Transposones Gentica 1 2do Cuatrimestre 2009

Elementos genticos mviles

Pueden cambiar su localizaci localizacin en el genoma
Se detectan porque producen anormalidades en la estructura o actividad actividad de los genes Importantes desde un contexto evolutivo (generaci (generacin de diversidad y reorganizaci reorganizacin/ relocalizaci relocalizacin de genes/exones/promotores en el genoma) Importantes herramientas en biotecnolog biotecnologa

Elementos genticos mviles

1948- Barbara McClintock propone la existencia de genes mviles Pero antes ya se haban observado mutaciones inestables, que revertan con cierta frecuencia (ms alta, por cierto) Recuerden: Mendel = 1965, redescubierto en 1902 Las mutaciones inestables obedecen a las leyes de Mendel? 1905 De Vries, la tendencia a la variegacin en Antirrinum majus es heredable 1910 Correns, observa en Mirabilis jalapa que mutaciones variegadas a coloreadas se comportaban en forma mendeliana 1911 Hayes observa lo mismo en maz

Rhoades: 1938 Lnea endocriada de maz con granos pigmentados Aparece una mazorca con una relacin: 12 granos pigmentados

3 granos punteados

1 incoloro

Hiptesis de Rhoades: 1938 2 loci

9 A- Dt3A- dtdt

3 aa Dtdt

aa dtdt

A = grano pigmentado a = grano incoloro (mutacin recesiva) Dt= produce efecto variegado dt= no produce efecto variegado

Rhoades lo razona correctamente

El tamao del sector depende del momento de la reversin (si es temprana o tarda en el desarrollo) y el nmero de sectores depende de la frecuencia

Razon que las reversiones en la lnea germinal deberan ser heredables y lo teste

50%

50%

Barbara McClintock, Premio Nobel 1983 1940s:

1920s: Establece una disciplina: la citogentica del maz. Establece los 10 cromosomas y asocia los grupos de ligamiento a cada cromosoma. 1935-1941: Mapeo gentico con maces irradiados; observ los Ring chromosomes Describi el ciclo breakage-fusion-bridge

Observ el efecto de roturas cromosmicas en el cromosoma 9 de una lnea de maz

Observ cambios en la expresin de genes lindantes, por lo cual los llam controlling elements, elementos controladores, porque dedujo que regulaban la expresin gnica

Describi el ciclo breakage-fusion-bridge

1948- Propuso que el chromosome-breaking locus puede moverse de un lugar al otro del genoma. Concluy adems, que dicho locus, Ds (dissociator) era regulado por otro, Ac (activator)

En ese momento se hacan mapas genticos y por lo tanto, se crea que los genes estaban estticos, La idea fue revolucionaria y poco aceptada. Por eso el premio nobel le lleg casi 40 aos ms tarde

normal

incolora

manchas de pigmento

Locus Ac promueve transposicin de Ds

Ds puede producir delecin

Locus Ac promueve su propia transposicin (autnomo)

El elemento Ds no es autnomo, se activa nicamente en presencia de otro elemento llamado Ac. Ac controla el movimiento de Ds, por eso McClintock llam al sistema Ac-Ds ELEMENTOS CONTROLADORES de maz Ac tambin es un elemento mvil

Hoy podemos explicar estos eventos en trminos moleculares

Escisin

Al producirse la escisin puede (o no) restablecerse la unin cromosmica

Posteriormente se describieron otros transposones en maz

Las familias de transposones estn compuestas por elementos autnomos y no autnomos

Controversias que el sistema de maz no poda aclarar

1960s gentica bacteriana Contexto: se saba la naturaleza del material hereditario, el cdigo gentico y secuencias limitadas, todava no estaban desarrollados los mtodos de secuenciacin pero la gentica molecular de bacterias avanzaba rpidamente (recuerden, opern lac, fagos, etc) Los avances con el maz se habian estancado a falta de suficientes herramientas moleculares A fines de los 60 se encuentran las IS (insertion sequences). Primero se encontraron mutaciones polares (se comportaban como deleciones) pero que tenan frecuencias altas de reversin)

Cmo se encontraron?
promotor galactoquinasa transferasa epimerasa Opern gal

mRNA
Mutacin polar Reversin: 10-5!

gal+

gal-

::IS1

Hibridacin con gal y 7 lugares ms!

