Mdulo 7.

NCLEO CELULAR: ESTRUCTURA Y FUNCIONES

INTERIOR DE LAS CLULAS EUCARITICAS Antiguamente los bilogos pensaban que las clulas estaban formadas por una gelatina uniforme a la que llamaban protoplasma. Con la microscopa electrnica y otras herramientas modernas de investigacin se ha extendido la percepcin del mundo con respecto a las clulas. En la actualidad sabemos que la clula tiene un alto nivel de organizacin y que es sorprendentemente compleja: tiene su propio centro de control, su sistema de transporte interno, fuentes de energa, fbricas para procesar la materia que requiere, plantas de empaquetamiento e incluso un sistema de autodestruccin. En nuestros das el trmino protoplasma, si acaso se utiliza, es en un sentido muy general. La porcin de protoplasma que se encuentra fuera del ncleo se llama citoplasma y el material interno del ncleo se llama nucleoplasma. Los organelos se encuentran suspendidos en el componente lquido del citoplasma (citosol). Cada uno de los organelos delimitados por sus membranas forma uno o ms compartimientos independientes dentro del citoplasma. En una clula animal tpica, todos los compartimientos en conjunto abarcan cerca de la mitad del volumen del citoplasma. ESTRUCTURA DEL NCLEO La estructura ms destacada de la clula es el ncleo. Tiene forma esfrica u oval, con un dimetro promedio de 5 m. Debido a su tamao y a que con frecuencia ocupa un lugar fijo cerca del centro de la clula, antiguos investigadores supusieron que era el centro de control de la clula, mucho antes de que existieran datos experimentales al respecto. La mayor parte de las clulas tienen un solo ncleo, aunque existen excepciones como por ejemplo algunas clulas de hgado que son binucleadas y las fibras musculares esquelticas que son multinucleadas. Envoltura nuclear La envoltura nuclear consta de dos membranas que separan el contenido nuclear del citoplasma circundante (las membranas nucleares externa e interna). Las dos membranas de la envoltura se interrumpen en algunos puntos formando poros nucleares, de tal forma que el interior del ncleo se comunica con el citoplasma celular. Los poros nucleares permiten el paso de sustancias del interior de ncleo hacia el citoplasma y viceversa. El poro nuclear en realidad es una estructura altamente elaborada, denominada complejo del poro nuclear, compuesta de ms de 100 protenas diferentes, ordenadas con una simetra octogonal. Las molculas pequeas (5 kDa o menos) difunden en forma prcticamente libre, pero las protenas de gran tamao necesitan contar con una seal de localizacin nuclear, que generalmente consiste en una corta secuencia de aminocidos (de 4 a 8. El proceso de entrada de una protena destinada al ncleo necesita que otra protena citoslica ("receptor nuclear de importacin") se una a la seal de localizacin nuclear y requiere adems de la energa que proporciona la hidrlisis de una molcula de trifosfato de guanidina (GTP). Esto provoca la dilatacin del poro y permite el pasaje de la protena. La salida de las subunidades

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ribosmicas fabricadas en el nucleolo y el ARNt tambin dependeran de un sistema de transporte activo mediado por seales de exportacin nuclear.

Unida al interior de la membrana nuclear se encuentra una capa de protenas especficas que al parecer funcionan como esqueleto del ncleo ( lmina nuclear) y que tiene un papel importante en la desorganizacin y reorganizacin de las membranas nucleares al comienzo y al fin de la divisin celular, respectivamente. La lmina nuclear es un enrejado de subunidades proteicas, del tipo de los filamentos intermedios que han sido vistos al tratar el citoesqueleto (protenas fibrilares) y que, como todas las protenas nucleares lleva una seal de transporte nuclear que los dirige desde el citosol, donde son sintetizados, hacia el ncleo. Cuando el ncleo se desensambla durante la mitosis, la lmina nuclear se depolimeriza por fosforilacin. Al mismo tiempo la membrana nuclear se desarma en vesculas membranosas, que van adheridas a las protenas fosforiladas (fracciones de la lmina nuclear). En la telofase temprana (una de las fases finales de la divisin celular) se produce la defosforilacin de las protenas y las vesculas se reorganizan alrededor de cada cromosoma. En la telofase tarda las vesculas se renen y reconstituyen la envoltura nuclear de cada clula hija con sus poros nucleares y posteriormente se reimportan selectivamente las protenas que llevan la seal de transporte nuclear por transporte activo.

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Cromatina y los cromosomas La mayor parte del ADN celular se localiza dentro del ncleo . Las molculas de ADN forman los genes que contienen las instrucciones qumicamente codificadas para producir casi todas las protenas que la clula necesita. El ncleo controla la sntesis de protenas enviando las molculas de ARN mensajero (ARNm) travs de la envoltura nuclear hacia el citoplasma que es el sitio donde se produce la sntesis de protenas. Estas molculas de ARNm son copias de los genes que codifican las protenas. Los ribosomas son compuestos supramacromoleculares donde a partir de la informacin de los mensajeros se realiza la sntesis de las protenas. Cada molcula de ADN est empaquetada en un cromosoma separado y la informacin gentica total almacenada en los cromosomas de un organismo constituye el genoma. El genoma humano, cuya composicin fue anunciada en junio del 2000, contiene alrededor de 3.10 9 pares de nucletidos. En organismos diploides como los seres humanos hay dos copias de cada cromosoma, una heredada de la madre y otra del padre1. Una clula tpica humana contiene entonces 46 cromosomas con un total de 6.10 9 pares de nucletidos. Los cromosomas cambian su estructura y su actividad de acuerdo al estado de la clula: en mitosis, o fase M, estn altamente condensados y transcripcionalmente inactivos, pero durante la parte ms larga del ciclo celular (interfase) estn mucho menos condensados y son muy activos en la sntesis de ARN. No todo el ADN cromosmico codifica para protenas o para molculas de ARN. Los genetistas de poblaciones han tratado de estimar cunto de ese DNA es esencial para la vida, estudiando cules son las regiones que se han conservado en el curso de la evolucin. Se considera que en los mamferos existen alrededor de 60.000 protenas esenciales y que slo un 10% del genoma resulta de importancia

A la izquierda se observa la estructura del nucleosoma, a partir de la disociacin en sus componentes. Puede verse el octmero compuesto de las ocho unidades de histonas. A la derecha se muestran distintos grados de empaquetamiento del ADN: una doble hlice de 2 nm de espesor, una secuencia de nucleosomas de 11 nm y una fibra de 30 nm, resultado de la organizacin de los nucleosomas en 6 unidades por vuelta.

