LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA PARA INGENIEROS

PRCTICA # 4

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Luis Pjaro, Carolina Len

Universidad de Antioquia Departamento de Ingeniera Qumica

Marco Terico. Las enzimas son protenas globulares compuestas por polmeros de aminocidos, que regulan actuando como catalizadores en la mayor parte de las reacciones metablicas de los seres vivos. Con su accin, regulan la velocidad de muchas reacciones qumicas implicadas en este proceso. Segn sea su composicin molecular, se distinguen dos tipos de enzimas: uno estrictamente proteico y otro constituido por la unin, ms o menos fuerte, de una molcula proteica o apoenzima y de una parte no proteica o cofactor; este tipo recibe el nombre de holoenzima. Las enzimas se requieren en pequeas cantidades, ya que estas son solo un soporte a la reaccin y no participan en ella, por lo tanto, no se consumen en la reaccin, para eso existen los mecanismos de control de la actividad enzimtica. - Mecanismos de control de la actividad enzimtica:

La temperatura: Si se suministra a una reaccin enzimtica energa en forma de calor, al ser captada por las molculas es transformada en energa cintica. Ello favorece la movilidad de estas molculas y por tanto el nmero de encuentros se incrementa. Si la temperatura es excesiva, la enzima, cuya estructura es protenica, se desnaturaliza perdiendo totalmente sus propiedades, de forma que la actividad enzimtica cesa. pH: Todas las enzimas tienen dos valores lmite de pH entre los cuales son efectivas. Traspasados estos valores, la enzima se desnaturaliza y deja de actuar. Entre estos dos valores extremos se sita un pH en el cual la enzima alcanza una efectividad mxima: Es el llamado pH ptimo. Este es independiente del punto isoelctrico de la molcula enzimtica, es decir, cuando sta no tiene carga global, ya que hay tantos radicales cidos como bsicos. El pH ptimo est condicionado por el tipo de enzima y de sustrato, debido a que el pH influye en el grado de ionizacin de los radicales del sustrato. Concentracin del sustrato: En toda reaccin enzimtica, si se incrementa la concentracin del sustrato se produce un aumento de la velocidad de formacin del producto, tendente a restablecer el equilibrio qumico entre la concentracin del sustrato y la del producto. En este proceso la enzima no vara. Se puede explicar considerando que, al abundar ms las molculas del sustrato, son ms probables los encuentros o choques entre estas molculas y la enzima. Si la concentracin del sustrato es excesiva, la velocidad de reaccin no aumentar, debido a que todas las enzimas estn en forma de complejo (E-S). En ciertos casos se producir un tipo se inhibicin enzimtica en la que dos sustratos se unen a la vez a la enzima, inutilizndola. Activadores: Algunos iones favorecen la unin de la enzima con el sustrato; por ejemplo, la enzima fosforilasa, que regula la formacin de ATP a partir de ADP y un grupo fosfato (H3PO4) y que se suele representar como Pi(Fosfato orgnico), se ve activada por la presencia de iones magnesio Mg+ 2.

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Inhibidores: Hay inhibicin cuando disminuye la actividad y la eficacia de una enzima. Las sustancias distintas del sustrato que tienen este efecto se denominan inhibidores (I). La inhibicin irreversible o envenenamiento de la enzima tiene lugar cuando el inhibidor se fija permanentemente al centro activo inutilizndolo al alterar su estructura. La inhibicin reversible tiene lugar cuando no se inutiliza el centro activo, sino que solo se impide su normal funcionamiento.

