lvarez Fernndez G, Bustos Jaimes I, Castaeda Patln C, Guevara Fonseca J, Vzquez Meza H. (eds). Mensaje Bioqumico, Vol.

XXXV, 2011, 159-172. Depto de Bioqumica, Fac de Medicina, Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Cd Universitaria, Mxico, DF, MXICO. (http://bq.unam.mx/mensajebioquimico) (ISSN-0188-137X)

APLICACIONES DE RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR EN EL ESTUDIO DE PROTENAS

APPLICATIONS OF NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE FOR PROTEIN ANALYSIS Carlos Amero
Centro de Investigaciones Qumicas - Universidad Autnoma del Estado de Morelos Av. Universidad 1001. Col. Chamilpa. Cuernavaca, Morelos. C. P. 62209 carlosamero@gmail.com

Resumen La Resonancia magntica nuclear (RMN) constituye una tcnica de vital importancia en la investigacin cientfica. La RMN es, junto con la difraccin de rayos X, la nica metodologa que puede usarse para determinar la estructura molecular de macromolculas con alta resolucin. Frente a la difraccin de rayos X, no obstante, la RMN presenta varias ventajas; una de ellas es que permite determinar la estructura molecular en solucin. La RMN permite, adems, estudiar de manera eficaz y sencilla las interacciones entre biomolculas. Tambin es la nica metodologa que permite el estudio de la dinmica de macromolculas con resolucin atmica en varias escalas de tiempos. En este artculo se presenta una pequea introduccin a la metodologa de RMN aplicada a protenas. Palabras clave: Resonancia magntica nuclear, protenas, estructura, dinmica, interacciones.

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MENSAJE BIOQUMICO, Vol. XXXV (2011) Abstract Nuclear Magnetic Resonance (NMR) is a technique of vital importance in scientific research. NMR is, together with X Ray difraction, the only methodology that can be used to determine the molecular structure of macromolecules with high resolution. Nevertheless, NMR offers several advantages over X Ray difraction; it allows to determine the molecular structure in solution. In addition, NMR allows to efficiently and easily study biomolecules interactions. And finally, it is also the only methodology allowing for the study of macromolecule dynamics with atomic resolution in several time scales. This article offers a brief introduction to NMR methodology applied to protein study.

Keywords: Nuclear magnetic resonance, proteins, structure, dynamics, interactions.

1. RMN de protenas Desde los inicios de la Resonancia Magntica Nuclear a mediados del siglo pasado, esta tcnica ha tenido un gran desarrollo y ha adquirido, con el paso del tiempo, una importancia fundamental en el estudio de molculas biolgicas. La RMN es a menudo errneamente considerada como una simple alternativa a la cristalografa de rayos X para la determinacin de estructuras de protenas; sin embargo, el poder y la utilidad de la RMN para el estudio de molculas biolgicas y sus interacciones se extiende mucho ms all de este uso [1]. La espectroscopia de RMN es una tcnica nica por sus capacidades para estudiar con resolucin atmica sitios de unin de ligados, cambios conformacionales y dinmica molecular [2-4]. La aplicacin de la espectroscopia de RMN requiere a menudo cantidades sustanciales de protena, con una alta estabilidad temporal. Debido a esto, el primer paso necesario para efectuar un estudio por RMN de protenas consiste en la optimizacin de la produccin de la muestra (expresin, purificacin y condiciones de la solucin del sistema) [1,3,5]. La Figura 1, describe los pasos fundamentales para efectuar un estudio por RMN de un sistema biolgico. 1.1 Preparacin de muestras La produccin de cada protena es distinta, y cada una requiere la seleccin de los distintos sistemas de expresin (vectores) y de las distintas tcnicas de purificacin (intercambio inico, cromatografa de afinidad, etc.) [1,5,6]. Una vez que se consigue la produccin y la purificacin de la muestra, es necesario evaluar las condiciones en las cuales se llevarn a cabo los experimentos (amortiguadores). Es preciso seleccionar condiciones que preserven la estructura correcta y la estabilidad de la muestra por el mayor tiempo posible y que permitan, al mismo tiempo, obtener la mayor seal posible. Algunas protenas requieren elevadas concentraciones de iones para mantenerse estables en altas concentraciones. Sin embargo, el uso de estas altas concentraciones de sal y amortiguadores con alta conductividad degrada la relacin seal-ruido en la RMN [7]. Se han propuesto varios protocolos para reducir la concentracin de sal en la muestra con el fin de aumentar la sensibilidad, manteniendo la estabilidad de la misma. Algunas de estas soluciones son, por ejemplo, el aumento de la concentracin del amortiguador hasta que se alcanza la fuerza inica deseada [7], o la adicin de solutos para sustituir la sal (Ej.Gly, Arg y Glu) [8,9]. 160

