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Rsonance Magntique Nuclaire 1
LA RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE

(Apprentissage l'interprtation des spectres une et deux dimensions des chanes O-glycanniques)
TF 1/TF
Emmanuel MAES
Unit de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle UMR 8576 du CNRS, Universit des Sciences et Technologies de Lille F-59655 Villeneuve d'Ascq
Emmanuel Maes
Maes E. Mise jour 01/09
Je voudrais ici remercier trs vivement, mon Matre, Monsieur le Dr Grard Strecker sans lequel ce livret naurait jamais pu exister. Grard ma accueilli dans son laboratoire en 1994, jai pu cette occasion suivre ma formation de D.E.A.. Celle-ci avait pour thme llucidation des structures glycanniques isoles de mucines damphibiens en relation avec la spcificit despces. Jai pu obtenir au terme de cette formation, une bourse du ministre de lenseignement et de la recherche dmontrant ainsi la qualit de lenseignement et de lapprentissage que jai suivis. Aprs ma thse de doctorat, obtenue en 1997, jai t recrut par le CNRS qui ma donn pour mission, lanalyse structurale des glycannes et glycoconjugus par Rsonance Magntique Nuclaire au sein de lUnit Mixte de Recherche 8576. Jai depuis particip la publication de plusieurs dizaines darticles scientifiques et tente de rendre plus accessible cette mthodologie une plus large communaut notamment par le biais denseignements en master biochimie. Merci Grard
TABLE DES MATIERES

1. 2. 3. INTRODUCTION ......................................................................................................................................... 5 SCHEMA GENERAL DUNE EXPERIENCE R.M.N. ............................................................................ 6 PRINCIPE DE BASE .................................................................................................................................. 7
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5

4.
Quest ce que la Rsonance Magntique Nuclaire ? ............................ 7 Quels sont les noyaux capables de fournir une rsonance ? ................. 7 Les tats nergtiques ........................................................................... 7 Frquence de prcession ....................................................................... 7 La rsonance.......................................................................................... 8
PRINCIPE GENERAL ................................................................................................................................ 9
Comment mesurer la frquence de prcession ? ................................. 10 Comment supprimer les signaux indsirables ? ................................... 11 Les monosaccharides........................................................................... 11 Les conditions de mesure..................................................................... 14 Les paramtres importants ................................................................... 14 4.5.1 Le dplacement chimique..............................................................15 4.5.2 La densit lectronique .................................................................16 4.5.3 Intensit des signaux.....................................................................16 4.5.4 La constante de couplage (J) ........................................................17 4.5.4.1 Le nombre de protons (figure 7) .............................................17 4.5.4.2 Angle entre deux protons .......................................................18 4.6 Comment apprhender linterprtation des spectres R.M.N. des Oglycannes ?......................................................................................................... 21 4.6.1 Mthodologie suivie.......................................................................21 4.7 Les expriences R.M.N. ....................................................................... 21 4.7.1 Le spectre proton (1H) une dimension ........................................21 4.7.2 Les spectres 13C et 31P une dimension....................................23 4.7.2.1 Le carbone : ...........................................................................23 4.7.2.2 Le phosphore : .......................................................................24 4.7.3 Lexprience COSY homonuclaire 1H/1H.....................................24 4.7.4 Exprience htronuclaire...........................................................24 4.7.4.1 HMQC : Heteronuclear MultiQuantum Coherence .................24 4.7.4.2 HMBC : Heteronuclear Multiple-Bond Correlation ..................25 4.7.5 Les expriences ROESY (Rotating frame Over Hauser Effect SpectroscopY) .............................................................................................25
5. ETUDE DUN EXEMPLE ......................................................................................................................... 27
4.1 4.2 4.3 4.4 4.5
5.1 5.2
Obtention et spectre 1H du N-actyl-galactosaminitol........................... 27 Spectre dun oligosaccharide-alditol ..................................................... 29 5.2.1 Spectre proton 1D de loligosaccharide .........................................30 5.2.1.1 Identification de losaminitol (Figure 15 C, D) .........................30 5.2.1.2 Observation de signaux particuliers .......................................31 5.2.2 Les expriences COSY 1H/1H .......................................................31 5.2.3 COSY 1 relais de loligosaccharide-alditol.....................................35 5.2.4 COSY 2 relais................................................................................37 5.2.5 Spectre HMQC de loligosaccharide-alditol ...................................39 5.2.6 Exprience ROESY .......................................................................41
EXPERIENCES COMPLEMENTAIRES................................................................................................ 43
6.

7. LINDICE SOACS ..................................................................................................................................... 44
7.1 7.2
Introduction ......................................................................................... 44 Principe ............................................................................................... 45 7.2.1 O-Glycannes ................................................................................45 7.2.1.1 Calcul des indices SOACS et SOACS-ol partir dun spectre 1D proton 46 7.2.1.2 Structures de O-glycannes sialyls ........................................47 7.2.1.3 Calcul des indices partir de spectres homonuclaires 2D ...47 7.2.1.4 Dfinition dune marge derreur ..............................................48 7.2.2 N-Glycannes.................................................................................66 7.3 Molcules de chimie organique ............................................................ 67 7.4 Conclusion............................................................................................ 70
8. 9. CONCLUSION .......................................................................................................................................... 71 BIBLIOGRAPHIE..................................................................................................................................... 72
1. INTRODUCTION
Ce livret a pour but d'expliquer les principes et la mthodologie de la R.M.N. au plus grand nombre. Cest pourquoi de nombreuses simplifications et omissions ont t sciemment faites. Ceci rjouira les nophytes, ne drangera pas les amateurs, mais scandalisera probablement les spcialistes auxquels nous demandons quelques indulgences La Rsonance Magntique Nuclaire en milieu liquide est une technique puissante non destructive permettant de dterminer la structure des molcules biologiques et en particulier celle des oligosaccharides. Elle est base sur la proprit magntique de certains atomes (ou noyaux) dont le proton (1H), le carbone (13C) ou encore le phosphore (31P). Par consquent, les oligosaccharides sont particulirement adapts ce type dexprience. Dans ce livret nous aborderons brivement la thorie de la rsonance en prenant le modle vectoriel comme reprsentation du noyau. Ce modle, trs accessible pour un grand nombre dutilisateurs, ne correspond pas tout fait la ralit, mais il permet de simplifier considrablement la reprsentation du principe de R.M.N.. Aprs une brve description thorique nous tenterons dexpliquer le cheminement dune analyse structurale par RMN dun oligosaccharide-alditol. Enfin nous terminerons cette tude par lexplication dun nouveau type de requte informatique invente pour une recherche de squence glycannique plus aise dans les banques de donnes.
2. SCHEMA GENERAL DUNE EXPERIENCE R.M.N.
Figure 1 : Reprsentation schmatique dune exprience R.M.N.
Lchantillon est plac dans un champ magntique statique intense (B0). Les molcules de cet chantillon sont soumises un champ magntique appliqu B1 qui provoque une perturbation des atomes considrs. Lapplication de ce champ de radiofrquence (RF) choisie (impulsion ou "pulse") est de courte dure, quelques microsecondes. Les noyaux gnrent leur tour un microchamp magntique qui sera capt par une bobine rceptrice, cest le signal R.M.N. (Donnes). Ces donnes sont envoyes un ordinateur o elles sont analyses et transformes en signal. Le traitement mathmatique, ou transforme de Fourier, permet de transformer le signal en spectre R.M.N.
3. PRINCIPE DE BASE
3.1 QUEST CE QUE LA RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE ?
Certains noyaux sont comparables de petits aimants, qui soumis un champ magntique intense peuvent sous laction dun champ de radio frquence (RF) convenable, absorber une certaine quantit dnergie : cest le phnomne de rsonance. Il se traduit par le passage des noyaux dun tat nergtique favorable un tat nergtique dfavorable.
3.2 QUELS SONT LES NOYAUX CAPABLES DE FOURNIR UNE RESONANCE ?

Tous les noyaux ne prsentent pas de rsonance, il en existe deux types : Les noyaux sensibles au champ magntique externe qui possdent un spin nuclaire I gal comme le proton 1H, le carbone 13C, le phosphore 31P, lazote 15N ou le fluor 19F. Ils ont une circulation de charge sphrique, et possdent deux moments magntiques. Les noyaux spin I suprieur : le deutrium 2H lazote 14N, loxygne 17O ou encore le soufre 33S ont une circulation de charge non sphrique et possdent un moment quadripolaire nuclaire. Tous ces noyaux sont capables de rsonner mais dans des conditions diffrentes. Les noyaux non sensibles possdent tous un nombre de masse et un nombre atomique pairs. La parit de ces deux valeurs entranent un moment magntique nuclaire unique. Les noyaux de carbone 12C ou doxygne 16O possdent un spin I gal 0.
3.3 LES ETATS ENERGETIQUES

Soumis un champ magntique B0, un noyau de spin I non nul peut prendre 2I+1 orientations par rapport la direction de ce champ. Pour exemple, le proton (1H) qui possde un spin nuclaire I = prend 2 orientations, celles-ci correspondent au nombre quantique m : m = + lorsque le spin nuclaire est dans la mme direction que le champ appliqu, il est alors dans un tat nergtique favorable . m = - lorsque le spin nuclaire une orientation antiparallle au champ appliqu. Il est alors dans une position nergtique dfavorable . Lquation de Boltzman N/N = exp (-E/kT) dfinie le rapport des noyaux dans les deux tats dnergies. La transition entre deux tats demande un apport dnergie qui est fourni par une radio-frquence. Le passage dun tat un tat est appel "transition nergtique". Lnergie ncessaire est selon lquation de Bohr : E = (hB0)/2 = h0 ou h est la constante de Planke, le rapport gyromagntique du noyau excit et B0 lintensit du champ magntique.
3.4 FREQUENCE DE PRECESSION

Le noyau peut tre reprsent par un vecteur de moment magntique (avec une direction et une intensit). Ce moment magntique tourne, autour dun axe
Rsonance Magntique Nuclaire 8 dirig suivant la direction du champ appliqu B0, la vitesse 0 = 20, ou 0 est la frquence de Larmor du noyau, elle est galement appele frquence de prcession, celle-ci est fonction du champ B0. (0 = B0 / 2)
3.5 LA RESONANCE
La rsonance consiste donc au passage du noyau dun tat nergtique favorable (suivant la direction B0) un tat nergtique dfavorable (antiparallle B0). Cette transition est induite par lapplication ponctuelle dun champ magntique B1 perpendiculaire B0 et de radiofrquence (RF) choisie 1. Pour avoir rsonance du noyau, il faut que la RF applique soit gale la frquence de prcession du noyau : B1 = 0 = B0/2 Larrt de lapplication de la RF va permettre le retour lquilibre des noyaux, cest le phnomne de relaxation (Figure 2).
Figure 2 : Reprsentation vectorielle de lapplication dune radiofrquence B1 sur un vecteur moment magntique reprsentant un spin nuclaire de proton. La rsonance est obtenue quand la RF applique 1 est gale la frquence de prcession du noyau 0.
Dans une molcule, comme un oligosaccharide, tous les protons ne sont pas quivalents et par consquent les frquences de prcession sont diffrentes. Cest pourquoi la RF B1 est applique avec des frquences croissantes ce qui permet datteindre la rsonance pour chaque noyau.
4. PRINCIPE GENERAL
Dans cette partie nous nous intresserons aux moments magntiques totaux qui sont dfinis comme la magntisation macroscopique, M. Celle-ci reprsente la somme des moments magntiques des noyaux parallles et antiparallles. La population des noyaux dans un tat tant plus grande que la population , la magntisation M est donc oriente suivant la direction du champ B0. La magntisation macroscopique M est, dans un champ intense B0, parallle ce dernier, elle est appele dans ce cas magntisation longitudinale (Figure 3A). Lapplication dune RF dont la composante magntique (externe) B1 est perpendiculaire au champ B0 provoque le basculement de cette magntisation sur un plan xoy pour donner la magntisation transversale, cest le principe de limpulsion R.M.N. ou pulse (Figure 3B). Lapplication de cette radiofrquence choisie sera de courte dure (quelques microsecondes). Les noyaux, dans une position nergtique dfavorable, tendent revenir dans leur position initiale lquilibre. La magntisation transversale va revenir lquilibre en oscillant autour de laxe la frquence de prcession des noyaux (Figure 3C). Cette frquence est spcifique de chaque espce de noyaux et dpend de lenvironnement lectronique (densit lectronique) de ces derniers. A titre dexemple le galactose possde 8 protons diffrents par leur environnement et leur position. Ces derniers, qui ont chacun leur propre frquence de prcession, donnent alors 8 signaux diffrents.
Figure 3 : Reprsentation schmatique de lapplication dune radiofrquence B1 sur la magntisation macroscopique.
4.1 COMMENT MESURER LA FREQUENCE DE PRECESSION ?

