Western blot

Western blot
El Western blot, o inmunoblot, es una tcnica analtica usada para detectar protenas especficas en una muestra determinada (una mezcla compleja de protenas, como un extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las protenas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana adsorbente (tpicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la protena de inters con anticuerpos especficos contra ella.[][] Finalmente, se detecta la unin antgeno-anticuerpo por actividad enzimtica, fluorescencia entre otros mtodos. De esta forma se puede estudiar la presencia de la protena en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras protenas.

Resultado del Western blot: una membrana con las protenas separadas en la electroforesis unidas, de las que slo se disciernen aquellas contra las se ha aadido un anticuerpo.

Esta tcnica es hoy en da imprescindible en varios campos de la biologa, como la biologa molecular, la bioqumica, la biotecnologa o la inmunologa. Existe toda una industria especializada en la venta de anticuerpos (monoclonales y policlonales) contra decenas de miles de protenas diferentes.[1][2] El Western blot fue desarrollado en el laboratorio de George Stark, en la Universidad de Stanford.[] El nombre (Western, occidental en ingls) le fue dado por W. Neal Burnette,[3] y consiste en un juego de palabras con una tcnica anloga pero que usa DNA, el Southern (sureo) blot, que en este caso debe su nombre a su descubridor, Edwin Southern. Otras tcnicas que fueron nombradas siguiendo este criterio son el Northern blot (en el que se separa e identifica RNA), el Eastern blot, el Southwestern blot.

Pasos del Western blot

Preparacin de la muestra
Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular: Una pequea cantidad del tejido se introduce en un buffer de extraccin. Despus se procede a homogeneizarlos, sea con una licuadora (para grandes volmenes de muestra), con un homogenizador (para muestras pequeas) o por sonicacin. Por ltimo se centrifuga para obtener las protenas en el sobrenadante, la fraccin no precipitada.[4] Las clulas pueden lisarse por uno de esos mtodos mecnicos. Tambin pueden usarse detergentes, sales o tampones que favorezcan la lisis y solubilicen las protenas. A veces se aaden inhibidores de proteasas y fosfatasas que evitan la digestin por las enzimas celulares de las protenas y de las fosfoprotenas, respectivamente.[5] Los materiales deben estar a bajas temperaturas (~4C) para evitar la desnaturalizacin proteica. Para separar protenas de compartimentos y orgnulos celulares es preciso combinar tcnicas mecnicas - como filtraciones y centrifugaciones - y bioqumicas.

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Electroforesis en gel
Las protenas de la muestra sern separadas mediante una electroforesis en gel en funcin de uno o varios (en las electroforesis bidimensionales) de estos criterios: punto isoelctrico, peso molecular y carga elctrica. La naturaleza de la separacin depende del tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel. La electroforesis en gel ms frecuente, conocida como SDS-PAGE, hace uso de gel de poliacrilamida y de tampn con dodecilsulfato (SDS). En esta tcnica las protenas sufren un tratamiento por agentes reductores que provocan la prdida de las estructuras secundaria y terciaria (por ejemplo, reduciendo los puentes disulfuro (S-S) a grupos tiol (SH + SH)) y mantiene los polipptidos en este estado desnaturalizado. De este modo, la estructura tridimensional de las protenas no influye en la electroforesis, y pueden separarse nicamente en funcin del tamao.

Transferencia
Para que las protenas sean accesibles a la deteccin por anticuerpos, se las transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF. Esta transferencia puede realizarse por difusin, por vaco o por accin de un campo elctrico (electrotransferencia). Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por su capacidad de unir protenas de forma inespecfica (es decir, se adhieren a todas las protenas con idntica afinidad): las membranas de nitrocelulosa, aunque no se conoce exactamente la naturaleza de las interacciones membrana protena, se sabe con cierta seguridad que se trata de interacciones no covalentes de naturaleza hidrfba. en las membranas de PVDF, la unin est basada en interacciones hidrofbicas y de dipolos entre la membrana y las protenas. Como particularidad, deben ser humedecidas con metanol o etanol antes de exponerlas a tampones acuosos, debido a su alta hidrofobicidad y a la ausencia de surfactantes.