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Figura 1. Esquema de los principales pasos en un estudio de protenas por RMN. Este esquema es una sobre simplificacin.

La viabilidad y la estabilidad de la muestra, en general, se pueden evaluar con un espectro de protones en una dimensin. Las seales intensas y delgadas, con una dispersin baja en el desplazamiento qumico, a menudo son indicadores de una protena desplegada [2,3]. Tambin el registro de espectros de protn variando las condiciones del sistema permite determinar los amortiguadores ptimos y evaluar la seal. En la Figura 2 se muestra el espectro de una protena plegada en una dimensin y se indican los correspondientes grupos funcionales que producen la seal.

Figura 2. Espectro RMN de protn en una dimensin (Amiloidasa). Se muestran las principales regiones de un espectro de protenas. El espectro fue adquirido en amortiguador Tris en H2O. Supresin de agua usando esquema WATERGATE [2].

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MENSAJE BIOQUMICO, Vol. XXXV (2011) Los experimentos de RMN requieren con frecuencia un largo tiempo de adquisicin (das/semanas), lo que explica que la estabilidad de la muestra sea uno de los parmetros ms relevantes. Para probar la estabilidad en una protena se pueden registrar espectros durante perodos de tiempos distintos y evaluar los cambios en la seal. Si los espectros se mantienen sin cambio con el tiempo, esto indicar que la muestra es estable. Por el contrario, la prdida de la seal y la aparicin de nuevas seales con picos delgados e intensos son indicativos de degradacin, ya que los pequeos fragmentos peptdicos formados por la degradacin son los que dan lugar a estas seales intensas. Otra manera de evaluar las condiciones de la muestra para estimar el estado oligomrico de la protena es mediante la medicin del coeficiente de la difusin traslacional [10] (en base a experimentos distintos tambin es posible la medicin del coeficiente de difusin rotacional). A pesar de que el espectro en una dimensin es de utilidad, la espectroscopia de RMN se basa en el uso de experimentos heteronucleares multidimensionales, para los que se requiere el uso de protenas marcadas con istopos enriquecidos de ncleos RMN-activos (15N y 13C) [1,11]. Para efectuar este marcaje se necesita producir las protenas de forma recombinante en un sistemas de expresin bacteriana, en el cual se utilizan medios de cultivo mnimos con 15Ncloruro de amonio y/o 13C-glucosa como nica fuente de nitrgeno y/o carbono, respectivamente [2,5]. Para muestras que presentan una relajacin transversal rpida, normalmente protenas de mayor peso molecular, se usa comnmente la deuteracin para reducir al mnimo las interacciones entre los espines que producen la relajacin [11-13]. El mtodo es igualmente sencillo, pero en este se requiere que la protena sea producida en cultivos utilizando medios deuterados [11-13]. Durante la purificacin, la protena se encuentra en contacto con disolventes protonados (es decir soluciones con H2O). Los grupos amidas son re-protonados en estas condiciones y, como resultado, se observarn seales para estos residuos. La Figura 3 muestra un espectro 1H-15N de correlacin heteronuclear en dos dimensiones (TROSY, transverse relaxation optimized spectroscopy [2,3]), donde se observa una seal para cada protn unido a un nitrgeno, es decir, una seal para todos los residuos de la protena (excepto la prolina) y algunas cadenas laterales. 1.2 Estrategias de asignacin Un requisito para casi cualquier estudio por RMN es la asignacin de las seales. Este proceso consiste en la identificacin de los residuos que generan cada seal en el espectro de RMN. La metodologa estndar para llevar a cabo este proceso se basa en la utilizacin de experimentos de triple resonancia que proporcionan una correlacin selectiva entre protones, carbonos y nitrgenos [14,15]. Por ende, para efectuar este tipo de experimentos, se requiere un doble marcaje (15N y 13C) y cada experimento tiene un tiempo de duracin promedio de entre 2 y 3 das. Estos experimentos se pueden entender como una extensin natural del espectro de correlacin heteronuclear en 2D mostrado antes. Aqu, adems de la correlacin del protn unido al nitrgeno, tambin se correlacionan los distintos carbonos. De esta manera se obtiene una seal en el espectro para cada protn unido a un nitrgeno que, a su vez, est unido a un carbono [3]. La Figura 4 muestra los tipos ms comunes de experimento de triple resonancia de RMN, indicando los ncleos que son correlacionados entre s [1,2].

