Analyse microbiologique des aliments Le dnombrement de la Flore Msophile Arobie Totale (FMAT)

Analyse microbiologique des aliments/Le dnombrement de la Flore Msophile Arobie Totale (FMAT)

La FMAT est un indicateur d'hygine important. En effet, elle permet d'valuer le nombre dUFC (Unit Formant colonie) prsent dans un produit ou sur une surface. Ce dnombrement se fait 30C ce qui permet de dnombrer trois grands types de flore:

la flore thermophile T optimale de croissance 45C La flore msophile T optimale de croissance entre 20C et 40C La flore psychrophile T optimale de croissance 20C

Comme il s'agit d'un milieu ordinaire, la plupart des micro-organismes peuvent se dvelopper, sauf ceux qui sont exigeants et les Micro-organismes anarobie stricts (contact avec l'air). Il est donc prfrable de parler de Flore Msophile Arobie 30C que de "flore totale". L'unit est l'UFC (Unit Formant colonie) car une colonie observable sur la glose peut venir d'un micro-organisme isol, ou bien d'une spore ou d'une microcolonie. [modifier]Dnombrement de la FMAT d'une surface Il existe plusieurs techniques possible, et sont relativement simples. Selon les inconvnients et les avantages de Chacune de ces techniques, le responsable qualit devra faire des choix [modifier]Dnombrement avec une Boite de contact Rodac Les boites sont des boites de ptris prtes l'emploi, avec un milieu glos PCA, lgrement bomb et bord surlev que l'on pose directement sur une surface. Du TTC est souvent ajout la glose pour stopper les actions des dtergent et dsinfectant et donc compter les survivants. Une Boite couvre la surface de 20cm. Les boites sont directement incubes 30C pendant 24 H, puis le nombre de colonies observables est compt.

Avantages : peu de manipulations, rapide, et simple. Inconvnients : ne peut se faire que sur des surface planes, pleines, et sches pour viter une culture en nappe.

[modifier]Dnombrement avec les couvillons Les couvillons ressemblent des cotons tiges. Aprs avoir t tremp dans un tube d'ure tryptophane additionn de TTC, il suffit de le frotter contre la surface et le remettre dans le tube. Aprs une agitation vive, 1 mL de solution est tal sur une glose PCA puis est incub 30C pendant 24 H. Ensuite un dnombrement est effectu.

Avantages: permet d'aller dans les coins difficiles d'accs.

inconvnients : besoin d'un talon de surface mtallique qui devra tre strilis chaque fois , (ce qui n'est pas toujours faisable), une partie seulement des micro-organismes est dnombre(une partie reste dans les fibres de l'couvillon).

[modifier]Dnombrement par mesure de L'ATP mtrie Cette mthode se base sur le fait que les micro-organismes produisent de ATP, molcule qui permet de fournir de l'nergie aux cellules, et qui a la proprit de se dgrader rapidement quand la cellule meurt. L'ATP sous l'action d'une lucifrase, produit un photon (c'est la mme raction qui permet aux lucioles de briller) en considrant que 1 Photon est mise par un ATP , et que la quantit d'ATP est pareille pour chaque micro-organismes, on peut mesurer la lumire mise et dnombrer les microbes. Le prlvement se fait toujours grce un couvillon adapt. L'embout est alors plong dans une cuve de solution enzymatique qui extrait l'ATP et la fait ragir. La Cuve est passe dans un spectrophotomtre qui donne directement le rsultat.

Avantages : Rapide ; moins de 2 minutes, accs aux zones difficiles, Inconvnients : Investissement financier important, applicable uniquement aux surfaces et pour certains liquides (eau de rinage, vin, ...).

[modifier]Dnombrement de la FMAT d'un produit Dans un produit alimentaire, on ne peut pas utiliser ces techniques: les micro-organismes sont prsents dans la totalit du produit et non pas seulement en surface. Il faut donc prlever un chantillon du produit qui puisse permettre d'apprcier la qualit microbiologique de l'aliment (ex : dans un plat en sauce, on prendra dans les chantillons analyser aussi bien des lgumes, de la viande et de la sauce.) [modifier]Dnombrement de la FMAT d'un produit alimentaire solide

