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CAPTULO

Consideraciones iniciales y tcnicas

La tercera columna sobre la que se fundamenta el diagnstico de las enfermedades hematolgicas es la citogentica y la biologa molecular. En esta rea, se produjeron importantes desarrollos metodolgicos: para la rutina, estn establecidas la hibridacin fluorescente in situ (fluorescent in situ hybridisation, FISH) y la reaccin en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction, PCR). Los mtodos para la determinacin de la ganancia o de la prdida de material gentico (comparative genomic hybridisation, CGH) y el anlisis de la expresin gnica mediante la tecnologa Chip constituyen metodologas que an no se utilizan en el diagnstico de rutina, aunque estn cerca de ello. Todos los mtodos mencionados intervienen conjuntamente en la clasificacin y el diagnstico de las enfermedades hematolgicas ( Cuadro 1.1). Este libro se centra en la morfologa de las clulas de la sangre y de la mdula sea. Puesto que la inmunologa, la biologa molecular y la citogentica se han vuelto esenciales para el diagnstico y la clasificacin de algunas enfermedades, se ha buscado presentar adecuadamente la relacin con estas metodologas. Tambin se presenta la conexin con los parmetros clnicos en aquellos casos en que stos resultan esenciales para el diagnstico y el tratamiento de las patologas mencionadas.

En el diagnstico de rutina actual, la diferenciacin de los leucocitos se efecta mediante el uso de contadores citolgicos. Segn la clase de equipo que se utilice, las clulas se diferencian en funcin de caractersticas tales como el tamao, la dispersin ptica, la impedancia; en parte tambin mediante coloracin citoqumica. Cuando se trata de la identificacin de clulas patolgicas, este tipo de diferenciacin se limita a la expresin de seales de advertencia. En la prctica mdica, la diferenciacin de los leucocitos mediante sistemas de anlisis de imgenes est poco difundida. Por lo tanto, la evaluacin microscpica y morfolgica de extendidos de sangre y de preparados de mdula sea constituye an la base del diagnstico hematolgico, que se complementa con la determinacin de enzimas caractersticas y otros componentes celulares mediante tcnicas citoqumicas. No obstante, el significado prctico de la citoqumica ha disminuido significativamente por la existencia de mtodos alternativos, y en muchos aspectos, slo debe considerarse como referencia histrica. El segundo pilar del diagnstico hematolgico es la caracterizacin inmunolgica de las clulas. En este punto, la citometra de flujo, que permite la deteccin de muchos antgenos en una clula, adquiere una importancia dominante. Las poblaciones celulares pueden caracterizarse exactamente mediante mediciones multiparamtricas. Otros mtodos relevantes son la inmunocitologa y la inmunohistologa. En este caso, los antgenos presentes en las clulas de extendidos y cortes histolgicos se marcan mediante el empleo de anticuerpos. La ventaja de estos procedimientos es que la expresin de determinados antgenos y protenas se asigna a clulas individuales, mantenindose las relaciones morfolgicas. En la prctica, los estudios inmunocitolgicos sobre extendidos son poco frecuentes y se realizan slo ante situaciones especiales. En la histologa, estas tcnicas son de rutina.

1.1 Obtencin de los preparados

La preparacin de extendidos de buen valor cualitativo es una condicin indispensable para lograr un diagnstico morfolgico significativo. Esto es particularmente importante para la citologa de mdula sea. Slo una experiencia suficientemente larga aporta las habilidades tcnicas requeridas. A continuacin, se indican algunos consejos metodolgicos. En la prctica, se utilizan generalmente portaobjetos

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1 Consideraciones iniciales y tcnicas

Cuadro 1.1 Mtodos de diagnstico y clasificacin de las enfermedades hematolgicas Criterios clnicos
Morfologa Tincin panptica (Pappenheim) Citoqumica (peroxidasa, tincin con azul de Prusia, entre otros) Inmunologa y marcadores de superficie Citometra de flujo Inmunocitologa Inmunohistologa Citogentica y biologa molecular Citogentica tumoral convencional Hibridacin fluorescente in situ (FISH) Combinaciones de citogentica y FISH (p. ej., tincin cromosmica o chromosome painting) Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), cualitativa y cuantitativa Anlisis de la expresin gnica con tecnologa Chip (micromatrices gnicas) Hibridacin genmica comparativa (CGH) Fig. 1.1 Preparacin de un frotis sanguneo