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Figura 3. Espectro 2D 1H-15N TROSY NMR (Cre recombinase) a 25C. El espectro muestra una buena dispersin, indicando que la protena est plegada.

Figura 4. Experimentos tpicos de triple resonancia para la asignacin de la cadena principal. Los recuadros rojos y azules representan los ncleos que son correlacionados en los experimentos. Los recuadros grises representan el recorrido de la magnetizacin en el experimento sin la adquisicin de informacin para estos ncleos.

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MENSAJE BIOQUMICO, Vol. XXXV (2011) Por ejemplo, el experimento HNCACB correlaciona los protones amida y los nitrgenos con los carbonos C
y C del mismo residuo (correlacin intra). As mismo, se obtiene tambin seal para la correlacin con los carbonos de los residuos anteriores (correlacin inter) (Figura 5). Por lo tanto, para cada residuo para el que se tiene una seal en el experimento de correlacin en 2D, (HSQC -por Heteronuclear Single Quantum Coherence- o TROSY), se espera observar cuatro seales: la correspondiente a las correlaciones H,N,C
y H,N,C del mismo residuo; y las correlaciones H,N,C
-1 y H,N,C-1 con el residuo anterior (con la excepcin de la Glicina, donde se esperan solamente dos seales para los C
). Para el anlisis del experimento, los datos se muestran en forma de bandas o franjas, de forma que cada franja corresponde a una seal observada en el espectro de 2 dimensiones (Figura 3). El proceso de asignacin consiste en identificar las seal para los C
y C de una franja con los correspondiente C
-1 y C-1 de otra franja. De esta forma se conectan entre s distintas franjas, que corresponden a sectores de aminocidos contiguos entre s. Puesto que en ocasiones la seal del HNCACB es incompleta o resulta difcil distinguir entre seales correspondientes al mismo residuo o al residuo anterior. Para complementar la informacin se realiza normalmente el experimento CBCACONH [3]. En este experimento la transferencia de magnetizacin ocurre a travs de los CO, con lo cual la correlacin es exclusivamente entre el protn y el nitrgeno de un residuo con los C
y C del residuo anterior. Los dos espectros se suelen analizar en conjunto y se muestran como franjas alternas.

Figura 5. Esquema del proceso de asignacin utilizando datos del HNCACB. El primer paso corresponde a la extraccin de franjas individuales para cada seal en la proyeccin del 1H-15N plano. El proceso de asignacin consiste en identificar franjas con correlacin intra y franjas con correlacin inter que tengan el mismo valor. Las conexiones entre franjas corresponden a fragmentos de la cadena principal polipeptdica.

