UROCULTIVO

Varios miembros de las enterobacterias pueden aislarse de la orina en el curso de infecciones del aparato urinario o urogenital, como tambin en otros tipos de afecciones. La orina vesical normalmente no contiene microorganismos. Sin embargo, los primeros 10 a 15 ml. de orina emitidos por personas normales de cualquier edad o sexo, siempre presentan bacterias, las que proceden de la flora corriente de la uretra anterior, prepucio, regin vulvovaginal o de contaminacin fecal. La flora de estas localizaciones es variada y est constituida por estafilococos coagulasa-positivo y negativos, estreptococos diversos, bacilos difteromorfos, enterobacterias, lactobacilos, micoplasmas, bacterias anaerobias, levaduras y muchos microorganismos. En la presencia de esta flora influyen localizacin anatmica, sexo, edad, hbitos de higiene y factores patolgicos propios del husped. En la etiologa de las infecciones urinarias predominan los bacilos gramnegativos. Los procesos agudos y crnicos son provocados por E. coli y por especies de los gneros Enterobacter, Proteus, Citrobacter, Pseudomonas, Serratia, etc. De estos agentes, E. coli se asla en 80% de los casos. Ps.aeruginosa y S.marcescens se identifican en pacientes hospitalizados, muy debilitados o sometidos a instrumentacin repetida. Con bastante menor frecuencia desempea un papel causal Streptococcus faecalis (enterococo) y excepcionalmente los estafilococos. El examen microbiolgico de una muestra de orina se denomina Urocultivo. ste se ha de hacer desde un punto cuantitativo y cualitativo.

A. Examen cuantitativo
Mtodo de conteo en placa o recuento de colonias. Introducido por Kaas para evitar los riesgos del cateterismo vesical y diferenciar bacteriuria verdadera de contaminacin, se realiza de la siguiente manera:
y y

Se homogeneiza la muestra mediante agitacin. Se diluye la muestra al 1:100, colocando 0.1 ml. de orina en 9.9 ml. de caldo de tripticasa o de suero fisiolgico, estriles. Se preparan diluciones al 1:1000 y 1:10 000, a partir de la dilucin al 1:100. Se deposita 1 ml. de cada dilucin en placas de Petri esterilizadas, sobre las cuales se vaca un tubo de agar-tripticasa o medio CLED, fundidos y enfriados a 45. Mediante rotacin suave, se favorece la distribucin homognea de la siembra. Se incuban todas las siembras a 37 durante 24 a 48 horas.

y y

Para calcular el nmero de colonias se eligen placas que contengan entre 30 y 300 colonias. Contadas stas, basta multiplicar su nmero por la dilucin respectiva para obtener la cuenta total. Mtodo del asa calibrada. Esta estimacin cuantitativa consiste en sembrar una placa con medio de agar-sangre o agar con CLED en una muestra de orina, sin centrifugar, empleando asa de platino calibrada (4 mm. de dimetro). Despus de incubar las siembras a 37 durante 24 a 48 horas, se cuenta el nmero de colonias desarrolladas y el resultado se multiplica por 100, ya que la asada de platino contiene 0.01 ml. de orina. Los resultados del estudio cuantitativo se informan de la siguiente manera:
y y y y

No hubo desarrollo microbiano. Menos de 10 000 colonias por ml. Entre 10 000 y 100 000 colonias por ml. Ms de 100 000 colonias por ml.

Cuando se obtienen dos recuentos sucesivos con ms de 100 000 colonias por ml., la probabilidad de infeccin es de 80%, cifra que se eleva a 95% si el mismo resultado se logra en tres recuentos sucesivos. Por lo general, las muestras contaminadas tienden a mostrar cuentas inferiores a 10 000 colonias/ml. Cuando el recuento revela valores intermedios, entre 10 0000 y 100 000 colonias /ml, el examen debe repetirse. Conviene advertir que pueden pasar inadvertidas infecciones urinarias verdaderas, si no se toman en cuenta cuentas inferiores a 100 000 colonias por ml, ya que existen diversos factores que pueden explicar recuentos bajos en infecciones urinarias verdaderas, diuresis acentuada, obstruccin uretral, infecciones crnicas e infecciones por cocos grampositivos.

