CAPTULO 2.6.5.

SNDROME REPRODUCTIVO Y RESPIRATORIO PORCINO

RESUMEN
El sndrome reproductivo y respiratorio porcino (SRRP) se caracteriza por defectos en la reproduccin de las cerdas y problemas respiratorios de los lechones y cerdos en etapas posteriores de crecimiento. La enfermedad est causada por el virus SRRP, un virus clasificado actualmente como miembro del nuevo orden establecido de los Nidovirales, familia Arteriviridae, gnero Arterivirus. La diana celular primaria de los virus son los macrfagos alveolares de los cerdos. Existen dos tipos antignicos principales, el tipo europeo y el tipo americano. Actualmente el virus del SRRP se encuentra distribuido en la mayor parte del mundo donde existe produccin intensiva de cerdos. El fallo reproductivo se caracteriza por infertilidad, momificacin fetal, abortos, nacidos muertos, y el nacimiento de cras dbiles que a menudo mueren al nacer por trastornos respiratorios e infecciones secundarias. Los cerdos adultos pueden mostrar signos ligeros de enfermedad respiratoria, a veces complicada por infecciones secundarias. El SRRP no parece afectar a otras especies animales, slo a cerdos. Identificacin del agente: El diagnstico de la infeccin vrica del SRRP es difcil; el virus puede aislarse de cerdos afectados a partir de tejidos tales como suero o lquido asctico, o de muestras de rganos, como pulmones, amgdalas, ganglios linfticos y bazo. Para el aislamiento del virus se recomiendan el uso de macrfagos alveolares porcinos porque constituyen el sistema de cultivo ms susceptible para los virus de ambos tipos antignicos. Tambin son adecuadas las clulas MARC145 (clon MA104). Existe variabilidad entre grupos de macrfagos en cuanto a su susceptibilidad frente al virus del SRRP. Por tanto, es necesario identificar un grupo con elevada susceptibilidad, y conservar esta cepa en nitrgeno lquido hasta su uso. El virus se identifica y caracteriza por inmunotincin con antisueros especficos. Se han desarrollado tcnicas adicionales, como la tcnica inmunohistoqumica e hibridacin in situ sobre tejidos fijados y la transcripcin inversa mediante la reaccin en cadena de la polimerasa para la confirmacin en el laboratorio de la infeccin por el virus del SRRP. Pruebas serolgicas: Hoy en da se dispone de un amplio rango de pruebas serolgicas para la deteccin en suero de anticuerpos frente al virus del SRRP. La tcnica de la inmunoperoxidasa en monocapa emplea macrfagos alveolares y la tcnica de inmunofluorescencia indirecta utiliza clulas MARC145 que se infectan normalmente con el tipo antignico viral europeo o el americano, respectivamente. Sin embargo, ambas tcnicas pueden ser diseadas con ambos tipos de virus del SRRP. En la actualidad se usan frecuentemente tcnicas inmunoenzimticas (ELISA) unidas a enzimas comercializados o propias. Se dispone de un ELISA comercial especfico para ambos tipos de virus, europeo y americano. Se han descrito ensayos de tipo ELISA indirecto, ELISA de bloqueo y ELISA doble, que permiten distinguir entre los tipos europeo y americano. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Las vacunas pueden ser de gran ayuda en la prevencin de las formas reproductiva y respiratoria del SRRP. Las vacunas vivas modificadas no son adecuadas para su uso en hembras gestantes, cerdas jvenes y verracos. La vacunacin puede dar lugar a la eliminacin del virus vacunal en el semen. Las vacunas de virus vivos modificados pueden persistir en animales vacunados y se ha descrito la transmisin potencial a animales no vacunados y la consiguiente enfermedad inducida por el virus vacunal.

