EXTRACCIN DE ADN (cido desoxirribonucleico) INTRODUCCIN La extraccin de ADN tiene como objetivo principal obtener la mayor cantidad posible

del ADN de alto peso molecular, libre de protenas, carbohidratos y otros inhibidores de enzimas. Diferentes mtodos de extraccin han sido descritos para el aislamiento de cidos nucleicos, aqu se trabajara especficamente con la extraccin de AND vegetal, la presencia de algunos metabolitos secundarios y como interfieren estos en el aislamiento del ADN. En plantas y hongos la pared celular es la primera barreras para la extraccin, es necesario degradarla empleando mtodos fsicos o qumicos. Los mtodos fsicos son los ms empleados, especialmente la congelacin y la maceracin. Para bacterias y clulas desprovistas de pared, se emplean soluciones ricas en detergentes o enzimas, para destruir las membranas celulares. Una vez se ha destruido la membrana celular debe emplearse detergentes y soluciones de alta (o baja) fuerza inica para permitir que el ADN se libere en el buffer. La inhibicin de nucleasas es un factor critico, esta se alcanza empleando buffer1 con pHs poco ptimos para accin de estas enzimas y adicionando agentes quelantes de iones como el EDTA (Ethylen diamin tetre acetato). Posteriormente se utilizan sustancias que desnaturalicen y separen las protenas del ADN como fenol y cloroformo. Finalmente en ADN es precipitado con alcohol y centrifugacin. El ADN libre de protenas y otros compuestos celulares se disuelve en un buffer2 . Algunos tejidos pueden poseer altas concentraciones de polisacridos, para separarlos de los cidos nucleicos se puede emplear mayor cantidad de buffer extraccin o sustancias como CTAB ( cetil trimethyammonium) que colabora en la precipitacin del ADN. El pH durante el proceso de extraccin debe ser ptimo, que evite la accin de enzimas degradativas del cido nucleico. La mayora de los procedimientos de extraccin de ADN emplean soluciones taponadas con pH 7.0-9.0. Para cuantificacin del ADN se hace uso de la espectrofotometra (absorbancia a una longitud de honda de 260nm), o la observacin directa con fluorescencia despus de teir el gel de extraccin con bromuro de etidio.(mtodo de saram wrap, mtodo del plato de agarosa, mtodo del minigel) o por fluorometria. OBJETIVO Comprender los procedimientos necesarios para extraer ADN de buena calidad y alta pureza. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS Material del que se extrae el DNA ( se recomienda utilizar material fresco), bistur, mortero, balanza analtica, tubos de ensayo con tapa, centrfuga refrigerada, bao agua (60 C), pipetas de 5 ml, micropipetas y puntas, tubos eppendorf, espectrofotmetro. Buffer 1 50mM Tris-HCl (pH8.0) 5mM EDTA 350mM Sorbitol 0.1% Mercaptoetanol

 10% polyetilienglicol Buffer 2 50 mM Tris- HCl (pH 8.0) 5 mM EDTA 350 mM Sorbitol 0.1% Mercaptoetanol 1% Sodio Sarkosyl 710 mM NaCl 0.1% Cetiltrimetilamonio. (CTAB) Otros reactivos Cloroformo, alcohol Isoamilico, iIsopropanol, etanol 70% PROCEDIMIENTO No. 1 Pesar 70mg del tejido, llevarlo a mortero y macerar. Agregar 1ml de buffer1por cada 70mg de la muestra Agitar Centrifugar a 5000 rpm /10min en fri a 4C Descartar sobrenadante Resuspender slido agregando 500l del buffer2 por cada 70mg de la muestra. Incubar a 60 C por 15 minutos Adicionar un volumen de cloroformo: alcohol isoamilico en una proporcin 24:1 Centrifugar a 5000rpm/10mit Transferir la fase acuosa a otro tubo Agregar 2 volmenes de isopropanol fri -20 C (para precipitar el ADN) Centrifugar y eliminar el Alcohol (isopropanol) Lavar con Etanol 70% Centrifugar y eliminar el Alcohol (etanol) Resuspender el precipitado en 300l de Tris-Edta, agitar suavemente. Leer espectrofotmetro a 260nm. (50g/ml ADN absorbancia de 1) Nota: Para saber que tan puro es el ADN obtenido realizamos la siguiente relacin ADN/Proteina =260nm/280nm Un valor menor de 1.8 indica contaminacin por protenas. MINIPREPARACION DE DNA PLASMIDICO INTRODUCCION Por lo general, los plsmidos son purificados a partir de cultivos (Crecidos en medio lquido que contienen el antibitico apropiado) que han sido inoculados con una colonia bacteriana, tomada de un plato de agar. Muchos de los plsmidos comnmente utilizados, se replican a muy altas tasas y pueden ser purificados en grandes cantidades a partir de bacterias transformadas que alcanzan la fase logartmica del crecimiento, en medio lquido. Las bacterias se recuperan por centrifugacin y son lisadas por uno de varios mtodos, incluyendo tratamiento con detergentes inicos y no inicos, solventes orgnicos, lcali o calor. En la presente prctica utilizaremos el mtodo de lisis alcalina para la preparacin de DNA plasmdico, debido a su facilidad de implementacin, rapidez y las altas cantidades de DNA obtenido.

