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Tcnicas de biologa molecular y de ingeniera gentica

Cuando los cientficos comprendieron la estructura de los genes y cmo la informacin que portaban se traduca en funciones o caractersticas, comenzaron a buscar la forma de aislarlos, analizarlos, modificarlos y hasta de transferirlos de un organismo a otro para conferirle una nueva caracterstica. Justamente, de eso se trata la ingeniera gentica, que se podra definir como un conjunto de metodologas que

permite transferir genes de un organismo a otro y expresarlos (producir las protenas para las cuales estos genes codifican) en organismos diferentes al de origen. El ADN

que combina fragmentos de organismos diferentes se denomina ADN recombinante. En consecuencia, las tcnicas que emplea la ingeniera gentica se denominan tcnicas de ADN recombinante. As, es posible no slo obtener protenas recombinantes de inters sino tambin mejorar cultivos y animales. Los organismos que reciben un gen que les aporta una nueva caracterstica se denominan organismos genticamente modificados (OGM) o transgnicos. A su vez, la ingeniera gentica es lo que caracteriza a la biotecnologa moderna que implementa estas tcnicas en la produccin de bienes y servicios tiles para el ser humano, el ambiente y la industria.

Etapas para la obtencin de un organismo transgnico


La obtencin de un transgnico implica la participacin de un organismo que dona el gen de inters y un organismo receptor del gen que expresar la nueva caracterstica deseada. La siguiente tabla resume los pasos bsicos de la ingeniera gentica empleados para transformar un organismo, y se ejemplifica con un caso concreto:
Metodologa Caso: obtencin de maz Bt que produce una protena recombinante que le confiere resistencia a determinados insectos 1. Identificar un carcter deseable en el organismo 1. Identificar el carcter resistencia a insectos en el de origen organismo de origen, la bacteria del suelo Bacillus

thuringiensis (Bt)

2. Encontrar el gen responsable del carcter deseado 2. Encontrar al gen que lleva las instrucciones para esta (gen de inters), aislarlo y caracterizarlo. caracterstica, aislarlo y caracterizarlo. 3. Combinar dicho gen con otros elementos necesarios 3. Combinar este gen con otros elementos genticos para (vector) para que ste sea funcional en el que sea funcional en una planta: especialmente una organismo receptor secuencia promotora (y ligarlo a un vector adecuado para transformar plantas) 4. Transferir el gen de inters, previamente 4. Transferir este gen a clulas de maz (organismo introducido en el vector adecuado, al organismo receptor). receptor. 5. Crecer y reproducir el organismo receptor, ahora 5. Identificar las clulas de maz que recibieron el gen modificado genticamente. (clulas transformadas) y regenerar, a partir de estas clulas, una planta adulta resistente a insectos.

Tcnicas de Ingeniera Gentica o del ADN Recombinante 1. Corroborar que existe un gen que codifica para la caracterstica de inters. Cuando se encuentra una caracterstica en un organismo que resulta interesante para transferir a otro organismo debe verificarse que es producto de un gen. Se identifica el gen de inters por medio de cruzamientos a partir de una caracterstica que se expresa, y se verifican las proporciones mendelianas. Si la caracterstica se atribuye a una protena, que es producto directo de un gen, ser ms sencillo transferir esa caracterstica a un organismo que no la tiene.

2. Clonar el gen de inters. Clonar un gen significa tenerlo puro en el tubo de ensayos, o mejor an, dentro de un vector (una molcula mayor de ADN que permite guardar fragmentos de ADN en forma estable y prctica por ms tiempo). La tarea de clonar un gen involucra varias tcnicas El ADN de inters se inserta en plsmidos-vectores que son molculas de ADN lineales o circulares en las cuales se puede guardar (clonar) un fragmento de ADN. Los ms usados son los plsmidos de origen bacteriano.

Figura 1. Los plsmidos pueden extraerse de las bacterias e incorporarse a otras, a travs del proceso de transformacin. Los plsmidos fueron modificados por los investigadores para ser empleados como vectores (vehculos). As, el gen de inters puede insertarse en el plsmido-vector e incorporarse a una nueva clula.