vital para los vertebrados. Adems de proveer a su propia multiplicacin en el proceso de divisin celular, en el que el ADN se copia a s mismo (replicacin), la funcin principal del genoma activo es copiar secuencias de ADN en forma de secuencias de ARN (proceso denominado transcripcin). El ARN copiado puede ser un ARNm
En los varones los cromosomas sexuales son diferentes: el cromosoma sexual Y es aportado por el padre y el cromosoma sexual X por la madre.
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(cido ribonucleico mensajero), que traducir su informacin generalmente en una nica protena (en algunos casos el ARNm transcripto, luego de ser procesado, puede dar lugar a ms de un ARNm final y en consecuencia codificar para ms de una protena). Tambin del ADN se transcriben molculas de ARNr (ribosmico) y ARNt (de transferencia). Cada regin del ADN que produce una molcula de ARN funcional constituye un gen. Si los cromosomas estuviesen compuestos solamente de ADN extendido, es difcil imaginar cmo podran replicarse y segregarse a las clulas hijas sin enredarse o romperse. Para evitar ello es que estn asociados a protenas de dos clases, las histonas y las protenas no histnicas. El complejo de ambos tipos de protenas con el ADN es conocido como cromatina. Las histonas son protenas bsicas (ricas en lisina y arginina), lo que les permite unirse a la molcula de ADN (con carga negativa debido a los restos fosfricos) independientemente de la secuencia nucleotdica. Hay dos tipos de histonas: las nucleosomales (H2A, H2B, H3 y H4) y las no nucleosomales (H1) que son ms grandes. Las histonas nucleosomales integran un ncleo con forma de cilindro achatado compuesto por ocho subunidades de histonas (dos de cada uno de los cuatro tipos mencionados) en el que se enrolla la molcula de ADN dando dos vueltas (146 pares de bases). A esta estructura se la conoce como nucleosoma. Cada nucleosoma est separado por una seccin de ADN no enrollado de 0-80 pares de nucletidos. Finalmente los nucleosomas se acomodan formando una especie de hlice (cada vuelta de la hlice compuesta por seis nucleosomas), proceso en el que juega un papel importante la histona no nucleosmica H1. De esta forma se obtiene una fibra de 30 nm de espesor, con el ADN empaquetado con las protenas histnicas. Nucleolo En muchas clulas la porcin ms visible del ncleo es el nucleolo, que se tie en forma distinta a la cromatina circundante. El nucleolo, un cuerpo compacto no delimitado por membranas, es el sitio de produccin de estructuras especializadas llamadas ribosomas , las que, una vez localizadas en el citoplasma, proporcionan el lugar donde la informacin contenida en el ARN mensajero es traducida en molculas de protenas. Cada ribosoma est compuesto de dos subunidades de diferente tamao, que se ensamblan separadamente en el nucleolo. A su vez, cada subunidad contiene ARNr y protenas. El ARNr se transcribe en el nucleolo, pero las protenas ribosmicas son sintetizadas en el citoplasma e ingresan al ncleo (y luego al nucleolo) a travs de los poros nucleares porque contienen seales de importacin especficas. Muchas de las protenas ms abundantes, como la hemoglobina o la mioglobina, son sintetizadas a partir de un nico gen. Este gen se transcribe muchas veces produciendo mltiples copias

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del ARNm. A su vez cada copia de ARNm es traducida gran cantidad de veces a molculas de hemoglobina, en un esquema de amplificacin usual en protenas. Sin embargo el ARNr ya es el producto final, por lo que la nica posibilidad de fabricar la cantidad de ARNr que necesita la clula es que en el ADN existan mltiples copias de los genes que codifican para el ARNr . En el hombre hay alrededor de 200 copias por genoma haploide, dispuestas en tndem en determinadas regiones de algunos cromosomas, separadas por regiones no codificantes. En eucariotas existen tres tipos de ARN polimerasas (I,II y III) que generan las diferentes molculas de ARN. Los genes que codifican para ARNr son transcriptos por la ARN polimerasa I, que produce un transcripto primario 2 (ARNr 45S, de 13.000 nucletidos), que es recubierto por protenas (alrededor de 80 tipos moleculares) que provienen del citoplasma. Este primer transcripto es procesado en tres fragmentos, con prdida de algunos nucletidos y de las protenas asociadas: ARNr 28S, ARNr 5,8S y ARNr 18S. Los dos primeros, junto con una fraccin de ARNr 5S transcripta fuera del nucleolo por la ARN polimerasa III forman finalmente la subunidad ribosmica mayor (60S), en tanto que el ARNr 18S integra la subunidad ribosmica menor (40S). Ambas subunidades salen separadamente del nucleolo y del ncleo pasando al citoplasma. En el humano los genes ribosomales se encuentran en determinadas regiones de 5 pares de cromosomas (13, 14, 15, 21 y 22). Dichos genes forman rulos (loops) y se ubican en el nucleolo, donde son activamente transcriptos por la ARN polimerasa I. Cada uno de los rulos (tndem de genes) recibe el nombre de Regiones de Organizadores Nucleolares (NORs). La ubicacin de los extremos de los cromosomas que contienen las copias del gen del ARNr en un mismo sector (el nucleolo) obedece a un criterio de eficiencia. Concentrndose en una zona determinada del ncleo, las molculas de ARN polimerasa y los ribonucletidos necesarios para su formacin estn fcilmente disponibles. Esta zona del ncleo es de alta produccin de cidos nucleicos (molculas de ARNr), que se tien intensamente con los colorantes nucleares y que originaron en los primeros microscopistas la idea de que el nucleolo era el ncleo del ncleo (de all su nombre). REPLICACIN (DUPLICACIN) DEL ADN 3 Es frecuente escuchar que el ADN contiene toda la informacin necesaria para el buen funcionamiento de la clula. Analizado a nivel molecular, la informacin que contiene el ADN est destinada (toda o parte de ella, segn el tipo de clula) a convertirse en primer trmino en algn tipo de cido ribonucleico: ribosmico (ARNr), mensajero (ARNm) o de transferencia (ARNt). Estas tres clases de ARN participan en el proceso de sntesis de protenas. Por ello, una expresin tal como en el ADN est contenida la informacin para la sntesis de todas las protenas que requiere la clula para su funcionamiento no es incorrecta, pero puede inducir a error. Es que en el ADN no existe informacin relacionada con los otros metabolitos primarios no proteicos? No existe acaso en el ADN informacin para la sntesis o la modificacin de hidratos de carbono, lpidos o de los propios cidos nucleicos, adems de otras sustancias no incluidas en esos grupos? La respuesta es afirmativa, ya que ente las muchas
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Se denomina as al producto inmediato de la transcripcin. En muchos casos el transcripto primario sufre modificaciones posteriores (por ello denominadas post-transcripcionales), como ocurre con el ARN mensajero de los ecuariotas. El trmino replicacin proviene de la traduccin directa del ingls replication. En castellano el trmino rplica es ms utilizado como argumento o discurso con el que se responde a una argumentacin, pero su segunda acepcin es precisamente copia (copiar, hacer una rplica de una obra original) y en este sentido es utilizado en Biologa.

