Informe del Laboratorio N 2

DETERMINACION DEL NIVEL DE GLUCOSA EN SUERO SANGUINEO

En el presente informe se detalla la tcnica adecuada para realizar la extraccin de sangre venosa exitosamente. Adems los mtodos para llevar a cabo la cuantificacin de la concentracin de glucosa en sangre. Para determinar la concentracin de glucosa en el suero sanguneo se usar el espectrofotmetro, el cual nos permite determinar la absorbancia de la sustancia, es decir, la luz UV visible a una determinada longitud de onda y mediante clculos se pudo obtener la concentracin de glucosa. La correcta extraccin de sangre venosa y manipulacin de muestra evitaran errores en los resultados y como consecuencia errores en el anlisis y conclusiones.
Integrantes: Carolina Snchez Cristian Castro 23 de Septiembre de 2013

1.- OBJETIVOS: 1.1.- Objetivo General: Determinar los niveles de glucosa en suero sanguneo de diferentes muestras mediante espectrofotometra.

1.2. Objetivos especficos: Adquirir los conocimientos necesarios en cuanto a la tcnica de extraccin de sangre venosa. Aplicar y perfeccionar la tcnica de extraccin de sangre venosa. Comparar los niveles de sangre obtenidos en la prctica realizada con los niveles normales de glucosa en la sangre.

2.-MARCO TEORICO: GLUCOSA: La glucosa es un monosacrido de seis carbonos el cual tiene por formula C6H12O6, es un compuesto qumico de vital importancia para el desarrollo de la vida, pues es un compuesto pilar de las variadas rutas metablicas usadas para la obtencin o reservacin de energa en el cuerpo como: la glicolisis, ruta de las pentosas-fosfato, glucognesis las cuales parten de la glucosa y desembocan dando los precursores para el ciclo de Krebs y fosforilacion oxidativa. Es un compuesto esencial en los organismos ya que estos se han acoplado increblemente al aprovechamiento de esta sustancia, por ejemplo solo molculas de glucosa son capaces de brindar energa al cerebro, ninguna otra ms; es por esto que es de vital importancia estudiarla a fondo tanto en su estructura como en su buen y mal funcionamiento. GLUCOSA EN SANGRE: Es la cantidad de esta azcar que se encuentra presente en el suero sanguneo y hace posible que todo el cuerpo tenga a la mano la cantidad de energa que necesite para cualquier actividad, esta cantidad se mide en mg/dl o en mmol/l; dependiendo la prueba que se haga los valores normales entraran en rangos un tanto distinto, pero en general se puede decir que los valores normales de glucosa en sangre recaen en estos intervalos: ( 72-145 mg/dl; 4-8 mmol/l). HIPERGLICEMIA E HIPOGLICEMIA: La ausencia de glucosa o un valor menor a los 70 mg/dl o 4mmol/l nos puede denotar que existe una alteracin en la homeostasis de la glucosa en el organismo, que puede ser provocada en el mejor de los casos por un ayuno en el individuo, o si no conlleva a desordenes ms graves como es la hipoglicemia; en el caso contrario cuando los niveles de glucosa superan los 145mg/dl u 8mmol/l estaramos hablando de que el individuo estuvo recin alimentado, o tiene un padecimiento conocido como hiperglicemia. Estas dos enfermedades derivadas de la glucosa son

difciles de tratar y no se tiene una cura contundente, provocando males como diabetes mellitus entre los mas conocidos. El exceso de azcar (glucosa) en sangre, incrementa el riesgo de infecciones y est directamente relacionado con la aparicin de complicaciones crnicas a largo plazo. La enfermedad provocada si existe un alza exagerada en los niveles normales se denomina coma diabtico, padecido principalmente con personas con diabetes tipo I. La hipogliemia no es un padecimiento grave, es fcilmente tratable pues lo que se necesita de manera principal es una mayor ingesta de alimentos que contengan gran cantidad de glucosa.

3.-FUNDAMENTO: MTODO ENZIMTICO PARA LA DETERMINACIN DE GLUCOSA EN SANGRE La determinacin de la glucosa es el mtodo por el cual se cuantifican los niveles de glucosa en plasma. Esto permite realizar el diagnstico de diferentes estados metablicos (hipoglucemia, normoglucemia o hiperglucemia). Teniendo en cuenta que los valores normales de glucosa en sangre son 75 a 115 mg%, pero en casos patolgicos pueden ser: menores de 70 mg% o sobrepasar largamente el valor de 110 mg%, se debe utilizar un mtodo bioqumico que permita detectar niveles de glucosa en un amplio rango de concentraciones. El mtodo de eleccin es el de la glucosa oxidasa-peroxidasa. Mtodo enzimtico colorimrtrico La glucosa es oxidada enzimticamente por la glucosa oxidasa (GOD) a cido glucnico y agua oxigenada (H2O2). El agua oxigenada en presencia de la enzima peroxidasa (POD) produce el acoplamiento oxidativo del fenol con la 4-aminofenazona dando lugar a la formacin de un cromgeno 4-p-benzoquinona-monoimino fenazona.