OBJETIVO Obtener DNA plasmdico de alta calidad a partir de cultivos bacterianos. MATERIALES Y MTODOS 1. Tome con un palillo o punta de micropipeta una colonia bacteriana e inoclela en un tubo falcn de 50 ml que contenga 5 ml de medio de cultivo LB suplementado con 50 ug/ml de ampicilina. Ponga el cultivo en agitacin a 250 RPM y 37oC toda la noche 2. Centrifugue 1.5mL del cultivo bacteriano crecido toda la noche a 12000 rpm por 1 minuto. Retire el sobrenadante. 3. Resuspenda el precipitado de clulas bacterianas en 100 ul de tampn GTE (50 mM Glucosa, 25 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, pH 8). Mezcle hasta que el precipitado quede totalmente disuelto, utilice un vortex si es necesario. 4. Adicione 200 ul de solucin de lisis (0.2 M NaOH, 1% SDS). Invierta el tubo unas 6 a 8 veces. 5. INMEDIATAMENTE adicione 150 ul de una solucin 5M de acetato de potasio pH 4.8. Esta solucin neutraliza el NaOH utilizado en el paso previo de lisis precipitando simultneamente el DNA genmico y el SDS. Centrifugue a 12000 rpm por 1 minuto. 6. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf, teniendo especial cuidado en no remover el precipitado blanco. Precipite los cidos nucleicos utilizando un volumen de isopropanol e incubando en hielo por 10 minutos. Centrifugue a 12000 rpm por 1 minuto. 7. Retire el sobrenadante de isopropanol y coloque con cuidado el tubo eppendorf boca abajo sobre una toalla de papel por 15 o 20 minutos (Debe asegurarse que todo el isopropanol se haya eliminado). Disuelva el precipitado en 400 ul de tampn TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7.5). Adicione 10ul de solucin de RNAse A (Stock de 20 mg/ml almacenado a -20 C), agite e incube a 37 C por 20 a 30 minutos para digerir todo el RNA. 8. Extraiga las protenas de la solucin que contiene el DNA del plasmido utilizando un volumen igual de FCI (fenol/cloroformo/alcohol isoamilico). Agite vigorosamente por 30 o 60 segundos. Centrifugue a 12000 rpm a temperatura ambiente. Observe que la fase orgnica de FCI se localiza en la parte baja del tubo eppendorf. 9. Remueva la fase acuosa (superior) que contiene el DNA del plasmado, cuidadosamente, sin alterar la interfase blanca que se encuentra por encima de la fase orgnica de FCI y transfirala a un tubo limpio de 1.5 ml. 10. Para precipitar el DNA del plasmado, adicione 100 _l de acetato de amonio 7.5 M y 1 ml de etanol, incube a -20C por 15 minutos. Centrifugue a 12000 rpm por cinco minutes a temperatura ambiente. 11. Retire el sobrenadante de etanol y coloque con cuidado el tubo eppendorf boca abajo sobre una toalla de papel por 15 o 20 minutos (Debe asegurarse que todo el etanol se haya eliminado). Disuelva el precipitado de DNA en 50 ul de

Tampn TE. Corra una electroforesis en gel de agarosa al 1% y observe el DNA del plasmido. Para cuantificar el DNA realice una dilucin 1/200 y lea la absorbancia a 260nm. Medio LB agar(1 litro): Bacto triptona 10.0 g Extracto de levadura 5.0 g NaCl 10.0 g Agite hasta que los solutos se hayan disuelto completamente. Ajuste a pH 7.0 con NaOH 5N. Autoclave por 20 o 30 minutos. Solucin GTE Solucin stock volumen concentracin final Glucosa estril 40% 2.27 ml 50 mM EDTA 0.5 M, pH 8 2.0 ml 10 mM Tris-HCl 1M, pH 8 2.5 ml 25 mM ddH2O estril 93.23 ml Total 100.0 ml Utilice todas las soluciones stock estriles. Almacene a 4C. Solucin de lisis NaOH/SDS Solucin stock volumen concentracin final NaOH 1N 2.0 ml 0.2 N SDS 10% 1.0 ml 1% ddH2O estril 7.0 ml Total 10.0 ml Solucin de acetato de potasio 5 M. Solucin stock volumen Acetato de potasio 5 M 60 ml cido actico glacial 11.5 ml ddH2O 28.5 ml Total: 100 ml Esterilice con filtro. La solucin resultante es 3 M de potasio y 5 M de acetato y tiene un pH aproximado de 4.8. Tampn TE : Tris-Cl 10 mM, pH 7.5 + EDTA 1 mM Se deben tener soluciones stock de Tris-Cl 1M (pH 7.5) y 500 mM de EDTA (pH 8.0). GLOSARIO ADN: cido desoxirribonucleico (ADN), material gentico de todos los organismos celulares y casi todos los virus. El ADN lleva la informacin necesaria para dirigir la sntesis de protenas y la replicacin. Tris: (hidroximetil amino metano) Es un tampn biolgico. Su principal funcin es mantener el pH de la solucin estable (7.0 8.0). EDTA: (Etilen diamino tetra actico) Es un agente quelante. Se encarga de remover iones de magnesio que son esenciales para preservar l estructura de la envoltura celular. Cloroformo: Solvente orgnico que se encarga de remover residuos de lpidos y fenoles en la muestra. Colabora en la desnaturalizacin de protenas. CTAB: cetil trimetil bromuro de amonio, detergente cationico que solubiliza las membranas celulares, dependiendo de la concentracin de cloruro de sodio en

la solucin, permite la remocin de polisacridos y otras macromolculas. El CTAB forma un complejo con el ADN y por lo tanto puede ser empleado para precipitar ADN selectivamente. Cloruro de sodio: colabora para equilibrar las fuerzas inicas. Mercaptoetanol: Antioxidante. Forma enlaces disulfuro, forma disulfuros mixtos con las cadenas laterales de las protenas. Evita color pardo en ADN extrado. Alcohol Isoamilico: Antioxidante. Reduce o imposibilita la formacin de interfases durante la extraccin de ADN. Etanol, Isopropanol: Alcoholes. En presencia de sales (temperatura de aproximadamente 20 C ) precipita ADN, reduciendo la constante dielctrica del solvente.