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A. INTRODUCCIN
El sndrome reproductivo y respiratorio porcino (SRRP) se caracteriza por defectos en la reproduccin de las cerdas y crisis respiratorias de los lechones y cerdos en crecimiento (3, 17, 37) y es causa significativa de prdidas econmicas. La enfermedad fue detectada por primera vez en 1987 en los Estados Unidos de Amrica (USA), donde fue conocida al principio como la enfermedad porcina misteriosa, debido a la naturaleza elusiva de su agente causal, pero ms tarde fue denominada sndrome respiratorio y de infertilidad porcino. Durante el invierno de 19901991 la enfermedad apareci en Europa Occidental, donde se extendi rpidamente y adquiri muchos ms nombres, incluyendo Seuchenhafter Sptabort der Schweine, Abortus blauw, enfermedad azul espigada porcina, sndrome dysgnsique et respiratoire du porc, y sndrome respiratorio y aborto epidmico porcino (10, 13, 48). A lo largo de este captulo, se emplear el nombre de SRRP para denominar esta enfermedad; este es el nombre ms ampliamente aceptado por la comunidad veterinaria internacional. El virus del SRRP (PRRSV), el agente etiolgico del SRRP, se clasifica en la actualidad como miembro del orden Nidovirales, familia Arteriviridae, gnero Arterivirus (7). Para su multiplicacin, tanto in vivo como in vitro, se emplean preferiblemente macrfagos alveolares porcinos. El virus presenta envuelta, contiene ARN con polaridad de mensajero y un dimetro de 5070 nm. Se ha determinado la secuencia genmica del virus (14, 34), y el ARN vrico es de aproximadamente 15 kb de longitud y codifica ocho marcos de lectura abierta (ORF). Se han identificado tres protenas estructurales principales: una protena de la nucleocpsida (N; ORF 7) de 1415 kDa, una protena de membrana (M; ORF 6) de 1819 kDa, y una glicoprotena de envuelta (E; ORF 5) de 2425 kDa. Otras tres glicoprotenas estructurales menos abundantes estn codificadas por las ORFs 4, 3, y 2 (38). Se han preparado anticuerpos monoclonales tanto contra las protenas estructurales mayoritarias como minoritarias (15, 19, 32, 35, 43, 46, 50). Las cepas virales europeas estn antignicamente muy relacionadas entre s, y ms alejadas de las correspondientes cepas americanas (4, 47). A su vez, la relacin antignica de stas ltimas entre s tambin es muy estrecha. Se ha detectado la presencia del SRRP en varios pases de Asia y unos pocos pases de Sudamrica. Australia, Nueva Zelanda, Suecia y Suiza se encuentran libres de SRRP. Se han publicado revisiones acerca de las manifestaciones clnicas detalladas y de las lesiones provocadas por la infeccin por el PRRSV en cerdos de diferentes grupos de edad (3, 17, 37). En resumen, los cerdos neonatales infectados por el PRRSV muestran disnea (dificultad respiratoria), pero tambin una variedad de otros sntomas tales como conjuntivitis, fiebre, aspereza de pelo, anorexia, diarrea, temblores, eritema cutneo, edema de prpados y mortalidad, que puede llegar a ser elevada. En cerdos destetados y en crecimiento, se ha observado fiebre, neumona, defectos en el desarrollo y un incremento en la mortalidad por infecciones bacterianas simultneas. Las infecciones subclnicas son ms comunes en cerdos en fase de acabado, verracos y cerdas de reposicin. La fiebre transitoria y la inapetencia pueden llegar a ser habituales. Se ha descrito que en verracos infectados con el PRRSV y en los vacunados con la vacuna viva atenuada, el PRRSV puede aparecer en el semen, lo que puede provocar cambios en la morfologa y funcin del esperma. Existen datos de mortalidad asociada con la infeccin por el PRRSV en cerdos adultos. Recientemente se ha descrito una forma virulenta de SRRP: sndrome de mortalidad y aborto de cerdas (SAMS). La enfermedad reproductiva se conoce bastante bien. Varios grupos de investigacin han demostrado repetidamente que existe una relacin causal entre la infeccin por el PRRSV y los defectos de reproduccin en las piaras de crianza, y la enfermedad ha podido ser reproducida experimentalmente. Las infecciones en el ltimo tercio del periodo de gestacin parecen causar los problemas principales, consistentes en abortos al final de la gestacin con fetos momificados y en nacimientos de lechones muertos o tan dbiles que mueren tras su alumbramiento (13, 48). No est claro si las infecciones en las primeras etapas de gestacin pueden causar fallos reproductivos o problemas en la recra. Existen algunas evidencias, aunque escasas, de varios aislados con diferente grado de virulencia reproductiva; en algunos pases se ha detectado la existencia de cepas que causan infeccin transplacental, sin efectos destructivos en los fetos. La importancia de la infeccin respiratoria es menos conocida. Ha sido difcil reproducir constantemente la enfermedad respiratoria con el virus solo y tambin ha sido difcil demostrar experimentalmente en cerdos el incremento en la susceptibilidad a infecciones bacterianas atribuida a la infeccin por el PRRSV. Algunos estudios han descrito diferencias en la gravedad de los sntomas clnicos y en lesiones microscpicas y macroscpicas tras la inoculacin experimental de cerdos con diferentes aislados PRRSV (22, 23). Tal predisposicin del PRRSV a exacerbar otras enfermedades es actualmente un tema tpico de estudio de varios grupos de investigacin, y aunque parece que el virus podra agravar algunas infecciones secundarias, no son del todo conocidos sus posibles mecanismos. Las lesiones microscpicas y macroscpicas consecuencia de la infeccin por el PRRSV se observan principalmente en cerdos recin nacidos y lactantes. En cerdos adultos, las lesiones pueden ser similares pero menos marcadas. Las lesiones macroscpicas asociadas con el PRRSV varan. Las lesiones de pulmn varan desde ninguna a una apariencia difusa, y se complican habitualmente por infecciones bacterianas coincidentes. Los ganglios linfticos afectados, ms comnmente en cerdos jvenes, pueden aumentar significativamente de tamao. Las lesiones microscpicas, bastante inespecficas, habitualmente afectan al pulmn y al tejido linfoide. Las lesiones de pulmn se caracterizan por neumona intersticial multifocal que muestra infiltracin de clulas mononucleares en los septos alveolares, hipertrofia e hiperplasia neumoctica de tipo 2, y una marcada

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acumulacin de exudado alveolar necrtico e inflamatorio. Los ganglios linfticos muestran hiperplasia folicular, focos de necrosis folicular y residuos en los folculos. Adems, se han descrito lesiones vasculares, cardiacas y cerebrales. Las lesiones fetales observadas sin consecuencia, se caracterizan por vasculitis, miocarditis y encefalitis. Es importante sealar que la infeccin por PRRSV es solamente un agente infeccioso que se ha asociado con neumona intersticial en cerdos. El sndrome del adelgazamiento postdestete asociado con la infeccin por circovirus porcino de tipo 2 est actualmente relacionado con neumona intersticial y linfoadenitis en cerdos. En general, los anticuerpos parecen poseer un valor protector limitado. Los cerdos infectados pueden permanecer virmicos durante 46 semanas despus de la infeccin, y pueden transmitir el virus a otros cerdos. No se sabe si los anticuerpos maternales pueden proteger contra infecciones tempranas, pero se puede detectar viremia de la semana 4 en adelante en cerdos nacidos a partir de hembras seropositivas. Sin embargo, se ha observado un cierto nivel de proteccin en lechones con anticuerpos maternos, y la elevacin en los ttulos de anticuerpos neutralizantes se corresponde a menudo con un descenso en los ttulos virales de la sangre. Adems, las hembras infectadas por segunda vez no muestran defectos reproductivos recurrentes. En pocas palabras, la relacin entre ttulos de anticuerpos y proteccin no se entiende muy bien. La inmunidad mediada por clulas no se ha estudiado ampliamente pero se piensa que ejerce un papel protector. La infeccin por PRRSV, sin embargo, parece provocar una dbil respuesta inmune celular adaptativa. Un aspecto intrigante de la infeccin por PRRSV es la duracin prolongada de viremia y la consiguiente transmisin de los virus por contacto a animales, en comparacin con otras infecciones virales. Los virus desaparecen de la circulacin con el tiempo, pero se mantiene una infeccin persistente en los tejidos linfoides. Sin embargo, en general se est de acuerdo en que la infeccin no parece perdurar toda la vida.

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1. Identificacin del agente.