Elementos IS (Insertion sequence)

Interrumpan genes pero las mutaciones podan revertir y eran muy polares! Estn normalmente presentes en cromosomas y plsmidos Unidades autnomas: son los transposones ms simples Estructura general: Secuencias invertidas en sus extremos Duplicacin de una secuencia del sitio blanco: flanqueado por secuencias directas repetidas (9bp) La transposicin implica siempre ruptura endonucleoltica de la unin fosfodiester y la transferencia de estos residuos a una molcula blanco COMPLEJO NUCLEOPROTEINA -TRANSPOSASA -EXTREMOS DEL TRANSPOSON -ADN BLANCO

Caractersticas de las IS

Esquema del mecanismo de transposicin de las ISs

Transposones compuestos (Tipo I)

Transposasa

Resistencia a antibiticos

Los transposones compuestos contienen regiones centrales flanqueadas por ISs. Los IS pueden estar en la misma direccin o no.

Transposones compuestos

evolutivamente

Ejemplos de Transposones compuestos:

Transposicin desde los extremos de afuera

Cuando la transposasa acta sobre las secuencias invertidas mas lejanas, los dos IS van a transponer como una unidad, llevando consigo los genes entre ellos. Normalmente una de las transposasas es inactiva.

Secuencia repetida del blanco

Transposicin desde los extremos de adentro

Tiene consecuencias muy diferentes: Se puede crear otro transposn Se pueden producir deleciones e inversiones cuando el ADN blanco es cercano Ejemplo: 1) Se infecta con lambda con mutaciones ambar en los genes de replicacin, una bacteria permisiva que alberga el plsmido dador que contiene el transposn (ver figura) 2) Con la progenie se infecta una bacteria NO permisiva. Si se obtienen una 2da progenie quiere decir que transpuso el elemento nuevo (si hay placas)

La inestabilidad del ADN inducida por transposones compuestos es causada por transposicin desde los extremos de adentro

Ensamblaje de elementos IS: Plsmidos R

Plsmidos R
Plsmidos R - plsmidos conjugativos de resistencias - compuestos por varios Tn/IS - ejemplo: R100 (90 kb): lleva varios genes de resistencia, puede transferirse entre bacterias entricas

Mecanismo de los transposones compuestos:

Transposicin no replicativa
Ejemplos:Tn5 Tn10 Tn9

Caractersticas del mecanismo: Corte y pegado del transposn Corte doble cadena en el ADN dador Duplicacin de un pequea secuencia en el ADN aceptor Degradacin del dador Evidencias de una transposicin no replicativa: No se forma un co-integrado, no poseen resolvasa (No existen mutantes que acumulen un cointegrado) Deja una sla copia del transposn en la clula No se aislaron revertantes (el dador no se re-sella)

Mecanismo de transposicin del Tn5

Ruptura de ADN doble cadena en el ADN dador:
Complejo Sinptico

OE: outside end IE: inside end

Transferencia de cadena

Transposones tipo II (o no compuestos)

res
Transposicin autorregulada

La unidad mnima transponible contiene el gen de resistencia, la transposasa, la resolvasa y la regin res (por resolucin)

Ejemplos de transposones tipo II

Ensayos para medir la transposicin

1)Vectores suicidas: Fagos suicidas Plsmidos suicidas 2)Ensayo de conjugacin: Ensayo de mating out

Plsmido no se transfiere por si mismo y no es movilizable

Plsmido transferible

Confirmacin por mapeo de restriccin

Mecanismo de transposicin de transposones tipo II

Transposicin replicativa Ejemplo: Tn3
La Transposasa: es responsable de la ruptura de las uniones y de las ligaciones Observaciones: Una secuencia corta del ADN blanco se duplica Se forma un co-integrado (fusin del dador y aceptor con 2 copias del tn) Resolucin del co-integrado en la secuencia res: acta adems de la transposasa, una resolvasa que resuelve el co-integrado Ambos (dador y aceptor) terminan con una copia del Tn

La transposasa y la resolvasa
TnpA se une a las IR e inicia la transposicin. TnpR se une a la secuencia res del transposon duplicado, reprime tnpA y tnpR, y resuelve el co-integrado en los sitios res por recombinacin sitioespecfica .

Pasos en la transposicin:
1. Corte simple cadena a ambos lados del tn. Corte doble cadena en el aceptor (extremos cohesivos--responsables de la duplicacin del ADN blanco). El extremo 5 del aceptor se liga al 3 del tn

2.

3. Ocurre la replicacin en las 2 direcciones (desde los extremos 3del aceptor: primers) 4. Ligacin del los 3 del aceptor con los 5 libres del tn (por la transposasa): formacin del cointegrado 5. Resolucin del cointegrado (recombinacin sitio especfica) en res por la resolvasa

Diferencia entre ambas transposiciones: Nro de sitios de corte en los extremos del transposn. Una evidencia contundente: Si se muta la transposasa del transposn Tn7 (no replicativo) de manera que induce slo un corte en cada extremo del transposn (un solo cambio de aa) Se convierte en una transposicin replicativa!!!