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Amero Debido a que algunos residuos producen seales en sitios caractersticos del espectro (Figura 6), se utilizan estos datos particulares para conocer los aminocido de las conexiones entre franjas. Es posible, entonces, identificar algunos tipos de aminocidos en los segmento de conexiones y, por lo tanto, es posible determinar su posicin en la secuencia. Por ejemplo, en el segmento de HNCACB que se muestra en la Figura 5, hay dos Ala y una Thr, los cuales tiene C
caractersticas (basndonos en los valores de la Figura 6). As se puede inferir que el segmento corresponde a la secuencia de xAxAxxxT, donde x representa cualquier otro aminocido. Ahora se busca dentro de toda la secuencia primaria de la protena este patrn y, si resulta nico, se pueden conocer los valores para los aminocidos denotados por x. En la prctica los experimentos no son perfectos y resulta necesario realizar diferentes experimentos para obtener una asignacin completa de nuestra protena. Se utilizan entonces experimentos complementarios para obtener toda la asignacin de las seales de la cadena principal (Figura 4). Este paso es esencial para la continuacin de cualquier anlisis multidimensional de RMN (Figura 1).

Figura 6. Valor promedio para el desplazamiento qumico de los carbonos. El largo de la barra corresponde a una desviacin estndar. Diferentes colores representan diferentes carbonos. Datos extrados de BMRB [16].

1.3 Asignacin de la cadena lateral La asignacin de la cadena lateral no es un requisito para analizar datos de RMN, pero s lo es para la determinacin de estructuras. Esta asignacin se basa en la combinacin de experimentos tipo cosy (correlation spectroscopy)/tocsy (total correlation spectroscopy) y experimentos de triple resonancia [2,3]. En estos experimentos, se correlacionan nuestros grupos aminos, ya asignados, con todos los carbonos de la cadena lateral. Como ya se tiene la asignacin de los aminos, es relativamente sencillo finalizar la asignacin de los carbonos. 165

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Sin embargo, en muchos casos estos experimentos de anlisis sencillo no producen buenas seales y se tiene que realizar experimentos tipo HCCH [2]. La diferencia general es que, en los experimentos descritos anteriormente, la asignacin comienza desde los grupos aminos; en cambio, en estos experimentos la asignacin debe de comenzar desde un protn unido a un carbono, lo cual hace que el anlisis se complique substancialmente. Los experimentos tipo cosy nos dan solamente correlaciones entre ncleos contiguos, mientras que los de tipo tocsy nos proporcionan todas las correlaciones [3]. 2. Determinacin de estructuras La principal fuente de informacin estructural derivada de la RMN sigue siendo la medicin de distancias entre protones, medidas a partir de experimentos basados en el efecto de Nuclear Overhauser (NOE) [2,3]. Este efecto se debe a la interaccin entre dipolos a travs del espacio y es dependiente de la distancia entre los ncleos. De esta manera, al cuantificar el efecto, simplemente cuantificando intensidades de seales, se puede inferir la distancia entre ncleos y as conocer experimentalmente las distancias entre distintos residuos de la protena. Este efecto es de corto alcance con lo cual solamente permite la medicin de distancias menores a 5 ; la magnitud del NOE es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre los ncleos (NOE ~ 1/r6) [2,3]. En un experimento de NOEs, solamente obtendremos seales cruzadas para ncleos que estn cerca en el espacio (Figura 7).

Figura 7. Ejemplo de un NOE observado en una protena. En el espectro de NOE, se observa una seal para los residuos A-B, lo cual implica que en nuestro modelo esta distancia medida experimentalmente tiene que ser satisfecha.

Los distintos patrones observados en los experimentos NOE son indicadores de determinados elementos de estructura secundaria (Figura 8) y proporcionan una informacin muy valiosa que puede ser usada en el proceso de asignacin [2]. Al analizar estos experimentos, se obtienen listas de distancias entre ncleos para la protena, y estos datos experimentales tiene que ser satisfechos por un modelo estructural. Utilizando simulacin por computadora [17], se introduce esta gran lista de distancias, junto con una cadena de aminocidos totalmente desplegada, a una temperatura alta. El proceso para obtener un modelo estructural consiste en disminuir poco a poco la temperatura mientras los distintos campos de fuerza actan (datos experimentales). Este proceso se repite varias veces obteniendo as una gran cantidad de estructuras, para asegurarse de que no se est dentro de un mnimo local. Al finalizar este proceso se selecciona una familia de estructuras que mejor coincidan con las restricciones medidas experimentalmente. Cuando se cuenta con un gran nmero de restricciones experimentales de distancia, es posible por este proceso obtener el plegamiento bien definido de una protena. 166