dilutions successives

Prenons l'exemple du yaourt: Cet aliment est riche en bactrie lactique. Si vous taliez 1 g de yaourt pur sur une glose, vous obtiendriez une culture bactrienne en nappe (il vous serait impossible de compter les colonies) Pour viter ce problme, il faut effectuer des dilutions successives.On a pour habitude de prlever 10g de produit de faon homogne que l'on dilue dans 90g d'ure-tryptophane contenu dans un sac spcial.(dilution dite pondral, en admettant que la masse volumique du diluant est gal 1 c'est dire la masse volumique de l'eau; ce qui veut dire que 1 cm3 de diluant correspond 1g. On peut peser 25g de produit dilu au 1/10 dans le cas de la recherche des salmonelles (absence dans 25 g, plan deux classe), ce qui peut aussi servir aux autres recherches. Comme les micro-organismes peuvent tre partout dans l'aliment, l'aliment va tre broy dans une machine, puis il faudra procder comme ce qui suit

Attention : une dilution au 1/10 est dj ralise quand 10 g de produit sont mis dans 90 mL d'ure-tryptophane
[modifier]Technique des dilutions successives Prenez un mL du sac avec une pipette gradue, et transverser le dans un tube contenant 9 mL d'ure tryptophane. Vous venez de raliser une dilution au 1/10. C'est dire que si votre lait pur contenait 10 000 bactries/ mL votre second tube en contient maintenant 1 000 / mL. Renouveler l'opration en changeant de pipette et en versant de nouveau 1 mL dans un nouveau tube d'ure tryptophane et ainsi de suite jusqu' ce que la concentration en bactrie devienne relativement faible. On considre que les colonies sont dnombrables si leur nombre est compris entre 30 et 300. Au dessus 300, elles sont indnombrables, en dessous 30 on considre qu'elles sont trop rares pour tre dnombres. Pour savoir quand arrter les dilutions, rfrez vous aux normes des produits.

Remarques : Les dilutions doivent tre faites en milieu aseptique. Homognisez bien vos tubes entre chaque dilution. Une fois que vous avez fait votre dernire dilution, vous devez homogniser votre tube et jeter 1 mL de dilution pour avoir une galit statistique entre les tubes. Annotez vos tubes : (E, pour chantillon puis 1, 2,3,....)
[Modifier]Mise en glose PCA

Mise en glose PCA

]] Comme nous l'avons vu prcdemment, la glose PCA est une glose standard pour le dnombrement. Commencez par annoter vos boites de ptri, elles doivent contenir sur la tranche :

la date la dilution qui va tre utilise la temprature d'incubation la dure d'incubation

Attention: il devra y avoir deux boites par dilution.

Prenez une nouvelle pipette et partir de la dernire dilution, prlevez 1 ml de dilution que vous rpartirez en goutte au fond de la boite correspondante, et renouvelez l'opration pour la seconde boite. Sans changer de pipette remontez la dilution suprieure, et recommencez et ce ainsi de suite jusqu' la premire dilution. Recouvrez les gouttes d'une couche de glose PCA en surfusion, et homognisez grce des mouvements circulaires.

Attention: trop chaude, la glose tue les bactries.

Quand la glose a refroidi, passer une seconde couche de glose PCA ce qui aura pour effet d'immobiliser les bactries, et donc de former des colonies bien dfinies. Mettez incuber 30C pendant 24 H [Modifier]Dnombrement de la FMAT d'un produit liquide

Mme chose que prcdemment, mais il suffira de prendre 1 ml d'chantillon et le diluer directement. Il faudra retenir, la sortie de l'tuve, le nombre de dilutions positives, ce qui nous donnera un nombre plusieurs chiffres (ex: 210) reporter dans un tableau pour obtenir le nombre exact du dnombrement. [Modifier]Lecture des rsultats Nous considrons que vous avez obtenu les rsultats suivants pour l'analyse de 25 g de yaourt.

chantillon pur Dilution Boite 1 Indnombrable Boite 2 Indnombrable Indnombrable Indnombrable

Dilution 295 280

Dilution 34 31

Dilution 3 4

Il est impossible de compter une boite contenant plus de 300 colonies. Le risque d'erreur est trop important donc elles sont cartes. Les boites contenant moins de 30 colonies sont elles aussi cartes, les colonies sont trop rares et peuvent induire en erreur.

La formule mathmatique suivante peut tre utilise:

: Nombre d'UFC par gramme ou par mL de produit initial : Somme des colonies des boites interprtables : volume de solution dpose (1ml) : nombre de boites considr la premire dilution retenue : nombre de boite considr la seconde dilution retenue : facteur de la premire dilution retenue

Application numrique:

UFC par gramme de yaourt