Western blot Las membranas de nitrocelulosa son ms baratas que las de PVDF, aunque son tambin ms frgiles, tienden a tornarse quebradizas cuando se secan y no pueden ser sometidas a varias pruebas consecutivas.[6] Tambin pueden usarse otros soportes, como las membranas de nylon o el papel activado. Sin embargo, no son tan usados como los anteriores. Difusin simple En la transferencia por difusin simple se ponen en contacto las superficies del gel electrofortico y de la membrana y, sobre sta, se dispone un taco de papeles de filtro. Con el fin de facilitar el proceso, puede ponerse encima una placa de vidrio y un objeto pesado. Este montaje se coloca sobre un tampn, que ascender por capilaridad hacia el papel de filtro arrastrando consigo las protenas. Al llegar a la membrana, quedarn retenidas en ella. Este protocolo no est muy extendido actualmente, puesto que la cantidad de protena transferida a la membrana es muy baja, mucho menor que con la electrotransferencia. Sin embargo, ha ganado cierta popularidad por una modificacin que permite obtener mltiples transferencias de un mismo gel, permitiendo de esta forma realizar varias pruebas sobre geles virtualmente idnticos. Esta modificacin es viable cuando no es necesaria una transferencia cuantitativa de protena.[7][] Transferencia al vaco En esta tcnica, se aade el poder de succin de una bomba conectada a un sistema de secado de planchas de gel, el cual lleva las protenas desde el gel hasta la superficie de la membrana de nitrocelulosa.[8] Este mtodo es vlido tanto para protenas de alto como de bajo peso molecular.[] Electrotransferencia Este mtodo se basa en una corriente elctrica y un tampn de transferencia para llevar las protenas desde el gel hacia la membrana. Para ello, se apilan en el orden descrito los siguientes elementos (del polo negativo o ctodo al positivo o nodo): esponja, varios papeles de filtro empapados en buffer de transferencia, gel, membrana, ms papeles de filtro empapados y otra esponja. Este montaje, llamado coloquialmente sandwich, se dispone en el sistema de transferencia y se aplica una corriente elctrica, de magnitud acorde a los materiales empleados, al tiempo disponible,... Las protenas del gel se desplazan hacia el polo positivo y quedan atrapadas por la membrana.[]

Tras la transferencia, se suele proceder a la tincin del gel con Coomassie Brilliant Blue (un colorante de protenas) para comprobar que en efecto una parte importante del material proteico ha pasado a la membrana. La electrotransferencia es hoy en da la tcnica de transferencia ms usada gracias a la velocidad del proceso y al elevado porcentaje de protena que se transfiere (especialmente en comparacin con las otras tcnicas).

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Bloqueo
Puesto que la membrana escogida necesita poder unirse protenas de forma inespecfica, es preciso bloquear los lugares de unin que han quedado libres tras la transferencia. En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza proteica) empleado en la deteccin puede unirse a ellos, dificultando la distincin del complejo antgeno-antgeno que se forma con la protena que se busca. En el bloqueo se incuba la membrana con una solucin de protenas, tpicamente de albmina de suero bovino o ASB (ms conocida por sus siglas en ingls, BSA), leche en polvo o casena, con una diminuta fraccin de detergente, como Tween 20 o Tritn X-100. Las protenas en solucin se unirn a todos aquellos lugares de unin de la membrana que no estn ya ocupados por las transferidas desde el gel. De este modo, el anticuerpo slo podr unirse a su antgeno especfico, reduciendo as el ruido de fondo y los falsos positivos.

Deteccin
En la deteccin se comprueba la presencia en la membrana de una determinada protena. Para ello se emplea un anticuerpo especfico contra ella unido a enzima que, en presencia de su sustrato, catalice una reaccin colorimtrica (produce color). De esta forma, se hace patente la unin con el antgeno, la protena, as como su localizacin. El proceso tradicionalmente se ha realizado en dos pasos, aunque ahora es posible la deteccin en un nico paso, lo cual es til en ciertos campos. Mtodo en dos pasos Los dos pasos de los que consta este mtodo de deteccin son la unin del anticuerpo primario y la del anticuerpo secundario.