1.1.2 Concentrado de leucocitos

En casos de leucopenia, la preparacin de un concentrado de leucocitos puede resultar til. De esta forma, puede presentarse tambin una pequea cantidad de clulas patolgicas para el anlisis de su morfologa o la realizacin de tinciones especiales. Procedimiento: 1 parte de gel (Plasmagel, Braun, Melsungen, Alemania), 4 partes de sangre. Incubar durante 15 min a 37 C en estufa, aproximadamente 7 minutos en posicin inclinada (45) y alrededor de 7 minutos en posicin vertical ( Fig. 1.2 a). La fase superior es rica en leucocitos. sta se transfiere a un tubo nuevo ( Fig. 1.2 b) y se centrifuga suavemente a 1200 U/min (aproximadamente 500 G) durante 5 minutos. Se descarta el sobrenadante, se resuspende el sedimento y se preparan los extendidos. Atencin: Prestar atencin a la conservacin de la esterilidad. Las bacterias presentes en el Plasmagel pueden ser fagocitadas por granulocitos o por monocitos durante el procedimiento de concentracin a 37 C, lo que puede originar interpretaciones errneas.

con borde esmerilado para las inscripciones. La identificacin inequvoca (apellido y nombre, fecha de nacimiento y fecha de obtencin de la muestra o nmero de laboratorio con referencia a dichas indicaciones en el libro del laboratorio) debe estar garantizada.

1.1.1 Frotis sanguneo

Durante la preparacin de los frotis o extendidos sanguneos, debe tenerse en cuenta que slo 2/3 a 3/4 del portaobjetos puede quedar cubierto por el preparado. Los cubreobjetos largos (24 50 mm) son los ms adecuados para realizar el frotis ( Fig. 1.1). El grosor del extendido en el ltimo tercio del preparado debe ser tal que permita que los eritrocitos se distribuyan parcialmente aislados entre s y tambin juntos como pequeas pilas de monedas. Los preparados muy gruesos hacen imposible el anlisis de las estructuras celulares finas, dado que las clulas no se encuentran suficientemente extendidas.

1.1.3 Citologa de mdula sea

Al igual que con la sangre, pueden prepararse extendidos a partir de punciones de mdula sea ( Fig. 1.4). Tambin pueden realizarse preparados por presin de la mdula sea ( Fig. 1.6). Para la anticoagulacin de la mdula sea, se recomienda utilizar jeringas de 20 mL pretratadas con 1-2 mL de EDTA (etilendiaminotetraactico) 2% en H2O para inyeccin. Despus de la aspiracin, se deja gotear la mezcla de aspirado de mdula sea y EDTA

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1.1 Obtencin de los preparados

Fig. 1.2 Representacin esquemtica de la obtencin de un preparado de leucocitos

Portaobjetos

Superficie rugosa para la identificacin

Fig. 1.5 Esquema de la morfologa de un extendido de mdula sea

Fig. 1.3 Para la recuperacin de fragmentos de mdula sea, dejar correr el aspirado; los fragmentos son visibles sobre el portaobjetos

Fig. 1.6 Obtencin de un preparado de mdula sea por presin

Fig. 1.4 Preparacin de un extendido de mdula sea

Fig. 1.7 Esquema de la morfologa de un preparado de mdula sea por presin

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1 Consideraciones iniciales y tcnicas Los preparados por presin pueden obtenerse mediante distintos mtodos. A fin de proteger a las clulas, los fragmentos de mdula sea deben presionarse con extremo cuidado. Se puede ejercer la presin con ayuda de un portaobjetos, que se arrastra sobre el primer portaobjetos en direccin longitudinal. De esta manera, el material de los fragmentos se extiende en una capa ms fina. Una forma ms preservadora pero ms difcil es la realizacin de preparados por presin con un cubreobjetos grande. En este caso, el cubreobjetos se emplea como una esptula para extender los fragmentos de mdula sea sobre el portaobjetos ( Fig. 1.6). Debe tenerse en cuenta que en los extendidos derivados de punciones de mdula sea, existe un nmero suficiente de regiones finas que, gracias a la distribucin homognea de los elementos celulares que permanecen ntegros y en lo posible cercanos, permiten una evaluacin correcta. Cuando la tcnica se realiza de manera ptima, los preparados por presin tienen la ventaja de que existe una gran superficie con clulas nucleadas entre los fragmentos de mdula sea para su evaluacin ( Fig. 1.7). La desventaja es el riesgo de la presencia de artefactos como consecuencia de la presin.