Larrt de lapplication de B1 va permettre la magntisation transversale de revenir sa position initiale le long de laxe z avec une frquence de prcession spcifique et pendant un certain temps T. La projection du vecteur de magntisation sur le plan xoy qui correspond la magntisation transversale dcrot en fonction du temps (Figure 3C). Cette dcroissance peut tre mesure et correspond au temps de relaxation transversale T2. De la mme manire, la composante Mz reprsente la magntisation transversale qui peut tre mesure et elle correspond au temps T1.
Loscillation des noyaux provoque un champ lectromagntique qui est capt par un rcepteur situ suivant laxe y. Le signal obtenu sappelle une FID1 ou dcroissance dinduction libre (Figure 3D). Ce signal est tout fait comparable celui produit par un guitariste qui pince une corde de sa guitare, le son rsultant, de frquence constante, a une intensit qui diminue en fonction du temps. Ce signal (S = f(t)) nest pas exploitable en tant que tel, cest pourquoi il est transform en fonction dune frquence. Cest la transforme de Fourier qui permet dobtenir le spectre connu I = f (Hz).
Figure 4 : La transforme de Fourier permet de transformer la FID totale qui est une fonction du temps S = f(t) en un spectrogramme qui est une fonction de frquence (Hz). Chaque signal correspond une frquence de prcession dun noyau donn.
FID : Free Induction Decay

Rsonance Magntique Nuclaire 11 La FID finale est en fait, constitue dune superposition de sinusodes amorties, chacune delles correspondant un type de noyau. Il y a donc autant de sinusodes que de signaux R.M.N..
4.2
COMMENT SUPPRIMER LES SIGNAUX INDESIRABLES ?
Un monosaccharide comme le galactose possde 12 atomes dhydrogne chimiquement diffrents. En effet certains atomes sont chimiquement mobiles, cest notamment le cas des protons hydroxyls (-OH) et des protons des fonctions amines (-NH-). Ceux ci sont remplacs par des atomes de deutrium (2H) qui, dans les conditions de mesure standards, ne rsonnent pas. Ils sont par consquent invisibles sur un spectre R.M.N.. Cette opration sappelle lchange chimique. Cette modification consiste solubiliser lchantillon anhydre dans un volume de 2H2O (D2O), de lyophiliser et de solubiliser nouveau dans le mme solvant. Cette opration peut tre rpte plusieurs fois si ncessaire. Nanmoins le D2O nest pas enrichi 100% de deutrium si bien qu'il subsiste alors un signal rsiduel deau visible sur le spectre et not HOD (HO2H).
4.3 LES MONOSACCHARIDES

Les monosaccharides peuvent exister sous deux configurations diffrentes (appel D ou L) et un grand nombre de conformations (pyranique, furanique etc. ...) (pour revue McNaught 1997). Nanmoins les sucres pyraniques adoptent presque toujours les conformations chaises 4C1 ou 1C4 (Figure 5). Cest cette dernire qui est considre dans ce travail. La connaissance de la conformation des sucres est essentielle pour pouvoir interprter un spectre R.M.N.. La majorit des monosaccharides ont une conformation en 4C1 (Tableau 1) qui signifie que le carbone n 4 du cycle est au dessus du plan form par loxygne du pont hmiactalique et les carbones C2, C3, C5, alors que le carbone 1 est en dessous.
Figure 5 : Conformation en chaise 4C1 du -D-galactose. Les protons axiaux (en rouge) sont parallles entre-eux. Seul le proton H4 est en position quatoriale, il est alors parallle au plan du cycle (en gris).
Dans ce type de conformres, il existe 3 types de protons : Les protons axiaux parallles entre-eux (H 1, 2, 3, 5) Les protons quatoriaux (H 4) Les protons exocycliques (H 6, 6)
Rsonance Magntique Nuclaire 12 Les molcules O-glycanniques sont gnralement isoles sous forme rduite. La N-actyl-galactosamine en position terminale rductrice sera donc sous forme dosaminitol non cyclique. Certains de ses protons ont des frquences de rsonances particulires, caractristiques et parfaitement identifiables.

Tableau 1 : Reprsentation des principaux monosaccharides rencontrs dans les Oglycannes de type mucines. Les structures sont prsentes aprs change au deutrium, les protons indiqus en rouge sont observables sur un spectre. R : groupements N-actyl (NeuAc), N-glycolyl (NeuGc), OH (Kdn). La symbolique est utilise dans le tableau 7.
4.4 LES CONDITIONS DE MESURE

Les programmes dimpulsions qui permettent dobtenir un signal sont courts, de lordre de la seconde. De ce fait les expriences sont rptes un certains nombre de fois et les FID accumules avant de procder la transforme de Fourier. Le rapport signal sur bruit (S/B) est alors amlior. En effet S/B est proportionnel N (o N est le nombre daccumulations). Les expriences R.M.N. doivent tre, en rgle gnrale, ralises dans les mmes conditions physico-chimiques. En effet les diffrents paramtres sont variables suivant la temprature et le pH des solutions (ajustement du pH possible avec DCl et NaOD). Etant donn que la R.M.N. peut ncessiter une tude comparative il convient de raliser les expriences temprature et pH constants, ce principe permettant alors de se rfrer aux banques de donnes des dplacements chimiques qui seront dfinis par la suite.
4.5
LES PARAMETRES IMPORTANTS
Chaque signal R.M.N. est caractris par plusieurs grandeurs qui sont caractristiques de chaque noyau considr. Ces paramtres donnent des informations sur le proton et son environnement. La dtermination de la structure primaire des oligosaccharides repose sur les diffrents critres que sont : Le dplacement chimique exprim en ppm (partie par millions) ou parfois en Hz La constante de couplage dont la grandeur est exprime en Hertz Lintensit du signal
Figure 6 : Reprsentation schmatique des paramtres R.M.N. contribuant lanalyse de la structure primaire des oligosaccharides (Daprs van Halbeek 1995).
Ces paramtres peuvent tre complts par dautres : Les effets nOe2 qui sont dues aux interactions dipolaires entre deux noyaux diffrents et voisins dans lespace et dont lintensit de corrlation est
2
nOe : nuclear Overhauser enhancement

Rsonance Magntique Nuclaire 15 inversement proportionnelle R6. Ce paramtre est essentiel dans les analyses conformationnelles des oligosaccharides. Ce paramtre na pas de valeur numrique mais une valeur informationnelle. Le temps de relaxation longitudinal T1 (exprim en secondes) qui dcrit la cintique de retour des noyaux lquilibre aprs une impulsion. Le temps de relaxation transversale T2 (en seconde) dcrit le taux de dcroissance de la magntisation transversale. Pour les molcules de petite taille, comme les oligosaccharide-alditols, T1 et T2 sont similaires. Les macromolcules de type polysaccharide ont des temps T1 entre 0.1 et 1 seconde alors que T2 est infrieur 0.1s. Ces deux paramtres ont leur importance dans ltablissement des squences dimpulsions R.M.N. mais ne sont pas ncessaires dans linterprtation des spectres. 4.5.1 LE DEPLACEMENT CHIMIQUE Cette valeur dfinie () la position du signal sur laxe des frquences (axe x du spectre), la valeur sera mesure par rapport au signal rfrence par la relation suivante :
- = ref ref
106
ref correspond au dplacement chimique des protons du T.M.S.3 (Tetra Methyl Silane) Ces protons ont la particularit d'tre dans un environnement dont la densit lectronique est la plus forte. La frquence de rsonance est calcule pour un rapport gyromagntique H = 26.752 x 107 rad T-1 s-1 et avec lintensit (en Tesla) du champ magntique B0 de lappareil utilis. Par exemple dans un champ B0 de 9.4 T la frquence de rsonance des protons du T.M.S. se trouve ref = H x B0 / 2 = (26.752 107 x 9.4)/ 2 = 400.22 MHz. Par dfinition le dplacement chimique T.M.S. = 0 ppm. : correspond la frquence de rsonance du signal observ. Les frquences , et ref sont trs grandes (MHz) cest pourquoi est exprim en ppm. Lchelle des spectres pour ltude des O-glycannes se situe entre 0 et 7 ppm soit pour un appareil de 400MHz, de 0 2800Hz. Cette valeur de dplacement chimique exprime lenvironnement direct du noyau considr. Si un noyau se trouve dans un environnement o la densit lectronique est trs forte (il est dit "blind") comme cest le cas pour les protons mthyliques (R-CH3), le dplacement chimique est alors faible. Par contre, si la densit lectronique est moins intense comme pour les protons anomres, le dplacement chimique sera plus grand (le proton est "dblind"). Ce paramtre est la base des "structural reporter groups" qui fournissent une carte didentit pour chaque oligosaccharides. (Vliegenthart et al 1983, Kamerling et al 1992)
T.M.S. : (CH3)4Si

Tableau 2 : Correspondance des frquences de rsonance de noyaux couramment analyss dans le champ magntique correspondant. Isotope Spin abondance naturelle % Frquence de rsonance (MHz) dans un champ de : 1,8790 (T) 2,3488 (T) 4,8975 (T) 7,0463 (T)
1
9,395 (T) 11,744 (T) 17,615 (T) 400,000 100,577 40,531 161,923 500,000 125,721 50,664 202,404 750,000 188,580 75,996 303,606
H C N P
1/2 1/2 1/2 1/2
99,98 1,108 0,37 100
80,000 20,115 8,106 32,385
100,000 25,144 10,133 40,481
200,000 50,288 20,265 80,961
300,000 75,432 30,398 121,442
13
15
31
4.5.2 LA DENSITE ELECTRONIQUE La densit lectronique est responsable du blindage ou du dblindage des atomes observs. Pour valuer la densit lectronique il faut prendre en compte les proprits lectro-attractives ou lectro-rpulsives des atomes et des groupements chimiques (sulfate, phosphate etc. ...). Cette notion est dcrite par la constante dcran magntique , cette constante dpend, comme nous lavons vu, de la place du noyau dans la molcule mais galement du milieu dans lequel la molcule se trouve. Le champ statique effectif sera alors plus faible que le champ rel appliqu : Beff = Bo (1-). Le caractre lectro-attractif des groupements chimiques provoque un "dblindage" des atomes observs, a contrario un groupement lectro-rpulseur induit un blindage par augmentation de la densit lectronique autour des noyaux observs. Cette notion est galement importante puisquau plus un proton est dblind plus la radiofrquence B1 ncessaire faire basculer la magntisation transversale sera leve et inversement. Sur un spectre R.M.N. cela se traduit par deux zones, une zone dite des hauts champs magntiques et lautre des bas champs magntiques.
De ce principe, chaque proton dun monosaccharide aura son propre dplacement chimique (donc sa propre frquence de prcession), avec comme exception les protons chimiquement identiques qui possdent dans ce cas strictement le mme dplacement chimique. Nanmoins lintensit du signal observ sera proportionnelle au nombre de protons qui rsonnent la mme frquence. 4.5.3 INTENSITE DES SIGNAUX Les protons chimiquement identiques ont la mme frquence de prcession (ou frquence de rsonance) et ont de ce fait le mme dplacement chimique. Lintensit du signal considr sera directement proportionnelle au nombre de protons impliqus dans ce signal. Lintgration du signal par rapport
Rsonance Magntique Nuclaire 17 un signal de rfrence permet alors de dterminer le nombre de protons. Cette proprit quantitative de lexprience R.M.N. permet danalyser le cas chant un mlange doligosaccharides. 4.5.4 LA CONSTANTE DE COUPLAGE (J) Cette entit est fondamentale dans la dtermination structurale et conformationelle des molcules. Cette valeur prend en considration deux lments : Le nombre de noyaux voisins, cest dire les noyaux coupls au noyau observ. Langle qui existe entre les deux noyaux considrs, la valeur de cet angle est importante puisquelle dtermine la largeur du signal observ. Il existe plusieurs types de constantes de couplage dont la nomenclature est la suivante : JY,Z : X reprsente le nombre de liaisons covalentes entre le noyau observ et le noyau voisin, Y et Z reprsentent les deux noyaux pris en compte. Ils peuvent tre identiques (H,H) ou diffrents (C,H). La constante de couplage gminal entre deux noyaux 2JC,H, 2JH,H. La constante de couplage vicinal entre deux protons (homonuclaire) 3JH,H ou htronuclaire 3JC,H. La constante 3JH,H Permet de dterminer sur les spectres COSY la nature des monosaccharides.
n X
J ou n 4, couplage longue distance.
4.5.4.1 Le nombre de protons (figure 7) Il est important de considrer le nombre de protons voisins, en effet le nombre de raies spectrales dun proton est gal 2n o n est le nombre de protons coupls au proton observ. Lintensit relative de ces raies, lorsque les constantes de couplage sont identiques, est donne par le triangle de Pascal.
1 1 1 1 2 1 1 3 3 1
aucun couplage, singulet (s) 1 noyau coupl, 2 raies dintensit 1 : 1, doublet (d) 2 noyaux coupls, 3 raies dintensit 1 : 2 : 1, triplet (dd) 3 noyaux coupls, 4 raies dintensit 1 : 3 : 3 : 1, quadruplet (ddd) etc. ...
1 4 6 4 1 1 5 10 10 5 1
-D-galactose
10 Hz
ppm
H1
ppm
H4
3
OD H
CH 2OD
JH1,H2
H4
OD
CH2 OD
JH4,H3 JH4,H5
H2
H
H2
H5
OD DO DO H1
Doublet
OD DO H1
Quadruplet (pseudo-singul)
DO H
H3
H5
H2
OD H
CH 2 OD
3
OD H2
H
JH2,H1 JH2,H3
H4
C H2 OD
JH5,H6 JH5,H6' JH5,H4
H2
H5
OD DO H1
OD DO H1
3
DO H
DO H3
Quadruplet (pseudo-triplet)
Octuplet (pseudo-quadruplet)
OD H4
CH 2OD
H3
3
H6 3
3
H2
H
JH3,H2
H4
OD
CH 2OD
JH6,H6' 3JH6',H6 JH6,H5 3JH6',H5
OD DO H1
3
H2
H5
DO H3
JH3,H4
OD DO H1
DO H3
Quadruplet (pseudo-doublet)
Quadruplet (pseudo-doublet)
Figure 7 : Reprsentation des diffrentes constantes de couplages vicinaux (3JH,H) du galactose telles quelles peuvent tre reprsentes sur un spectre 2D type COSY.
4.5.4.2 Angle entre deux protons La relation entre la valeur en Hertz de la constante de couplage et langle dihdral () que font deux protons voisins peut tre schmatise par la relation de Karplus :