Anticuerpo primario El primer paso es permitir la unin de un anticuerpo primario contra la protena buscada. ste se consigue inoculando dicha protena o uno de sus eptopos (regiones capaces de desencadenar la respuesta inmune) a un animal (como un conejo o una cabra) o a un cultivo celular. Adems, como la protena se ha desnaturalizado durante la electroforesis en gel, es preciso que el anticuerpo reconozca especficamente la protena desnaturalizada. La presencia del elemento extrao debera desencadenar una respuesta inmune cuyo resultado incluya la produccin del anticuerpo, primario en este caso, ya que reconoce la protena. As pues, tras el bloqueo se incuba en agitacin moderada la membrana con una disolucin de anticuerpo primario (0,5 - 5 g/ml). La disolucin consiste en un tampn salino, con cloruro de sodio por lo general, con un pH cercano a la neutralidad, una pequea fraccin de detergente y, en ocasiones, protenas disueltas, como ASB o leche en polvo. La membrana junto con la disolucin pueden ser introducidas en una pequea bolsa de plstico. Esta incubacin

Western blot puede durar desde 30 minutos a una noche entera. La temperatura a la que puede tener lugar es igualmente variada; en general, las elevadas temperaturas favorecen las uniones ms especficas. Anticuerpo secundario Tras lavar la membrana para eliminar el anticuerpo primario que no se ha unido, se expone al anticuerpo secundario. ste reconoce de forma especfica una regin concreta del anticuerpo primario. Suelen estar marcados para ser detectables (unin a biotina, a una enzima reporter como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa del rbano (HRP), etc.). Varios de estos anticuerpos se unirn a cada anticuerpo primario, amplificando la seal. Los anticuerpos secundarios proceden de animales o de cultivos de hibridomas de origen animal. Por ejemplo, un anticuerpo secundario "anti-ratn" es aquel capaz de reconoces casi todos los anticuerpos primarios obtenidos de ratones. Igualmente hay anticuerpos "anti-cabra", "anti-conejo"... Su uso presenta ciertas ventajas: econmicas, por permitir a un laboratorio compartir una nica fuente de anticuerpos secundarios; y dan resultados mucho ms consistentes. Tambin pueden emplearse protenas no anticuerpos, como las protenas A y G. Radiactividad Es una alternativa al uso de anticuerpos secundarios que consiste en protenas de unin a anticuerpos marcadas radiactivamente. Esta protena puede ser, por ejemplo, la protena A de Staphylococcus aureus[9] o la protena G[10] marcadas con 125I (un istopo radiactivo de yodo). Las protenas mencionadas tienen la capacidad de unirse a anticuerpos de forma inespecfica, por lo que se unirn al primario. Este mtodo apenas se usa actualmente, por o la protena G para ser detectada. ser significativamente ms caro, peligroso y lento que los otros. Sin embargo, presenta ventajas: es muy sensible, da bandas que permiten una precisa cuantificacin; y la imagen autoradiogrfica puede ser reproducida fcilmente y con gran precisin para su publicacin.[]
Unin del anticuerpo primario a la protena de inters. A este se une la protena A

Western blot Anticuerpo unido a una enzima Un mecanismo de deteccin simple y rpido consiste en unir al anticuerpo secundario enzimas que catalicen la transformacin de un sustrato soluble en un producto insoluble. De esta forma, en el posterior anlisis quedar una mancha all donde est la protena de inters. Enzimas como la peroxidasa de rbano (HRP) o una fosfatasa alcalina son vlidas para este mecanismo.[] Por ejemplo, la peroxidasa puede catalizar la oxidacin del 4-cloronaftol en presencia de un 1% de perxido de hidrgeno. El resultado es que el primero forma una mancha de precipitado oscura.[11] Otras tcnicas, como ELISA o ELISPOT, tambin emplean este mtodo de deteccin.

Anticuerpo secundario unido a la peroxidasa de rbano, de modo que puede catalizar la reaccin quimioluminiscente.