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protenas que se sintetizan en base a la informacin contenida en el ADN estn las enzimas responsables de todas las reacciones qumicas que ocurren en las clulas, cuya expresin da lugar a su vez a la fabricacin de todos los materiales que la misma requiere para su correcto funcionamiento. Por lo expuesto, las secuencias de nucletidos del ADN describen en ltimo trmino la estructura primaria de todos los ARN y protenas celulares y mediante las enzimas pueden afectar indirectamente la sntesis del resto de los constituyentes celulares, determinando as el tamao, forma y funcin de cualquier objeto viviente. De all la importancia de asegurar que la informacin contenida en el ADN de una clula pueda ser transmitida sin errores a las clulas hijas formadas en el curso de la divisin celular. En la sntesis de todas las macromolculas que contienen informacin intervienen sistemas complejos que aseguran que la informacin se transmita intacta. Si no se corrigen los errores en la sntesis del ADN, stos pueden tener consecuencias directas porque son, esencialmente, permanentes. Mucho antes de que se conociese la estructura del ADN, los cientficos ya se haban sorprendido de la capacidad que mostraban todos los organismos para crear copias de ellos mismos , as como de la capacidad de las clulas de producir muchas copias idnticas de macromolculas grandes y complejas. La especulacin del problema se centr en el concepto de molde. El proceso de replicacin (duplicacin) del ADN fue el primer ejemplo biolgico de la utilizacin de un molde molecular para guiar la sntesis de una macromolcula. Watson y Crick, al proponer su concepto de estructura del ADN, proporcionaron la base terica para comprender cmo el ADN poda actuar como molde para la replicacin y transmisin de la informacin gentica. Una cadena es el complemento de la otra. Las estrictas reglas del apareamiento de bases (A con T y G con C) permitirn que cada cadena sea el molde para fabricar su respectiva cadena complementaria, es decir una cadena con una secuencia nucleotdica predeterminada. La replicacin del ADN es semiconservadora Si cada cadena acta de molde para la sntesis de una nueva cadena, se producirn dos molculas de ADN nuevas, cada una con una cadena nueva y una vieja. Este proceso se denomina replicacin semiconservadora. Esta teora fue propuesta por Watson y Crick, pero fueron Meselson y Stahl en 1957 quienes le dieron confirmacin experimental, incubando durante mucho tiempo clulas de la bacteria Escherichia coli en un medio que contena como nica fuente de nitrgeno cloruro de amonio con 15N. Al cabo de un tiempo todo el ADN microbiano era pesado (las bases pricas y pirimdicas estaban constituidas exclusivamente por 15N). A continuacin, algunas de estas clulas pesadas se pasaron a un medio que contena slo cloruro de amonio con nitrgeno ligero ( 14N) hasta que se duplicara la cantidad de clulas presentes (indicador de una duplicacin en la cantidad de ADN). En este caso se pudo ver (por centrifugacin en equilibrio en un gradiente de cloruro de cesio) que todo el ADN formaba una nica banda, intermedia entre la posicin que hubiera ocupado el ADN pesado (integrado exclusivamente por 15N)y el ADN ligero (integrado exclusivamente por 14N). El experimento demostr que la replicacin es semiconservadora, dando dos dobles hlices hijas que contienen, cada una de ellas, una hebra pesada y una hebra liviana.
Composicin del medio Medio conteniendo slo 15N ( ) Pasaje a medio con N 14 () Nueva divisin en medio con N 14 () Inicial Final + + + Resultado (ADN pesado) (ADN hbrido) (ADN hbrido y ADN liviano)

La hiptesis de la replicacin semiconservadora recibi an ms apoyo en la segunda parte del experimento: si se permita que nuevamente se duplicara la poblacin celular en el mismo medio de nitrgeno ligero (con 14N) se producan dos bandas, una correspondiente al ADN hbrido (con una

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cadena de 14N y otra de 15N) y otra de ADN exclusivamente ligero (producto de la replicacin de las cadenas ligeras en un medio que contena exclusivamente 14N). La replicacin empieza en un punto de origen y normalmente es bidireccional En este momento aparece un buen nmero de preguntas: ( 1) se desenrollan totalmente las cadenas del ADN parental antes de que cada una sea replicada o la replicacin se produce simultneamente con el desenrrollamiento? ( 2)empieza la replicacin en sitios al azar o en un nico punto? y (3) despus de iniciada la replicacin en un punto, transcurre en una nica direccin o en ambas? Gran parte de la informacin de la que disponemos sobre este tema proviene de estudios realizados en Escherichia coli. En este caso pudo verse, cultivando las clulas en un medio con timidina tritiada (conteniendo tritio, el ismero pesado del hidrgeno, 3H), que a medida que el nico cromosoma circular de la bacteria se desenrrollaba, simultneamente se iba produciendo la incorporacin de nucletidos radiactivos, de modo que la replicacin proceda simultneamente con el desenrrollamiento de las hebras. Un extremo del lazo, o los dos, son puntos dinmicos llamados horquillas de replicacin en donde se desenrolla el ADN parental y las cadenas separadas se replican rpidamente. Mediante la aplicacin de otras tcnicas tambin se revel que los lazos de replicacin siempre se originan en un punto denominado origen de replicacin y que tanto en el caso de las molculas de ADN circulares, como ocurre en bacterias, como tambin en el ADN no circular de las clulas eucariotas, la replicacin es bidireccional, es decir que los dos extremos del lazo de replicacin son horquillas de replicacin activas y se unen en un punto del lado del crculo opuesto al origen . La nica diferencia con las clulas eucariotas es que, debido al mayor tamao del ADN, se producen mltiples orgenes de replicacin. La sntesis de ADN transcurre siempre en direccin 5 3 y es semidiscontinua Una cadena nueva de ADN siempre se sintetiza en la direccin 53. Debido a que las dos cadenas de ADN son antiparalelas, la enzima que forma la nueva hebra (ADN polimerasa) lee la cadena que acta de molde desde el extremo 3 al 5. Si la sntesis transcurre siempre en la direccin 5 3, cmo se pueden sintetizar simultneamente las dos cadenas si las dos hebras que constituyen el ADN estn dispuestas en sentido antiparalelo (opuesto)? La respuesta la dio Okazaki en los aos 60, al encontrar que una de las dos cadenas se sintetiza en piezas cortas denominadas desde entonces fragmentos de Okazaki. Ello condujo a la conclusin de que una cadena se sintetiza continuamente y la otra discontinuamente . La cadena continua o cadena conductora es aquella en la que la sntesis 5 3 transcurre en la misma direccin que el movimiento de la horquilla de replicacin. La cadena discontinua o cadena rezagada es aqulla en la que la sntesis 5 3 transcurre en la direccin opuesta a la del movimiento de la horquilla. Los fragmentos de Okazaki tienen una longitud entre unos pocos centenares y unos pocos millares de nuclotidos, segn el tipo de clula. Como la sntesis es bidireccional (transcurre hacia ambos lados del punto de replicacin), la sntesis en una cadena es continua hacia un lado y discontinua hacia el otro.