H R3 C R4 R2 R1 R4 H R3 C H
H R2 R1 C
Cette proprit permet de dterminer lanomrie des sucres et leur nature. En effet, chaque monosaccharide est caractris par son schma de constante de couplage vicinal comme cela est indiqu dans le tableau 3.
Figure 8 : Reprsentation de langle dihdral () entre les protons H1 et H2 des deux anomres du galactose.
Ainsi pour les conformations et configurations classiques, les anomres prsentent en rgle gnrale une petite constante de couplage (J < 5Hz) et les anomres une grande constante de couplage 5 Hz <J > 12Hz.

Tableau 3 : Rcapitulatif de toutes les constantes de couplage 3JH,H possibles des rsidus aldopyranosyles. Les symboles G et P reprsentent respectivement des constantes de couplage vicinal 3 JH,H grandes (>5 Hz) et petites (< 5Hz). (Koerner et al 1987). Les rsidus les plus frquemment rencontrs dans les oligosaccharide-alditols isols partir de mucines sont en caractres gras.
Strochimie des rsidus aldopyranosiques
J1,2 J2,3 J3,4 J4,5 G G G G G G G G G G P P G P G P
Configuration -gluco -ido strochimie impossible -galacto -altro
Conformation
4
Exemples de rsidus -D-Glc, -D-GlcNAc, -D-Qui (-D-Idose)
C1 C4
C1 C4
-D-Gal, -D-GalNAc, -L-Fuc, -D-Fuc (-D-Altrose)
G G G G P P P P P
P P P P G G G G P
G G P P G G P P G
G P G P G P G P G
strochimie impossible strochimie impossible -allo -gulo -gluco -ido strochimie impossible -galacto -manno -manno
4 4
C1 C1 C1 C4
(-D-Allose) (-D-Gulose) -D-Glc, -D-GlcNAc, -D-Qui (-D-Idose)
C1 C1 C1 C4 C1 C1 C1 C1
-D-Gal, -D-GalNAc, -L-Fuc, -D-Fuc -D-Man, -D-ManNAc, -L-Rha -D-Man, -D-ManNAc (-D-Gulose) ( or -D-Altrose, -D-Allose) ( et -D-Idose) (-D-Gulose) ( et -D-Talose)
P P P
P P P
G P P
P G P
-gulo et altro, allo et ido, gulo gulo et talo
4.6 COMMENT APPREHENDER LINTERPRETATION DES O-GLYCANNES ?
DES SPECTRES
R.M.N.
La lecture des spectres R.M.N. est facilite par la connaissance de lorigine et de la mthode de sparation du produit analys. Les O-glycannes de type mucine sont gnralement isols ltat doligosaccharide-alditols ; cest pourquoi nous considrerons par la suite que tous les oligosaccharides tudis ici, le sont. Les indications apportes par les mthodes disolements (rsines changeurs dions, HPLC etc. ...) permettent dorienter la recherche dlments structuraux caractristiques des molcules acides ou neutres. La rduction des O-glycannes aprs -limination indique que ces oligosaccharides possdent tous un rsidu de N-actyl-galactosaminitol. Toutefois il arrive que certaines molcules aient subit une dgradation rcurrente avec ou sans rduction. Les produits obtenus possdent alors un rsidu de galactitol ou sont caractriss par la prsence dun hxne-ttrol (dgradation par deshydratation du N-actylgalactosaminitol), ce dernier compos est trs facilement identifiable la vue de la rsonance trs particulire de ses protons thylniques aux environs de 6 ppm. 4.6.1 METHODOLOGIE SUIVIE La ralisation dun spectre proton une dimension est systmatique. Elle permet de connatre plusieurs paramtres. Deux cas peuvent se prsenter : La molcule a dj t isole et, dans ce cas, les dplacements chimiques de ses protons sont strictement identiques ceux dj publis (cf &7). Lanalyse est alors termine. La molcule est nouvelle, la comparaison des dplacements chimiques avec la banque de donnes ne permet pas didentifier les monosaccharides et les liaisons. Dans ce cas les analyses R.M.N. doivent tre approfondies par la ralisation dexpriences deux dimensions. Les expriences COSY homo- et htronuclaire et ROESY permettent, dans la majorit des cas, didentifier la nature des monosaccharides de loligosaccharide et dlucider la structure primaire de ce dernier.
4.7
LES EXPERIENCES R.M.N.
4.7.1 LE SPECTRE PROTON (1H) A UNE DIMENSION Ce type dexprience apporte de nombreux renseignements linterprtation : La valeur des dplacements chimiques de chaque proton identifiable Le nombre de rsidus monosaccharidiques (nombre de protons anomres) La prsence ou non dacide sialique (prsence des protons axial et quatorial) Le nombre dosamines (nombre de raies correspondants aux groupements actamides) Le nombre de rsidus de 6-deoxyose et notamment de fucose (nombre de doublets caractristiques dans les hauts champs (1.1 < -CH3 <1.3) Accessoirement, ltat de puret de la molcule (intensit relative des signaux)
Rsonance Magntique Nuclaire 22 Le spectre une dimension peut tre scind en trois rgions distinctes, comme lindique la figure 9 suivante :
Figure 9 : Ce schma, trs gnral, est valable pour tout O-glycanne de type mucine.
La rgion des protons anomres est importante4 (comprise entre 6 ~ 4.5 ppm), elle permet de dterminer le nombre de rsidus monosaccharidiques qui constituent loligosaccharide. Les constantes de couplage peuvent tre mesures discriminant lanomrie ou des sucres. La "bulk region" (~ 3.6 3.2 ppm) renferment de nombreux protons qui possdent une frquence de rsonance proche ce qui rend leur distinction trs difficile. Mais les protons ports par des carbones impliqus dans une liaison Oglycosidique sont trs souvent dblinds, ils peuvent alors glisss vers les bas champs. Par consquent ils peuvent tre distingus. Enfin la rgion comprise entre 1 et 3 ppm correspond diffrents protons qui apportent de nombreuses indications (prsence des protons quatorial et axial des acides sialiques, protons actamides des osamines, etc. ...). A titre dexemple, la figure 10 reprsente un spectre 1D dun oligosaccharidealditol, lemplacement des protons y est caractristique.
voir le chapitre 7
Figure 10 : Spectre proton dun oligosaccharide-alditol ralis 400 MHz et 300K. Les dplacements chimiques sont mesurs par rapport une rfrence interne : les protons de l'actone rsonnent 2.225 ppm.
4.7.2 LES
SPECTRES
13
C ET
31
P A UNE DIMENSION
Comme nous avons pu lindiquer prcdemment, les 13C et 31P possdent un moment magntique nuclaire et il est donc possible de raliser les expriences R.M.N. Tandis que labondance naturelle du 13C est de 1/100 par rapport au 12C, les expriences seront alors plus longues et les quantits de matriels devront tre plus consquentes. Alors que labondance naturelle du 31P est de 100%, les expriences seront plus facilement ralisables. De la mme manire que pour le proton, la position et limplication de ces noyaux dans une fonction chimique particulire influenceront leurs dplacements chimiques (constante dcran). 4.7.2.1 Le carbone : La fentre spectrale de lobservation des carbones se situe entre 0 et 200 ppm. Ainsi les carbones anomres se situent entre 90 et 110 ppm, les autres carbones rsonnant entre 50 et 90 ppm. Les signaux des carbones des groupes methylnes (R-CH2-R) sont observs aux environs des 60-70 ppm, les carbones mthyliques (R-CH3) aux environs de 30 ppm et enfin le carbone dune fonction carboxyle environ 180 ppm. Une diffrence de = +10 ppm est significative dune substitution sur le carbone observ. A titre indicatif, la rfrence utilise pour obtenir les conditions de rsonance du carbone 13C est galement le T.M.S.. Le rapport gyromagntique des carbones de cette rfrence est 13C = 6.7283 107 rad T-1 s-1 (Tableau 2). Ce rapport reprsente le quart de celui du proton, la radio-frquence, dans un
Rsonance Magntique Nuclaire 24 champ magntique identique au proton, utilise pour faire basculer la magntisation est alors gale au de celle utilise pour le proton. Par exemple, dans un champ de 9.4 T la rsonance du = 6.72 107 X 9.4 / 2 ~ 100MHz. 4.7.2.2 Le phosphore : La fentre spectrale dobservation du phosphore devra tre faite en deux fois. Cet atome peut tre impliqu dans un grand nombre de liaison avec des aglycones qui possdent des comportements de rsonances extrmement variables. Ainsi il sera choisi une fentre de 600 ppm centre 0 ppm. En effet les atomes de phosphore peuvent, par rapport au standard utilis, avoir des dplacements chimiques ngatifs. Cette fentre spectrale sera ajuste dans le cas de notre tude 20 ppm, centre 0 ppm. La rfrence (externe) utilise gnralement est lacide phosphorique, 31P = 0. 4.7.3 LEXPERIENCE COSY5 HOMONUCLEAIRE 1H/1H Le COSY 90 permet dobtenir des informations importantes. Cette exprience permet de corrler les protons qui sont coupls scalairement, en dautres termes celle-ci permet de transfrer la magntisation dun proton sur un proton voisin et permet donc de visualiser les constantes de couplage 3J entre 2 protons. Il existe plusieurs expriences COSY : COSY 90 : Il y a transfert de magntisation entre le proton H1 et H2 COSY R1 : COSY un relais, la magntisation est transfre du H1 H3 via H2 COSY R2 : La magntisation va jusquau proton H4 Il existe galement le COSY R3 et le TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY o COSY multirelay). Cette dernire exprience permet de transfrer la magntisation sur la totalit des protons dun monosaccharide. Nanmoins la visualisation des constantes de couplage y est beaucoup moins aise. Les expriences COSY sont fondamentales puisquelles permettent de mesurer toutes les constantes de couplage vicinales entre les diffrents protons et donc de dterminer la nature du monosaccharide (Tableau 3). Cette exprience permet, en plus, de dterminer les dplacements chimiques des protons qui rsonnent dans la "bulk region". 4.7.4 EXPERIENCE HETERONUCLEAIRE 4.7.4.1 HMQC : Heteronuclear MultiQuantum Coherence Cette exprience R.M.N. permet de corrler chaque proton avec lhtro atome sur lequel il est attach (1JH,C ~145Hz ; 1JH,N ~90Hz ). La finalit de cette exprience est indissociable des expriences COSYs ou TOCSY. Celles-ci permettent didentifier et de dterminer le dplacement de la majorit des protons de la molcule, le report de ces valeurs sur le spectre 1H-13C-HMQC permet didentifier les carbones correspondants et den dterminer leur
5
13
C est obtenue pour :
COSY : acronyme de COrrelation SpectroscopY