El diagnstico virolgico del SRRP es difcil. Ello es debido, principalmente, a que las clulas elegidas para aislar el virus son los macrfagos alveolares porcinos, que debe extraerse de cerdos (preferentemente libres de patgenos especficos [SPF]) de menos de 68 semanas de vida (48, 51). No todos los laboratorios disponen de un suministro adecuado de este tipo de cerdos y las lneas celulares continuas no pueden reemplazar correctamente a los macrfagos alveolares porque aquellas son generalmente menos susceptibles al virus. Adems, no todos los cultivos de macrfagos son igualmente susceptibles al virus; se desconoce la razn de esto, pero es necesario probar cada cultivo antes de su uso. Ciertas lneas celulares de rin de mono (p. ej. MA104) pueden reemplazar correctamente a los macrfagos pero estas lneas celulares no permiten la multiplicacin de todos los aislados, particularmente de las cepas europeas. Este captulo, por tanto, slo describe el aislamiento de virus con macrfagos alveolares. Se han desarrollado tcnicas de inmunohistoqumica e inmunofluorescencia para detectar el antgeno del PRRSV en tejidos. Estas pruebas son ms rpidas que el aislamiento de los virus y no necesitan la infraestructura de los cultivos celulares. Adems, la tcnica inmunohistoqumica (21, 28) empleando tejidos fijados con formalina hace posible la visualizacin del antgeno junto con las lesiones histolgicas y permite el anlisis comparativo retrospectivo con especmenes de archivo. Tambin se ha descrito la hibridacin in situ, capaz de detectar y diferenciar los genotipos PRRSV norteamericano y europeo en tejidos fijados con formalina (29, 41). La transcripcin inversa mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (RTPCR) y la PCR combinada son pruebas muy sensibles para detectar el ARN vrico (12, 27, 30, 33, 45) y ahora son empleadas ms habitualmente sobre otros tejidos diferentes, incluyendo el suero. Estas pruebas son tambin tiles cuando es problemtico el aislamiento del virus, como por ejemplo cuando se examina semen (12) y cuando se emplean tejidos parcialmente degradados por autolisis o por calor durante el transporte de las muestras para el aislamiento de los virus. Se ha diseado una tcnica de PCR multiplex para diferenciar los aislados PRRSV norteamericano y europeo (20). El anlisis de los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restriccin de los productos amplificados por PCR, ha permitido diferenciar cepas naturales y vacunales del PRRSV (49) y recientemente se han llevado a cabo estudios epidemiolgicos moleculares mediante el anlisis filogentico de secuencias especficas de genes estructurales.

a)

Obtencin de macrfagos alveolares a partir de los pulmones

Los pulmones deben proceder preferentemente de cerdos SPF o de una piara de cerdos que se haya demostrado estar libre de la infeccin por PRRSV. Los mejores resultados se obtienen con cerdos de menos de 8 semanas de vida. Los macrfagos se deben obtener a partir del pulmn el mismo da del sacrificio del cerdo. Los pulmones deben lavarse tres o cuatro veces con un volumen total aproximado de 200 ml de tampn fosfato salino estril (PBS). Posteriormente el lquido de lavado recogido se centrifuga a 1.000 g durante 10 minutos. El precipitado resultante conteniendo los macrfagos se resuspende en PBS y se centrfuga (se lava) dos veces ms. El precipitado final se resuspende en 50 ml de PBS, y se realiza un recuento del nmero de macrfagos para determinar la concentracin celular. Los macrfagos pueden ser

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utilizados en fresco, o pueden conservarse en nitrgeno lquido segn procedimientos estandarizados, a una concentracin final de aproximadamente 4 x 107 macrfagos/1.5 ml. Los cultivos de macrfagos no deben mezclarse.

b)

Comprobacin de los cultivos de macrfagos alveolares

Antes de poder utilizar un cultivo de macrfagos, ste debe validarse. Se realiza por titulacin con un PRRSV estndar, de ttulo conocido, sobre los nuevos macrfagos, mediante un ensayo de inmunoperoxidasa en monocapa (IPMA) con suero positivo y negativo, en placas inoculadas con estos macrfagos. Se considera que las clulas son adecuadas para ser usadas slo si el PRRSV estndar crece hasta alcanzar su ttulo especfico (DICT50 o dosis infectiva 50% en cultivo celular). Es recomendable que los macrfagos alveolares y el suero bovino fetal (FBS) empleados para suplementar los medios de cultivo estn libres de pestivirus.

c)

Aislamiento de virus a partir de macrfagos alveolares

Los macrfagos alveolares se inoculan en los pocillos de fondo plano de placas de microtitulacin para cultivo de tejidos. Tras la adhesin, los macrfagos se infectan con la muestra. Las muestras pueden ser suero o lquido asctico, o suspensiones de tejidos al 10%, tales como amgdalas, pulmn, ganglios linfticos, y bazo. En general, el PRRSV provoca un efecto citoptico (ECP) en los macrfagos despus de 12 das de cultivo, pero a veces los virus producen un ECP casi inapreciable o slo se observa tras pases sucesivos. Una vez que se observa un ECP, el PRRSV debe ser identificado por inmunotincin con un antisuero especfico. i) Inoculacin de los macrfagos en las placas de microtitulacin Se descongela un vial conteniendo 6 x 107 macrfagos/1,5 ml. Se lavan las clulas una vez con 50 ml de PBS y la suspensin celular se centrfuga a 300 g durante 10 minutos (a temperatura ambiente). Se resuspenden las clulas en 40 ml de medio RPMI (Rose Memorial Institute) 1640 suplementado con FBS al 5% y mezcla de antibiticos al 10 % (medio de crecimiento). Se dispensan 100 l de la suspensin celular en cada pocillo de la placa de microtitulacin (con un vial de clulas, se pueden inocular cuatro placas de microtitulacin a una concentracin de 105 clulas en cada pocillo de las placas). ii) Preparacin de las diluciones de la muestra (suero, lquido asctico, suspensin de tejidos al 10%) en placas base Se dispensan 90 l de medio de crecimiento en cada pocillo de una placa de microtitulacin. Se aaden muestras de 10 l a los pocillos de las filas A y E (dilucin 1/10 por duplicado). Se agitan las placas y se transfieren 10 l de las filas A y E a las filas B y F (dilucin 1/100). Se agitan las placas y se transfieren 10 l de las filas B y F a las filas C y G (dilucin 1/1.000). Se agitan las placas y se transfieren 10 l de las filas C y G a las filas D y H (dilucin 1/10.000). Se agitan las placas. iii) Incubacin de las muestras Se transfieren 50 l de las diluciones de la muestra de las placas base a los correspondientes pocillos de la placa con macrfagos (primer pase). Se incuban de 25 das y se observan diariamente los posibles ECP. El da 2, se inoculan macrfagos en placas de microtitulacin nuevas (como se ha indicado previamente). Se transfieren 25 l de los sobrenadantes procedentes de las placas del primer pase a los pocillos correspondientes de las nuevas placas inoculadas (segundo pase). Tras incubar durante 25 das se observa la posible aparicin de ECP. iv) Lectura e interpretacin de los resultados Los pocillos en los que los macrfagos muestran ECP slo en el primer pase se considerarn falsos positivos debido a la toxicidad de la muestra. Los pocillos en los que los macrfagos presenten ECP en ambos pases o slo en el segundo pase se considerarn como presuntos positivos. Todos los pocillos con monocapas de macrfagos que no muestren ECP sern confirmados como PRRSV negativos mediante inmunotincin con un antisuero PRRSVpositivo. Las muestras ECPpositivas deben identificarse como PRRSV positivos mediante cultivo de las muestras de sobrenadante ECP positivo, o diluciones de la muestra original, durante 24 y 48 horas en los macrfagos, y posterior inmunotincin con antisuero PRRSVpositivo. v) Inmunotincin con antisuero PRRSVpositivo Se infectan macrfagos con 50 l de sobrenadante de muestra de tejido como se describe en la Seccin B.2.a., y se crecen las clulas infectadas durante 24 y 48 horas. Se prepara la dilucin apropiada de un suero PRRSVpositivo en tampn de dilucin, y se inmunotien los macrfagos como se describe en la Seccin B.2.a. o B.2.b.