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El ADN es sintetizado por polimerasas, de las cuales existen distintos tipos. Todas las polimerasas requieren de un molde. La reaccin de polimerizacin es conducida por una cadena molde, de modo que donde hay una G se aade una C y donde hay una A se aade una T y viceversa. En segundo lugar, se requiere un cebador (primer, en ingls), es decir un segmento de cadena nueva (complementario al molde) con un grupo 3-hidroxilo libre al que se puedan incorporar ms nucletidos. El extremo 3 del cebador se denomina extremo cebador. Dicho de otro modo, parte de la cadena nueva ya debe estar en su sitio antes que la polimerasa acte. La ADN polimerasa slo puede aadir nucletidos a una cadena preexistente (sin distinguir si se trata de ribo- o de dexosirribonucletidos). En consecuencia, ninguna enzima sintetizadora de ADN puede iniciar la sntesis de una cadena nueva. Como veremos ms adelante, enzimas que sintetizan ARN s tienen la capacidad de iniciar la sntesis, por lo que los cebadores son a A menudo oligonucletidos de ARN, que luego deben ser reemplazados por sus equivalentes de ADN. B La replicacin del ADN requiere muchas enzimas y factores proteicos En la actualidad sabemos que la C replicacin de Escherichia coli requiere no solamente una sola ADN polimerasa (hasta el momento han sido aislada tres polimerasas, denominadas ADN polimerasa I, II y III) sino 20 o ms D enzimas y protenas diferentes, cada una llevando a cabo una tarea especfica. Aunque an no se ha E obtenido como una entidad fsica, el complejo completo se ha denominado sistema ADN replicasa o replisoma. Para tener acceso a las cadenas de ADN que han de actuar de molde deben separarse las dos cadenas parentales. Esto se consigue generalmente mediante la accin de El esquema muestra el proceso de inicio de la replicacin. En (A) las protenas iniciadoras se unen al origen de replicacin. La fase helicasas, que se trasladan a lo largo (B) marca el momento de la unin de la helicasa a las protenas del ADN y usan la energa qumica del iniciadoras. En (C) la helicasa ha comenzado a separar las dos ATP. La separacin de las cadenas crea hebras del ADN e inicia la formacin de la orquilla de replicacin. una tensin en la estructura helicoidal La etapa (D) marca el comienzo de la accin de la primasa, que (similar a la que se produce cuando se generar el cebador (primer) de ARN, necesario para que pueda separa parte de una bandita elstica actuar la ADN polimerasa (E). enrollada), que debe ser resuelta por la accin de las topoisomerasas4. Las cadenas separadas se estabilizan por medio de protenas fijadoras de ADN. Los cebadores deben estar presentes antes que la polimerasa pueda actuar y suelen ser fragmentos cortos de ARN formados por enzimas denominadas primasas. Finalmente, los cebadores de ARN deben ser eliminados y reemplazados por ADN. En E. coli esta funcin es cumplida por la ADN
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Dado que el ADN se encuentra enrollado y que cada vuelta de hlice contiene 10,5 pares de bases, la separacin de las cadenas por parte de las helicasas crea una tensin, haciendo que las hlices sean ms apretadas a ambos lados de la horquilla de replicacin. Para eliminar dicha tensin actan las topoisomerasas, enzimas que cortan una o las dos hebras del ADN, permitiendo que se elimine una o ms vueltas de hlice y retornan al ADN a su condicin relajada(sin tensin).

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polimerasa I. Pero despus de la eliminacin del ARN y de su reemplazo por ADN quedan puntos en el ADN donde hay un enlace fosfodister roto, situacin que es reparada por enzimas selladoras denominadas ADN ligasas. La replicacin del cromosoma de Escherichia coli tiene lugar en varias fases La sntesis de una molcula de ADN se puede dividir en tres fases: inicio, elongacin y terminacin. Como veremos ms adelante, la sntesis del ARN y de las protenas tambin proceden en etapas similares. Inicio El inicio de la replicacin en Escherichia coli est representado por un ordenamiento en tndem de tres secuencias de 13 pares de bases (bp) y cuatro secuencias separadas de 9 bp que funcionan como sitios de fijacin de la protena que inicia el proceso. En el inicio participan al menos 8 enzimas o protenas diferentes. El inicio de la replicacin debe estar regulado con precisin para que se produzca slo una vez por cada ciclo celular, pero el mecanismo an no se conoce con claridad. Elongacin La fase de elongacin consiste en dos operaciones muy similares en apariencia pero que son mecansticamente muy diferentes: la sntesis de la cadena conductora y la sntesis de la cadena rezagada. La sntesis de la cadena conductora empieza con la sntesis de un cebador de ARN corto (10 a 60 nucletidos) por accin de la primasa en el origen de replicacin. A continuacin se adicionan desoxirribonucletidos al cebador por la accin de la ADN polimerasa III. Una vez iniciada, la sntesis de la hebra conductora transcurre de manera continua al mismo ritmo que la horquilla de replicacin. La sntesis de la hebra rezagada requiere de un conjunto proteico denominado primosoma, constituido por al menos siete protenas diferentes. El complejo multiproteico del primosoma viaja en el mismo sentido que la horquilla de replicacin, pero a intervalos la primasa sintetiza un cebador corto de ARN de 10 a 60 residuos, a partir del cual la ADN polimerasa III inicia la formacin de la cadena complementaria de la hebra molde ( fragmento de Okazaki) en sentido contrario al avance de la horquilla de replicacin. Cuando el nuevo fragmento de Okazaki est completo se reemplaza el cebador de ARN por ADN, acciones llevadas a cabo por tres enzimas adicionales: una nucleasa que elimina el cebador, una ADN polimerasa de reparacin (ADN polimerasa I) y finalmente la interrupcin que queda entre dos fragmentos es sellada por una ADN ligasa. Terminacin Finalmente, las dos horquillas de replicacin se encuentran en el otro lado del cromosoma circular de Escherichia coli. Se sabe muy poco sobre esta fase, aunque parece necesaria la accin de una topoisomerasa del tipo 2 para la separacin final de dos molculas completas de ADN circular. La replicacin en las clulas eucariotas es ms compleja Las molculas de ADN de las clulas eucariticas son considerablemente mayores que las de las bacterias y estn adems organizadas en estructuras nucleoproteicas complejas (cromatina), pero los rasgos esenciales de la replicacin son los mismos que en las clulas procariticas . En levaduras se han identificado y estudiado orgenes de replicacin denominados ARS (autonomous replicating sequences) de hasta 300 bp y que contienen varias secuencias conservadas que son esenciales para la funcin de inicio de la replicacin. La velocidad de movimiento de la horquilla de replicacin en los eucariotas es slo una dcima parte de la observada en Escherichia coli, con lo que la replicacin de un solo cromosoma humano tardara unas 500 horas (21 das). Sin embargo se ha detectado que la replicacin en cromosomas humanos tiene lugar en forma bidireccional a partir de mltiples orgenes de replicacin separados por unas 30.000 a 300.000 bp uno de otro. En el genoma humano parece haber unos 10.000 orgenes de replicacin.