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Aunque la principal fuente de informacin para obtener la estructura tridimensional es esta lista de distancias experimentales, es posible incluir otros tipos de restricciones estructurales utilizados en RMN, como son: restricciones angulares, enlaces de hidrgeno, acoplamientos dipolares e incluso desplazamientos qumicos [17]. 3. Interacciones moleculares Una de las aplicaciones ms comunes y ms poderosas de la RMN biomolecular consiste en la identificacin de sitios de unin de diferentes ligandos [18-20]. La determinacin de estos sitios de interaccin es fundamental para la comprensin de enzimas, la regulacin de genes, el desarrollo de frmacos y muchos otros procesos biolgicos. Aunque es posible determinar la estructura tridimensional, de nuevo, para estos complejos, por lo general esto requiere de mucho tiempo, es una operacin costosa y solo es posible para sistemas donde la interaccin con el ligando es fuerte, mientras que muchas interacciones biolgicamente relevantes son necesariamente dbiles para garantizar la reversibilidad. Sin embargo, la espectroscopia de RMN permite determinar las interfaces de interaccin de manera sencilla y rpida, sin necesidad de determinar de nuevo la estructura [1,2]. Es importante destacar que estos mtodos son a menudo aplicables a sistemas de interaccin fuerte y dbil y pueden incluso aplicarse en grandes ensambles [1].

Figura 8. NOEs observados comnmente para estructuras secundarias. Las lineas rojas y azules representan los NOEs observados en elementos de estructura secundaria, mientras que su grosor representa la intensidad. La distancias promedias entre ncleos se muestra en la tabla. Datos extrados de BMRB [16].

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MENSAJE BIOQUMICO, Vol. XXXV (2011) La frecuencia de resonancia, es decir, la posicin de la seal en el espectro de un ncleo de RMN activo es determinada por su entorno qumico local, con lo cual, si este entorno qumico llegase a cambiar, tambin lo hara la posicin en el espectro. Si imaginamos una protena que interacciona con un cido nucleico [20] (Figura 9), es claro que los residuos en el sitio de interaccin cambian de entorno qumico cuando interaccionan, lo cual da como resultado un cambio en la seal de los residuos interactuantes. El aspecto importante aqu es que, para los residuos que no se encuentran en la zona de interaccin, el entorno qumico permanece igual y, por lo tanto, tambin permanece igual su posicin en el espectro. Esto nos permite saber qu residuos estn en los sitios de interaccin. El anlisis de estas perturbaciones del desplazamiento qumico se efecta mediante el registro de espectros de correlacin heteronuclear de dos dimensiones (HSQC) de la molcula libre y de la molcula que interacciona con el ligando. Debido a su versatilidad y sencillez, la perturbacin espectral es quiz la tcnica de RMN ms ampliamente utilizada para la determinacin de interfaces de enlace. Sin embargo, es importante tener en cuenta la naturaleza de la informacin obtenida. Si la interaccin da lugar a cambios conformacionales, estos cambios darn lugar a cambios en el entorno qumico y podran producir perturbaciones espectrales para residuos lejanos a la interfaz, lo que complica el anlisis. Cabe mencionar que si este es el caso, existen otros experimentos de RMN para la completa determinacin de sitios de interaccin [1]. Los desplazamientos qumicos tambin pueden ser tiles en la generacin de modelos estructurales de los complejos moleculares cuando se combina con la informacin estructural y con servidores de acoplamiento (docking).