Rsonance Magntique Nuclaire 25 dplacement chimique. La connaissance des dplacements chimiques des carbones permettent de dterminer la substitution par lobservation dun dblindage des carbones, + 5 << + 10 ppm. Il est noter que certaines variations sont plus ou moins importantes et apportent des informations quant la nature des liaisons et substitutions diverses. 4.7.4.2 HMBC : Heteronuclear Multiple-Bond Correlation Cette exprience permet dobtenir les corrlations et les couplages (3JH,P ~ JH,C ~8Hz) entre un proton et lhtroatome voisin. Ces informations sont dautant plus importantes quelles permettent de dterminer la squence de loligosacccharide. En effet les couplages 3J permettent de corrler les noyaux distants de trois liaisons covalentes, il est donc observ, pour un monosaccharide, les corrlations suivantes :
3 3 3
JH1,C3, 3JH1,C5 3JH2,C4, 3JH3,C5, 3JH3,C1, 3JH4,C2,3JH4C6, 3JH5,C3,3JH5C1 mais surtout JH1,CX o X est la position du carbone du monosaccharide inclus dans la liaison O-glycosidique. Malgr tout, cette exprience nest pas toujours possible. En effet si le spectre HMQC ncessite une concentration de matriel de lordre de la millimole, lexprience HMBC en ncessite 10 fois plus.
Figure 11 : Schma reprsentant les corrlations 3JH,C (en rouge) carbone/proton observes partir du proton H1 dans une exprience HMBC. La corrlation la plus intressante est celle qui indique la liaison O-glycosidique.
4.7.5 LES EXPRIENCES ROESY (ROTATING FRAME OVER HAUSER EFFECT SPECTROSCOPY) Ce type dexprience permet de visualiser les corrlations dipolaires proton-proton entre deux voisins proches dau plus 5 . Les corrlations peuvent tre dorigine intra- ou extra-rsidu. Il est vident que les interactions interrsidus sont plus intressantes puisquelles permettent de conforter la squence primaire de loligosaccharide-alditol.
Figure 12 : Reprsentation dune corrlation dipolaire visible entre deux protons dans une exprience ROESY. Cette exprience associe lHMQC peut se substituer lexprience HMBC.
5. ETUDE DUN EXEMPLE

5.1 OBTENTION ET SPECTRE 1H DU N-ACETYL-GALACTOSAMINITOL
Cet osaminitol est le point commun de tout O-glycanne de type mucine isol par -limination en milieu rducteur. Il semble donc intressant didentifier les signaux caractristiques de cet alcool.
Figure 13 : Schma simplifi de la -limination dune mucine et libration dun oligosaccharidealditol stable
Certain de ses protons sont effectivement parfaitement identifiables dans de trs nombreux spectres. Ils refltent alors la nature du noyau (core) de loligosaccharide-alditol. (Tableau 4)
Figure 14 : Spectre RMN 1H du N-actyl-galactosaminitol. Le signal des protons du groupement N-actyl nest pas indiqu dans le spectre, il rsonne 2.055 ppm.
Tous les protons des monosaccharides ont des dplacements chimiques variables suivant la nature du noyau ("core") de loligosaccharide. Les monosaccharides du noyau sont dailleurs ceux qui sont le plus affects. Les protons H2 et H5 sont plus dblinds que les autres protons et "sortent" du massif (o "bulk region"). Ils sont, par consquent, plus facilement identifiables. La comparaison des dplacements chimiques avec les banques de donnes permet souvent de dterminer la nature de la substitution. Lidentification des autres protons est parfois possible si loligosaccharide est restreint quelques rsidus. Les protons H-3 et H-4 reprsents par 2 quadrupls identiques peuvent ainsi tre aisment distinguables, en effet le proton H-3 est dblind et rsonne aux environs de 3.8, 4 ppm alors que le proton H-4 rsonne aux environs de 3.3, 3.7 ppm. Lidentification de ces protons et la valeur de leur dplacements chimiques respectifs, ajouts aux protons H-2 et H-5, sont trs souvent suffisants pour lucider le type de noyau de loligosaccharide-alditol.
Tableau 4 : Dplacements chimiques des protons des noyaux 1 6 (Daprs Kamerling et Vliegenthart 1992)
noyau 1
noyau 2
noyau 3
noyau 4
noyau 5
noyau 6
H-2 H-3
4.252 3.850 3.390 3.928 3.668 3.647 2.055
4.395 4.065 3.507 4.196 3.69 3.628 2.050 Gal Gal 4.468 3.542 n.d. 3.901 n.d. n.d. n.d. 3.901 n.d. n.d. n.d. -
4.395 4.061 3.468 4.281 3.931 n.d. 2.066 GlcNAc (6) 4.538 n.d. n.d. n.d. n.d. 3.932 n.d. 2.066
4.287 3.996 3.546 4.141 3.65 n.d. 2.037 GlcNAc 4.604 n.d. 3.584 n.d. n.d. 3.950 n.d. 2.085
4.280 3.984 3.519 4.230 3.905 n.d. 2.044 GlcNAc (3) 4.600 n.d. n.d. n.d. n.d. 3.949 n.d. 2.081 GlcNAc(6) 4.543 n.d. n.d. n.d. n.d. 3.931 n.d. 2.063
4.395 3.888 3.680 3.749 3.647 3.647 2.049 GalNAc 5.103 4.235 3.921 4.043 4.073 n.d. n.d. 2.060
4.242 3.841 3.379 4.021 3.933 n.d. 2.046 GlcNAc 4.553 n.d. n.d. n.d. n.d. 3.928 n.d. 2.059
GalNAc-ol
H-4 H-5 H-6 H-6 NAc
H-1 H-2
4.478 3.564
Autres rsidus
H-3 H-4 H-5 H-6 H-6 NAc
5.2 SPECTRE DUN OLIGOSACCHARIDE-ALDITOL

Loligosaccharide a t isol par -limination rductive dune mucine. La mthodologie disolement et de purification est la suivante : Mlange total des oligosaccharide-alditols => Chromatographie dchange anionique => Discrimination des isomres par CLHP 6. Les renseignements apports par les mthodes disolement indiquent que cet oligosaccharide-alditol est acide et de petite taille (Chromatographie de retard sur gel de silice).
CLHP : Chromatographie Liquide Haute Performance

Rsonance Magntique Nuclaire 30 5.2.1 SPECTRE PROTON 1D DE LOLIGOSACCHARIDE
Figure 15 : Spectre proton de loligosaccharide ralis 400 MHz et 27C. Les parties expliques dans le texte sont agrandies
5.2.1.1 Identification de losaminitol (Figure 15 C, D) La prsence de pseudo-hexupls (ddd) aux dplacements chimiques 4.388 et 4.145 ppm correspondant respectivement aux protons H-2 et H-5 et la prsence dun signal actamide 2.044 ppm indique la prsence de N-actylgalactosaminitol (Figure 15 C, D). Combien y-a til de rsidus monosaccharidiques ?
Rsonance Magntique Nuclaire 31 Lobservation de 3 protons anomres (A,B,C) aux dplacements chimiques7 respectifs A = 5.286, B = 4.710 et C = 4.598, indique la prsence de 3 rsidus monosaccharidiques (Figure 15B), les constantes de couplage 3 JH1,H-2 peuvent tre mesures :
3
JH1,H2 (Hz) P8 (3.4) G (7.8) G (7.8) anomre anomre anomre
rsidu A rsidu B rsidu C
=> Loligosaccharide est donc constitu de 3 rsidus monosaccharidiques et dun rsidu de N-actyl-galactosaminitol. 5.2.1.2 Observation de signaux particuliers La prsence dun doublet (Figure 15D) 1.242 ppm indique quil existe un monosaccharide possdant un groupement mthyle (R-CH3). Cette observation avec la prsence dun rsidu danomrie semble indiquer quil existe un rsidu de fucose. Lobservation dun seul signal actamide indique quil nexiste pas de Nactyl-hexosamine autre que la N-actyl-galactosamine rduite (Figure 15D). Labsence de signaux (entre 2 et 3 ppm) correspondants des protons axial et quatorial indique que loligosaccharide-alditol acide isol ne possde pas dacide sialique. La charge est donc porte par un autre groupement acide. Lobservation totale du spectre permet dindiquer que cet oligosaccharide nest pas contamin par un autre (Figure 15A). Lintgration des raies de protons anomres (Figure 15B) permet de donner lquimolarit des monosaccharides en proportion 1 : 1 : 1. Lintgration des groupements methyle et acetamide donne 3 : 3 (3 protons quivalents). Il nexiste donc quun seul dsoxy-sucre et une seule osamine (Figure 15D). Pour des raisons didactiques videntes nous admettons que la comparaison des dplacements chimiques avec la littrature et les banques de donnes ne donne pas dindications sur la structure de loligosaccharide-alditols. Il faut donc poursuivre les investigations par des expriences deux dimensions. 5.2.2 LES EXPERIENCES COSY 1H/1H Comment seffectue la lecture dun COSY ?
7 8
Le dplacement chimique scrit ou alors il est exprim en ppm P ou G signifient des constantes de couplage 3JH,H Petites ou Grandes.
Figure 136 : Reprsentation schmatique dun spectre COSY avec le parcours des corrlations de H1 H-6.
La diagonale du spectre (Figure 16) reprsente le spectre 1D proton classique. Lexprience COSY va permettre de corrler les protons H1-H2 ; H2H3 et H3-H4 (Certaines corrlations seront dtermines par les expriences TOCSY). En partant du proton H1 le proton H2 est dtermin. La projection de ce signal (ou tache de corrlation) sur la diagonale permet de dterminer la corrlation H2-H3. Lidentification et la projection sur la diagonale du proton H3 permet didentifier le proton H4 et ainsi de suite. A noter que le spectre est parfaitement symtrique.
Figure 147 : Spectre COSY 90 de loligosaccharide-alditol, le rsidu A est codifi en rouge, le B en bleu, le C en noir et losaminitol en vert
Cette exprience permet dune part didentifier les protons H2 des rsidus A, B et C et den dterminer les constantes de couplages respectives. Dautre part cette exprience permet de corrler les signaux H2 et H-5 de losaminitol avec leurs protons voisins.
Rsonance Magntique Nuclaire 34 Il est important de souligner quau plus la rsolution9 est importante plus la valeur des constantes de couplage est prcise. Mesure des constantes de couplage 3JH2,H3 :
3
JH1,H2 (Hz) P (3.4) G (7.8) G (7.8)
JH2,H3 (Hz)
rsidu A rsidu B rsidu C
G (> 5Hz) G (> 5Hz) G (> 5Hz)
La consultation du tableau 3 permet dores et dj de discriminer un certain nombre daldopyranoses mais nest pas suffisante pour dsigner les monosaccharides B et C. En outre le monosaccharide A qui possde les constantes de couplage 3JH1,H-2 (P) et 3JH2,H3 (G) est un rsidu de fucose. En effet le tableau 3 indique que ces 2 constantes (P et G) sont attribuables 8 rsidus aldopyranoses diffrents, cependant la prsence dun dsoxy-sucre reprsent par la prsence dun doublet = 1.242 et labsence de groupement actamide montre formellement que le rsidu A est un -Fucose. A ce stade de lexprimentation nous pouvons affirmer que le compos possde un osaminitol et un rsidu de fucose. Bien que le COSY 90 puisse nous donner, dans ce cas, les autres constantes de couplage nous allons poursuivre linvestigation R.M.N. par une exprience COSY 1 relais.
Quest ce que la rsolution : La taille informatique dun spectre est donne en nombre de points. Le point reprsente lchantillonnage du signal. Ainsi une FID peut tre forme de 512 points, 1024, 2048 etc. ... Ainsi une FID de 2048 points permet dobtenir un rsolution spectrale 4 fois plus grande quune FID de 512 points cependant le temps daccumulation sera 4 fois plus important. La rsolution standard dun spectre COSY est de 2048 points en F2 et 512 points en F1.
Rsonance Magntique Nuclaire 35 5.2.3 COSY 1 RELAIS DE LOLIGOSACCHARIDE-ALDITOL
Figure 158 : Spectre COSY 1 relais, mme codification que pour le COSY 90. Exprience ralise 27C et 400 MHz, rsolution 2048 (F2) X 512 (F1) pts.
Les protons H-2 identifis, les protons H-3 peuvent donc ltre trs facilement. Les corrlations H2-H3 et constantes de couplages sont parfaitement lisibles sur le spectre.
Rsonance Magntique Nuclaire 36 Mesure des constantes de couplage :

3
JH1,H2 P G G
JH2,H3 G G G
JH3,H4
Fucose rsidu B rsidu C
P (<5z) P (<5z) P (<5z)
La consultation du tableau 3 permet ds maintenant de dterminer la nature des monosaccharides B et C. En effet, la combinaison des lments apports par le spectre 1D et les constantes de couplages mesures (B : GGP, C : GGP) montrent sans ambigut que les rsidus aldopyranosiques B et C correspondent 2 rsidus galactosyls. Labsence de groupement actamide surnumraire permet dliminer la prsence de N-actyl-galactosamine. De plus lobservation fine des signaux H3 des galactosyles B et C indique quils ont des dplacements chimiques franchement diffrents. Le proton H3-B est anormalement dblind ( = 4.326) compar au H3-C ( = 3.988). Cette indication permet de penser quil existe une substitution ce niveau par un groupement particulirement lectro-attracteur.
Rsonance Magntique Nuclaire 37 5.2.4 COSY 2 RELAIS
Figure 19 : Spectre COSY 2 relais effectu 400MHz et 27C.
De la mme manire, le spectre COSY 2 relais (figure 19) permet, connaissant la position des protons H2 et H3, didentifier les protons H-4 de tous les rsidus. La mesure des constantes de couplages donne les rsultats suivants :