Otro mtodo ms sofisticado consiste en la unin de una enzima que catalice una reaccin quimioluminiscente. Las anteriormente citadas enzimas tambin son vlidas en este caso, aunque cada una usa un agente quimioluminiscente diferente. En el caso de la peroxidasa, cataliza la oxidacin del luminol en presencia de perxido de hidrgeno. La fosfatasa alcalina cataliza la defosforilacin del adamantil-1-2-dioxetano fosfato, reaccin que genera luz. Si se coloca una pelcula fotogrfica sobre la membrana, la exposicin a la luz que se desprende en la reaccin permite detectar la actividad enzimtica. Marcaje fluorescente Otro mtodo basado en el mismo principio emplea anticuerpos unidos a fluorocromos del infrarrojo cercano, como el 2 - metoxi - 2,4 - difenil - 3 (2H) - furanona (MDPF) o el rojo Nilo. Estos compuestos emiten una cantidad de luz constante (estado esttico) cuando se excitan de manera constante, permitiendo una deteccin muy precisa y una cuantificacin del antgeno ms exacta que la de la quimioluminiscencia, que se realiza durante un estado dinmico. El rojo Nilo no es puede usarse para teir bandas en membranas de PVDF; sin embargo es posible realizar la tincin en el gel SDS - PAGE y luego transferirlo a la membrana de PVDF. Esto ltimo presenta una ventaja, y es que no es necesario realizar una tincin del gel para comprobar la transferencia proteica.[12] Sistema avidina/estreptavidina Otra opcin es emplear un anticuerpo primario unido covelentemente a molculas de biotina. Despus la deteccin se llevar a cabo con una protena de unin a la misma, como la estreptavidina o la avidina. Deteccin con oro Otra tcnica, conocida como Golden blot, consiste en la deteccin de los anticuerpos primarios con protena A unida a partculas de oro. El resultado es una membrana con manchas rojas, causadas por el oro, all donde est la protena.[13] La sensibilidad del mtodo puede incrementarse con una tincin fotoqumica de plata: el oro cataliza la reduccin de los iones plata a plata metlica en presencia de otro agente reductor, como la hidroquinona; la plata forma de este modo unas manchas visibles bajo microscopio ptico. Se consigue as una sensibilidad comparable a la de las tcnicas radiactivas.[][14]

Western blot Mtodo en un paso Histricamente la deteccin se ha realizado en dos pasos por la relativa facilidad que supone producir anticuerpos primarios y secundarios en procesos separados. Esto ofrece a investigadores y empresas enormes ventajas en lo que a flexibilidad se refiere, y aade un efecto amplificador al proceso. Sin embargo, debido a la llegada de los anlisis de protenas de alto rendimiento y los menores lmites de deteccin ha crecido el inters por desarrollar sistemas de deteccin en un solo paso que aumentaran la rapidez del proceso al tiempo que reducen los consumibles. Esto requiere un anticuerpo que reconozca al mismo tiempo la protena de inters y una "etiqueta" detectable. Se incuba de manera similar al anticuerpo primario del proceso en dos pasos, y, tras una serie de lavados, ya se puede detectar directamente.

Anlisis
Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la deteccin de aquellas que s se han unido a la protena de inters. Deteccin colorimtrica La deteccin colorimtrica depende de la incubacin del Western blot con un sustrato que reacciona gracias a la enzima reporter (una peroxidasa, por ejemplo) unida al anticuerpo secundario. Pasa as de ser un compuesto soluble a una forma insoluble de otro color que precipita cerca de la enzima tiendo as la membrana. Se procede despus a un lavado en el que se elimina el tinte soluble. La cuantificacin proteica se evala por densitometra (cuan intensa es la mancha) o por espectrometra. Deteccin quimioluminiscente La deteccin quimioluminiscente requieren la incubacin de la membrana con un sustrato, que emitir luminiscencia al ser expuesto al reporter que trae unido el anticuerpo secundario. La luz emitida es captada por una pelcula fotogrfica o, ms recientemente, por cmaras CCD, que toman una imagen digital del Western blot. Se analiza la imagen por densitometra para evaluar la cantidad relativa de mancha y cuantifica el resultado en trminos de densidad ptica. Actualmente hay programas que permiten realizar anlisis ms profundos si se aplican ciertos estndares, como la obtencin del peso molecular.

Western blot Deteccin radiactiva Los marcadores radiactivos no requieren sustratos enzimticos; en su lugar se coloca una pelcula fotogrfica contra el Western blot y la actividad radiactiva del marcador provoca la aparicin en ella de regiones oscuras. stas se correspondern con las bandas de las protenas de inters. Su alto precio y su riesgo para la salud y la seguridad han provocado su desuso en los ltimos tiempos. Deteccin fluorescente En la deteccin con marcadores fluorescentes se procede a la excitacin lumnica de stos que les provoca una excitacin. sta es detectable por un fotosensor, como una cmara CCD equipado con los filtros de emisin apropiados. Se consigue as una imagen digital del Western blot que puede ser analizado para obtener el peso molecular o la cuantificacin proteica. La fluorescencia es considerada uno de los mtodos de anlisis ms sensibles.