La 4-p-benzoquinona-monoimino fenazona es de color rojo-cereza. La cuantificacin del producto coloreado se realiza midiendo A505 nm en un espectrofotmetro o en su defecto un fotocolormetro, utilizando filtro verde de A490-530 nm. Cada molcula de glucosa que reacciona produce una molcula de H2O2 y cada una de stas oxida una molcula de colorante, produciendo una molcula coloreada (rojo cereza). El desarrollo del color es cuantificado en un fotocolormetro. Este valor debe ser comparado con los obtenidos a partir de cantidades conocidas de glucosa, con los que se construye una curva de calibracin: a

mayor cantidad de glucosa, mayor ser la cantidad de compuesto coloreado y por lo tanto, mayor la absorbancia. Se preparan por lo menos cuatro tubos testigos, con distintas cantidades de glucosa (T1-T2-T3-T4) y otro tubo (BLANCO) en el cual el volumen de la solucin de glucosa se reemplaza por agua. En forma simultnea, se procesan las muestras incgnitas. Luego, se agrega a todos los tubos el mismo volumen de reactivo necesario para inducir la obtencin del producto coloreado. El tubo BLANCO no debe desarrollar el color caracterstico de la reaccin, debido a la ausencia total de glucosa. Para simplificar, el primer tubo que se lee es el tubo BLANCO, con el cual se calibra la escala de absorbancias a 0 y automticamente esta lectura es restada, por el fotocolormetro, a todas las lecturas posteriores. Se contina con la lectura de los tubos TESTIGOS y de los tubos MUESTRA. 4.-MATERIALES Y METODOS: -2 Jeringuillas 5ml -Torniquete -Torunda con alcohol -6 tubos de ensayo -STD -Espectrofotmetro -Centrifuga

1.-Se procedi a realizar la extraccin de sangre utilizando el mtodo de la practica anterior, tratando de obtener el fluido sin que este sufra de hemolisis. 2.-Se tomo una muestra de cada uno de los dos individuos, uno en ayunas y otro en estado postprandial. 3.-Obtenidas las muestras se dejo pasar 5 minutos hasta que estas empiecen con el proceso de coagulacin y se procedi a ingresarlas en la centrifuga a 1000 Rpm durante 5 minutos, para lograr separar el suero de la sangre. 4.-Se rotulo cuatro tubos de ensayo uno con la palabra blanco, otro con estndar, otro con muestra 1 y otro con muestra 2. 5.- Los cuatro tubos se prepararon con 1000 ul. de RGT (Caldo enzimtico) 6.- Al cabo del tiempo se extrajo las muestras de la centrifuga y se pipeteo la mayor cantidad de suero posible en dos tubos de ensayo previamente preparados (muestra 1 y muestra 2). 7.- El tubo blanco se conserv solo con RGT y el tubo estndar con 1000 ul. de RGT y 10 ul. de STD.

8.-Se mezcl cada uno de los tubos y se los dejo a temperatura ambiente durante 10 minutos. 9.-Se encero el espectrofotmetro primero usando agua destilada y luego usando la solucin blanco. 9.-Se procedi a obtener la absorbancia de los otros tres tubos (estndar, muestra 1 y muestra 2).

5.-RESULTADOS: Tabla 1 Los resultados que encontramos aqu fueron encubados a 10 minutos a temperatura ambiente (20-25) C Blanco RGT Estandar (STD) Suero (1-2) Resultados en el espectrofotmetro 1000ul 0 Estandar 1000ul 10ul 0.038 c Muestra (1) Ayuna 1000ul 10ul 0.031c Muestra (2) Pos prandial 1000ul 10ul 0.038c

Tabla 2 Cantidad de Glucosa encontrada en el suero de las dos muestras. C mg/dl=100*(Ab muestra/Ab estndar) Niveles de glugosa(mgldl) 81.57 100 Rango (75-115)mg/dl Normal Normal

Muestra (1)Ayunas Muestra (2)Pos Prandial

Tabla 3 Resultados Globales de los 7 grupos del laboratorio. De los grupo (1-4) fueron sometidos su incubacin a 37C en bao Mara, en cambio del (5-7) fueron sometidos su incubacin a temperatura ambiente (20-25) C Grupo Absorbancia Estandar Absorbancia de la muestra (1) Ayunas 0.028 0.025 Absorbancia de la muestra (2) Pos Pandial 0.029 0.020 Glucosa mg/dl Ayunas Glucosa mg/dl Pos Prandial 103.57 66.667