3
JH1,H2 P G G
JH2,H3 G G G
JH3,H4 P P P
JH4,H5
Fucose Galactose Galactose
P (<5Hz) P (<5Hz) P (<5Hz)
Les expriences prcdentes ont permis de dterminer le nombre et la nature des monosaccharides, les dplacements chimiques de leurs protons. Ces indications permettent maintenant la lecture dun spectre htronuclaire de type HMQC. En effet, ces peuvent tre reports sur laxe F2 du spectre HSQC (Figure 20).
Rsonance Magntique Nuclaire 39 5.2.5 SPECTRE HMQC DE LOLIGOSACCHARIDE-ALDITOL
Figure 20 : Spectre htronuclaire 1H/13C de loligosaccharide-alditol permettant de dterminer les corrlations entre les protons des rsidus et leurs carbones correspondants.
Le spectre de la figure 20 reprsente la partie du spectre la plus intressante o sont reprsentes toutes les corrlations carbone-proton qui ont un intrt dans la dtermination de la structure primaire de loligosaccharide.
Rsonance Magntique Nuclaire 40 Le report des dplacements chimiques des protons (donns par le spectre COSY 2 relais, figure 19) permettent didentifier chaque carbone correspondant. Lobservation de singulet, de doublets et de triplets permet de discriminer les protons H2, H3 et H4 des rsidus galactosyles. Quelles sont les informations obtenues ? Le dplacement chimique des carbones La position des substitutions Lobservation des carbones C3 du Gal B, C2 et C4 du Gal C montre que les dplacements chimiques, compars ceux de la littrature, ont des valeurs qui correspondent des carbones fortement dblinds. Ils traduisent ainsi une substitution sur ces carbones. De la mme manire les dplacements chimiques du carbone C3 et C5 du GalNAc-ol indique que ce dernier possdent un noyau de type 1 : Gal(13)GalNAc-ol. Les carbones du rsidu fucosyle indiquent que ce monosaccharide est en position terminale non rductrice et quil nest donc pas substitu. Le spectre HMQC apporte donc les informations suivantes : Le Gal B est donc substitu en 3 Le Gal C est substitu en 2 et 4 Le GalNAc-ol est substitu en 3 Le fucose est en position terminale non rductrice et il nest pas substitu Loligosaccharide possde un noyau de type 1 Il reste ce niveau positionner les rsidus galactosyles et fucosyle sachant que le Gal li sur le GalNAc-ol peut tre le rsidu B ou C et quil peut tre substitu en 2, 3 et/ou 4. La solution est apporte dans ce cas par une exprience ROESY.
Rsonance Magntique Nuclaire 41 5.2.6 EXPERIENCE ROESY
Figure 21 : Spectre ROESY de loligosaccharide-alditol ralis 400 MHz et 27C.
Connaissant tout les dplacements chimiques des protons il est maintenant trs ais de dterminer les corrlations spatiales entre certains protons. Le spectre de la figure 21 indique donc : Qu'il existe une corrlation entre le proton H1 du GalC avec le H3 du GalNAc-ol, le Gal C est donc li en C-3 sur le N-actyl-galactosaminitol confirmant par ailleurs la prsence dun noyau de type 1.
Rsonance Magntique Nuclaire 42 Que le proton H1 du fucose avec les protons H2 et H3 du Gal C, le fucose peut donc tre li en 2 ou 3 sur le Gal C. Comme lHMQC nous a indiqu que le Gal C est substitu en 2 et 4 ; le rsidu de fucose est donc li en C-2 sur le Gal C. Et enfin, que le H1 du Gal B est corrl avec le H4 du Gal C. Le galactose B est donc li en 4 sur le Gal C. A ce niveau la squence est maintenant parfaitement connue :
Seule la substitution du galactose B reste inconnue. La mthodologie disolement et le spectre 1D 1H nous indiquent que ce compos est acide et quil nexiste pas dacide sialique. La charge est donc assure par un groupement sulfate. En effet la charge ne peut pas tre un groupement phosphate tant donn quil n'est pas observ de couplage fort Phosphore-Proton 3JH,P. Cette substitution peut dailleurs tre confirme par spectromtrie de masse (MALDITOF10). La squence primaire complte de loligosaccharide-alditol est donc la suivante.
10
MALDI : Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight

6. EXPERIENCES COMPLEMENTAIRES
Certaines expriences non dcrites dans ce livret sont tout fait intressantes et se substituent celles prcdemment expliques. Elles requirent cependant une quantit de matriel plus importante. Citons par exemple, lexprience HMQC-TOCSY, qui permet de relier le proton son carbone correspondant (ex : 1H1-13C1, 1H2-13C2 etc) puis deffectuer une corrlation totale des protons de chacun des cycles. Ainsi chaque carbone il est possible dobserver toutes les corrlations C-H dun mme cycle et de la mme manire chaque proton il est observ toutes les corrlations H-C. Enfin il est important davoir conscience que toutes les expriences htronuclaires sont applicables pour tout les noyaux coupls des protons, 1H-31P HMQC, 1H31 P HMBC, 1H-31P HMQC-TOCSY. De plus certaines expriences une dimension dites slectives peuvent tre envisages avec les squences de type selmlev (tocsy selectif) ou selno (noesy selectif). Le principe de ces expriences est trs simple puisquil consiste envoyer limpulsion sur une frquence prcise (un proton anomre choisi, par exemple) encore appele O111. De cette manire, seules les corrlations scalaires (dans le premier cas) ou dipolaires (dans le second cas) appartenant au proton slectivement excit (O1) seront visibles sur le spectre. Ces expriences sont particulirement intressantes dans le cas de mlange doligosaccharides.
11
Gnralement O1 est appele frquence porteuse, celle-ci peut tre utilise dans ces cas prcis dexcitations slectives
7. LINDICE SOACS
7.1 INTRODUCTION Llucidation des structures primaires par RMN implique lutilisation videmment des constantes de couplage et des dplacements chimiques, qui sont les deux paramtres indispensables pour de telles tudes. Ces derniers, tant des constantes physiques indpendantes du champ magntique, sont susceptibles aux paramtres physico-chimiques tels que le pD, la temprature ou encore la force osmotique. Il est par consquent ncessaire pour ce qui suit de raliser les expriences dans les conditions standards daccumulation. Ces constantes sont maintenant rpertories dans quelques banques de donnes gratuites de rfrences comme la sweet-DB (reference), la Sugabase ou encore la GlycoBase pour les O- et N-glycannes ainsi que les glycannes libres. La BCSDB quant elle est dvolue aux polysaccharides bactriens. Nous ne citerons pas les quelques banques de donnes payantes qui sont notre point de vue inutiles et non avenues. Si lintrt des banques de donnes nest plus prouver, la recherche dune squence uniquement partir de ces donnes RMN se rvle fastidieuse tant lhtrognit et le choix, qui se doit tre judicieux, des dplacements chimiques sont grands. Cette difficult rend ltude structurale par RMN trs souvent inaccessible aux personnes non inities. Cest pourquoi nous sommes partis du principe que chaque molcule possde son spectre RMN, proton ou carbone, qui lui est propre. Ce spectre RMN reprsente la carte didentit de la molcule et ce dans des conditions standardises daccumulation des donnes.
Figure 22: Spectre proton dun O-glycanne classique, les dplacements chimiques sont calibrs par rapport au dplacement chimique des protons methyles de lactone. Seules les zones des protons anomres et des protons H3 axiaux des acides sialiques sont importantes
Nous avons de ce fait mis au point un nouveau type de requte appel indice SOACS (acronyme de Sum Of Anomeric Chemical Shifts) sur la base dun spectre une dimension. Cet indice est dune simplicit dconcertante et se base uniquement sur la valeur des dplacements chimiques des protons anomres qui sont facilement identifiables puisque dans une zone spectrale libre
Rsonance Magntique Nuclaire 45 de tout autre proton (Fig. 22). Cet indice a t valid pour les O- et NGlycannes et nous sommes entrain de le valider pour dautres types de molcules (polysaccharides, glycannes libres, molcules de chimie organique). Il est souligner que sur plusieurs centaines de glycannes seuls quelques cas particuliers dindice identique (1 cas) et dindices trs proches ( < 0.01) sont dcris. Nous avons galement extrapol aux oligosaccharide-alditols, cet indice SOACS en un indice SOACS-ol qui comme lindique son suffixe intresse les molcules rduites. Ainsi le couple SOACS/SOACS-ol permet de lever toute ambigut et enfin il est souligner que ces molcules ont des spectres RMN compltement diffrents. Lutilisation de ces indices comme requte est actuellement utilise avec succs dans notre banque de donnes, la GlycoBase 7.2 PRINCIPE 7.2.1 O-GLYCANNES Ce type de glycanne peut-tre libr des protines soit par laction denzymes dont les spcificits sont parfaitement dcrites dans le chapitre correspondant de lencyclopdie Comprehensive Glycoscience [Vliegenthart 2007], ou encore de manire plus courante par hydrolyse chimique et notamment par -limination prcdemment dcrit dans ce livret (cf &5). Les conditions de -limination sont plus souvent ralises en milieu rducteur en prsence de borohydrure de Na ou de K de manire stabiliser les molcules libres. Ceci permet dviter les ractions de dgradation rcurrente lorsque des liaisons 1-3 sont prsentes sur le noyau de ces O-glycannes. Ainsi, lorsque ces O-glycannes sont librs de la sorte, ils sont rduits et stables, ils sont alors appels oligosaccharide-alditols. Lorsque les O-glycannes sont de type mucine, le sucre rduit form correspond au N-Acetyl-Galactosaminitol, cet alcool peut tre idalement identifi en RMN du proton par certains de ses dplacements chimiques12. Ceux-ci ont t dcrits dans un chapitre prcdent. Donc dans ce cas, lindice SOACS peut tre complment par un deuxime indice nomm SOACS-ol qui prend alors en compte le proton H-2 de ce rsidu de GalNAc-ol.
12
Le dplacement chimique est symbolis par

