupos amino para as amostras (a), (b), (c) e (d) obtidos pelo ensaio de titulao potenciomtrica. A amostra reticulada com glutaraldedo no apresentou uma quantidade de grupos

Figura 5. Distribuio de dimetros das microesferas (naturais) obtida a partir das condies 2,5 kgf.cm-2 para presso e 9,0 ml.min-1 para vazo mssica . Tabela-1. Reprodutibilidade dos ensaios de distribuio de tamanho das microesferas feitos na condio de 9,0 ml.min-1 de vazo mssica e 2,5 kgf.cm-2 de presso de N2.

Ens aio 1 2 3

Dime tro m dio (m) 140 129 151

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Tabela-2. Percentual de grupos amino protonveis das amostras, natural (a), reticulada com glutaraldedo (b), reticulada com epicloridrina (c) e acetilada (d).

a b c d
nd= sem valores nessa condio

82,5 nd 68,7 70

amino protonveis expressiva. Observou-se somente uma inflexo na curva de titulao potenciomtrica, referente ao consumo de NaOH necessrio para neutralizar o HCl adicionado. A amostra reticulada com epicloridrina apresentou um percentual de grupos amino prximo ao valor encontrado para a quitosana natural, indicando que esta reao deva atuar prioritariamente em outros grupos funcionais da quitosana alm dos grupos amino. A amostra acetilada apresentou um percentual de grupos amino de 70%. A Figura 6 nos mostra os espectros FTIR-ATR para as amostras analisadas. Foi possvel verificar a presena das seguintes bandas de absoro: 1060 cm -1 estiramento vibracional C-O do lcool primrio; 1090 cm-1 estiramento vibracional do grupo ter; 1070-1100 cm-1 aminas alifticas; 1654 cm-1 e 1380 cm 1 vibrao de deformao de intensidade mdia N-H de amina primria e banda relativa vibrao de deformao angular simtrica de grupos metil do grupo acetamido; 1400 cm-1 grupos alquilas e carboxilatos O-C=O; 1450 cm -1 vibrao de deformao angular de grupos metilnicos CH2; 1550 cm-1 bandas de sobreposio de aminas N-H, amida N-C=O e carboxilato O=C-O; 1725-1750 cm-1 e 1230-1277 cm-1 grupos steres C=O-O . Na amostra (b) pdese observar que a intensidade da banda devido amina aliftica (1100 cm-1) diminuiu, denotando que estes grupos foram ligados as molculas de glutaraldedo, formando uma nova estrutura denominada imina (N=C), conforme mostra a Figura 1-b. Este fato pde ainda ser confirmado pelo aparecimento de um pico a 1655 cm-1 atribudo a ligao imina

N=C[12-19] e outro pico a 1562 cm-1 associado ligao etilnica C=C. Pde-se observar o aparecimento de bandas caractersticas entre 1700-1750 cm-1 relacionadas aos grupos aldedicos livres, os quais no reagiram com o polmero. Especialmente em reticulaes extremas, como o nosso caso, validado pelo resultado da titulao potenciomtrica, as molculas bifuncionais do glutaraldedo no tm necessariamente ambos os grupos aldedicos ligados quitosana e funes aldedicas podem estar disponveis na matriz final reticulada. Na amostra (c) observou-se um aumento na intensidade entre 1000-1300 cm-1, indicando a formao da ligao C-O, caracterstico do processo de reticulao com epicloridrina, conforme mostra a Figura 1-c[20]. Na amostra (d) pde-se observar que a intensidade da banda devido amina aliftica (1100 cm-1) diminuiu, indicando a acetilao destes grupos pelo anidrido actico. Estes resultados concordam com aqueles apresentados pela titulao potenciomtrica onde se observou que parte dos grupos amino foram acetilados. A Figura 7 mostra os resultados obtidos das anlises termogravimtricas para as microesferas. Observa-se que a degradao das amostras ocorre em dois estgios distintos. O primeiro referente perda de gua residual das amostras, e o segundo, referente degradao das amostras propriamente dita. No primeiro estgio, possvel verificar que a amostra reticulada com glutaraldedo (b) retm menos gua e com isso volatiliza mais facilmente. Esse comportamento sugere que os grupos amino, de carter hidroflico, encontram-se ligados aos grupos aldedicos[12,14,19,20], concordando com os resultados apresentados pela titulao potenciomtrica e pelo FTIR-ATR. Como conseqncia observou-se uma queda em sua resistncia trmica. J as temperaturas de degradao das amostras (a), (c) e (d) ficaram muito prximas, em torno de 300 C. O fluxo de massa perdido, associado perda de gua, para as amostras (a), (c) e (d) apresentaram comportamentos similares. Podemos inferir com isso que a reticulao com epicloridrina influenciou apenas parcialmente o carter hidroflico da amostra (a), com o bloqueio preferencial aos grupos hidroxlicos, e no aos grupos amino. O aumento das unidades monomricas acetiladas na amostra (d) no alterou

Figura 6. Espectros de FTIR-ATR para as microesferas natural (a), reticuladas com glutaraldedo (b), reticuladas com epicloridrina (c) e acetiladas (d).