Regulacin de la transposicin
-Transponen poco frecuentemente: 10-8 -Altamente regulables Mecanismos descriptos en la regulacin de transposones:

Menor expresin de tnp Inhibicin de la traduccin del mRNA de la transposasa tnp Inestabilidad del mRNA de tnp Inhibicin de la actividad de Tnp La transposasa slo acta en cis La transposasa slo es activa como multmero

Regulacin de la transposicin
Regulacin por ARN antisentido Regulacin por metilacin

Regulacin del Tn10

Transposasa (IS10R) acta preferencialmetne en cis, limita la frecuencia de transposicin Regulacin por ARN antisentido: 30 veces mayour expresin de este ARN (Pout/Pin).

Metilacin Dam: La hemi-metilacin en GATC activa el promotor de la transposasa (Pin) y la unin de la transposasa a los extremos de los IS10; la metilacin completa bloquea la transposicin .

Regulacin por metilacin del DNA

Disgnesis hbrida mediada por elementos P

Disgnesis hbrida mediada por elementos P

Repeticiones invertidas intactas Gen de transposasa eliminado

Repeticiones invertidas eliminadas Gen de transposasa intacto

Expresin de lacZ

Plsmidos suicidas (no tienen capacidad de replicacin en moscas) expresin transitoria de la transposasa

La transposicin de los elementos P ocurre slo en la lnea germinal por una regulacin post-transcripcional

Retrovirus y retrotransposones

Retrovirus

Retrotransposones

El mecanismo explica las dos bases que se pierden del virus y las duplicaciones en el husped

Ciclo simplificado de un retrotransposon

Los retrotransposones Ty de levaduras

El splicing y la duplicacin de la mutacin son evidencias de la forma de replicacin

Otros retrotransposones (o retroprosones) no tienen LTRs

Pero siguen teniendo transcriptasa reversa

Pueden constituir una parte importante del genoma

Transposones en el genoma humano

Secuencias Alu de humanos (300 pb),1.000.000 de copias, ocupan el 10% del genoma

Gen de la hogentisato 1,2-dioxigenasa (alkaptonuria)

Recapitulando

Clase II

Clase I

Compuestos No compuestos

Consecuencias de la transposicin
Generacin de diversidad gentica (junto a mutaciones) Transmisin horizontal de nuevos genes (particularmente, pero no nicamente, en bacterias) Especiacin? Reordenamientos genmicos (deleciones, inversiones, duplicaciones) Relocalizacion de secuencias (exon y gene shuffling) Promover nuevos sistemas de regulacin de la expresin gnica

Exon shuffling

Mediado por transposasa

Uso de los elementos Mviles en Biotecnologa

Mutagnesis por insercin (knock out) Clonado posicional de genes o etiquetado de genes (gene tagging) Estudio de secuencias reguladoras Transformacin gentica de insectos Terapia gnica

TERAPIA GNICA: Sleeping Beauty Transposon System (SBTS) United States Patent 6,489,458; Hackett , et al. December 3, 2002; DNA-based transposon system for the introduction of nucleic acid into DNA of a cell. The adenoviral vector, flanked by inverted terminal repeats (ITR), contains a Sleeping Beauty transposon (yellow bars indicate transposon terminal repeats). Flanking the transposon with Flp recognition target sequences (FRT, blue triangles) and expression of Flp recombinase results in circularization of theSleeping Beauty substrate. These circular donor molecules undergo transposition, resulting in insertion of the transgene into the host genome.

The image shows transgenic mice that carry the piggyBac transposon that has caused their cells to express red fluorescent protein. (Credit: Howard Hughes Medical Institute (HHMI), Yale University).

Aplicaciones de los transposones

Enhancer trap activation tagging Promotor especifico de anteras

Obtencin de mutantes dominantes

Etiquetado y pesca de genes con transposones

Transposn Tn 5 de E. coli Conjugacin con Rhizobium y transposicin desde el plsmido suicida al genoma

gen nif expresa nitrogenasa

Rhizobium nif+ (fijadora)

Sonda de Tn 5 (etiqueta para identificacin de clones con genes nif ) gen nif mutado no expresa nitrogenasa mutante nif(no fijadora)

Aislamiento DNA y corte con ER Confeccin de genoteca de Rhizobium nif- y plaqueo

Rescate del plsmido o plasmid rescue

Cortes con enzima de restriccin

AmpR

Ori

R mp

Or i

secuenciacin

ADN genmico adyacente