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REPARACIN DEL ADN La diversidad de los organismos vivientes y su xito en colonizar casi cualquier parte de la superficie terrestre ha dependido de los cambios genticos acumulados gradualmente durante millones de aos, permitiendo a los organismos adaptarse a las cambiantes condiciones ambientales y colonizar nuevos hbitats. Sin embargo, en un corto tiempo y desde la perspectiva de un organismo individual, todos los cambios genticos resultan casi siempre perjudiciales, especialmente en organismos multicelulares, donde un cambio gentico casi siempre constituye un trastorno en el afinado y extremadamente complejo sistema fisiolgico y del desarrollo. Una clula slo tiene uno o dos conjuntos de ADN genmico y mientras que las protenas y las molculas de ARN pueden ser reemplazadas rpidamente en caso de resultar daadas utilizando informacin codificada en el ADN, las propias molculas de ADN son irremplazables. El mantenimiento de la informacin contenida en el ADN es por lo tanto un imperativo celular, por lo que en cada clula se encuentra un complicado conjunto de sistemas de reparacin del ADN. Las ADN polimerasas son muy precisas La replicacin debe realizarse con un grado de fidelidad muy elevado. En Escherichia coli se comete un error solo cada 109 a 1010 nucletidos. Dado que el cromosoma de E. coli tiene unos 4,7.106 bp, esto significa que se comete un error cada 1.000 a 10.000 divisiones celulares. Sin embargo, anlisis cuidadosos han demostrado que se inserta un nucletido incorrecto por cada 10 4 a 105 nucletidos correctamente incorporados. Un mecanismo eficiente para corregir estos errores los posee la propia ADN polimerasa, que pose una actividad exonucleasa 3 5, que le permite eliminar eficientemente un nucletido mal apareado. A esta actividad adicional de la polimerasa se la denomina correccin de pruebas, ya que la polimerasa chequea si los dos nucletidos son los que corresponden y de no ser as no puede avanzar en la reaccin de polimerizacin. An as, sumando la eficiencia natural ms la capacidad de correccin de pruebas, estamos lejos de explicar la alta eficiencia de la reaccin de polimerizacin que mencionamos al principio. La diferencia se logra a travs de la actuacin de distintas enzimas que reparan los pares de bases incorrectos que se han formado durante la replicacin. Mutaciones Los cambios permanentes en la molcula del ADN se denominan mutaciones. Las mutaciones pueden ir desde el reemplazo de un par de bases por otro ( mutacin por sustitucin) a la adicin o eliminacin de uno o ms pares de bases ( mutaciones de insercin o de delecin, respectivamente). Si la mutacin afecta a ADN no esencial o si tiene un efecto insignificante en la funcin de un gen se denomina mutacin silenciosa. Las mutaciones favorables son raras; la mayora de las mutaciones son deletreas para la clula. En los mamferos existe una fuerte correlacin entre la acumulacin de mutaciones y el cncer. Las mutaciones pueden ser inducidas por agentes mutagnicos, es decir sustancias que estimulan la produccin de mutaciones. La mayora de los compuestos que se consideran carcinognicos, es decir que son responsables de la produccin de cncer, son tambin mutagnicos 5 El genoma de una clula tpica de mamfero acumula muchos millares de lesiones durante un lapso de 24 horas. No obstante, debido a la reparacin de ADN, menos de una lesin de cada mil se transforma en una mutacin. El ADN es una molcula relativamente estable, pero sin sistemas de
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Los ensayos de mutagenicidad se realizan midiendo la capacidad de producir mutaciones en bacterias: por ejemplo, una bacteria que ha perdido la capacidad de crecer en ausencia de un nutriente determinado no lo hace, a menos que se produzca una mutacin -en este caso retromutacin, es decir capacidad de readquirir una condicin perdida- por la cual readquiere la capacidad de crecer sin ese nutriente. Las sustancias con capacidad mutagnica, o mutgenos, son aquellas que estimulan la produccin de mutaciones en el cultivo bacteriano. Es clsica la prueba de Ames, donde se siembran clulas de Salmonella typhimurium (una enterobacteria) sin capacidad de crecer en un medio sin histidina porque carecen del gen que les permite biosintetizar este aminocido. El agregado de concentraciones variables de la sustancia en el ensayo de mutagenicidad determinar si sta permite o no que la bacteria crezca como consecuencia de una mutacin. A veces sustancias no mutagnicas en la prueba directa s lo son luego de ser incubadas con extractos de hgado, revelando que ciertos compuestos slo son mutagnicos luego de este tratamiento, simulando lo que ocurre en el organismo (donde los compuestos pueden ser modificados por las clulas hepticas).