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2.

Pruebas serolgicas

Existe una variedad de tcnicas para la deteccin de anticuerpos sricos contra el PRRSV. El diagnstico serolgico es, en general, fcil de realizar, y presenta una adecuada especificidad y sensibilidad, especialmente en una piara base. En ocasiones el suero de cerdos individuales causa problemas por reacciones inespecficas, pero esta dificultad se puede resolver tomando de nuevo muestras al cabo de 23 semanas. La serologa se lleva generalmente a cabo generalmente mediante tcnicas de unin, tales como el IPMA, la tcnica de inmunofluorescencia, o la tcnica del enzimoinmunoensayo (ELISA) de todas ellas se han descrito muchas variedades (1, 8, 9, 16, 24, 36, 39, 40, 48, 52). Estas pruebas se llevan a cabo habitualmente con antgeno vrico de un determinado tipo antignico, de modo que los anticuerpos dirigidos contra el otro tipo antignico, heterlogo, pueden ser detectados con menor sensibilidad. En Dinamarca se ha utilizado extensamente un ELISA de bloqueo (39) y se ha descrito como un sistema ELISA doble que emplea como antgeno tanto el virus europeo como el americano (40). La primera vacuna atenuada viva para el SRRP basada en el virus del tipo americano se ha observado que se transmite a animales no vacunados (6, 42), y se ha descrito en Dinamarca el desarrollo subsiguiente en las piaras de defectos en la reproduccin del SRRP inducidos por el virus de la vacuna (6, 31). La reaccin al PRRSV vacunal del tipo americano puede que se produzca en pases que usan o han estado usando esta vacuna; los pases europeos pueden, por tanto, observar reacciones y aislar ambos tipos antignicos (6, 31). Recientemente se ha descrito la identificacin de las cepas de PRRSV de tipo europeo en EE.UU. y Canad, pero su prevalencia no est bien documentada. Los anticuerpos contra el virus pueden detectarse mediante tcnicas de unin a anticuerpo tan slo 714 das despus de la infeccin, y alcanzan sus ttulos mximos en 3050 das. Algunos cerdos pueden convertirse en seronegativos en 36 meses, pero otros permanecen seropositivos durante mucho ms tiempo. Los anticuerpos neutralizantes se desarrollan lentamente y no alcanzan ttulos elevados. Se pueden detectar a partir de 3 4 semanas tras la infeccin y pueden persistir durante 1 ao o ms. Se ha descrito el uso del complemento para aumentar la sensibilidad de la prueba de neutralizacin srica del virus (25). Todava no se ha investigado en profundidad la duracin de los ttulos de anticuerpos tras la infeccin, y probablemente los resultados dependern de las pruebas realizadas. Los anticuerpos maternos tienen una vida media de 1214 das, y su ttulo puede, en general, detectarse hasta 48 semanas despus del nacimiento, dependiendo del ttulo de anticuerpos de la vaca en el parto y la prueba realizada. En un medio infectado, los cerdos nacidos de madres seropositivas pueden seroconvertirse activamente a partir de las 3 6 semanas de vida. Este captulo describe con detalle el IPMA y cmo llevar a cabo esta prueba en laboratorios donde se hayan establecido los procedimientos de aislamiento de virus empleando macrfagos, y pueda ser utilizado con virus de ambos tipos antignicos. Esta tcnica puede ser adaptada tambin a la lnea celular MARC145, para los tipos europeo y americano (39, 40). Igualmente se ha diseado una tcnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) empleando clulas MARC145 para la serologa del PRRSV y se incluye en el presente captulo. Se dispone de ELISAs comerciales con buena sensibilidad y especificidad y se han comparado (18).

a)

Deteccin de anticuerpos por la tcnica de la inmunoperoxidasa en monocapa

Los macrfagos alveolares se inoculan en los pocillos de placas de microtitulacin. Tras la adhesin, los macrfagos se infectan con el PRRSV. El objetivo es infectar aproximadamente el 3050% de los macrfagos de modo que seamos capaces de distinguir suero no especfico. Despus de un periodo de incubacin, los macrfagos se fijan y se emplean como sustrato celular para las pruebas serolgicas. En cada placa se pueden analizar 11 sueros por duplicado. Los sueros a analizar se diluyen e incuban sobre el sustrato celular. Si en el suero problema estn presentes anticuerpos, se unirn al antgeno en el citoplasma de los macrfagos. En la siguiente etapa de incubacin, los anticuerpos unidos se detectarn mediante un anticuerpo antiespecie conjugado a peroxidasa de rbano (HRPO). Finalmente, el sustrato celular se incuba con una solucin cromgeno/sustrato1. La lectura de la prueba se realiza mediante un microscopio invertido. i) Inoculacin de macrfagos en las placas de microtitulacin Se descongela un vial conteniendo 6 x 107 macrfagos/1.5 ml.

Preparacin de la solucin cromgena Solucin stock de cromgeno (3amino9etilcarbazol[AEC]): (a) 4 mg AEC; (b) 1 ml N, Ndimetilformamida. Se disuelve (a) en (b) y se conserva la solucin stock AEC a 4C en la oscuridad. Preparacin de la solucin del cromgeno/sustrato (se prepara poco tiempo antes de usar) Se prepara 0.05 M tampn acetato sdico, pH 5.0, como sigue: se disuelve 4.1 g de acetato sdico en 1 litro de agua destilada. Se ajusta el pH a 5.00 con cido actico al 100%. Se aade 1 ml de solucin stock AEC a 19 ml de 0.05 M tampn acetato sdico. Se aaden 10l de H202 al 30% por cada 20 ml de solucin cromgeno/sustrato. La solucin se filtra a travs de filtros de 5m.