Cuadro 1.2 Comparacin entre el valor diagnstico de la citologa y la histologa de mdula sea en 300 casos (Evaluacin histolgica: Prof. Lennert, Kiel; Prof. Burkhardt, Mnchen). Diagnstico
Anemias (general) Anemia aplsica Panmieolopata Mielodisplasia Leucemia aguda Leucemia mieloide crnica (LMC) Policitemia vera

Citologa Histologa
+++ + + ++ +++ + + poco frecuente ++ ++ (+)/+(F?)* poco frecuente (F?) + ++ +++ +

Mielosis megacarioctica, +/ mielofibrosis + Linfoma no Hodgkin (LNH): leucemia linfoide crnica (LLC) leucemia de clulas pilosas Otras formas Plasmocitoma Linfoma de Hodgkin (+) +/++ +++ (+)

++ ++ + (F) + ++ + poco frecuente

1.1.4 Citologa frente a histologa

En la citologa de mdula sea, es posible la evaluacin morfolgica de las clulas individuales ( Fig. 2.1 y Fig. 2.2). Por el contrario, la fortaleza de la histologa radica en la representacin de la estructura de la mdula sea, de la formacin de fibras y en el reconocimiento de alteraciones locales, como por ejemplo, infiltrados de clulas tumorales o granulomas. La comparacin de las observaciones citolgicas e histolgicas aporta los puntos centrales que se muestran en el cuadro de la izquierda ( Cuadro 1.2) para cada uno de los mtodos de evaluacin. Debe considerarse como regla general que, en todos los casos en los que la evaluacin citolgica e histolgica resulte dudosa y en la puncin seca, el diagnstico que prevalece es el histolgico.

Metstasis de carcinomas + Citoqumica: Fe + Otras reacciones

* F = Fuente de error

+++

sobre un portaobjetos dispuesto dentro de una pequea placa de Petri u otro recipiente similar. Los fragmentos de mdula sea se depositan ( Fig. 1.3). Se pueden juntar con un poco de sangre de la mdula con un cubreobjetos para realizar los extendidos o los preparados por presin. Los extendidos de mdula sea se preparan de la misma manera que los frotis sanguneos ( Fig. 1.4). Los fragmentos de mdula sea se disponen sobre el borde en pluma del extendido ( Fig. 1.5). Una de sus ventajas es que el riesgo de magullar a las clulas es menor. La desventaja es que al arrastrar a los fragmentos de mdula sea quedan pocas clulas nucleadas disponibles para su evaluacin.

1.2 Generalidades acerca de los mtodos de tincin

Para la evaluacin morfolgica de los preparados de

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1.2 Generalidades acerca de los mtodos de tincin

Anticuerpos monoclonales conjugados con fluorescena Anticuerpo puente (de conejo) Complejo APAAP

Anticuerpo primario (de ratn, monoclonal)

Clula con el antgeno

Clula con el antgeno

Fig. 1.8 Principio de la inmunocitologa con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorescena

Fig. 1.9 Principio de la inmunocitologa con mtodos inmunocitoqumicos (reaccin APAAP)