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reparacin el efecto acumulativo de muchas mutaciones poco frecuentes pero dainas hara que la vida fuese imposible. SNTESIS DE ARN DEPENDIENTE DE ADN (TRANSCRIPCIN) En la expresin de la informacin gentica contenida en un segmento de ADN siempre se genera una molcula de ARN. Adems de ser una nica cadena (no dos cadenas complementarias como en el ADN) el ARN difiere del ADN en que contiene ribosa (en lugar de 2-desoxirribosa como en el ADN) y, en consecuencia, posee un grupo hidroxilo adicional en posicin 2, y adems la base pirimdica timina (5metil uracilo) es reemplazada por uracilo. Con la excepcin de los genomas de ARN de ciertos virus, todas las molculas de ARN se forman a partir de informacin contenida permanentemente en el ADN. En el proceso denominado transcripcin, un sistema enzimtico convierte la informacin gentica de un segmento de ADN en una cadena de ARN con una secuencia de bases complementaria a una de las cadenas de ADN. Existen tres clases principales de ARN. El ARN mensajero (ARNm) es portador de las secuencias que codifican la secuencia de aminocidos de uno o ms polipptidos especificados por un gen o un conjunto de genes en los cromosomas. El ARN de transferencia (ARNt) es un adaptador que lee la informacin codificada en el ARNm y transfiere el aminocido adecuado a la cadena polipeptdica en crecimiento durante la sntesis proteica. Las molculas de ARN ribosmico (ARNr) se asocian con protenas, formando la intrincada maquinaria para la sntesis de protenas, el ribosoma. Adems de stos, existen muchos ARN especializados con funciones reguladoras o catalticas. La transcripcin es muy similar a la replicacin en trminos de mecanismo qumico (necesidad de una polimerasa que realice la unin de nucletidos), polaridad (direccin de la sntesis) y utilizacin de un molde. Los dos procesos difieren en que la transcripcin no requiere cebador, que slo afecta a segmentos cortos de ADN y que slo una de las cadenas acta como molde. La sntesis de ARN requiere de la presencia de enzimas especficas, denominadas ARN polimerasas. Como se ha adelantado, la ARN polimerasa no requiere un cebador, pero el inicio de la sntesis de ARN slo tiene lugar a partir de una zona definida por la presencia de secuencias especficas llamadas promotores, que veremos ms adelante. Para permitir que la ARN polimerasa sintetice una cadena de ARN complementaria a una de las dos hebras de ADN, la molcula de ADN se ha de desenrollar en una corta distancia formando una burbuja de transcripcin. Durante la transcripcin, la ARN polimerasa de Escherichia coli mantiene generalmente unos 17 pares de bases desenrollados, desenrollando el ADN por delante y enrollndolo por detrs. La transcripcin en E. coli transcurre a una velocidad de unos 50 nucletidos por segundo. La cadena que sirve de molde se denomina cadena molde. La ARN polimerasa de E. coli (y probablemente la de todos los procariotes) sintetiza todos los tipos de ARN. Se trata de una enzima compleja y grande formada por 6 subunidades (5 forman el ncleo y una sexta slo acta al comienzo) que carece de actividad correctora de pruebas y por lo tanto su eficiencia es menor que la que exhibe la ADN polimerasa (se produce un error cada 104 a 105 nucletidos) pero la trascendencia no es tan seria porque existen muchas copias del ARN y porque finalmente estas molculas son degradadas ms o menos pronto. Los promotores han sido determinados en bacterias y estn representados por dos zonas de secuencias cortas localizadas a unos 10 bp y 35 bp anteriores al sitio de inicio de la transcripcin (por ello se denominan regiones -10 y -35). La ARN polimerasa se une al promotor en dos pasos: primero la enzima completa (con sus seis subunidades) se fija al ADN y migra a la regin -35 formando el complejo