b. Examen cualitativo
El estudio cualitativo, que conduce a la identificacin del agente, se realiza mediante la siembra de la muestra homogeneizada, en placas con agar-sangre, agar-CLED, agar de Levine o MacConkey. Es recomendable el medio CLED, porque favorece el desarrollo de bacterias patgenas urinarias y permite la identificacin de los microorganismos contaminados. Su contenido en cistena y lactosa y su deficiencia en electrolitos facilitan, por una parte, el reconocimiento de colonias de bacterias y, por otra, inhiben el carcter invasor de las colonias de Proteus. As se facilita la identificacin de estafilococos, bacilos difteromorfos, lactobacilos y otros agentes que pueden contaminar la orina. La identificacin final de los agentes se hace mediante el estudio de sus propiedades bioqumicas y caractersticas serolgicas. Esto permite establecer relaciones de identidad entre microorganismos aislados en cultivos sucesivos o de control, y definir el estado de

revivida o de reinfeccin. De esto deriva el valor que tiene el conocimiento del biotipo, del serotipo (particularmente en E. coli), del piocinotipo (en especial cuando es de Ps. aeruginosa) y del antibitico. ste ltimo se obtiene al comparar el antibiograma de cepas aisladas de muestras obtenidas de diferentes oportunidades en un mismo paciente Si existe correspondencia, se concluye que se trata de una misma cepa.

* Mtodos rpidos de diagnstico.

Existen varios procedimientos prcticos y econmicos para el diagnstico rpido de infecciones urinarias o de bacteriurias significativas. Son tiles para investigar grandes grupos de personas. Estos mtodos pueden ser microscpicos, qumicos o de microcultivo. La coloracin de un frotis de orina no centrifugada mediante el mtodo de Gram constituye un ndice prctico para diferenciar entre infeccin y contaminacin urinarias. En efecto, la observacin de un bacilo gramnegativo por campo microscpico puede realizarse cuando la muestra contiene ms de 100 000 bacterias por ml. Sin embargo, la dificultad de encontrar bacterias en frotis de orina por este mtodo, provoca resultados falsos negativos. Menos confiable aun es el hallazgo de 20 o ms bacterias gramnegativas por campo microscpico de sedimento urinario, aunque dicho nmero permita sospechar recuentos superiores a 100 000 microorganismos por ml. Los procedimientos qumicos estn basados en propiedades enzimticas de las bacterias, que se pueden poner de manifiesto en la orina. Entre las pruebas se pueden mencionar: catalasa, reduccin de nitratos, reduccin de trifeniltetrazolio e hipoglucosuria. Estos mtodos, aunque rpidos y econmicos, tienen el inconveniente de ser indirectos, basarse en propiedades metablicas de las bacterias y no en su desarrollo y observacin, y producir muchos falsos negativos. II. REALIZACIN DE LA PRCTICA A. TOMA DE LA MUESTRA El mtodo ms recomendado para realizar la recogida de muestra para un urocultivo es la toma, durante el periodo medio de la miccin, siempre que el paciente sea capaz de limpiarse y recogerla, ya que la muestra de orina requiere una cuidadosa limpieza de los genitales externos. Esta tcnica impone los siguientes requisitos: El paciente debe tener como mnimo de tres a cuatro horas de retencin de orina, y la muestra ms representativa es la primera orina de la maana. El paciente no debe haber recibido tratamiento antimicrobiano durante los tres das anteriores a la recoleccin, exceptuando los casos de control de tratamiento, y paciente gravemente enfermos. Esta tcnica no es apropiada para nios que no controlan sus esfnteres, en cuyo caso se procede a hacer limpieza de los genitales y a fijar un recolector de orina estril (especial