El desarrollo de estas tcnicas fue posible en gran medida por el descubrimiento de las enzimas de restriccin. Las enzimas de restriccin reconocen secuencias determinadas en el ADN. De esta manera, conociendo la secuencia de un fragmento de ADN, es posible aislarlo del genoma original para insertarlo en otra molcula de ADN. Hay muchas enzimas de restriccin obtenidas a partir de bacterias y que sirven como herramientas para la ingeniera gentica.

Figura 2. Las enzimas de restriccin reconocen secuencias de 4, 6 o ms bases y cortan generando extremos romos o extremos cohesivos. Estos extremos, generados en diferentes molculas de ADN, pueden sellarse con la enzima ADN ligasa y generar as una molcula de ADN nueva, denominada recombinante.

Tcnicas para clonar un gen

i) Extraccin de ADN. Las extracciones de ADN de todos los organismos guardan cierta similitud y consisten en romper las clulas para liberar su contenido y separar el ADN liberado del resto de los componentes celulares. ii) Bsqueda de un gen entre la mezcla de genes del ADN. Si se conoce una pequea porcin de la secuencia del gen que se est buscando, es posible construir una sonda que permita pescar el fragmento de ADN que contiene esa misma secuencia. Una vez aislado ese fragmento se lo estudia ms detalladamente. La tcnica de PCR (siglas en ingls de Reaccin en Cadena de la Polimerasa) permite amplificar la cantidad de ADN

y esto facilita el clonado del gen de inters. La tcnica de PCR se representa en la siguiente ilustracin:

Figura 3. La tcnica de PCR permite obtener, a partir de una sola molcula de ADN, millones de copias de un fragmento de ADN particular. La base de esta tcnica consiste en que la enzima polimerasa de ADN cumpla su funcin: sintetizar ADN a partir de un pequeo fragmento llamado cebador, y de los nucletidos (A, C, G y T). Las nuevas molculas de ADN sintetizadas en cada ciclo sirven de molde para ciclos siguientes. Por lo tanto, la PCR es una reaccin de amplificacin de fragmentos de ADN en forma exponencial y al final del ciclo 35-40 en el tubo de ensayos existen millones de copias del fragmento de inters.

Una vez terminada la PCR, se realiza una tcnica conocida como electroforesis en gel de agarosa para visualizar los millones de fragmentos de ADN de inters, como muestra la siguiente imagen:

Figura 4. Electroforesis en gel de agarosa. Esta tcnica consiste en armar un gel de agarosa, con pequeos huecos en un extremo donde se deposita (siembra) el contenido del tu bo de PCR. El gel es sometido a corriente elctrica de modo que el ADN, que es una molcula cargada negativamente, se desplaza por el gel hacia el polo positivo. Cuanto ms pequeo es el fragmento de ADN ms rpido se desplaza y llega hasta el extremo opuesto. Al preparar el gel se agrega la sustancia bromuro de etidio que se intercala entre las bases del ADN y permite visualizarlo al ser iluminado con luz UV. Las bandas luminosas corresponden a los fragmentos de ADN amplificados.

iii) Secuenciacin: Una vez que se visualiz el resultado del PCR en el gel de agarosa, la bandita del gel que contiene el ADN de inters se recorta y se purifica el ADN. Luego se realiza la secuenciacin que consiste en conocer la cantidad y el orden en que se ubican los nucletidos en el fragmento de ADN analizado. Actualmente se realiza en un secuenciador automtico utilizando nucletidos marcados fluorescentemente, que son ledos por un lser acoplado a una computadora. iv) Construccin del vector recombinante: Esta etapa consiste en recortar y pegar ADN para insertar el gen de inters dentro de un vector (son en general molculas de ADN circulares). Para recortar el ADN se utilizan enzimas de restriccin y para pegar fragmentos de ADN se utilizan enzimas ligasas. Como muestra la imagen el vector abierto y el fragmento de inters se agregan al tubo de ensayos en presencia de la enzima ligasa. Al fragmento de ADN dentro del vector se denomina inserto y el nuevo vector se conoce como vector recombinante.

Figura 5.Representacin de los pasos de restriccin y ligacin para clonar un fragmento de ADN en un vector

Para tener gran cantidad y fcil disponibilidad del ADN de inters, el vector se inserta dentro de bacterias (E. coli), las cuales crecen fcil y rpidamente. O sea, la bacteria se utiliza como multiplicadora del vector, y por ende del inserto de inters.