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cerrado y luego se desenrolla el ADN en unos 17 pares de bases empezando en la regin -10, con lo que queda al descubierto la hebra molde en el sitio de iniciacin. La sexta subunidad ( ) es necesaria slo para asegurar el reconocimiento especfico del promotor por la ARN polimerasa. Una vez formados unos cuantos enlaces fosfodister se disocia la subunidad , dejando que la polimerasa ncleo (las otras 5 subunidades, 2 subunidades , 2 subunidades y una subunidad ) complete la sntesis de la molcula de ARN. En las clulas eucariticas se han aislado tres tipos de polimerasas , designadas Polimerasas I, II y III, cada una con una funcin especfica. La ARN polimerasa I (Pol I) es responsable de la sntesis de un slo tipo de ARN, un transcripto prerribosmico que contiene el precursor de los ARNr 18S, 5,85S y 28S (que vimos al estudiar la funcin del nucleolo). La ARN polimerasa II (Pol II) tiene la funcin central de sintetizar ARNm as como algn ARN de funcin especial. La ARN polimerasa III (Pol III) produce ARNt, el ARNr 5S y algunos ARN pequeos especializados. La sntesis de ARN transcurre hasta que la ARN polimerasas se encuentra con una secuencia que provoca su separacin de la cadena molde. Maduracin del ARN Una molcula de ARN recin sintetizada se denomina transcripto primario. Un transcripto primario contiene, tpicamente, secuencias que corresponden a un gen. En las bacterias, una cadena polipeptdica est codificada generalmente en una secuencia de ADN que es colineal con la secuencia de aminocidos. En los eucariotes, por el contrario, las secuencias que codifican el polipptido normalmente no son contiguas; en lugar de ello, en la mayora de casos la secuencia codificante est interrumpida por trechos no codificantes llamados intrones, en tanto que los segmentos codificantes reciben la denominacin de exones. Una de las pocas excepciones de genes sin intrones corresponde a las histonas, protenas que acompaan a los cidos nucleicos en la estructura cromatnica. Los intrones6 se cortan del transcripto primario, se eliminan y los exones remanentes se empalman dando el ARN maduro funcional, por un proceso de corte y empalme. En los ARNm eucariticos la mayora de exones tienen menos de 1.000 nucletidos, con un valor promedio de 100 a 200 nucletidos, pero los intrones presentan una variacin de tamao mayor (50 a 20.000 nucletidos). Los ARNm eucariticos tambin se modifican en ambos extremos: se aade una estructura denominada casquete en el extremo 5 (una molcula de trifosfato de 7-metilguanosina) y un polmero de adenina, poli(A) en el extremo 3, que contiene de 20 a 250 residuos adenilato.
Existen cuatro clases de intrones. Los intrones del Grupo I se encuentran en genes nucleares, mitocondriales y de cloroplastos que codifican ARNt, en tanto que los del Grupo II se encuentran en genes mitocondriales y de cloroplastos que codifican ARNm. Ambos grupos comparten la propiedad de que no necesitan ATP para el proceso de corte y empalme. Los intentos de aislamiento de los enzimas que catalizan el corte y empalme de los intrones de los grupos I y II produjeron una enorme sorpresa, ya que muchos intrones experimentan fenmenos de autocorte y empalme (autosplicing), no interviniendo enzimas proteicos. Esta capacidad cataltica del ARN ( ribozimas) ha conducido a uno de los descubrimientos ms excitantes de la bioqumica y ha obligado a modificar el concepto de que todas las enzimas son protenas. El tercero y ms numeroso grupo de intrones, el Grupo III, encontrado en los transcritos primarios de ARNm nuclear, experimentan corte y empalme similar al que exhiben los del Grupo II, pero el corte y empalme es responsabilidad de complejos ARN-protenas denominados ARN nucleares pequeos (ARNsn, small nuclear RNA). En el proceso interviene el ATP, pero no se sabe si es realmente necesario en la reaccin de corte y empalme. La cuarta clase de intrones, que se encuentra en algunos ARNt, se distingue de los grupos I y II porque requiere ATP para el proceso de corte y empalme, que es llevado a cabo por un endonucleasa con un mecanismo de accin semejante al de las ligasas
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Los transcriptos primarios de los ARNt tambin se modifican mediante eliminacin de secuencias de cada extremo y por eliminacin de intrones; en el ARNt hay a menudo muchas bases (pricas o pirimdicas) modificadas. Es probable que ambas modificaciones ayuden a proteger al ARNm de la destruccin enzimtica que llevan a cabo las ribonucleasas La modificacin post-transcripcional no se limita al ARNm. Como hemos visto al estudiar la funcin del nucleolo, los ARN ribosmicos, tanto de bacterias como de clulas eucariticas, se forman a partir de precursores ms largos denominados ARN prerribosmicos. En las bacterias los ARNr 16S, 23S y 5S surgen de un nico precursor 30S, en tanto que en los eucariotes se modifica un ARN prerribosmico de 45S en el nucleolo para dar ARNr de 18S, 28S y 5,8S. El ARNr de 5S se forma como un transcripto separado. Con respecto a los ARNt, la mayora de las clulas tienen alrededor de 40 a 50 ARNt diferentes. Ocasionalmente se encuentran dos o ms ARNt diferentes sobre un nico transcripto primario. Los precursores de ARNt pueden experimentar otros dos tipos de modificacin post-transcripcional. Primero, el trinuclotido 3-terminal CCA(3), que es caracterstico de los ARNt, est ausente en la secuencia de algunos precursores bacterianos y en todos lo eucariticos, debiendo ser incorporado posteriormente por una enzima especfica. El tipo final de maduracin del ARNt es la modificacin de algunas bases por metilacin, desaminacin o reduccin. SNTESIS DE ARN Y ADN DEPENDIENTES DE ARN Ciertos virus constituidos por ARN contienen dentro de la partcula vrica una ADN polimerasa de caractersticas nicas, ya que es dirigida por el ARN: se trata de la transcriptasa inversa (o transcriptasa reversa), as llamada porque forma copias nuevas de ADN a expensas de un molde de ARN, en una reaccin de sentido opuesto al que realizan las ARN polimerasas que hemos visto al considerar el metabolismo del ARN. En estos casos, la infeccin incluye dentro de la clula husped tanto el genoma vrico (ARN viral) como la enzima (transcriptasa inversa). Dentro de la clula, la transcriptasa inversa cataliza (1) la sntesis de una nueva hebra de ADN a expensas de ARN, (2) degrada la hebra molde de ARN original y (3) replica la hebra de ADN recientemente formada. El ADN dplex as formado se incorpora luego al genoma de la clula husped. Los virus ARN que contienen transcriptasa inversa tambin se conocen como retrovirus y constituyen la prueba molecular de que la informacin gentica puede a veces fluir hacia atrs (desde el ARN hacia el ADN). Las transcriptasas inversas, al igual que las ARN polimerasas, carecen de actividad correctora de pruebas y en consecuencia cometen un error cada 20.000 nucletidos aadidos, lo que puede ser un factor importante en la aparicin frecuente de nuevas cepas de virus patgenos 7. Las transcriptasas inversas se han convertido en reactivos importantes en el estudio de las relaciones ARN-ADN y en el clonado de ADN. Permiten las sntesis de un ADN complementario (ADNc) a partir de cualquier molde de ARN, sea ARNm, ARNt o ARNr, procedimiento que constituye la base de la ingeniera gentica. La telomerasa, la enzima responsable de incorporar las secuencias finales en los extremos (telmeros) de los cromosomas tiene caractersticas similares a la transcriptasa inversa. Los telmeros consisten generalmente de muchas copias en tndem de una secuencia oligonucleotdica corta, normalmente de la forma TxGy en una hebra y AxCy en la hebra complementaria, en donde x e y pueden ser de uno a cuatro. La telomerasa es un complejo de ARN y protena, en la que el ARN contiene la copia de la secuencia AxCy adecuada. Esta parte de ARN acta como molde para la sntesis de la hebra T xGy del telmero. En efecto, la telomerasa es una transcriptasa inversa que slo sintetiza un segmento de ADN complementario sobre la base de un molde de ARN interno8
El virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), responsable del SIDA, es un retrovirus. Entre sus genes figura el gen env, que muta a una velocidad muy rpida, lo que perjudica la tarea de confeccionar una vacuna efectiva. Por otra parte, la transcriptasa reversa del virus HIV es unas diez veces menos precisa que otras, por lo que es responsable de la elevada tasa de mutacin producida por este virus. Los primeros frmacos disponibles para el ataque de la enfermedad estn basados en la inhibicin de la accin de esta enzima. 8 La prdida de la actividad telomerasa en los protozoos da lugar a un acortamiento gradual de los telmeros con cada divisin celular, lo que lleva a la muerte de la lnea celular. En el hombre se ha observado una relacin entre longitud telomrica y edad,
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El ltimo aspecto que debemos considerar est relacionado con la replicacin de los ARN vricos, como los que corresponden a los bacterifagos de Escherichia coli, que tienen genomas de ARN. En estos casos la replicacin del ARN del virus se produce por la accin de una ARN polimerasa dirigida por ARN, tambin llamada ARN replicasa. La sntesis tambin sigue la direccin 5 3, careciendo de actividad correctora de pruebas, siendo su frecuencia de errores similar a la de la ARN polimerasa. Bibliografa Alberts, B., D. Bray, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts y P. Walter (1998) Essential Cell Biology. An Introduction to the Molecular Biology of the Cell. Garland Publishing, Inc., New York & London Cooper, G.M. La Clula. 2 edicin. Marbn Libros, S.L., Espaa. 2002. Lehninger, A.L., D.L. Nelson y M.M. Cox (1993) Principios de Bioqumica, Ediciones Omega, Barcelona, 2a edicin (traducido de la segunda edicin inglesa. Lodish, H., A. Berk, S.L. Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore & J. Darnell. Biologa Celular y Molecular, Editorial Mdica Panamericana, 2002. Solomon, E.P., L. R. Berg, D.W. Martin & C. Villee (1996) 3ra. Edicin (traducido de la tercera edicin inglesa, 1993). Interamericana McGraw-Hill, Mxico. CUESTIONARIO TERICO 1) Cul es la estructura de la envoltura nuclear? Qu son los poros nucleares y cmo funcionan? 2) Existe algn tipo de selectividad en el pasaje de sustancias hacia o desde el ncleo? Relacione la permeabilidad de la envoltura nuclear con su ultraestructura. 3) Dadas las siguientes molculas, indique cules atravesarn la envoltura nuclear, en qu direccin, y cul ser su localizacin predominante en la clula: a) histonas, b) desoxirribonucletidos, c) protenas ribosomales, d) ARNt, e) ARNm 4) Cul es la funcin de la lmina nuclear en el proceso de divisin celular? 5) Cmo se denomina la unidad fundamental de empaquetamiento del ADN y cul es su composicin en cuanto a tipo y cantidad de protenas? Cul es la caracterstica principal que hace que dichas protenas se unan al ADN?. 6) Dnde se sintetizan y cmo se ensamblan las protenas histnicas a las molculas de ADN recin replicadas? 7) Qu es el nucleolo, dnde se ubica y cul es su funcin? 8) Describa los mecanismos de la replicacin del ADN. Explique por qu es semiconservativa y por qu se dice que este proceso es semidiscontinuo 9) Mencione las principales diferencias entre la replicacin en clulas procariticas y eucariticas 10) Seleccione la respuesta correcta. La sntesis de las dos nuevas cadenas de una molcula de ADN: a. No es simultnea y se realiza en cualquier sentido (5 3 o 3 5) b. No es simultnea pero se realiza nicamente en sentido 5 3 c. Es simultnea y se realiza en cualquier sentido (5 3 o 3 5) d. Es simultnea y se realiza nicamente en sentido 5 3 11)En qu se diferencian el ARNm, ARNt y el ARNr? Cul es su funcin en la sntesis de protenas?. 12) Qu son las mutaciones y cul es su trascendencia? 13) El ARN se transcribe a partir de una de las dos cadenas (hebras) del ADN dplex. Es indistinto que lo haga a partir de una o de otra? 14) Qu son los intrones y los exones? Qu modificaciones sufre el ARNm luego de transcribirse en clulas eucariotas y procariotas? 15) Cul es la composicin, estructura y ultraestructura de los ribosomas? En qu compartimento celular se sintetizan? 16) Cules son los posibles resultados de un error en la replicacin o en la transcripcin del ADN?
planteando una intrigante cuestin: es este acortamiento gradual de los telmeros la clave del envejecimiento? viene determinada la longitud natural de nuestra vida por la longitud de los telmeros con que nacemos?