Rsonance Magntique Nuclaire 46 7.2.1.1 Calcul des indices SOACS et SOACS-ol partir dun spectre 1D proton
Figure 23 : Rgion anomre dun spectre de O-glycanne ralis dans leau lourde 300K. Seule cette partie suffit dterminer lindice SOACS.
Sur le spectre enregistr, il suffit dagrandir la partie spectrale correspondante aux protons anomres. Dans ce cas de glycanne, celle-ci est toujours, et sans exception, comprise entre 4.4 et 6 ppm. Sachant quun proton anomre, excepts quelques trs rares cas particuliers13, se dfinie par un doublet avec une constante de couplage petite, c'est--dire infrieure 5Hz pour les protons danomries alpha et suprieure 5 Hz pour les protons danomries beta. Pour le calcul de lindice SOACS-ol, lidentification du proton 2 du rsidu de N-Acetyl galactosaminitol est ncessaire. Il nest pas toujours vident didentifier ce multiplet sur un spectre 1 dimension toutefois il faut savoir que ce proton raisonne exclusivement entre 4.20 et 4.45 ppm. Son identification sur un spectre deux dimensions est beaucoup plus aise. Sachant galement que la RMN est quantitative14 il est souhaitable dintgrer de manire systmatique les signaux dintrts de manire ne pas omettre de valeurs de dplacement chimique. Sur la figure 23, 4 protons anomres sont observs aux 4.983, 4.871, 4.582 et 4.516. La dfinition de la valeur de lindice SOACS est obtenue simplement par laddition de ces quatre valeurs pour obtenir 18.952. Pour lindice SOACS-ol il suffit dadditionner la valeur du proton 2 du rsidu de N-Acetyl-galactosaminitol identifi ici 4.396, lindice SOACS-ol est donc : 18.952 + 4.396 = 23.347. Ce
Dans certains cas, le proton anomre peut-tre reprsent sous forme dun doublet de doublet dans le cas dun 2-deoxy sucre ou lorsquil sagit dun sucre 1-phosphate et quil existe une constante de couplage vicinale entre le phosphore et le proton anomre. Enfin il est noter quaucun de ces deux cas na encore t observ dans les O-glycannes de type mucine 14 Il se peut dans certains cas que deux protons anomres rsonnent, par pure concidence, au mme dplacement chimique.
13
Rsonance Magntique Nuclaire 47 couple de valeurs est spcifique de cette molcule. Lune ou lautre (ou les deux) peut tre utilise comme requte dans la GB (Tab. 4, 5, 6 et GlycoBase). 7.2.1.2 Structures de O-glycannes sialyls Lacide sialique tant un ctose ne possde pas de proton anomre, toutefois il peut tre caractris sans ambigut par la lecture de son proton H3 axial. Ce proton quelque soit la nature de lacide sialique ou de son type de liaison rsonne systmatiquement entre 1.60 et 1.95 ppm. Ainsi partir de lexemple de la figure 24, lindice SOACS peut-tre calcul comme suit : IS = 5.406 + 5.237+4.893+4.701+1.682=22.009. Cette valeur peut-tre directement utilise comme requte dans la GB : http://glycobase.univ-lille1.fr/base/ La lecture de la valeur du proton H-2 du rsidu GalNAc-ol est dans ce cas trs hypothtique et ne peut-tre obtenue aprs la ralisation dun spectre homonuclaire deux dimensions.
Figure 24 : Spectre proton 1 dimension dun O-glycanne sialyl
7.2.1.3 Calcul des indices partir de spectres homonuclaires 2D La dtermination des indices dans ce cas est rendue beaucoup plus aise lorsquil y a superposition de signaux RMN. Evidemment, les spectres homonuclaires utiliss seront de type COSY90 ou TOCSY avec, pour ce dernier, un temps de mlange de lordre de 30ms. Dans ce cas la lecture des dplacements chimiques se fait sur laxe F2, de manire obtenir une meilleure dfinition des valeurs. Il est toutefois recommand de nutiliser que deux dcimales. Dans ce cas : IS : 5.38 + 4.68 + 4.61 + 4.60 + 4.59 + 4.47 = 28.33 IS-ol = 28.33 + 4.32 = 32.65
Figure 25 : Dtails dun spectre COSY90 dun O-glycanne sulfat montrant les parties ncessaires au calcul de lindice SOACS.
7.2.1.4 Dfinition dune marge derreur Comme toute exprience, la spectroscopie de RMN peut tre soumise des erreurs exprimentales. Cest pourquoi, par principe, nous avons dcid le cas chant dutiliser une marge derreur qui peut-tre lapproximation de lexprimentateur. Nous avons dcid que lorsque la lecture des dplacements chimiques utiliss pour calculer le SOACS est faite sur un spectre proton une dimension, dutiliser une marge derreur de plus ou moins 0.002 ppm par unit monosaccharidique. Celle-ci peut-tre estime plus ou moins 0.005 ppm lorsque la lecture se fait sur un spectre 2 dimensions. Quoiquil en soit lutilisation de cette marge derreur nenlve en rien la pertinence de ces indices. IS/IS-ol : Nombre de dplacements chimiques () utiliss X 15 Ainsi pour les calculs faits prcdemment les indices incluant les marges derreurs peuvent tre utiliss de la manire suivante : IS : 6 => = 6 X 0.005 =+/- 0.03 28.30<IS<28.36 IS-ol : 7 => = 7 X 0.005 = +/- 0.035 32.615<IS-ol<32.685 Dans les tableaux 4,5 et 6 sont rpertoris les indices calculs pour des O-Glycannes de la littrature utilise.
15
Au choix de lexprimentateur, nous proposons un 0.002 ppm pour la lecture des sur une 1D proton et 0.005 ppm pour une lecture sur un spectre 2D de type COSY ou TOCSY

Tableau 4 : Classement des indices SOACS et SOACS-ol calculs pour les oligosaccharide-alditols isols de mucines oviducales damphibiens. rt : Rana temporaria (Florea 1997, Maes 1997), ra : Rana arvalis (Coppin 1999), xt : Xenopus tropicalis (Gurardel 2003), bv : Bufo viridis (Coppin 2002), rc : Rana clamitans (Delplace 2002), rr : Rana ridibunda (Mourad 2001), rd : Rana dalmatina (Florea 2002), rp : Rana palustris (Maes 1999) Nom Publi rt NIII-1a rt 100-4-a rt NIII-1b ra FNII-2 rt 200-3 rt NIII-2 rt 50-5-a Xt 10B rt 1 bv 10 Rt 50-4 ra FNII-4 rc D1 xt 5A rt 300-5 rd A-5 rtb 6 Ra 50-5 rt 200-7 rd N-4 rp N-2 rd N-3 ra FNII-3 rtb 4 rp 80-4a rd A-12A rd 3 rp 80-5 bv 8 rr 100-2 bv 9 rt 50-5-b rtb 13(1) ra 100-E rd A-4A rt 3 rd A-7A rc C1(D2) rd A-7B rr 200-I-2 rd A-6A xt 6 rtb 8 ra FNII-5 xt 5B rd A-6B rt 200-9 rtb 7 rt 200-8 rtb 9 ra FNII-6 ra 100-A rd A-3 IS 0,000 1,660 4,478 4,478 4,592 5,170 6,124 6,165 6,242 6,615 6,811 9,001 9,001 9,002 9,022 9,022 9,094 9,201 9,203 9,413 9,413 9,820 9,820 10,429 11,073 11,073 11,104 11,104 11,223 11,249 11,535 12,105 13,539 13,550 13,819 13,897 13,941 13,993 14,015 14,015 14,069 14,145 14,344 14,344 14,345 14,395 14,397 14,485 14,594 14,672 14,672 14,760 14,762 IS-ol 4,251 5,903 8,873 8,873 8,988 9,543 10,501 10,544 10,625 10,544 11,176 13,395 13,395 13,395 13,411 13,411 13,483 13,596 13,592 13,821 13,821 14,210 14,210 14,854 15,453 15,453 15,499 15,499 15,603 15,627 15,912 16,256 17,929 17,945 18,214 18,284 18,331 18,386 18,407 18,407 18,479 18,423 18,747 18,747 18,749 18,791 18,790 18,878 18,981 19,009 19,009 19,122 19,119 Nom Publi xt 5C rtb 14 rd A-19A xt 12A bv 11 rr 100-5 rd A-18 xt 9A rc C3 rc C2 rtb 13(4) rd A-8 ra 100-G rtb 12 rd A-4B ra 100-H rd A12-B ra 100-F rt 4 ra 100-D ra 50-10 rr 100-7 rd A-7C rr 200-II-6 rd N-8A rt 100-4b xt 8 xt 10A rc D3 rtb 10 rr N-II-6d rd N8-B xt 7 rd 4 bv 12 xt 12B rc C7 rc C5-3 rc C5-1 rc C5-4 ra 100-J bv 1 rr 100-10 ra 50-14B rd A-12C rt 5 rd A-15A rt 100-8 rr 100-9 rt 6 rt 2 rc D5(C2) rt 50-7b IS 15,289 15,595 15,784 15,846 16,378 16,381 16,459 18,511 18,570 18,737 18,879 18,952 18,963 18,994 19,169 19,244 19,276 19,276 19,286 19,320 19,374 19,381 19,393 19,393 19,650 19,673 19,809 19,863 19,956 20,010 20,087 20,338 20,431 21,994 21,994 22,126 23,161 23,238 23,298 23,476 23,833 23,856 23,909 23,909 24,018 24,130 24,223 24,233 24,287 24,421 24,435 24,493 24,557 IS-ol 19,59 23,93 3 20,17 6 20,09 9 20,70 4 20,76 3 20,82 8 22,90 2 22,96 9 23,12 1 23,27 7 23,34 7 23,35 5 23,39 3 23,56 4 23,61 5 23,64 5 23,64 5 23,67 5 23,67 0 23,72 8 23,74 1 23,78 5 23,78 5 23,98 9 24,03 2 24,09 9 24,16 0 24,34 6 24,38 8 24,45 0 24,62 4 24,73 1 26,23 1 26,23 261 ,42 272 ,62 2 27,62 3 27,68 0 27,85 9 28,15 6 28,23 7 28,25 4 28,25 4 28,36 3 28,51 8 28,55 4 28,56 8 28,65 0 28,75 3 28,78 3 28,88 3 28,95 4 Nom Publi rr N-II-8d rr 200-I-7 rt 50-7a rd A15-B xt 9B rt 100-6 rr N-II-10c bv 2 bv 13 rc C10-1 rc C8-1 rc C6 ra 100-M bv 3 rd A-19B rr 100-12 rr 400-II-4 rr 400-II-3 bv 4 rr 100-11 bv 5 ra 100-L rt 7 rd A-20 rtb 15(6) rc C10-4 rr 100-13 rr 200-I-10 rr 400-II-5 rr 400-II-6 rc C10-2 rc C10-3A ra 50-14A rc C10-3B rd A-21 rt 300-11 bv 6 rc C8-2 bv 14 rr 400-II-7 rr 200-I-8 bv 7 rc C11-4 bv 15 rr 200-I-9 rc C12 rc C14 rc C15-6 rc C16 rc C17-3 rc B1(C18) rc B2(C19) IS 24,621 24,663 24,770 24,892 24,967 25,156 25,794 25,816 26,582 27,727 27,825 28,242 28,339 28,626 28,827 28,879 28,895 28,976 29,231 29,288 29,429 29,508 29,592 29,778 30,522 32,816 33,811 33,871 33,888 33,896 33,954 33,979 33,986 33,987 34,050 34,326 34,448 34,924 36,184 38,488 38,904 38,976 39,188 41,390 43,252 44,434 49,237 49,375 53,744 58,143 68,452 68,455 IS-ol 28,988 29,017 29,114 29,223 29,270 29,476 30,096 30,197 30,818 32,339 32,212 32,628 32,667 33,027 33,160 33,234 33,246 33,340 33,231 33,651 33,662 33,732 33,924 34,050 34,908 37,264 38,176 38,236 38,232 38,257 38,488 38,369 38,198 38,377 39,039 38,668 38,676 38,699 40,414 42,839 43,255 43,199 43,577 45,613 47,591 48,821 53,775 53,959 58,132 62,529 72,840 72,841

Tableau 5 : Classification des oligosaccharide-alditols compils par Kamerling and Vliegenthart (1992) en fonctions de leurs indices SOACS croissants et SOACS-ol
Numro de la sequence 1 2 5 3 4 9 10 78 78A 11 11A 85 7 165 19 17 18 16 8 60 29 90 94 166 79 83 83A 96 86 25 133 13 12 21 24 61 35 38 34 37 66 87 80 98 105 134 112 81 92 135 89 95 91 84 109 97 22 IS no 4.478 4.553 4.604 5.103 6.169 6.305 6.347 6.364 6.790 6.807 8.033 9.006 9.007 9.048 9.086 9.115 9.141 9.143 9.394 9.840 10.796 10.812 10.871 11.225 11.551 11.571 12.666 12.915 13.495 13.583 13.615 13.631 13.636 13.636 13.932 14.213 14.344 14.420 14.446 15.288 15.320 15.354 15.359 15.364 15.446 15.503 15.516 15.919 16.043 16.057 16.129 16.159 17.009 17.224 17.766 18.119 IS-ol 4.252 8.873 8.795 8.891 9.498 10.544 10.565 10.737 10.753 11.183 11.207 12.411 13.401 13.394 13.291 13.376 13.404 13.541 13.423 13.798 14.239 15.056 15.073 15.258 15.605 15.932 15.957 16.928 17.725 17.889 17.968 18.016 18.027 17.918 18.039 18.337 18.485 18.745 18.724 18.713 19.592 19.700 19.752 19.751 19.754 19.830 19.782 19.910 20.166 20.293 20.332 20.366 20.422 21.300 21.611 22.015 22.402 Numro de la squence 23 20 76 167 41 49 30 77 75 39 40 48 36 72 67 110 114 116 117 101 88 107 119 113 82 122 99 106 93 123 141 27 26 28 15 14 62 57 51 52 168 63 33 43 124 50 31 69 42 68 138 140 111 115 120 118 102 IS 18.132 18.195 18.398 18.405 18.580 18.738 18.757 18.760 18.824 18.833 18.843 18.99 19.507 19.746 19.830 19.977 19.981 19.989 20.004 20.194 20.436 20.443 20.506 20.578 20.594 20.598 20.711 20.714 21.216 22.303 22.565 22.634 22.636 22.658 22.695 22.790 23.369 23.464 23.466 23.466 23.727 23.775 23.872 23.922 24.021 24.026 24.063 24.112 24.189 24.237 24.517 24.530 25.053 25.069 25.132 25.334 25.550 IS-ol 22.419 22.437 22.79 22.806 22.973 23.018 23.154 23.15 23.215 23.238 23.241 23.272 23.773 24.026 24.139 24.362 24.274 24.275 24.282 24.586 24.815 24.830 24.886 24.856 24.989 24.974 25.111 25.102 25.466 26.687 26.954 27.040 27.033 27.050 27.084 27.191 27.774 27.728 27.749 27.736 28.135 28.181 28.272 28.323 28.405 28.308 28.459 28.504 28.589 28.629 28.902 28.916 29.440 29.350 29.508 29.590 29.949 Numro de la squence 108 125 100 126 137 45 46 136 54 58 53 127 44 70 139 121 103 104 143 142 146 47 151 162 164 147 157 154 74 159 32 145 59 56 55 71 144 149 65 64 152 153 160 150 148 155 158 163 161 156 73 IS 25.745 25.758 25.775 27.466 27.694 27.714 27.759 27.903 28.507 28.814 28.822 29.180 29.226 29.474 29.775 30.207 31.000 31.091 31.697 31.712 32.541 32.632 32.669 32.884 32.960 33.035 33.148 33.158 33.214 33.318 33.442 33.594 33.853 33.865 33.877 34.952 36.968 37.522 37.523 37.547 37.738 37.743 37.840 38.235 38.265 38.463 38.509 38.842 38.912 43.666 43.827 IS-ol 30.132 30.142 30.174 31.849 32.082 32.109 32.156 32.302 32.777 33.074 33.102 33.569 33.627 33.876 34.159 34.584 35.294 35.415 36.084 36.099 36.825 37.024 36.888 37.277 37.356 37.317 36.532 37.437 37.614 37.705 37.828 37.982 38.143 38.135 38.142 39.222 41.357 41.804 41.915 41.939 41.997 42.022 42.235 42.636 42.561 42.742 42.908 43.243 43.182 48.068 48.229