Exploraciones secundarias
Una caracterstica de las membranas de PVDF, de la que carecen las de nitrocelulosa, es su capacidad de quitar los anticuerpos y volver a explorar la membrana con otros anticuerpos. Aunque hay protocolos que permiten hacer lo mismo en membranas de nitrocelulosa, la robustez de las de PVDF facilita la eliminacin de los anticuerpos, permitiendo ms reusos antes de que el ruido de fondo es tan grande que impide continuar con los experimentos. Otra diferencia es que, a diferencia de la nitrocelulosa, el PVDF debe ser empapado en etanol, isopropanol o metanol al 95% antes de ser usado. Adems, las membranas de PVDF tienden a ser ms delgadas y ms resistentes a los daos durante su uso.

Aplicaciones
Investigacin
Actualmente, el Western blot es una de las tcnicas ms usadas en el estudio de la biologa molecular.[15]

Diagnstico
Prueba de VIH: Aunque el VIH suele detectarse mediante la tcnica ELISA, el Western Blot se usa como prueba confirmatoria cuando el ELISA da un resultado positivo en un grupo que no es de riesgo o en una poblacin donde la prevalencia del virus es muy baja. Mediante el Western blot se buscan los anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano. Se transfieren a una membrana las protenas de clulas que, se sabe, estn infectadas por el VIH. Entonces, se incuba el suero que hay que probar con esta membrana. Este paso es equivalente a la incubacin con el anticuerpo primario; si hay anticuerpos anti-VIH en el suero, sern estos los que realizen el papel de anticuerpo primario. Se lava, para eliminar los anticuerpos no unidos, y la membrana se vuelve a incubar con un anticuerpo secundario anti-humano unido a una enzima-seal. La aparicin de bandas indica la presencia de protenas contra las cuales el suero del paciente contiene anticuerpos, es decir, el paciente es seropositivo. Se emplea como prueba definitiva de la encefalopata espongiforme bovina, comnmente llamada "enfermedad de las vacas locas". Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western blot. En veterinaria, ocasionalmente se emplea el Western blot para confirmar la presencia del FIV en gatos.

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Protocolos
Western Blotting Protocol from Protocolmonkey [16] Modified Western blotting protocols from Biotechniques [17] Western Immunoblot protocols from Cell Signaling Technology [18] Dr. Mark Barton Frank Lab protocol [19] Kamps's Western Blotting Protocol [20] http://www.natureprotocols.com/2006/09/15/western_blot_analysis_of_subce.php http://www.prosci-inc.com/Western-Blot-Protocol.html CSH Protocols collection: Immunoblotting [21]

Enlaces externos
Mtodos de transferencia de protenas a filtros - Universidad de Barcelona [22]

Referencias
[5] (http:/ / www. molecularstation. com/ protein/ western-blot/ #prepare) [16] http:/ / www. protocolmonkey. com/ protocols/ view_protocol. php?id=1 [17] [18] [19] [20] [21] [22] http:/ / www. e-biotek. com/ protein/ 244-western-blot-protocol. html http:/ / www. cellsignal. com/ support/ protocols/ index. html#western http:/ / www. protocol-online. org/ prot/ Molecular_Biology/ Protein/ Western_Blotting/ http:/ / carmen. salk. edu/ ~sefton/ Hyper_protocols/ western. html http:/ / cshprotocols. cshlp. org/ cgi/ collection/ immunoblotting http:/ / www. ub. es/ biocel/ wbc/ tecnicas/ westernblot. htm

Fuentes y contribuyentes del artculo

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Fuentes y contribuyentes del artculo

Western blot Fuente: http://es.wikipedia.org/w/index.php?oldid=67123328 Contribuyentes: 3coma14, Airunp, CASF, Ca in, Cvun, Diegusjaimes, EKhan, El Moska, Fanattiq, Flakinho, GermanX, Isha, J3D3, Jerryq, Jorge c2010, Maleiva, Playita, Saracenomartin, UPO649 1112 mreycor1, 23 ediciones annimas

Fuentes de imagen, Licencias y contribuyentes

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