para bebs). Se deja en esta posicin hasta que el nio realice su miccin; se despeja el recolector y se sella inmediatamente. No debe dejarse colocado el recolector por tiempo prolongado. La alta probabilidad de contaminacin en muestras de orina de lactantes, obliga a realizar el estudio en tres muestras sucesivas de miccin espontnea. En ciertas ocasiones se justifica el sondeo uretral o la aspiracin suprapbica. No obstante, existe un pequeo riesgo de infeccin tras sondeo uretral, el cual vara segn el tipo de paciente. Debido a la colonizacin por bacterias de la uretra, suele ser difcil definir si los microorganismos aislados a partir de orina tomada con sonda son de origen urinario o uretral. En los pacientes con sonda uretral permanente con drenaje cerrado, la orina para cultivo se recoge despus de desinfectar la pared de la sonda en su punto de unin con el tubo de drenaje. Se aspira la orina por medio de puncin en la sonda con una aguja 21. En ningn momento deber sacarse de la bolsa de drenaje material para cultivo. b. Conservacin y/o Transporte En lo que respecta al transporte y conservacin de muestras de orina, hay que tener en cuenta que la orina constituye un excelente medio de cultivo para casi todas las bacterias, por lo que una vez recogida, la muestra debe enviarse de inmediato al laboratorio, previa colocacin del envase en un recipiente que contenga cubos de hielo. Este procedimiento permite que el nmero de bacterias permanezca relativamente constante por un tiempo considerable. C. Procesamiento de la muestra Una vez se ha obtenido la muestra de orina se homogeneiza en dos partes: Una parte de la muestra va destinada al Examen en Fresco y posterior Tincin. La otra parte va destinada al Urocultivo. En nuestra prctica vamos a realizar en primer lugar una siembra en placa con la muestra de orina. Cuando se desean observar las caractersticas de las colonias de un microorganismo, las placas de Petri resultan muy adecuadas para tal fin. La poca profundidad de la placa y la extensa superficie de cultivo facilitan el examen macroscpico de las colonias as, como si fuera necesario, la observacin microscpica de las mismas. Para aislar colonias de modo individualizado el medio en placas de Petri se inocula de la siguiente manera. Empleando un asa estril se extiende la toma de la muestra a modo de estras en el primer cuadrante. A continuacin se hace lo mismo en el segundo cuadrante pero en una direccin diferente a la anterior. En el tercer y cuarto cuadrante hacemos lo mismo.

Una vez realizada la extensin de la muestra dejamos incubar la muestra a 37 C durante 24 o 48 horas. A continuacin vamos a hacer un urocultivo en el cul emplearemos un tubo a cuyo tapn hay unido una lengeta. En cada cara de la lengeta hay una medio de cultivo. En nuestro caso, uno de los medios de cultivo es agar MacConkey y el otro es Agar CLED. EL agar MacConkey es un medio selectivo-diferencial. Los microorganismos aislados de orina pueden ser fermentadores o no fermentadores de la lactosa. Se emplean medios diferenciales para distinguir unos de otros. El medio MacConkey se utiliza para diferenciar los microorganismos intestinales fermentadores de la lactosa de los que no presentan esta propiedad. En el agar, los nutrientes bsicos son el agar y la peptona. El taurocolato sdico (sal biliar) inhibe la flora Gram positiva, mientras que la lactosa y el indicador (rojo neutro) diferencia los fermentadores de la lactosa de los que no tienen esta capacidad. Los microorganismos que fermentan la lactosa producen cido lctico, que neutraliza la sal biliar y absorbe el colorante dando colonias rojizas. Los microorganismos que no fermentan la lactosa dan una reaccin alcalina, no toman el rojo neutro y dan lugar a colonias incoloras. Composicin del agar MacConkey: Taurocolato sdico 5 g. Peptona 20 g. Lactosa 10 g. ClNa (opcional) 5 g. Agar deshidratado 15 g. Solucin acuosa rojo neutro al 1% 5-7 ml. Agua destilada 1000 ml.