Figura 7. Anlise termogravimtrica das microesferas de quitosana (a) natural, (b) reticulada com glutaraldedo, (c) reticulada com epicloridrina e (d) acetilada.

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Tabela 3. Valores de solubilizao das amostras em soluo aquosa de HCl 0,2 mol/L pelo tempo mximo de 48 hs.

Amos tras a b c d
nd= sem valores nessa condio

Solve is 10 nd nd 12

Ins olve is nd 48 48 nd

Figura 8. Perfil trmico obtido por DSC para as microesferas de quitosana (a) natural, (b) reticulada com glutaraldedo, (c) reticulada com epicloridrina e (d) acetilada.

de forma importante o carter hidroflico, apresentando resultados prximos aos encontrados nas amostras (a) e (c). A Figura 8 mostra os resultados obtidos pelas anlises de calorimetria exploratria diferencial para as microesferas. Observa-se em todas as amostras um pico endotrmico relacionado evaporao de gua e um pico exotrmico relacionado capacidade de reteno de gua. O comportamento similar para as amostras (a), (c) e (d). J para a amostra (b) reticulada com glutaraldedo possvel verificar que o pico exotrmico menos intenso quando comparado s demais amostras. Essas observaes confirmam os resultados encontrados nas anlises termogravimtricas, relacionando as alteraes promovidas pela reticulao com glutaraldedo com a baixa capacidade de reteno de gua pelas cadeias hidrofbicas. A Figura 9 mostra os resultados obtidos pelas anlises mecnicas para as microesferas. Foi possvel observar comportamento similar nas curvas (a), (c) e (d) com relao estabilidade das amostras aps aplicao de fora de compresso em torno de 0,5 N. Mas todas as amostras, aps as respectivas modificaes qumicas, apresentaram perda de resistncia mecnica quando comparados amostra (a). A amostra (c) apresentou inicialmente maior deformao na mesma tenso imposta quan-

do comparada s demais, mas com flexibilidade suficiente para alcanar a estabilizao sem ruptura do material. A amostra (d) teve comportamento prximo a amostra (a). J a amostra (b), comparativamente, apresentou deformao acentuada em todo o ensaio (sinal de um material mais rgido) com a ruptura da amostra caracterizado na curva, pelo ponto de cedncia. Esse fenmeno ocorreu aps a aplicao de uma fora equivalente a 0,15 N. Diferentemente das demais amostras, a amostra (b) apresentou esfarelamento aps o ensaio (j observado durante o manuseio), mostrando, nesse caso, que a reticulao com glutaraldedo alterou mais intensamente o empacotamento das cadeias macromoleculares e seu relaxamento aps ser submetido a tenses diminuindo a flexibilidade final da amostra. Nos ensaios de solubilidade ao cido clordrico, conforme Tabela 3, pod-se observar que as amostras (a) e (d) foram totalmente solubilizadas aps 10 e 12 horas de contato com a soluo cida, respectivamente. Esses tempos de solubilizao prximos indicam disponibilidade similar de grupos amino na estrutura macromolecular dessas amostras. As amostras (b) e (c) no apresentaram nenhum trao de solubilizao aps 48 horas de observao visual, mostrando que as modificaes promovidas nesses dois casos resultaram no bloqueio dos grupos amino em grau suficiente para elevar sua resistncia qumica nas condies citadas.

Concluses
O processo de atomizao e coagulao mostrou-se: 1eficaz para a obteno de microesferas de quitosana; 2reprodutvel; 3- simples e 4- possvel de se realizar em maior escala. Esforos concentrados na otimizao dos parmetros operacionais (presso; vazo mssica e altura entre o bico de atomizao e a soluo coagulante) podem vir a gerar microesferas com distribuio de tamanhos mais adequada a cada aplicao. As anlises trmicas mostraram que h diferena na perda de gua e na temperatura de degradao entre as amostras naturais, reticuladas com epicloridrina, e acetiladas com relao s amostras reticuladas com glutaraldedo. O que nos leva a inferir que a alterao induzida pela reticulao com glutaraldedo afeta os grupos amino das cadeias polimricas e por conseqncia a sua hidrofobicidade em maior intensidade. As modificaes qumicas realizadas no contriburam para aumentar a estabilidade mecnica das amostras analisadas em
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Figura 9. Perfil obtido por DMA para as microesferas de quitosana (a) natural, (b) reticulada com glutaraldedo, (c) reticulada com epicloridrina e (d) acetilada.

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comparao com a amostra natural. Em especial as microesferas aps reticulao com glutaraldedo tiveram sua estrutura comprometida quando aplicadas foras superiores a 0,15 N. As microesferas aps as modificaes qumicas com epicloridrina e glutaraldedo tiveram um aumento acentuado de resistncia qumica soluo aquosa de HCl quando comparadas as microesferas naturais. J com as microesferas acetiladas, o valor de 12 h, prximo das microesferas naturais (10h), mostra que o grau de desacetilao de 70% no foi suficiente para conferir a amostra (d) aumento significativo na resistncia qumica soluo aquosa de HCl.

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Agradecimentos
Os autores agradecem o suporte financeiro da FAPESP e CNPq.

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Enviado: 17/03/05 Reenviado: 25/07/05 Aprovado: 30/07/05

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