sangre y de mdula sea, se realiza una tincin panptica segn Pappenheim ( Cap. 1.7). Adems de la tincin panptica de Pappenheim, existen otras tinciones especiales y reacciones citoqumicas. Las tinciones especiales se fundamentan en la deteccin de sustancias particulares en las clulas (ejemplo: deteccin de hierro con la tincin de azul de Prusia). Las reacciones citoqumicas utilizan enzimas presentes en las clulas para transformar sustratos incoloros en productos coloreados (ejemplo: peroxidasa). Estas ltimas reacciones dependen de que las enzimas correspondientes no se hayan degradado y, por lo tanto, puedan ser utilizadas slo durante un tiempo limitado sobre preparados conservados a temperatura ambiente. Debido a las tcnicas alternativas, como por ejemplo, la citometra de flujo, las tinciones citoqumicas tienen actualmente escasa relevancia: se utilizan principalmente la reaccin de la peroxidasa para la identificacin de leucemias mieloides y la tincin de azul de Prusia sobre el hierro en los sndromes mielodisplsicos. Los mtodos inmunocitolgicos permiten la deteccin de antgenos de superficie, antgenos citoplasmticos y antgenos nucleares. Estos mtodos fueron creados gracias al desarrollo de los anticuerpos monoclonales. La gran cantidad de anticuerpos monoclonales producidos que reconocen clulas hematopoyticas y linfoides ha hecho necesaria la creacin de una nomenclatura internacional nica, que fue desarrollada durante los International Workshops on Human Leukocyte Differentiation Antigens y que actualmen-

te contina con la denominacin de Human Cell Differentiation Molecules. Los anticuerpos monoclonales que presentan reactividad serolgica similar, que reconocen el mismo antgeno, aunque no necesariamente el mismo eptopo de un antgeno, fueron asignados a un as llamado grupo de diferenciacin (cluster of differentiation, CD) y numerados consecutivamente. La lista detallada con numerosas referencias puede encontrarse en Internet (http://www.hlda8.org). La reaccin de los anticuerpos monoclonales especficos (anticuerpos primarios) puede visualizarse o detectarse de diversas maneras: los anticuerpos primarios pueden conjugarse directamente con cromforos fluorescentes ( Fig. 1.8) y el resultado de la reaccin puede visualizarse mediante un microscopio de fluorescencia. La desventaja de este mtodo es que slo puede evaluarse la morfologa mediante contraste de fase. Adems, los preparados pierden rpidamente la fluorescencia (decaen) y, por lo tanto, no pueden ser archivados. Otro mtodo para la visualizacin de la reaccin de los anticuerpos primarios es la reaccin APAAP (alkaline-phosphatase and mouse monoclonal antialkaline-phosphatase). En ella, el primer anticuerpo se acopla a un anticuerpo anti-Ig de ratn (anticuerpo puente), que, a su vez, es reconocido por un anticuerpo monoclonal de ratn conjugado con fosfatasa alcalina. Esta enzima puede transformar un sustrato en una sustancia de color rojo brillante ( Fig. 1.9). La realizacin de las evaluaciones inmunocitolgicas requiere que las estructuras superficiales de las

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1 Consideraciones iniciales y tcnicas Signos de displasia de los neutrfilos? Modificaciones reactivas de los linfocitos? Clulas patolgicas? Precursores nucleados de la serie roja? Durante la evaluacin de la composicin cuantitativa de leucocitos, debe tenerse presente la elevada variacin estadstica que conlleva el recuento habitual de 100 clulas. El intervalo de confianza de 95% para un valor de 5% sobre 100 clulas evaluadas es de entre 0,64 y 9,36%.

clulas estn intactas. Por consiguiente, los preparados que deben evaluarse mediante tcnicas inmunocitolgicas deben procesarse o congelarse en un plazo no mayor de 24 horas. Para el congelamiento, los preparados deben envolverse en papel de aluminio. Antes de la realizacin de las tcnicas inmunocitolgicas, los preparados se descongelan dentro del envoltorio.