ANTIBIOGRAMA
Se entiende por antibiograma el estudio de la sensibilidad "in vitro" de las bacterias a los antibiticos. Por extensin, se suele incluir el estudio de la sensibilidad a las sulfamidas y otros quimioterpicos. Utilidad: La razn por la cual es conveniente el estudio del antibiograma de una bacteria determinada radica en el hecho de la diferente sensibilidad a los antibiticos de las distintas especies bacterianas y, ms an, en el hecho de que en numerosas especies existen grandes diferencias de sensibilidad a un determinado antibitico entre unas y otras cepas. El antibiograma es un mtodo de diagnstico rpido y preciso Con ayuda del antibiograma se puede escoger el antibitico ms adecuado para el tratamiento de una enfermedad. Mtodo de la difusin en medio slido Se siembra, con el grmen a estudiar, una placa de un medio de cultivo adecuado. Sobre la superficie del medio se colocan discos de papel impregnados con el antibitico o quimioterpico a ensayar. Si el germen estudiado es sensible, en torno al disco se observar un halo, en el cual no hay proliferacin de bacterias. Si el germen es resistente al antibitico, crecer uniformemente y no habr ningn halo de inhibicin en torno al disco de papel.

Preparacin de los discos impregnados de antibitico para realizar un antibiograma. En las casas de productos de laboratorio pueden adquirir se los discos que se emplean para hacer un antibiograma. Sin embargo, como aprendizaje, y con bastante fiabilidad, es fcil prepararlos a partir de las cpsulas, comprimidos grageados o viales de 250 mg 500 mg de los antibiticos que expenden en las farmacias.

Para que la concentracin de antibitico que impregna los discos no sea ni excesiva ni insuficiente, y sea posible distinguir los halos de inhibicin, se puede proceder del siguiente modo, realizando un banco de diluciones. La concentracin de 0,1 mg/cl ya es adecuada para trabajar. Para evaluar, aproximadamente, el volumen de una gota se pueden colocar en una probeta gra duada 100 gotas calculando el volumen que ocupan; dividiendo por 100 tendremos el volumen que corresponde a una gota. Suponiendo que el volumen hallado para una gota sea de 0,003 ml, la expresin 0,1 x 0,003 nos dar la concentracin de antibitico en mg/ gota. De este modo sabremos la concentracin de antibitico con que impregnamos los discos de papel secante, que se acostumbran a tomar de 6,5 m m de dimetro. Repitiendo la operacin con cpsulas de distintos antibiticos podremos preparar diferentes discos.

Medios de cultivo. Los distintos microorganismos tienen distintas exigencias tanto en los que se refiere al medio nutritivo en s como a la temperatura de incubacin ya las condiciones atmosfricas. Casi todos los microorganismos pueden cultivarse en medios nutritivos inertes. Hay medios de cultivo lquidos y slidos; de hecho los slidos son medios de cultivo lquidos a los que se adicionan diferentes sustancias, las ms utilizadas son el agar y la gelatina.

Agar ordinario peptona 15 gr/l NaCl 5gr/l agar 12gr/l Agar nutritivo Agar nutritivo Agar ordinario ms 10 gr/1 de glucosa Los medios de cultivo deben estar ajustados a un pH adecuado. El agar ordinario y el agar nutritivo a un pH = 7,2. El ajuste se realiza con NaOH y/o HCl en soluciones 1 N y 1/10N. Se acostumbra a hacer antes de la esterilizacin, aunque, a veces, debe hacerse despus. La esterilizacin de los medios de cultivo se hace generalmente calentndolos en un autoclave a 121 C ya una atmsfera de presin de vapor, durante 15-30 minutos. Alternativamente puede utilizarse una olla a presin adecuada. Lectura del antibiograma. Una vez sembrada una placa de un medio de cultivo adecuado y colocados los distintos discos im pregnados de antibitico y una vez colocada a incubacin en la estufa durante unas horas, se procede a la lectura de los resultados, que puede hacerse a intervalos peridicos, basada en la medi cin del halo de inhibicin. Segn la amplitud de este halo los grmenes se clasifican en: -RESISTENTES -SENSIBLES -MUY SENSIBLES Debe tenerse presente que el dimetro del halo de inhibicin depende tambin de la difusibilidad del antibitico y, por tanto, no es una medida absoluta de la eficacia. Los datos que proporciona el antibiograma son muy valiosos pero su aplicacin no es tan sencilla. Para la prescripcin correcta de los antibiticos hay que tener en cuenta siempre la naturaleza del proceso infeccioso, la historia clnica del paciente, el mecanismo de accin del antibitico, la toxicidad, las posibles sensibilizaciones del paciente, la va de administracin, etc.