1 2

0.028 0.039

100 64.103

3 4 5 6 7

0.041 0.033 0.035 0.038 0.027

0.022 0.024 0.032 0.031 0.025

0.035 0.031 0.032 0.038 0.020

53.66 72.72 91.428 81.57 92.6

85.37 93.93 91.428 100 74.07

Grafico 1

Glucosa vs Absorbancia Muestra (1)

140 120 100 80 60 40 20 0 1 0.028 0.025 0.022 0.024 0.032 0.031 0.025 0 2 3 4 5 6 7 8 0 9 64.103 53.66 100 72.72 91.428 92.6 81.57 75 Series2 Series1 115

Grafico 2

Glucosa vs Pos Prandial Muestra (2)

140 120 100 80 60 40 20 0 1 0.029 0.02 0.035 0.031 0.032 0.038 0.02 0 2 3 4 5 6 7 8 0 9 66.67 103.57 85.37 93.93 91.43 100.00 74.07 75.00 Series2 Series1 115.00

6.-ANALISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS: Mediante el anlisis de Glucosa en Sangre se determinaron valores de las dos muestras extradas. Los valores obtenidos en la TABLA 2 , la muestra 1 y muestra 2 fueron 81.57 mg/dl y 100 mg/dl respectivamente, con lo cual podemos decir que los valores se encuentran en el rango normal, descartando la presencia de enfermedades relacionadas con falta o exceso de azcar en la sangre. En la tabla 3 podemos observar que la Absorbancia Estndar no es igual en los mismo grupos ya que influye varias cosas, como pipetea la persona que puso en la muestra con qu rapidez lo hizo, en el tiempo que lo hizo y como fue sometida en su proceso de incubacin En el Grafico 1 podemos observar que encontramos 2 valores que estn menores al nivel del rango establecido y que posiblemente pueden estar ocurriendo falta de azcar en la sangre para que esto sea confiable se debera realizar otra prueba tomando en cuenta todas las medidas necesaria y si volveran a tener esos resultados, se deber entregar al mdico para que se realice el tratamiento correspondiente. En el Grafico 2 encontramos un caso parecido al del grafico 1, se deber tomar las mismas medidas anteriormente mencionadas Resulta importante tomar en cuenta que la glucosa se encuentra en constante cambio, ya que va a sufrir modificaciones de acuerdo a comida, ejercicio, entre otras actividades. Si el anlisis se lo realiza una hora y media despus de haber ingerido alimentos tendremos como resultado ptimo un valor inferior a 180 mg/dl. Tomando en cuenta esta variacin es necesario que el examen se realice en ayunas, caso contrario se pueden obtener valores falsos indicando valores normales en un paciente cuando puede estar enfermo o viceversa.

Por ltimo se consider necesario que los reactivos utilizados en el anlisis se coloquen si es posible al mismo tiempo en las muestras a ser analizadas, con el fin de evitar errores en los resultados. De la misma manera es indispensable evitar la coagulacin de las muestras de sangre una vez extradas. 7.-CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES: 7.1.-Conclusiones: -Se observa en las tablas de resultados obtenidas una clara diferencia entre el promedio de las personas que se realizaron la prueba en ayunas y las personas en estado post-prandial, mostrndonos un media mayor en estas ltimas debido a la ingesta de alimento de estas personas, las cuales sufren un proceso temporal de alza de los niveles normales de azcar en su sangre, esto ya que debe degradarse el alimento ingerido y metabolizarse para poder volver a su estado normal. -Existi variabilidad en los resultados de la absorbancia de las distintas muestras trabajadas (tabla 2), lo que deja ver que puede existir fallos en los anlisis de este tipo, por lo que si se arroja algn resultado fuera de lo normal lo aconsejable es repetir la prueba para asegurar un diagnstico ms acertado .

7.2.-Recomendaciones: -Se recomienda la mayor precaucin y tranquilidad al momento de llevar a cabo el test, pues cualquier error en el procedimiento puede desembocar en resultados falsos acerca de las muestras. -Se recomienda el pipeteo de una sola persona para todas las muestras, pues asi el ndice de error disminuir y se obtendrn resultados ms confiables. 8.-BIBLIOGRAFIA: -Glucemia, Bioqumica Humana, Facultad de Medicina Virtual de la Universidad de Buenos Aires, (2010), Pgs. 2,3. -X. Fuentes et al. Bioqumica clnica y patologa molecular Vol. II Librimundi Segunda Edicin Mxico. 2007 Enlace: www.fmvuba.org.ar/grado/medicina/ciclo_biomedico/segundo_a%C3%B1o/bioquimica/glucemia 2.pdf www.niprodiagnostics.co -