Digestin con enzimas de restriccin

Las enzimas de restriccin, tambin conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material gentico a partir de una secuencia que reconocen. Estas enzimas reconocen una secuencia de 4-8 pares de bases en una secuencia de ADN de doble banda; este sitio de reconocimiento se denomina sitio de restriccin, Estas enzimas se encuentran en muchas especies de bacterias, donde funcionan in vivo como parte de un sistema de restriccin y modificacin. Este sistema es anlogo a un sistema inmune, y le permite distinguir a la bacteria entre su propio ADN y el ADN exgeno, siendo este ltimo degradado por la enzima de restriccin. El ADN propio no es reconocido por sus enzimas de restriccin, puesto que previamente lo ha modificado por mutilacin a travs de la accin de una metiltransferasa (enzima que transfiere grupos metilo desde S-adenosilmetionina a bases especficas). La mayora de las enzimas de restriccin reconocen secuencias palindrmicas (secuencias que se leen igual en direccin 5-3 en cualquiera de las 2 hebras) (Fig. 1)

5'- G A A T T C -3' 3'- C T T A A G -5'

Figura 1. Ejemplo de secuencia palindrmica

Existen 3 tipos de enzimas de restriccin:

Tipo I y Tipo III: a. Tienen actividad de restriccin (cortan) y modificacin (metilan). b. Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea corriente arriba o corriente abajo. Las Tipo III

cortan de 5-8 bases antes o despus de la secuencia que reconocen. c. Necesitan ATP para moverse a travs de la molcula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.

Tipo II: a. Slo tienen actividad de restriccin. b. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen. c. Slo requieren Mg++ como cofactor. d. No necesitan ATP. Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extradas, su nombre est dado segn el gnero y la especie de la bacteria de donde se aisl por primera vez esta enzima. La primera letra representa el gnero de la bacteria, las prximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un nmero al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa. Ej: Eco RI E = gnero Escherichia co = especie coli R = cepa RV 13 I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

Las enzimas de restriccin al cortar el DNA pueden producir 2 tipos de cortes: 1. Cohesivos o con puntas pegajosas:

2. Abruptos o con puntas roma:

Existen varios factores que son crticos al trabajar con enzimas de restriccin y que pueden afectar la actividad de las mismas: 1. Pureza del DNA la reaccin de enzimas es muy dependiente de la pureza, contaminantes como protenas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS, altas concentraciones de sal, etc. inhiben la endonucleasa. 2. Temperatura y pH las enzimas son muy sensitivas a temperatura y pH en lo que respecta a su estabilidad y actividad. 3. ADNasas Las ADNasas degradan el DNA en presencia de Mg++ . 4. Contaminantes con carga (-). 5. DNA contaminado con otro DNA. 6. Grados de metilacin algunas endonucleasas son inhibidas por metilacin. 7. Tipo de molcula de DNA si el DNA no tiene la secuencia que es reconocida por la enzima accesible, esta no puede cortar el material gentico (ej. si el DNA est superenrrollado el lugar de restriccin no va a estar accesible para la enzima). 8. Buffer adecuado este provee el ambiente que necesita la enzima para trabajar en condiciones ptimas.

9. Tiempo de digestin un tiempo muy corto de digestin puede resultar en una digestin parcial (no total) de la enzima.

Las enzimas de restriccin son una herramienta bsica de la biologa molecular y tienen muchas aplicaciones. Algunas de ellas son: 1. Hacer mapa de restriccin de un plsmido o bacterifago. 2. Fragmentar DNA genmico para separacin de electroforesis y Southern Blot. 3. Generacin de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en Southerny Northern blotting. 4. Generacin de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creacin de DNA recombinante. 5. Diagnstico molecular

Importante: Una unidad de enzima se define como la cantidad de enzima que se necesita para cortar 1g de DNA en 1 hora.

Metodologa En la prctica de har una digestin del bacterifago lambda con tres enzimas de restriccin: PstI, EcoRI y HindIII.