Coagulacin Enzimtica En la industria quesera el mtodo ms empleado es la coagulacin enzimtica de la leche. Consiste en aadir a la leche un enzima que tiene la propiedad de coagular el complejo casena. En esta reaccin el fosfonato clcico que se encuentra en forma soluble en la leche, se transforma por la accin de una enzima coagulante en fosfoparacaseinato de calcio insoluble. El calcio y el fsforo desempean un papel fundamental en el mecanismo de coagulacin y forman parte del gel de casena, lo que confiere al cogulo unas propiedades especiales: es compacto, flexible, elstico, impermeable y contrctil. Estas caractersticas tienen una gran influencia en le desuerado y endurecimiento de la cuajada porque le permiten soportar las intervenciones mecnicas durante el proceso de la fabricacin. Cuajo El cuajo natural, llamado renina, es una enzima proteoltica segregada por la mucosa gstrica del cuarto estmago (cuajar) de los terneros, cabritos y corderos antes del destete. Esta secrecin se produce en forma de un precursor inactivo, la pro-renina, que en medio neutro no tiene actividad enzimtica pero que en medio cido se transforma rpidamente en renina activa. El cuajo contiene dos enzimas: la quimiosina, que es el componente principal y la pepsina. Despus del destete, disminuye la produccin de quimiosina y la pepsina pasa a ser el componente mayoritario. El cuajo se extrae de los cuajares mantenindolos a remojo en salmuera. Para el uso comercial, se preparan soluciones purificadas de fuerza estandarizada en las que se ajusta el pH, la sal y el color y a las que se aade agentes conservantes. La actividad proteoltica del cuajo se ejerce sobre la casena, principalmente, y otras protenas. Por lo tanto realiza dos acciones fundamentales. La primera accin es la de provocar la desestabilizacin de las micelas de casena rompiendo las casena k en un punto determinado de su molcula: el enlace peptdico entre el aminocido fenilalanina y su vecino, que es una metionina. Generalmente la fuerza del cuajo se mide por la eficacia al romper este enlace, accin que produce la coagulacin de la leche. En la casena k hay unos 164 enlaces peptdicos que pueden ser atacados, adems de los que hay en las otras fracciones de las micelas. El segundo papel del cuajo es el de hidrolizar estos enlaces siguiendo un orden especfico que es caracterstico de la enzima empleada. Esta accin secundaria sobre las protenas comienza lentamente despus de la coagulacin y contina durante la maduracin del queso. Esta accin, junto con la de las proteasas nativas de la leche, las proteasas de la flora original y las del fermento, contribuye al desarrollo de algunas de las caractersticas de textura y sabor del queso.

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Procedimiento, Clculos y Resultados 1. Se prepar una solucin de 10ml cuajo 1%p/v y de esa solucin se agrego 1 ml a 5 ml de leche. A temperatura ambiente se observa la formacin de cuajo a los 6minutos con 2 seg. A 35C se observa la formacin de cuajo al minuto con 20 seg. A T de ebullicin se observa la formacin de cuajo a los 36 segundos.

Ilustracin 1. Datos Fuerza de cuajo vs Temperatura. Cuajo natural.

Se puede observar que con el cuajo a medida que aumenta la temperatura la fuerza de cuajo aumenta siendo ms rpida la formacin del cuajo

2. Se prepar una solucin de 10 ml de renina 0.05% p/vy de esa solucin se agreg 1 ml a 5 ml de leche. A temperatura ambiente se observa la formacin de cuajo a los 7 minutos con 47seg.

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A 35C se observa la formacin de cuajo al minuto con 20seg. A T de ebullicin no se observ formacin de cuajo.

Ilustracin 2. Fuerza de cuajo vs Temperatura. Cuajo renina concentrada.

Se puede concluir que la renina acta mejor a 35 C que a temperatura ambiente, pero a altas temperaturas se desnaturaliza perdiendo totalmente sus propiedades, de forma que la actividad enzimtica cesa. Actividad enzimtica En esta parte del informe no se cont con una curva de calibracin que pudiera relacionar la absorbancia vs velocidad reaccin y as poder utilizar la ecuacin:

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Sin embargo se obtuvieron los siguientes datos:

Tabla 1. Composicin de la muestra a trabajar.

Compuesto Blanco Muestra Muestra + Inhibidor Buffer 1 ml 1 ml 1 ml Agua 0.4 ml 0.36 ml 0.16 ml metil 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml Extracto enzimtico 0.04 ml 0.04ml Inhibidor 0.2 ml

Los datos tabulados para esta prctica fueron:

Tabla 2. Medicin de la absorbancia en muestra sin inhibidor.