1.3 Observacin microscpica

1.3.1 Frotis de sangre perifrica
La observacin microscpica de un extendido sanguneo se realiza en primera instancia con los objetivos 10 y 40 con un ocular 10 , a fin de obtener rpidamente un panorama general respecto de la cantidad y la calidad de las clulas presentes en el preparado y, dado el caso, tambin de sucesos poco frecuentes. La verdadera diferenciacin del frotis sanguneo se realiza con ayuda de la inmersin en aceite con objetivos 60 a 100 . Se recorre el ltimo tercio del extendido en patrn de guarda griega, sin prestar atencin a las prolongaciones terminales, dado que en esta zona pueden acumularse artificialmente algunos glbulos blancos parcialmente daados, lo que puede originar falsos recuentos. Por otro lado, en esta porcin del preparado, al igual que en los laterales, pueden buscarse intencionalmente clulas patolgicas. Las sombras nucleares o las clulas alteradas artificialmente no se incluyen en la diferenciacin (existe una posible excepcin en la LLC: en este caso, se considera que deben incluirse las sombras nucleares en la diferenciacin). Durante la evaluacin de la morfologa de los eritrocitos, debe tenerse en cuenta que su forma se modifica artificialmente en las zonas muy finas o muy gruesas del extendido. Es importante realizar la observacin esquemticamente, casi como si se siguiera una lista, para no olvidar nada: Eritrocitos: Tincin? Tamao en relacin a los linfocitos? Morfologa? (p. ej., esferocitos, inclusiones malaria, fragmentocitos, etc.) Plaquetas: Nmero en relacin a los eritrocitos? Agregados? Tamao normal? Megaplaquetas? Etc. Clulas nucleadas: Cantidad? Composicin?

1.3.2 Preparados de mdula sea

Al igual que con los frotis sanguneos, los preparados de mdula sea deben visualizarse inicialmente con bajo aumento, a fin de obtener una visin general del cuadro celular y evitar la falta de deteccin de modificaciones localizadas (nidos de clulas tumorales, granulomas). En todos los casos, los hallazgos ms llamativos se esclarecen mediante inmersin en aceite, con aumento de 60 a 100 veces. Su utilizacin se ubica en segundo lugar despus del examen mdico. Slo este tipo de anlisis combinado de la puncin medular requiere integridad de las clulas. El recorrido inicial del preparado con poco aumento facilita tambin el reconocimiento de aquellas zonas en las cuales las clulas pueden evaluarse adecuadamente. Las zonas ideales y ms representativas son las cercanas a los fragmentos de mdula sea, en las cuales las clulas se encuentran bien distribuidas y teidas, sin artefactos producidos por la presin. Las clulas no intactas (sombras nucleares, clulas magulladas o que demuestren otros artefactos) no se incluyen en la evaluacin. Sin embargo, la presencia de una proporcin elevada de dichos artefactos debera constar en el informe, puesto que limita la capacidad de evaluacin del preparado. En el informe de una evaluacin de mdula sea tambin es importante completar sistemticamente los distintos tems y documentarlos como corresponde: Panorama general: Celularidad? Artefactos? Nidos de clulas tumorales? Otras particularidades? Megacariocitos: anlisis cualitativo y cuantitativo Eritropoyesis: proporcin y estado de maduracin de las clulas nucleadas, modificaciones displsicas, alteraciones de la maduracin? Granulopoyesis: Diferenciacin normal? Multi-

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1.3.2 Preparados de mdula sea plicacin de blastos, desviacin a la izquierda? Signos de displasia o alteraciones de la maduracin? Particularidades: Eosinofilia? Mastocitos? Plasmocitos? Linfocitos? Clulas patolgicas? La produccin peridica de anlisis cuantitativos de mdula sea se realiza en una minora de laboratorios. Para el nmero de clulas por analizar que se emplea de rutina (entre 200 y 500), la significancia es moderada debido a la variacin estadstica. En consecuencia, para una proporcin de 5% de un total de 500 clulas analizadas, el intervalo de confianza de 95% se ubica entre 3,05 y 6,95%. Sin embargo, durante la evaluacin de la remisin o en el diagnstico de una leucemia aguda, se incluye una proporcin de clulas correspondiente a los blastos. Naturalmente, en este caso, se debe procurar contar los blastos en relacin con una cantidad de clulas relativamente grande. Por ltimo, debe mencionarse que, para todo aquel

interesado en la hematologa, resulta extremadamente valioso construir una coleccin de preparados de muestra. Otras posibilidades surgen a partir de la documentacin fotogrfica obtenida por tcnicas digitales, que en la actualidad se encuentra fcilmente disponible.

1.3.3 Conceptos clave del diagnstico hematolgico microscpico

C O N C E P TO S C L AV E
El diagnstico no es posible sin frotis ptimos; el recorrido inicial de los preparados a escaso aumento; la evaluacin sistemtica de todas las series celulares; el resumen de la evaluacin de los preparados de sangre y mdula sea.

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