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ii) iii) iv)

Se lavan las clulas una vez con 50 ml de PBS y la suspensin celular es centrifugada 10 minutos a 300 g (a temperatura ambiente). Las clulas se introducen en 40 ml de medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 5%, 100 IU (Unidades Internacionales) de penicilina y 100 g de estreptomicina (medio de crecimiento). Se distribuyen 100 l de la suspensin celular en cada pocillo de una placa de microtitulacin (con un vial de clulas, se pueden inocular cuatro placas a una concentracin de 105 clulas por cada pocillo de las placas). Alternativamente se utiliza tampn HEPES (cido N2 hidroxietilpiperazina, N2 etanosulfnico) Se incuban las placas 1824 horas a 37C en un incubadorcon atmsfera humidificada y un 5% de CO2 en el medio. Infeccin de las clulas con PRRSV A cada pocillo se le aaden 50 l de una suspensin vrica conteniendo 105 DICC50/ml, reservando dos pocillos sin infectar como controles. Se incuban las placas 1824 horas a 37C en un incubador con CO2 al 5%. Fijacin de las clulas Se decanta el medio de crecimiento y las placas se enjuagan una vez en solucin salina. Las placas se golpean suavemente sobre una toalla para eliminar el exceso de lquido y se secan (sin tapadera) 45 minutos a 37C. Se congelan las placas (sin tapadera) 45 minutos a 20C. (Las placas que no se utilicen inmediatamente en las pruebas deben ser selladas y conservadas a 20C). Se incuban las clulas 10 minutos a temperatura ambiente con paraformaldehdo al 4% (en PBS). Alternativamente las clulas pueden fijarse en etanol absoluto enfriado en hielo durante 45 minutos a 5C o en acetona al 80% en hielo durante 45 minutos (5). Se elimina el paraformaldehdo y las placas se lavan una vez con solucin salina. Preparacin de las diluciones de suero en una placa base Se distribuyen 180 l de 0,5 M NaCl con suero de caballo al 4% y Tween 80 al 0,5%, a pH 7,2 (tampn de dilucin), en los pocillos de las filas A y E de la placa/s base. Se adicionan 120 l del suero problema y control a los pocillos de las filas A y E (=dilucin 1/10), y se agitan. Se diluye el suero cuatro veces transfiriendo 40 l de las filas A y E a las filas B y F, y as sucesivamente hasta preparar las siguientes diluciones 1/40, 1/160 y 1/ 640. Incubacin del suero en las placas con macrfagos fijados Se transfieren 50 l de cada uno de los pocillos de la placa/s base a los correspondientes pocillos de una placa con macrfagos fijados. Se sella la placa/s y se incuba durante 1 hora a 37C. Se eliminan las diluciones de suero y se lava la placa/s tres veces con 0,15 M NaCl + Tween 80 al 0,5%. Incubacin con el conjugado Se diluye el conjugado de conejo antiporcino HRPO a una dilucin predeterminada en 0,15 M NaCl + Tween 80 al 0,5%. Se aaden 50 l de la dilucin del conjugado a todos los pocillos de la placa/s. Se sella la placa/s y se incuba 1 hora a 37C. Se lavan las placas tres veces. Procedimiento de tincin Se dispensan 50 l de la solucin filtrada de cromgeno/sustrato (AEC) a todos los pocillos de la placa/s (ver nota al pie de pgina 1). Se incuba el AEC durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Se sustituye el AEC por 50 l de 0,05 M acetato sdico, pH 5,0 (ver nota al pie de pgina 1).

v)

i) ii) i) ii) iii) iv)

v) i) ii) iii)

i) ii)

i)

i) ii) iii)

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Lectura e interpretacin de los resultados

Si los anticuerpos estn presentes en el suero problema, aproximadamente el citoplasma del 3050% de las clulas del pocillo estar teido de rojo intenso por el cromgeno. Un suero problema negativo se reconocer por falta de tincin del citoplasma. Un suero que reacciona de forma inespecfica puede teir todas las clulas del pocillo (si se compara con un suero control positivo). El ttulo de un suero se expresa como el inverso de la mayor dilucin que tie el 50% o ms de los pocillos. Un suero con un ttulo < 10 se considera negativo. Un suero con un ttulo de 10 a 40 se considera como dbil positivo. A menudo se observa tincin inespecfica en algunas diluciones. Un suero con un ttulo de 160 se considera positivo.

b)

Deteccin de anticuerpos con la tcnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI)