Figura 9. Esquema de experimento de perturbaciones de desplazamiento qumico. a) Espectro en dos dimensiones de 1H-15N correlacin. Residuo correspondiente a las seales b) Se muestra el mismo espectro (negro) y el cambio que presenta (rojo) cuando la protena interacciona con el ligando. Las seales de los residuos en la interface sufren una perturbacin en la posicin. Mientras que seales de residuos que no estn en la interface permanecen en el mismo sitio.

4. Dinmica de Protenas Una de las mayores fortalezas de la espectroscopia de RMN es que permite la medicin del movimiento molecular con resolucin atmica en un gran rango de escalas de tiempo [1,21168

Amero 23]. Actualmente, comienza a ser reconocida la importancia fundamental de la dinmica para la funcin de una protena. El comportamiento dinmico que afecta las funciones biolgicas abarca una amplia gama de escalas de tiempo, que pueden caracterizarse experimentalmente usando una variedad de mtodos basados en RMN [21,24]. Los procesos dinmicos en una enzima incluyen la re-orientacin de cadenas laterales, el movimiento de asas (loops), los cambios de estructura secundaria, los movimientos de dominio, la unin del ligando, el plegado y la tasa de recambio [25,26]. Con relacin a otras tcnicas para estudiar la dinmica, la RMN permite el monitoreo simultneo de todos los residuos de la protena, adems de que no existe la necesidad de insertar una sonda especfica en el sistema que perturbe las propiedades esenciales de su estructura, su dinmica y su funcin. Experimentalmente, el procedimiento para la medicin de la dinmica molecular depende de la duracin de los movimientos moleculares. La Figura 10 muestra los rangos que pueden ser estudiados por mtodos de RMN y algunos de los mecanismos moleculares que requieren de movimiento para su funcionamiento. El modelo ms simple de un proceso dinmico es la interconversin entre dos estados conformaciones A
B. Por RMN, los dos estados tienen entornos qumicos diferentes, por lo que tendrn desplazamientos qumicos A y B con una diferencia  = | A - B | [1, 2]. Es importante mencionar que la seal en el espectro de RMN depender de las poblaciones de cada uno de estos dos estados, PA y PB, y los valores relativos de la interconversin kB kA.

Figura 10. Escala de tiempos, desde pseg hasta segundos. Se muestran los distintos experimentos de RMN para la medicin de dinmica y la lnea roja representa las escalas de tiempo donde son aplicables. Los mecanismos moleculares que requieren de movimiento van acompaados de una lnea azul. La lnea verde representa el tiempo de correlacin de las protenas (tiempo de rotacin). T1 y T2 corresponden a tiempos de relajacin.

Ahora bien, si el cambio es lento (kex <<|  |) las seales de ambos estados se observan, reflejando sus distintos entornos, intensidades y formas. Esto se debe a que la interconversin A
B no es significativa durante el perodo de deteccin del experimento de RMN. En este lmite, la intensidad de cada seal nos informa directamente sobre la poblacin de esa especie. En el lmite opuesto de intercambio rpido se observar nicamente una sola seal, que corresponde al promedio de los desplazamientos qumicos y sus poblaciones. Esto se debe a que la rpida interconversin A
B ocurre mucho mas deprisa que el experimento y la deteccin. En cambio, en un intercambio intermedio, la interconversin ocurre en el tiempo que se adquiere el experimento de RMN. Los novedosos experimentos de dispersin miden la dinmica en esta escala de tiempo, que corresponde a una escala de tiempo de milisegundo [27,28]. El experimento consiste en una serie de ecos en los cuales, si el entorno qumico no cambia, el eco tiene como efecto que no haya cambios en la seal. Sin embargo, si al comenzar el experimento 169