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Mdulo 7. TRABAJO EXPERIMENTAL

Objetivos: Observar diferentes tipos celulares con distinto nmero, tamao y morfologa nuclear. Aplicar y discutir los fundamentos de la metodologa para el aislamiento de ncleos a partir de muestras biolgicas y tincin de las estructuras nucleares. Obtencin de hebras de ADN (constituidas por la agrupacin de un gran nmero de molculas ) poniendo en evidencia su estructura fibrilar. I. Observacin de ncleos interfsicos en diferentes tipos celulares Describir y esquematizar clulas con diferente nmero, ubicacin, tamao y morfologa nuclear. 1- Corte histolgico de hgado de rata. Observacin de hepatocitos binucleados. 2- Corte histolgico de msculo esqueltico Observacin de clulas plurinucleares 3- Frotis de sangre humana Observar e identificar diferentes tipos celulares de acuerdo a la presencia o ausencia de ncleo y a la morfologa nuclear. 4- Apice radical Observar e identificar clulas en interfase en dos sectores diferentes de un corte longitudinal del extremo en crecimiento de una raz (pice radical): 1. Meristema radical (extremo subterminal de la raz) 2. Regin de elongacin celular (sector del preparado alejado del meristema) Cmo identifica las clulas en interfase? Describa la estructura de los ncleos en interfase. Qu diferencias se observan en los ncleos de ambos tipos celulares? A qu se deben estas diferencias? II. Aislamiento y observacin de ncleos interfsicos a partir de timo y obtencin de hebras de ADN. 1- Tomar un trozo de timo de aproximadamente 20 g y cortarlo con tijera en trozos lo ms pequeo posibles. Colocar los trozos en un mortero, aadir un poco de arena lavada y 30 ml de solucin hipotnica de citrato de sodio 0,1 M. Triturar el material hasta que quede una suspensin homognea y semilquida. 2- Filtrar el homogenado a travs de gasa para eliminar los restos groseros. 3- Centrifugar el homogenado repartido en dos tubos plsticos a 3000 rpm durante 10 minutos para sedimentar los ncleos. Con pipeta Pasteur extraer y desechar el sobrenadante. 4- Tomar una muestra del sedimento y extenderla sobre un portaobjetos. Secar al calor suave. Cubrir el extendido con una solucin de cristal violeta al 1% durante 1 minuto. Lavar con agua, secar y observar al microscopio. 5- En cada tubo, agregar 10 ml de NaCl 2M y 4 ml de SDS (dodecil sulfato de sodio) al 10%. Resuspender suavemente por agitacin e incubar durante 5 minutos con agitacin ocasional. El agregado de la

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solucin de NaCl y del detergente (SDS) provoca la ruptura de las envolturas nucleares y adems contribuye a la separacin de las protenas que se encuentran unidas al ADN. 6- Centrifugar 10 minutos a 3000 rpm para eliminar los restos insolubles. Pasar los sobrenadantes a un vaso de precipitado chico teniendo la precaucin de no producir espuma. 7- Aadir lentamente, resbalando por las paredes del vaso, 20 ml de etanol 96 fro, de manera que se formen dos capas. Dejar reposar 2 a 3 minutos. 8- Introducir con cuidado una varilla de vidrio perpendicularmente al fondo del vaso y hacerla rotar suavemente en una misma direccin. Con el agregado del etanol el ADN precipita, pudindose observar la formacin en la interfase de unos filamentos blanquecinos que son un agrupamiento de un gran nmero de molculas de ADN. Estos agrupamientos se van enganchando y enrollando a la varilla.

El producto filamentoso obtenido durante la extraccin no es ADN puro ya que, entremezclado con l, hay otras molculas, fundamentalmnte ARN. Para obtener una preparacin ms pura es necesario aadir enzimas (ribonucleasas) que degradan las molculas de ARN e impiden que se unan al ADN.