Aunque en la actualidad no existe una nica tcnica de inmunofluorescencia aceptada como estndar, se han desarrollado varios protocolos que utilizan diferentes laboratorios en Norte Amrica. La tcnica IFI puede llevarse a cabo sobre portas de ocho cmaras empleando la lnea celular MARC145 y un aislado PRRSV adaptado a dicha lnea celular. Para evitar la reaccin cruzada con pestivirus, se recomienda que las clulas y el FBS, para suplementar el medio de cultivo, estn libres de pestivirus. Tras un periodo de incubacin, las clulas infectadas por PRRSV se fijan y se utilizan como sustrato celular para las pruebas serolgicas. Se comprueban las muestras de suero empleando una nica dilucin de examen, la 1/20, y las muestras sern consideradas positivas o negativas a esta dilucin. Cada suero porcino a analizar se aadir a los pocillos o cmaras conteniendo las clulas infectadas por el PRRSV. Los anticuerpos contra este virus, si estn presentes en el suero, se unirn a los antgenos en el citoplasma de las clulas infectadas. Tras esta etapa se aade un anticuerpo antiporcinoIgG conjugado a fluorescena, el cual se unir a los anticuerpos porcinos que estn unidos a los antgenos del PRRSV en las clulas infectadas. Para observar los resultados se emplea un microscopio de fluorescencia. Pueden emplearse tambin placas de microtitulacin a fin de poder titular el suero (ver Seccin b1 ms adelante). i) Inoculacin e infeccin de las clulas MARC145 en placas de microtitulacin Se aaden 50 l de medio de cultivo celular (p ej. Medio Mnimo Esencial [MEM] conteniendo L glutamina 2 mM, piruvato sdico 1 mM, 100 IU de penicilina y 100 g de estreptomicina) sin FBS a cada pocillo de las columnas 2, 4, 6, 8, 10 y 12 de la placa de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal. Se emplean clulas confluentes MARC145 tripsinizadas (cultivadas en frascos de cultivo) para inocular placas de microtitulacin de 96 pocillos y se resuspenden las clulas en medio de cultivo conteniendo FBS al 8% a una concentracin de 100.000125.000 clulas/ml. Las clulas MARC145 se tripsinizan a partir de los frascos de cultivo para los ensayos IFI una vez a la semana, empleando tripsina/EDTA (cido etilendiaminotetraactico) y se inoculan en frascos de cultivo a una concentracin de 250.000 clulas/ml. Tras 4 das en los frascos de cultivo, se adiciona medio de cultivo nuevo conteniendo FBS al 2% mantenindose tres das ms. Empleando una pipeta multicanal se adicionan 150 l de la suspensin celular a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Se diluye la preparacin del PRRSV en MEM sin FBS hasta una concentracin de 102,2 DICC50/50l y se distribuyen 50 l en cada pocillo de las columnas 1, 3, 5, 7, 9 y 11. Se incuban las placas aproximadamente 4872 horas a 37C en un incubador con atmsfera humidificada y un 5% de CO2 hasta obtener una monocapa con el 4050% aproximadamente de las clulas infectadas, lo que se determinar mediante inmunofluorescencia indirecta. Alternativamente, las placas de microtitulacin pueden ser primero inoculadas con suspensiones celulares MARC145 (p. ej. a una concentracin de 100.000 clulas/ml en un medio suplementado con FBS al 510%) e incubadas, como mximo 72 horas, hasta que las clulas confluyan. Entonces se aaden volmenes de 50 l de preparaciones del PRRSV (p. ej. 105 DICT50/ml) en cada pocillo y las placas se incuban un tiempo adicional de 4872 horas antes de la fijacin. Se ha sugerido el uso de tampones orgnicos tales como HEPES en los medios para estabilizar el pH cuando no se dispone de incubadores con CO2. Inoculacin e infeccin de clulas MARC145 en portas de ocho cmaras Se aaden 500 l de una suspensin de clulas MARC145 (p. ej. en MEM suplementado con FBS al 10%) a una concentracin de 100.000 clulas/ml, a cada compartimento de un porta de ocho cmaras. Se incuban las clulas aproximadamente 4872 horas a 37C en un incubador con atmsfera humidificada y un 5% de CO2 hasta que confluyan.

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iii) iv) v)

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iii)

Se aaden a cada cmara 50 l de una suspensin del PRRSV conteniendo 105 DICC50/ml y despus se incuban las clulas aproximadamente 18 horas en un incubador con atmsfera humidificada y un 5% de CO2. En ese momento podrn observarse mediante inmunofluorescencia indirecta 1520 clulas infectadas por campo de visin. Fijacin de las clulas Se elimina el medio, se lava una vez con PBS y se elimina el PBS. En el caso de portas de ocho cmaras, se sacan las paredes de plstico de los compartimentos y se dejan intactas las gomas. Se aaden volmenes de 150 l de acetona (al 80% en agua) fra (4C) a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Las placas se incuban 30 minutos a 4C. En el caso de portas de ocho cmaras, se emplea acetona (80100%) a temperatura ambiente para fijar las clulas durante 1015 minutos a temperatura ambiente. Algunas marcas comerciales de acetona pueden degradar las gomas de las cmaras dejando una pelcula sobre los portas. Es recomendable comprobar la acetona antes de usarla para la fijacin rutinaria. Se elimina la acetona y se secan las placas y portas a temperatura ambiente. Las placas pueden introducirse entonces en bolsas de plstico, se sellan y conservan a 70C hasta su uso. Los portas pueden mantenerse de forma similar en cajas de portas. Preparacin de las diluciones de suero Se diluyen las muestras de suero hasta la dilucin 1/20 en PBS (0,01 M; pH 7,2) en placas de 96 pocillos (p. ej. se aaden 190 l de PBS empleando una pipeta multicanal y seguidamente 10 l del suero problema). Se incluyen como controles de referencia sueros de ttulo conocido, positivos con anticuerpos contra el PRRSV y negativos, sin ellos. Incubacin de los sueros con clulas MARC145 fijadas Se sacan las placas almacenadas en el congelador a 70C y cuando alcanzan la temperatura ambiente, las clulas se rehidratan unos pocos minutos con 150 l de PBS. Se quita el PBS invirtiendo las placas y se secan con toallas de papel. Las clulas en los portas de ocho cmaras no se rehidratan. De cada suero diluido se aaden volmenes de 50 l a un pocillo conteniendo clulas no infectadas fijadas y a un pocillo conteniendo clulas infectadas fijadas. Se aaden volmenes similares de cada suero a cada cmara de los portas. De la misma manera se aaden volmenes de 50 l de diluciones de sueros control negativo y positivo. Se incuban las placas tapadas a 37C durante 30 minutos en una atmsfera hmeda. Los portas deben ser incubados de forma similar en cajas o bandejas de portas con tapadera. Se eliminan las muestras de suero y las placas se secan sobre toallas de papel. Se deben realizar un total de seis lavados empleando 200 l de PBS. El PBS se aade a cada pocillo y a continuacin se invierten las placas para eliminar el PBS. En el caso de portas, despus de extraer las muestras de suero, se lavan 10 minutos con PBS. Incubacin con el conjugado Mediante una pipeta multicanal se aaden a cada pocillo volmenes de 50 l de los conjugados diluidos apropiadamente (en PBS preparado en el momento) de IgG (cadenas ligeras y pesadas) de conejo o de cabra antiporcino conjugada con FITC (isotiocianato de fluorescena). Volmenes similares se aaden a las cmaras individuales de los portas. Se incuban las placas o los portas con sus tapaderas a 37C durante 30 minutos en una atmsfera hmeda. Se elimina el conjugado de las placas y stas se secan sobre toallas de papel. Se realiza un total de cuatro lavados mediante PBS, como se ha descrito previamente. Tras eliminar el conjugado de los portas, se aclaran con PBS, se lavan 10 minutos con PBS y se aclaran con agua destilada. Se deben golpear suavemente los portas sobre un papel absorbente para eliminar el exceso de agua. Las placas y los portas se observan mediante un microscopio de fluorescencia.