MENSAJE BIOQUMICO, Vol. XXXV (2011) un residuo se encuentra en una posicin A y despus del eco ha cambiado a un estado B, su entorno ha cambiado y el eco no produce el efecto deseado, con lo cual la seal cambia. De acuerdo a estos cambios, es posible determinar el movimiento de intercambio de A
B y as conocer el movimiento para cada residuo en la protena. Otro ejemplo de experimento para la medicin de la dinmica por RMN son las mediciones en tiempo-real [29,30]. En una escala de tiempo lenta, se pretende ver el intercambio de A
B mientras este tiene lugar. Para este tipo de estudios, se utilizan experimentos con un tiempo de repeticin corto. El objetivo es repetir el experimento mientras sucede esta interconversin y as poder describir el movimiento, esto es, describir los cambios mientras van sucediendo, puesto que los espectros van cambiando al mismo tiempo. Esta metodologa ha sido utilizada con xito para el estudio del plegamiento de protenas [29,30]. 5. Otras avances 5.1 Acoplamientos dipolares residuales Durante la ltima dcada, se han desarrollado mtodos para la medicin de acoplamientos dipolares residuales (RDC) en molculas parcialmente alineadas. Estas mediciones permiten obtener informacin sobre las orientaciones relativas de los distintos ncleos, dominios o molculas [31,32]. Una gran ventaja de este enfoque experimental es que el requisito para el anlisis de este tipo de informacin es simplemente la asignacin de la cadena principal. Los acoplamientos dipolares surgen de la interaccin entre dos dipolos y el campo magntico. Aunque esta interaccin es dominante en los espectros de RMN en estado slido, en solucin, debido al rpido giro de las protenas, estos acoplamientos se promedian a cero. Sin embargo, si se obliga a la molcula a tener una orientacin dbilmente preferencial en relacin con el campo magntico externo, los acoplamientos dejan de tener un valor de cero y es posible obtener informacin estructural y de dinmica [19,33]. El mtodo ms comn de obtener estos acoplamientos dipolares residuales es mediante la comparacin de espectros de correlacin del sistema libre y el sistema alineado en experimentos acoplados. La diferencia entre el acoplamiento escalar en estos dos espectros corresponde al acoplamiento dipolar [34]. 5.2 Efectos paramagnticos en la RMN Las tcnicas paramagnticas han surgido como un complemento a la resonancia tradicional. La presencia de electrones no apareados en un ion paramagntico tiene grandes efectos sobre el espectro de RMN, proporciona un conjunto de informacin angular y de distancias inexistente por otras fuentes [35-38]. Estos efectos pueden detectarse como acoplamientos dipolares residuales (RDC) [39], relajacin paramagntica (PRE) [39-41] y cambios de pseudocontacto qumico (PCS) [39,42]. La anisotropa magntica de los iones paramagnticos alinea parcialmente la protena con el campo magntico externo, dando lugar a acoplamientos dipolares residuales, sin la necesidad de un medio de alineacin. Mientras que el efecto de relajacin paramagntica (PRE) se basa en el incremento de la relajacin debida a la anisotropa magntica del ion paramagntico, este efecto depende de la distancia. De esta forma, los cambios en la relajacin de cada residuo puede ser correlacionados con la distancia de cada uno de estos tomos al centro paramagntico. En la prctica, las resonancias de los residuos muy prximos al centro paramagntico sufren una relajacin demasiado rpida y se pierde toda seal. 170

