UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA INSTITUTO DE BIOTECNOLOGA CTEDRA BIOTECNOLOGA PARA NO BIOTECNLOGOS TALLER TCNICAS MOLECULARES Amanda Catalina Duarte

Gmez 244480

Las tcnicas moleculares revolucionaron el mundo de la investigacin cientfica, pues aportaron las herramientas necesarias para estudiar las molculas de ADN, logrando la manipulacin biotecnolgica de los cidos nucleicos.

ELECTROFORESIS Es una tcnica que permite visualizar los cidos nuclicos en geles que actan como un soporte. 1. Cul es el principio de la electroforesis? El principio se basa en el movimiento de partculas cargadas en un campo elctrico, que se mueven hacia el electrodo de carga opuesta. 2. Cules son las aplicaciones que se le han dado a esta tcnica? Se aplica en la separacin de compuestos que tiene grupos Ionizables como los aminocidos, protenas, pptidos y cidos nucleicos. 3. Qu clases de electroforesis se pueden encontrar?

La electroforesis en gel de muestras grandes de ADN y ARN se efecta en geles de agarosa. La electroforesis de protenas se lleva a cabo en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE), isoelectroenfoque, geles nativos o electroforesis bidimensional. Electroforesis capilar. Electroforesis de ADN.

4. Por qu es importante el aporte de la electroforesis al desarrollo de la biotecnologa? Principalmente por la facilidad que tiene sta para aislar protenas y compuestos ionizados y que en la biotecnologa ha sido un gran paso para

entender la composicin gentica y el mapa que todos los seres vivos poseen para su existencia. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIN Son enzimas que cortan las molculas de ADN en sitios especficos denominados sitios de restriccin, razn por la cual se les ha llamado en algunas ocasiones las tijeras moleculares. 5. Cul es el origen de las enzimas de restriccin? Las enzimas de restriccin son unas protenas con accin cataltica que tienen la propiedad de reconocer secuencias cortas, de unos cuatro o seis pares de bases en el ADN de doble hebra, y cortar en todos los puntos donde se encuentre dicha secuencia. 6. Cmo se nombran las enzimas de restriccin? Las enzimas de restriccin se nombran a partir de las bacterias de las que son extradas, su nombre est dado segn el gnero y la especie de la bacteria de donde se aisl por primera vez esta enzima. La primera letra representa el gnero de la bacteria, las prximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un nmero al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa. 7. Qu significa que algunas enzimas de restriccin tengan una secuencia palindrmica? Que leen igual en cualquier sentido. 8. A continuacin se muestran algunas enzimas de restriccin con sus caractersticas:

Se tiene una muestra de ADN cuya secuencia es la siguiente:

5 GAAAAAACTGAAATTACGGTTGACGCACCTCTGGTATAAGGCTGATG AAACTTGGGCTGAAAAGTGATGAAGTCTATTACATAGGCGGAGTGAA GCCCTGCCGCCTCCATTATCTAA 3 A esta muestra se le realiza una restriccin con EcoRI y posteriormente con HindII, luego se visualizan los productos de digestin en un gel de agarosa.
A B C

+--------

<-------- -

Carriles: A. Fragmento sin digerir. B. Fragmento digerido con slo EcoRI C. Fragmento digerido con EcoRI y HindII

9. Indique en la figura la polaridad de los electrodos. 10. Por qu se observa una banda en el carril A? Es el blanco de la prueba, muestra que el sistema funciona 11. Por qu se observa una sola banda en el carril B? No hay ningn fragmento de ADN que sea ledo por la ECORI, por lo que queda en la zona de carga solamente 12. Por qu se observan dos bandas en el carril C? Porque en la muestra hay varios fragmentos de cdigo que se aslan con HINDII por lo cual se muestra la barra en la zona de carga y el desplazamiento en la segunda barra hacia en electrodo opuesto.

PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa) La PCR (del ingls Polymerase Chain Reaction) es una reaccin in vitro que consiste en la sntesis de numerosas copias de un fragmento de ADN en particular. 13. Explique brevemente cules son las etapas de una PCR

Desnaturalizacin: Para que pueda iniciarse la reaccin es preciso que las molculas de ADN molde se encuentren en forma de cadena simple. Esto se consigue calentando a temperatura de 90 a 95C para que produzca la rotura de los enlaces puente de hidrogeno intercatenarios y la separacin de ambas cadenas, para asegurar la completa separacin de la doble cadena del ADN esta temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el ADN solo se desnaturaliza parcialmente ste tender a renaturalizarse muy rpidamente dificultando con esto el proceso de hibridacin. Hibridacin: Una vez que el ADN est desnaturalizado se disminuye la temperatura de la reaccin hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60C para que se pueda producir la hibridacin especfica de los cebadores a las secuencias flanqueantes del fragmento que se desea amplificar, la temperatura a la que se realiza esta etapa debe establecerse para cada reaccin en funcin de la longitud de los cebadores y su secuencia (Temperaturas inferiores a la ptima nos producirn hibridaciones inespecficas de los cebadores y temperaturas superiores nos dificultarn la eficiencia de la misma. Extensin: Durante esta etapa la ADN polimerasa termoresistente incorpora nucletidos en el extremo 3 del cebador utilizado como molde la cadena de ADN previamente desnaturalizada. La temperatura a la que se realiza esta etapa de la reaccin suele ser de 72C ya

que es la temperatura a la que la Taq polimerasa alcanza su mxima actividad. Normalmente una extensin de 20 segundos es suficiente para fragmentos menores de 500 pares de bases, y 40 segundos para fragmentos por encima de 1.2Kb.Al finalizar cada uno de los ciclos el nmero de copias obtenidas se duplica y despus de 20 ciclos ya tenemos aproximadamente 1 milln de copias de cada una de las molculas molde iniciales ADN. 14. Cules son las aplicaciones que se le han dado a esta tcnica? Anlisis de expresin de genes Aislamiento de Genes Clonacin de productos del PCR 15. De acuerdo a la carrera que usted estudia, realice una corta discusin de los posibles beneficios y perspectivas que puede tener la PCR. En la ingeniera Qumica, los beneficios de la PCR se desarrollan principalmente en la biotecnologa, en campos como el mejoramiento de especies vegetales, la produccin de biomasa a partir de especies existentes, principalmente todo lo que mejore los resultados de un bioproceso.

SECUENCIACIN La secuenciacin involucra una cantidad de procesos en los cuales se determina la serie exacta de los nucletidos que conforman una cadena de ADN. 16. Por qu es necesario secuenciar fragmentos de ADN? Para saber el orden de los nucletidos y para investigar los procesos biolgicos fundamentales. 17. Explique brevemente uno de los procedimientos que son utilizados para secuenciar. La secuenciacin con marcador fluorescente, se basa en marcar los didesoxinucletidos con un color diferente fluorescente para observar toda la muestra en una sola reccin hacindola una tcnicamuy atractiva por su practicidad.