Tableau 6 : Rcapitulatif des structures compiles dans la rfrence Kamerling 1992. LINUCS ID, correspond la numrotation de la Sweet-DB. La symbolique est rsume tableau 1 (&4).
N Ref (Kamerling 1992)
Schma
Mini
IS n.d.
Maxi
LINUCS ID 1561
Mini 4,250 8,869 8,887 9,494 8,791 5,941 5,970 13,395 13,417 10,538 10,562 10,559 -0,006 11,177 11,201 18,019 18,008
IS-ol 4,252 8,873 8,891 9,498 8,795 5,945 5,974 13,401 13,423 10,544 10,568 10,565 0,000 11,183 11,207 18,027 18,016
Maxi 4,254 8,877 8,895 9,502 8,799 5,949 5,978 13,407 13,429 10,550 10,574 10,571 0,006 11,189 11,213 18,035 18,024
1 2 3 4 5 6 6A 7 8 9 9A 10 10A 11 11A 12 13 4,476 4,602 5,101 4,551 1,698 1,719 9,002 9,139 6,162 6,184 6,301 -0,004 6,786 6,803 13,625 13,609
4,478 4,604 5,103 4,553 1,700 1,721 9,006 9,143 6,166 6,188 6,305 0,000 6,790 6,807 13,631 13,615
4,480 4,606 5,105 4,555 1,702 1,723 9,010 9,147 6,170 6,192 6,309 0,004 6,794 6,811 13,637 13,621
375 630 632 631 636 660 634 633 26663 2108 2505 1825 13822 1824 4281 4279
14
22,780
22,790
22,800
12295
27,179
27,191
27,203

Schma
Mini
IS
Maxi
LINUCS ID
Mini
IS-ol
Maxi
15
22,685
22,695
22,705
12296
27,072
27,084
27,096
16
9,137
9,141
9,145
8943
13,535
13,541
13,547
17
9,082
9,086
9,090
685
13,370
13,376
13,382
18
9,111
9,115
9,119
3668
13,398
13,404
13,410
19
9,044
9,048
9,052
3171
13,285
13,291
13,297
20
18,187
18,195
18,203
12298
22,427
22,437
22,447
21
13,630
13,636
13,642
4282
17,910
17,918
17,926
22
18,111
18,119
18,127
4290
22,392
22,402
22,412
23
18,124
18,132
18,140
4289
22,409
22,419
22,429
24
13,630
13,636
13,642
unreferenced
18,031
18,039
18,047
25
13,489
13,495
13,501
647
17,881
17,889
17,897
26
22,626
22,636
22,646
7045
27,021
27,033
27,045
27
22,624
22,634
22,644
12297
27,028
27,040
27,052
28
22,648
22,658
22,668
7046
27,038
27,050
27,062
29
9,836
9,840
9,844
80
14,233
14,239
14,245

Schma
Mini
IS
Maxi
LINUCS ID 4285
Mini
IS-ol
Maxi
30
18,749
18,757
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Schma
Mini
IS
Maxi
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Mini
IS-ol
Maxi
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unreferenced
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unreferenced
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Schma
Mini
IS
Maxi
LINUCS ID
Mini
IS-ol
Maxi
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Schma
Mini
IS
Maxi
LINUCS ID
Mini
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Maxi
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undetermined
0,000
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Mini
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Schma
Mini
IS
Maxi
LINUCS ID
Mini
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Maxi
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Schma
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IS
Maxi
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Mini
IS-ol
Maxi
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Schma
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Schma
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IS
Maxi
LINUCS ID
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Schma
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Mini
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Maxi
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Schma
Mini
IS
Maxi
LINUCS ID
Mini
IS-ol
Maxi
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148
38,249
38,265
38,281
12505
42,543
42,561
42,579
149
37,504
37,522
37,540
12506
41,784
41,804
41,824
150
38,219
38,235
38,251
12502
42,618
42,636
42,654

Schma
Mini
IS
Maxi
LINUCS ID
Mini
IS-ol
Maxi
151(15)
32,655
32,669
32,683
12500
36,872
36,888
36,904
152
37,722
37,738
37,754
12501
41,979
41,997
42,015
153
37,727
37,743
37,759
12503
42,004
42,022
42,040
154
33,144
33,158
33,172
12496
37,421
37,437
37,453
155
38,447
38,463
38,479
12499
42,724
42,742
42,760
156
43,648
43,666
43,684
12504
48,048
48,068
48,088
157
33,134
33,148
33,162
12508
37,516
37,532
37,548
158
38,493
38,509
38,525
12511
42,890
42,908
42,926
159
33,304
33,318
33,332
12509
37,689
37,705
37,721
160
37,824
37,840
37,856
12513
42,217
42,235
42,253
161
38,896
38,912
38,928
12510
43,164
43,182
43,200
162
32,870
32,884
32,898
12541
32,261
32,277
32,293

Schma
Mini
IS
Maxi
LINUCS ID
Mini
IS-ol
Maxi
163
38,826
38,842
38,858
12512
43,225
43,243
43,261
164
32,946
32,960
32,974
12507
37,340
37,356
37,372
165
9,003
9,007
9,011
3459
13,388
13,394
13,400
166
10,865
10,871
10,877
3458
15,250
15,258
15,266
167
18,397
18,405
18,413
2540
22,796
22,806
22,816
168
23,717
23,727
23,737
378
28,123
28,135
28,147
Rsonance Magntique Nuclaire 66 7.2.2 N-GLYCANNES Lapplication de ce SOACS aux N-Glycannes est quasiment identique lexception de quelques paramtres. En effet, les N-Glycannes sont librs de diffrentes manires, enzymatiques ou chimiques, et leur extrmit terminale rductrice peut se trouver sous diffrentes formes. Ces N-Glycannes peuvent tre sous forme de glycopeptides16, de Glyco-asparagine17, peuvent tre rducteurs avec du chitobiose18 ou navoir quun seul rsidu de N-acetyl glucosamine en position terminale rductrice. Il est possible dans ces deux dernier cas de rduire le N-Glycannes pour obtenir un rsidu de GlcNAc-ol. De facto, lindice SOACS-ol nest pas dfini pour ce type de glycanne. De plus le rsidu Mannosyl substituant le chitobiose rsonne systmatiquement, dans les conditions standard daccumulation (D2O, pD 7) avec les protons du solvant rsiduel, il est par consquent rarement visible sur un spectre une dimension. Ainsi, seul ce rsidu nest pas pris en compte pour le calcul de lIS. Enfin, il est ncessaire dintgrer systmatiquement les protons observer pour valuer le nombre de protons prsents dans la molcule. Nous recommandons lorsque cela est possible denregistrer un spectre deux dimensions.
Figure 25 : Spectre une dimension dun N-glycanne oligomannosyl classique :
Seule la partie ou rsonnent les protons anomres est pris en compte. Le calcul de lIS seffectue donc de la mme manire que pour les O-Glycannes :
16 17
Le N-glycanne est alors li un peptide par liaison N-glycosidique sur une Asn Le N-glycanne est N-li sur un seul rsidu dAsn 18 chitobiose : -D-GlcpNAc-(1-4)-/-D-GlcpNAc
Figure 26 : Partie anomre dun spectre de N-glycanne oligomannosyl enregistr 300K19
Dans ce cas : IS = 5.403 + 5.333 + 5.305 + 5.071 + 5.059 + 5.052 + 4.907 + 4.871 + 4.608 = 45.609 La marge derreur de +/- 9 X 0.002 =0.018 Pour les N-glycannes sialyls, tout comme pour les O-glycannes, le proton H3 axial de lacide (ou des) est pris en compte.
7.3 MOLECULES DE CHIMIE ORGANIQUE

Lapproche pour ce type de molcule est un peu diffrente. En effet, ces molcules sont en gnral tudies en RMN du carbone20 une dimension compte tenu de la quantit de matriel disponible. De facto, lindice calcul seffectuera sur la base des dplacements chimiques carbones. La dfinition spectrale permet ainsi dobtenir tous les des carbones de la molcule. Lindice calcul correspond dans ce cas laddition de tous ces . Ceci nous permet de dfinir un autre indice le SACCS acronyme de Sum of All Carbone Chemical Shifts . Ainsi nous avons partir de la littrature (Leroy et al 1972) calcul les indices SACCS dun certain nombre de molcules, ceux-ci sont rpertoris dans la table 7.
19 20
Ce glycanne nest pas encore rpertori dans la glycobase Rappel, seuls les isotopes 13C sont observables en RMN

Table 7 : Classification (partielle) des structures de la rfrence Leroy (1972) en fonction de leur Indice SACCS. Malgr lexistence de SACCS identiques ou trs proches, nous remarquons que les molcules sont trs diffrentes, la simple comparaison de leur spectre suffit les discriminer.
Name Solvent N ref Indice SACCS chemical shifts
ethyl iodide 1-iodopropane ethylthiocyanate diethylamine dimethyl methylphosphonate tetrahydrothiophene ethanesulfonyl chloride N-nitrosodimethylamine pyrrolidine diethylsulfite tetramethylene sulfone 1,1,2-tribromomethane nitroethane ethylsulfate sym-dimethylethylenediamine 2-mercaptoethanol tetrahydrofuran 1-bromo-2-methylpropane 2-bromo-2-methylpropane 1,5-diaminopentane tert-butyl alcohol n-propanol 2-chloro-2-methylpropane piperidine 1,2,3-trichloropropane isopropylmethylamine 1,2-dibromopropane propylene oxide acetonitrile isobutyl alcohol 1,2-butanedithiol tetrahydropyran 1,1,2-trichloroethane 1-bromo-3-methylbutane 2-bromobutane 1,2-dichloropropane 1,2-dibromobutane 2-chlorobutane 1,2-dimethoxyethane 1-Chloro-3-methylbutane sec-butyl alcohol 1,2-dibromo-2-methylpropane propionitrile 1-chloropentane 2-amino-2-methyl-1-propanol N-methyl-sec-butylamine isopentyl alcohol 2-methylaminoethanol 2-chloro-2-methylbutane propylene glycol 2-amino-1-butanol dimethylglyoxime isobutyronitrile N,N-dimethyl-1,3-propanediamine choline chloride 3-chloro-1,2-propanediol 1,3-butanediol cyclobutylnitrile acetoneoxime acetic acid succinic anhydride
CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane CDCl3 dioxane CDCl3 dioxane dioxane CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane dioxane CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane CDCl3 dioxane dioxane CDCl3 CDCl3 dioxane dioxane CDCl3 dioxane dioxane CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane dioxane CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane CDCl3 CDCl3 CDCl3 DMSO CDCl3 dioxane water water CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 DMSO
9 33 25 98 42 78 8 11 84 94 77 2 10 13 101 12 73 79 81 144 88 39 82 133 23 97 26 29 4 90 95 124 3 129 80 27 69 83 93 131 89 70 24 132 99 141 139 41 130 40 100 71 66 143 142 32 91 56 35 7 49
19,3 51,3 55,9 59,5 61,9 62,6 69,3 72,0 72,8 73,7 74,3 79,0 83,0 84,1 88,4 91,1 93,7 93,8 98,5 100,1 100,1 100,8 101,2 101,6 104,3 106,9 107,4 113,0 119,0 119,1 119,2 120,0 120,5 122,0 125,4 127,7 129,7 129,9 130,9 132,4 133,9 138,1 142,2 142,6 148,4 149,0 149,8 150,6 151,3 154,6 157,0 162,3 163,4 176,2 179,7 182,3 190,3 191,4 191,6 198,7 201,5
-1,2 9,2 15,4 15,4 9,8 31,2 9,1 32,1 25,7 15,4 22,8 38,7 12,3 14,5 36,4 27,1 25,8 20,9 36,4 24,2 31,2 10,5 34,4 25,9 45,3 22,5 24,1 18,1 1,3 18,9 11,4 24,2 50,1 21,8 12,1 22,4 10,9 11,1 58,6 22,0 10,0 31,8 10,6 13,9 26,7 10,2 22,6 36,0 9,4 18,7 10,4 9,2 19,8 32,2 54,8 46,8 23,4 19,9 14,9 20,6 28,6
20,5 15,3 28,6 44,1 52,1 31,4 60,2 39,9 47,1 58,3 51,5 40,3 70,7 69,6 52,0 64,0 67,9 30,7 62,1 33,8 68,9 26,3 66,8 27,8 59,0 33,9 37,6 47,3 117,7 30,8 29,4 27,2 70,4 26,8 26,0 49,5 29,0 25,0 72,3 25,7 22,7 44,6 10,8 22,1 50,6 19,3 24,8 54,3 32,0 67,7 26,5 153,1 19,9 40,8 56,6 63,5 40,6 22,0 21,5 178,1 172,9
26,8 11,9
42,2 42,1 64,0 47,9 50,5 45,7 47,6 69,4 33,2 68,6 31,7 34,2 55,8 35,5 33,7 41,6 32,0 61,7 120,8 29,2 71,1 56,4 41,7 60,3 38,8 68,2 54,3 123,7 45,4 68,3 72,0 60,0 27,1 155,2
45,2
41,7 53,1 54,3 60,1 43,1 69,2
32,5 29,3 60,7 71,1 65,8
44,9 33,8
57,8
66,3 122,4