Amero El ltimo efecto paramagntico tiene que ver con el cambio de desplazamiento qumico debido a los electrones no apareados y al momento dipolar del centro paramagntico. Este cambio en la frecuencia se llama cambio de pseudocontacto qumico (PCS) y es un cambio generalmente pequeo que slo afecta a los residuos cerca del centro paramagntico. Este cambio depende de la distancia y del ngulo, con lo cual se puede utilizar para obtener informacin de la protena. Conclusiones La RMN ha sido una tcnica de gran repercusin cientfica en las ltimas 3 dcadas y, debido al desarrollo continuo de la teora, la instrumentacin y la aparicin de nuevas aplicaciones, es lgico esperar que tenga una contribucin incluso mayor en el futuro. Desde el punto de vista prctico, la limitacin ms importante de la RMN es su poca sensibilidad, que convierte a la RMN en una tcnica costosa en tiempo y en cantidad de material, aunque estas exigencias han ido reducindose con el tiempo. La RMN resulta tambin econmicamente costosa debido a la tecnologa necesaria para fabricar los instrumentos de alto campo magntico y las muestras marcadas isotpicamente. A pesar de estas limitaciones, la RMN sigue siendo la nica tcnica que puede detectar simultneamente entre decenas y cientos de sondas por molcula, lo que permite obtener una informacin muy completa que no puede igualarse en estudios por medio de otras tecnologas. Referencias 1. Downing K (Editor) (2004) Protein NMR Techniques , Humana Press. 2. Cavanagh j, Fairbrother j, Palmer a , Skelton N, Rance M (2006) Protein NMR Spectroscopy 2nd edition, Academic Press. 3. Rule, G.S. (2005) Fundamentals of Protein NMR Spectroscopy, Springer. 4. Levitt, M.H.(2008) Spin Dynamics: Basics of Nuclear Magnetic Resonance, Wiley. 5. Bagby, S., Tong, K.I. & Ikura, M. (2001) Meth. Enzymol. 339, 20-41 6. Kremer, W. & Kalbitzer, H.R. (2001) Meth. Enzymol. 339, 3-19 7. Kelly, A.E., Ou, H.D., Withers, R. & Dtsch, V. (2002) J. Am. Chem. Soc. 124, 12013-9 8. Hautbergue, G.M. & Golovanov, A.P. (2008) J. Magn. Reson. 191 , 335-339. 9. Lane, A.N. & Arumugam, S. (2005) J. Magn. Reson. 173, 339-43 10. William S Price (1997) Magn. Reson.: Educ. J. 9, 299-336 11. Lian L. Y. & Middleton D. A. (2001) Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 39, 171-191 12. Gardner, K.H. & Kay, L.E. (1998) Annu Rev Biophys Biomol Struct 27, 357-406 13. LeMaster, D.M. (1990) Q. Rev. Biophys. 23, 133-74 14. Sattler, M., Schleucher, J. & Griesinger, C. (1999) Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectros. 34, 93-158 15. Salzmann, M., Pervushin, K., Wider, G., Senn, H. & Wthrich, K. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13585-90 16. Schwieters, C.D., Kuszewski, J.J., Tjandra, N. & Clore, G.M. (2003) J. Magn. Reson. 160, 65-73 17. Zuiderweg, E.R.P. (2002) Biochemistry 41, 1-7 18. Rooney, L.M., Sachchidanand & Werner, J.M. (2004) Methods Mol. Biol. 278, 123-38 19. Foster, M.P., Wuttke, D.S., Clemens, K.R., Jahnke, W., Radhakrishnan, I., Tennant, L. et al. (1998) J. Biomol. NMR 12, 51-71 20. Kay, L.E. (1998) Biochem. Cell Biol. 76, 145-52 21. Kern, D., Eisenmesser, E.Z. & Wolf-Watz, M. (2005) Meth. Enzymol. 394, 507-524 22. Kempf, J.G. & Loria, J.P. (2003) Cell Biochem. Biophys. 37, 187-211 23. Kay, L.E., Torchia, D.A. & Bax, A. (1989) Biochemistry 28, 8972-9 171

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Semblanza del Dr. Carlos Amero

El Dr. Amero obtuvo la Licenciatura en Fsica en la Universidad Nacional Autnoma de Mxico (UNAM) y el doctorado en Biofsica en The Ohio State University (OSU), en Ohio, Estados Unidos, en 2008. Su investigacin doctoral se centr en la Resonancia Magntica Nuclear (RMN) aplicada al estudio de protenas. Posteriormente realiz una estancia de investigacin postdoctoral de dos aos en el Institut de Biologie Structurale Jean-Pierre Ebel (IBS), del Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) en Grenoble, Francia, donde continu la misma lnea de investigacin. En 2010 el Dr. Amero regres a Mxico para incorporarse como profesor- investigador en el Centro de Investigaciones Qumicas (CIQ) de la Universidad Autnoma del Estado de Morelos (UAEM). Actualmente est a cargo del Laboratorio de Bioquimica y Resonancia Magntica Nuclear para el estudio de protenas (www.labrmn.com).

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