Esta es una etapa de amplificacin del ADN para poder tener gran cantidad para secuenciarlo, caracterizarlo, y luego poder hacer con l ADN recombinante.

Figura 6. En placas de Petri se cultivan las bacterias. Se originan colonias de bacterias iguales (clones). Las bacterias transformadas, que incorporaron el plsmido y el gen de inters, se seleccionan por medio de antibiticos y por reacciones con indicadores de color.

3. Caracterizar el gen de inters. A partir de conocer la secuencia del gen se puede, mediante bioinformtica, comparar esta secuencia con las de genes ya conocidos para determinar a qu gen se parece, y se le asigna una posible funcin. Una vez predicha la funcin del gen clonado por medio de anlisis informtico, se debe proceder a confirmar la funcin real in vivo, o sea corroborar que en un sistema biolgico funciona acorde a lo que se prev. Para ello se suele transferir el gen a un organismo modelo, en el cual se pueda expresar el gen y medir su funcin. En el ejemplo del maz, el gen Bt se puede transferir primero a las especies modelo Arabidopsis thaliana y Nicotiana tabacum . 4. Modificar el gen de inters. Si as se desea se puede agregar, deletar o mutar secuencias dentro de la regin codificante, y agregar secuencias (promotor, terminador, intrones) para que se pueda expresar en el sistema de inters. Por ejemplo: si se clona un gen Bt de una bacteria para luego ponerlo en maz, se debe agregar un promotor que funcione bien en plantas, es decir, que permita que las clulas vegetales expresen la protena Bt. El promotor es una regin fundamental del gen ya que determina cundo y dnde se expresar el gen.

Figura 7. Inserto preparado para ser transferido.

5. Transformacin de un organismo con el gen de inters. Una vez hecha la construccin gentica con el gen y promotor deseado, se elige el mtodo de transformacin ms indicado para el organismo que se desea hacer transgnico. Ejemplos: Microinyeccin, biobalsica, etc. 6. Caracterizacin del OGM. Una vez obtenido el OGM, se debe demostrar, entre otras cosas, si tiene una (o ms) copias del transgn, y cmo y en qu tejidos se expresa el gen. Para lograrlo se extrae el ADN del organismo y se lo analiza. La tcnica de PCR, ya explicada, permite amplificar el transgn, si es que est en el genoma del organismo, y es una tcnica rpida para verificar si el organismo ha sido transformado o no. Para estimar cuntas copias del gen se insertaron en el genoma del organismo se utiliza la tcnica denominada Southern Blotting que se representa en la siguiente ilustracin:

Figura 8. Representacin esquemtica de la tcnica de Southern Blot . En este ejemplo se analiza la presencia de un cierto gen en ADN de tres individuos. Esta tcnica consiste en extraer ADN del organismo en estudio, fragmentar el ADN en forma aleatoria con enzimas de restriccin, someter los

fragmentos de ADN a electroforesis en gel de agarosa, y transferir los fragmentos de ADN desde el gel a una membrana (de nitrocelulosa o nylon). Luego, para detectar cuntas copias del transgn quedaron integradas al genoma del organismo, se utilizan sondas marcadas (radioactivamente, con fluorescencia, u otros mtodos). La membrana se baa en una solucin que contiene la sonda y se revela (como una radiografa) para ver si qued marca en algn fragmento de ADN. En la ilustracin las tres muestras de ADN poseen al menos una copia del gen transferido.

Para analizar en qu tejido, momento y cantidad se expresa el gen se analiza la presencia del ARN mensajero y de la protena codificados por el transgn (protena recombinante), mediante tcnicas especficas denominadas Northern blot (para el ARNm), y Western blot y ELISA (para las protenas). Aplicaciones de las tcnicas de biotecnologa moderna Hasta el momento se han utilizado las tcnicas de biologa molecular y de ingeniera gentica para producir, entre otros productos:
Vacunas, como la de la hepatitis B;

Frmacos, como la insulina y la hormona del crecimiento humano, tanto en clulas

transformadas y crecidas in vitro como en bacterias recombinantes y animales transgnicos. Enzimas para disolver manchas, como las que se usan en los detergentes en polvo; mayormente por medio de microorganismos recombinantes (transgnicos) que crecen en biorreactores. Enzimas para la industria alimenticia, como las empleadas en la elaboracin del queso y en la obtencin de jugos de fruta. Plantas resistentes a enfermedades.

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