2,5-dihydrofuran 1-amino-3-methoxypropane tetramethylurea 2-propyne-1-ol 2-butyne-1-ol succinimide ethylene glycol monoethyl ether alpha-methyltetrahydrofuran pyrrole thioacetic acid beta-methyltetrahydrofuran dimethylformamide acetaldehyde ethylcarbamate 3-mercaptopropionic acid acetone tetramethyliuorea 2,5-dibromothiophene 2,3-dibromopropionic acid alanine L-tartaric acid 3-methoxy-1-butanol hexachlorobutadiene thiophene furan 1-bromo-1-propene (cis) 3-pentanone 3-hydroxy-3-methylbutyne-1 1-bromo-1-propene (trans) 1,3,5-tribromobenzene ethyl methylcarbamate 2-bromobutyric acid N,N-dimethyl acetamide cysteine sodium diethyldithiocarbamate 2-pyrrolidone butyraldehyde Trifluoroacetic acid isopropylacetate cyclopentanone methyl ethyl ketone 3-ethoxypropionitrile allyl bromide maleic acid hydrazide betaine hydrochloride 4-butyrolactone 3-chloro-1-propene methyl isopropyl ketone maleic anhydride methylene cyclobutane 2-methyl-2-butene trimethylvinylammonium bromide 3-hydroxy-1-propene propylene carbonate methionine acetoin ethyl trichloroacetate threonine proline hexachlorocyclopentadiene ethyl trifluoroacetate 2-chloroacrylonitrile acrylonitrile beta-xylose trichloroacetylisocyanate crotononitrile (cis) alpha-xylose 2,3-butandione monooxime crotononitrile (trans) methoxyethyl thioglyconate CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane dioxane water CDCl3 dioxane CDCl3 dioxane dioxane CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 water water CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane CDCl3 CDCl3 dioxane CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane water water CDCl3 dioxane CDCl3 dioxane dioxane dioxane CDCl3 CDCl3 DMSO water CDCl3 dioxane CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane water CDCl3 CDCl3 water CDCl3 CDCl3 water water dioxane CDCl3 CDCl3 dioxane water CDCl3 dioxane water CDCl3 dioxane CDCl3 59 96 137 19 58 55 92 123 54 6 125 34 5 37 31 28 138 44 18 36 64 140 43 50 48 20 122 112 20 145 86 65 85 38 120 67 74 1 126 113 75 116 21 47 134 60 22 121 45 110 119 136 30 62 135 76 51 87 117 102 52 15 16 128 14 53 128 68 53 127 201,6 202,5 203,9 206,8 212,6 213,9 215,0 222,9 225,8 227,1 228,9 229,7 230,4 233,2 235,4 236,6 236,9 241,5 242,8 245,2 248,1 248,7 250,0 251,6 252,7 253,6 254,7 254,9 255,5 256,1 260,6 262,7 262,9 263,4 268,2 272,9 277,6 278,0 279,6 279,7 281,1 283,6 285,6 286,5 287,0 296,4 297,8 298,7 300,9 304,1 306,3 311,1 315,8 319,0 319,0 328,6 330,1 334,5 338,8 342,8 351,9 356,9 363,1 370,9 381,2 384,4 384,8 388,8 389,2 390,3 75,3 33,6 38,5 50,0 3,2 30,3 15,0 21,0 107,9 32,6 17,9 31,1 30,7 14,5 19,3 30,6 43,0 111,4 28,8 17,2 72,8 18,9 123,6 124,9 109,7 15,3 7,9 31,3 18,1 123,2 14,7 11,7 21,3 28,2 12,3 20,8 13,8 115,0 20,8 23,5 8,0 14,9 32,6 130,3 54,8 22,2 45,1 18,1 136,6 16,8 13,3 55,3 63,4 19,1 15,0 19,4 13,7 20,0 24,6 81,5 13,8 110,8 108,1 61,8 92,4 17,3 66,0 8,0 18,8 26,3 126,3 39,6 165,4 73,8 50,5 183,6 61,5 26,2 117,9 194,5 34,0 36,2 199,7 60,9 38,2 206,0 193,9 130,1 40,4 51,5 175,3 39,1 126,4 126,7 143,0 108,9 35,4 64,0 104,7 132,9 27,4 28,1 34,5 58,4 49,5 30,3 16,0 163,0 21,8 38,0 29,0 18,9 118,8 156,2 64,6 27,7 118,1 27,3 164,3 32,1 17,1 112,7 114,9 70,8 30,6 24,9 65,4 62,7 29,8 128,5 64,7 114,4 117,5 70,2 130,2 100,9 70,0 25,0 101,2 58,7 58,4 83,0 78,9 66,5 33,5 70,9
80,0 72,0 67,2
75,0
34,7 162,4 157,8 177,9
67,6
74,7
173,6 176,5 55,8 59,6 75,3
129,4 211,4 70,0 132,7 60,7 47,0 37,5 176,8 206,4 42,4 45,9 67,4 218,2 36,5 65,1 134,2 167,6 68,6 134,6 41,5 104,8 25,5 143,1 137,5 73,9 34,6 73,1 89,9 70,4 47,0 132,8 115,3 131,7 137,5 72,3 158,6 116,0 74,8 157,0 117,6 64,4
89,6
157,8 175,9 169,6
179,4 201,9 169,6 207,6 66,5
118,2
177,9 211,8 150,4 118,7
131,7
155,2 56,1 211,2 161,1 181,4 62,1 158,1
182,7
175,3
73,6 150,2 76,6 198,8 151,6 70,2
93,0
97,4
170,7

o-dichlorobenzene hydroxyproline pyridine thiazole vinyl acetate thiomalic acid N-Glyclyglycine monosodium glutamate methyl methacrylate crotonaldehyde 2-chlorothiophene m-dichlorobenzene 1,2,3-trichlorobenzenze 1-bromo-4-nitrobenzene 2-methylpyrazine acetyl acetone citraconic anhydride 3-chloro-6-methoxypyridazine 2-aminopyridine 2-pyridone furfural CDCl3 water CDCl3 CDCl3 dioxane water water water dioxane dioxane CDCl3 dioxane CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane CDCl3 CDCl3 CDCl3 CDCl3 dioxane 148 118 106 17 61 63 72 111 114 57 46 149 146 147 108 115 103 105 109 107 104 390,8 398,6 409,1 414,5 426,4 429,4 430,5 475,0 498,7 500,2 506,1 521,6 522,0 534,2 605,9 606,3 621,3 621,3 665,9 668,5 715,2 127,7 38,2 123,6 118,6 20,2 36,9 41,3 27,8 18,3 18,2 123,9 127,0 127,5 124,9 21,6 24,3 11,3 55,0 108,5 106,7 112,9 130,5 53,9 135,7 143,2 96,8 40,2 44,2 34,3 51,5 134,9 125,9 128,9 128,6 129,8 141,8 30,2 129,7 120,1 113,3 120,1 121,6 132,6 60,7 149,8 152,7 141,8 175,3 167,9 55,5 124,7 153,7 126,4 130,6 131,6 132,5 143,8 58,2 149,5 130,8 137,5 134,8 148,7 70,9 174,9
167,6 177,0 177,1 175,4 136,9 193,4 129,9 135,1 134,3 147,0 144,7 100,3 164,3 151,0 147,7 141,6 153,8
182,0 167,3
154,0 191,4 166,5 164,4 158,9 165,3 178,2
201,9
7.4 CONCLUSION
Les indices SOACS, SOACS-ol et a priori SACCS sont des outils de recherches perfomants qui permettent, sur la base de lexprience RMN proton ou carbone, de retrouver aisment une molcule dj compile dans la GlycoBase21. Nous tenterons de convaincre les autres banques de donnes RMN dutiliser cette requte en plus de celles existantes. Enfin cette requte a t publie dans Carbohydrate Research (Maes et al 2008).
TP PT
21
TP PT
http://glycobase.univ-lille1.fr/base/
8. CONCLUSION
Comme nous avons pu le voir, la R.M.N. est un outil particulirement intressant dans lanalyse structurale des oligosaccharide-alditols puisque ceux ci sont constitus majoritairement datomes possdant une rsonance. Cette technique est puissante par le fait quelle est suffisante pour une dtermination complte de la composition et de la structure de ces molcules biologiques. Bien que non destructive cette technique a ses limites. En effet les expriences, et notamment les expriences dobservation du carbone 13C, demandent une quantit non ngligeable de matriel qui nest pas toujours disponible. Nanmoins lavnement de la nouvelle gnration des supra-conducteurs et la mise au point de bobines inductrices de champs magntiques de plus en plus puissants (jusqu' 1 GHz) ainsi que de squences dimpulsions de plus en plus complexes permettent daugmenter la sensibilit de cette technique. La R.M.N. est une technique parfaitement complmentaire de la spectromtrie de masse (et vice et versa). Leur combinaison permet trs souvent dobtenir les rsultats souhaits. Enfin ce livret a t labor partir de revues gnrales et de sites internet. Nous conseillons vivement aux lecteurs la consultation de ces ouvrages pour de plus amples informations.
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9. BIBLIOGRAPHIE
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Rsonance Magntique Nuclaire 1

LA RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE

Rsonance Magntique Nuclaire 2

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 3

TABLE DES MATIERES

3.1 3.2 3.3 3.4 3.5

4.1 4.2 4.3 4.4 4.5

Rsonance Magntique Nuclaire 4

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 5

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 6

2. SCHEMA GENERAL DUNE EXPERIENCE R.M.N.

Figure 1 : Reprsentation schmatique dune exprience R.M.N.

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 7

3.2 QUELS SONT LES NOYAUX CAPABLES DE FOURNIR UNE RESONANCE ?

3.3 LES ETATS ENERGETIQUES

3.4 FREQUENCE DE PRECESSION

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 9

Figure 3 : Reprsentation schmatique de lapplication dune radiofrquence B1 sur la magntisation macroscopique.

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 10

4.1 COMMENT MESURER LA FREQUENCE DE PRECESSION ?

FID : Free Induction Decay

COMMENT SUPPRIMER LES SIGNAUX INDESIRABLES ?

4.3 LES MONOSACCHARIDES

Maes E. Mise jour 01/09

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 13

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 14

4.4 LES CONDITIONS DE MESURE

LES PARAMETRES IMPORTANTS

nOe : nuclear Overhauser enhancement

Rsonance Magntique Nuclaire 16

1/2 1/2 1/2 1/2

99,98 1,108 0,37 100

80,000 20,115 8,106 32,385

100,000 25,144 10,133 40,481

200,000 50,288 20,265 80,961

300,000 75,432 30,398 121,442

J ou n 4, couplage longue distance.

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 18

JH5,H6 JH5,H6' JH5,H4

JH6,H6' 3JH6',H6 JH6,H5 3JH6',H5

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 19

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 20

Strochimie des rsidus aldopyranosiques

J1,2 J2,3 J3,4 J4,5 G G G G G G G G G G P P G P G P

Configuration -gluco -ido strochimie impossible -galacto -altro

Exemples de rsidus -D-Glc, -D-GlcNAc, -D-Qui (-D-Idose)

-D-Gal, -D-GalNAc, -L-Fuc, -D-Fuc (-D-Altrose)

(-D-Allose) (-D-Gulose) -D-Glc, -D-GlcNAc, -D-Qui (-D-Idose)

-gulo et altro, allo et ido, gulo gulo et talo

Maes E. Mise jour 01/09

Rsonance Magntique Nuclaire 21

4.6 COMMENT APPREHENDER LINTERPRETATION DES O-GLYCANNES ?