Muestra Absorbancia Tiempo (s) Absorbancia Tiempo (s) 0.088 0 0.326 660 0.093 30 0.335 690 0.104 60 0.343 720 0.117 90 0.351 750 0.132 120 0.359 780 0.143 150 0.366 810 0.155 180 0.374 840 0.168 210 0.380 870 0.180 240 0.388 900 0.194 270 0.395 930 0.206 300 0.402 960 0.218 330 0.404 990 .0229 360 0.406 1020 0.240 390 0.406 1050 0.251 420 0.406 1080 0.261 450 0.406 1110 0.271 480 0.281 510 0.290 540 0.299 570 0.309 600 0.318 630

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Ilustracin 3. Datos de Absorbancia vs Tiempo. Muestra sin inhibidor.

Datos obtenidos para muestra + inhibidor:

Tabla 3. Composicin de la muestra + inhibidor a trabajar.

Muestra + Inhibidor Absorbancia Tiempo (s) Absorbancia Tiempo (s) Absorbancia Tiempo (s) 0.185 0 0.214 480 0.263 960 0.152 30 0.214 510 0.267 990 0.137 60 0.214 540 0.268 1020 0.133 90 0.220 570 0.271 1050 0.141 120 0.226 600 0.271 1080 0.150 150 0.230 630 0.271 1110 0.157 180 0.234 660 0.271 1140 0.165 210 0.235 690 0.170 240 0.239 720 0.177 270 0.242 750 0.184 300 0.247 780 0.191 330 0.249 810 0.196 360 0.253 840 0.201 390 0.255 870 0.206 420 0.258 900 0.211 450 0.261 930

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Ilustracin 4. Datos de Absorbancia vs Tiempo. Muestra + Inhibidor.

Anlisis de resultado Como se puede apreciar en las grficas el cuajo de renina tiene un alto desempeo a comparacin del cuajo natural cuando se trabaja a temperaturas entre los (30 y 35) C esto se debe a que el cuajo renina est en mayor concentracin que el cuajo natural, pero al aumentar la temperatura ms all de los 35C la fuerza de cuajo renina decrece de forma rpida debido a la desnaturalizacin que sta sufre al aumentar dicho parmetro, mientras que el cuajo natural aumenta su fuerza de cuajo al cambiar sta condicin en el medio. En cuanto los datos de absorbancia se manifiesta un aumento significativo a medida que trascurre el tiempo cuando slo se trata de la muestra, en comparacin a muestra + inhibidor, que reporta un aumento leve de absorbancia, esto es de esperarse puesto que esa es la funcin del inhibidor; es decir, trata de disminuir la interaccin entre la muestra y su medio de soporte. Como se manifest desde un principio, al no tener una curva de calibracin no se pudieron obtener los datos de actividad enzimtica, debido a la falta de una ecuacin que relacionara los datos de absorbancia y velocidad de reaccin.

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Conclusiones Para el proceso de cuajar la leche y con ello obtener quesito o cuajada es mejor utilizar el cuajo de renina en vez del cuajo natural, principalmente porque los costos de operacin son bajos, ya que no se requiere precalentadores que lleven a la leche a temperaturas superiores a 35C. Es importante anotar que a diferencia del cuajo natural el cuajo de renina es concentrado, por tanto es ms factible que se d una mejor cuajizacin por as decirlo, en comparacin del cuajo natural. En cuanto a la actividad enzimtica es de suponer que la muestra sin inhibidor tendr una mayor actividad en comparacin a la muestra con inhibidor puesto que este ltimo tiene la habilidad de reducir la actividad de las muestra. En la ltima grfica se observa un decrecimiento leve y luego un aumento en la absorbancia, se cree que hubo una pequea contaminacin en la muestra lo que hizo aparecer esta perturbacin en la grfica.