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iv)

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Lectura e interpretacin de los resultados

La presencia de fluorescencia verde en el citoplasma de clulas infectadas combinada con la ausencia de tal seal en clulas no infectadas es un indicador de la presencia de anticuerpos contra el PRRSV en el suero a la dilucin analizada. El grado de la intensidad de fluorescencia puede variar de acuerdo con la cantidad de anticuerpo especfico antiPRRSV presente en el suero probado. La ausencia de fluorescencia verde especfica en ambos tipos de clulas, infectadas y no infectadas, se interpreta como ausencia de anticuerpos contra PRRSV en tal suero a la dilucin probada. La prueba debe repetirse si en clulas infectadas no se observa fluorescencia al utilizar el suero control positivo o si se observa fluorescencia con el suero control negativo. No debe verse fluorescencia en clulas no infectadas con ninguno de los sueros control. Cualquier suero problema que ofrezca resultados dudosos debe ser probado de nuevo a la dilucin 1/20 y si los resultados siguen sin ser claros, es necesario tomar una nueva muestra del mismo animal para su anlisis posterior.

b1) Evaluacin mediante IFI de sueros para la titulacin de anticuerpos

Pueden emplearse placas de microtitulacin y la tcnica IFI con el propsito de titulacin de sueros. Se pueden titular hasta 16 sueros en cada placa de microtitulacin de 96 pocillos. i) ii) Se inoculan las placas con clulas MARC145 y se incuban a 37C en un incubador con atmsfera humidificada y un 5% de CO2 hasta que confluyan. Se inoculan todos los pocillos con la preparacin del PRRSV excepto los pocillos de las columnas 1, 6 y 11, y las placas se incuban a 37C en un incubador con atmsfera humidificada y un 5% de CO2 durante 4872 horas. Se elimina el medio de cultivo y las monocapas se lavan una vez con PBS (0,01 M, pH 7,2). Las monocapas se fijan con acetona fra (solucin acuosa al 80%) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se elimina la acetona, se secan al aire las placas y se mantienen tapadas a 20C para almacenamientos cortos o a 70C para almacenamientos a largo plazo, hasta su uso. Se preparan diluciones seriadas del suero incluyendo un suero control positivo antiPRRSV realizando diluciones al cuarto y empezando por la dilucin 1/16 1/20. Se diluye un suero control negativo a la dilucin 1/16 1/20. Se administran 50 l de cada dilucin (1/16, 1/64, 1/256, 1/1024 1/20, 1/80, 1/320, 1/1280) en los pocillos conteniendo el antgeno vrico de las columnas 2, 3, 4, 5 7, 8, 9, 10. Para cada suero, tambin se dispensan 50 l de la dilucin 1/16 1/20 en los pocillos control de las columnas 1 y 6. De la misma forma se administran las diluciones de los sueros control positivo y negativo en los pocillos de las columnas 11 y 12. Las placas se incuban a 37C durante 30 minutos en una cmara hmeda. Se desecha el suero y se lavan las placas tres veces con PBS. Se aaden 50 l de IgG antiporcino, diluida apropiadamente, conjugada con FITC y las placas se incuban a 37C durante 30 minutos en una cmara hmeda. Se elimina el conjugado, y las placas se lavan varias veces y se golpean ligeramente sobre material absorbente para eliminar el exceso de lquido. Lectura e interpretacin de resultados

iii)

iv)

v) vi)

Mediante examen al microscopio de fluorescencia, el ttulo de un suero se define como el inverso de dilucin ms alta del suero en lal que se observa la tpica fluorescencia citoplasmtica. Empleando muestras de suero, por duplicado, un incremento del ttulo de cuatro veces con un intervalo de 2 semanas, es un indicativo de infeccin activa en un animal determinado. No se debe observar fluorescencia especfica en clulas control no infectadas empleando sueros problema o sueros control positivo o negativo. Tampoco se debe observar fluorescencia en clulas infectadas usando suero control negativo. La fluorescencia especfica debe aparecer en clulas infectadas empleando suero control positivo a las diluciones apropiadas. El acabado final del IFI puede variar entre distintos laboratorios. Los resultados de las pruebas tambin pueden variar dependiendo del aislado PRRSV empleado en las pruebas debido a la diversidad antignica.

c)

Deteccin de anticuerpos mediante las tcnicas de enzimoinmunoensayo

Varios laboratorios han desarrollado ELISAs (indirecto o de bloqueo) para pruebas serolgicas (1, 8, 9, 16, 24, 39, 40). Se ha descrito un sistema ELISA doblede bloqueo que permite distinguir entre reacciones serolgicas frente a los tipos antignicos europeo y americano (40). Se dispone de kits comerciales de ELISA para determinar el estado serolgico de los cerdos frente al PRRSV. Estos kits emplean los tipos PRRSV americano o europeo separadamente o bien ambos antgenos combinados. La principal ventaja es

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el manejo rpido de gran nmero de muestras. Tambin se han desarrollado y estn disponibles comercialmente ELISAs que utilizan protenas recombinantes de ambos tipos de PRRSV como antgenos.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNSTICO

En USA se han autorizado varias vacunas de virus vivos modificados (MLV) para el control de las formas reproductiva y/o respiratoria del SRRP. Tambin, tanto en EE.UU. como en Europa se ha autorizado el uso de una vacuna con virus muertos, con objeto de ayudar en la reduccin de abortos y cras dbiles causadas por la forma reproductiva del SRRP. Todas las vacunas frente al SRRP actualmente autorizadas en EE.UU. contienen el tipo antignico americano. En Europa, se han autorizado y se dispone comercialmente de dos vacunas MLV. Los tipos antignicos (americano o europeo) empleados, deben ser apropiados a la regin de aislamiento (44). Las directrices a seguir para la produccin de vacunas de inters veterinario se indican en el Captulo I.1.7. Principios de produccin de vacunas veterinarias. Las directrices dadas aqu y en el Captulo I.1.7 pretenden ser en esencia generales y pueden ser complementadas ante requerimientos regionales y nacionales. Aunque la vacunacin de los cerdos no evita la infeccin con el PRRSV, puede ser til en granjas porcinas que experimenten problemas con el SRRP o granjas con alto riesgo de infeccin por el PRRSV. Las vacunas MLV no han sido pensadas para ser utilizadas en explotaciones no experimentadas, ni en cerdas gestantes, ni en cerdas jvenes o machos en edad de crianza. Las vacunas MLV han sido diseadas para ser aplicadas a cerdas adultas y jvenes 36 semanas antes de tener cras y en lechones de 3 semanas de edad o mayores para ayudar a reducir los trastornos provocados por el SRRP. El virus de la vacuna puede persistir en verracos y puede ser diseminado a travs del semen (11, 12). El virus de la vacuna MLV puede ser vertido y transmitido por contacto a cerdos no vacunados (42).

1.
a)

Control del inculo

Caractersticas del inculo
El aislado del PRRSV utilizado en la produccin de vacunas debe ir acompaado de una ficha describiendo su origen e historial de pases. El aislado debe ser seguro en los cerdos a la edad a la que va dirigida la vacuna y proporcionar proteccin frente al virus de desafo objeto de la prueba. Los aislados para cualquier vacuna MLV deben demostrar ausencia de reversin a su estado virulento tras varios pases en animales hospedadores.

b)

Mtodo de cultivo
El PRRSV se propaga en una lnea celular continua de rin de mono verde africano, tal como la MA104 o Vero. La propagacin vrica no debe exceder de cinco pases desde el virus del inculo original (MSV) a menos que pases posteriores demuestren proporcionar proteccin en el ganado porcino.

c)

Validacin como vacuna

El MSV debe estar libre de bacterias, hongos y micoplasmas. Mediante tcnicas con anticuerpos fluorescentes, debe demostrarse que el MSV est libre de virus extraos, incluyendo el virus de la gastroenteritis transmisible, el adenovirus porcino, el virus de la encefalitis hemaglutinante porcina, el parvovirus porcino, el virus de la diarrea vrica bovina, reovirus, y el virus de la rabia. El MSV debe estar libre de virus extraos comprobndose mediante ECP y hemoadsorcin en la lnea celular Vero y en un tipo celular porcino embrionario. Se sabe que los aislados atenuados del PRRSV causan viremia y que pueden transmitirse a animales susceptibles. Debe demostrarse que el MSV no es virulento en lechones y hembras gestantes mediante cinco pases seriados del MSV a travs de cerdos susceptibles empleando la ruta de infeccin ms natural. En un ensayo de inmunogenicidad, el MSV en su nivel de pase ms elevado intentado para la produccin, debe proteger a los cerdos susceptibles contra una cepa virulenta heterloga de desafo. Para la forma respiratoria, los lechones de 3 semanas se vacunan con el nivel de pases mal alto del MSV. Los lechones se enfrentan a un aislado virulento del PRRSV 216 semanas ms tarde para determinar si estn protegidos de los signos clnicos respiratorios del SRRP. Para determinar proteccin de las prdidas causadas por la forma reproductiva de SRRP, los animales vacunados se desafiarn aproximadamente al da 85 de la gestacin. Un nmero significativo de los vacunados debe estar protegido de los signos clnicos de la enfermedad reproductiva, incluyendo momificacin fetal, nacidos muertos y o lechones dbiles, cuando se comparan con los controles. Los estudios de pruebas de campo deberan conducir a determinar

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la seguridad de la vacuna. Debe incluirse en cada lugar cerdos centinelas no vacunados a fin de vigilar la posible fuga de virus atenuados.

2.

Mtodo de produccin

La lnea celular de rin de mono verde africano se siembra en recipientes adecuados. Para la produccin se emplea medio MEM complementado con FBS; el FBS debe estar libre de pestivirus o anticuerpos frente a pestivirus y tambin libre del riesgo de encefalopata espongiforme bovina. La incubacin se realiza a 37C. Los cultivos celulares se inoculan directamente con un stock de virus productor del SRRP, que generalmente procede del 1 al 4 pase a partir del MSV. Los cultivos inoculados se incuban de 18 das antes de recoger el medio de cultivo. Durante la incubacin, los cultivos deben observarse diariamente para detectar ECP y contaminacin bacteriana. Las vacunas de virus muertos se inactivan qumicamente con formalina o etileneimina binaria y se mezclan con un adyuvante adecuado. Las vacunas MLV se mezclan generalmente con un estabilizador antes de ser embotelladas y liofilizadas. Si se emplea formalina como inactivador, debe comprobarse que en el producto final la concentracin residual de formaldehdo no excede de 0,5 g/l.

3.

Control interno

Los lotes de produccin del PRSV deben ser titulados en cultivos de tejidos mediante estandarizacin del producto. Los lotes de titulacin baja deben concentrarse o bien mezclarse con lotes de titulacin ms alta para alcanzar el ttulo correcto.

4.

Control de lotes

Las muestras en sus envases finales deben analizarse en cuanto a su pureza, seguridad o inocuidad y potencia. Los viales de MLV deben ser probados en cuanto al contenido mximo de humedad permitido.

a)

Pureza
Las muestras se examinan para descartar una posible contaminacin con bacterias, hongos o pestivirus. Para probar la presencia de bacterias se inoculan diez recipientes, cada uno de ellos conteniendo 120 ml de medio hidrolizado de casena de semilla de soja, con 0,2 ml procedentes de 10 muestras de contenedores finales. Los diez recipientes se incuban a 3035C durante 14 das y se realiza un seguimiento del posible crecimiento bacteriano. Para probar la presencia de hongos se inoculan 10 recipientes, cada uno de ellos conteniendo 40 ml de medio hidrolizado de casena de semilla de soja, con 0,2 ml procedentes de 10 muestras de contenedores finales. Los recipientes se incuban a 2025C durante 14 das y se observa el posible crecimiento de hongos.

b)

Inocuidad
Las pruebas de inocuidad pueden llevarse a cabo con una combinacin de cobayas, ratones o cerdos.

c)

Potencia
Las muestras de los contenedores finales de una vacuna MLV se titularn (log10) en placas de microtitulacin para la determinacin del ttulo. i) Procedimiento de la prueba Se preparan diluciones decimales partiendo de 101 hasta 105 empleando la vacuna problema rehidratada y 1,8 ml de MEM. Debe titularse un control positivo interno del PRRSV en el rango apropiado. Se inocula 0,1 ml/pocillo de cada dilucin en cinco pocillos de una placa con 96 pocillos conteniendo monocapas de rin de mono verde africano. Se incuba la placa a 37C en una atmsfera con CO2 durante 57 das. Se observan las placas microscpicamente para detectar ECP. El control positivo interno del PRRSV debera dar un ttulo dentro del rango de 0,3 log10 DICC50 de su media predeterminada. Se determina la DICT50/dosis mediante el mtodo de SpearmanKrber. El ttulo obtenido debe ser al menos 1,2 logs mayor que el ttulo utilizado en el ensayo de inmunogenicidad. Los 1,2 logs incluyen

ii) iii) iv) v)

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0,5 logs para estabilidad durante el periodo de validez del producto y 0,7 logs para la variabilidad de la prueba de potencia. Para determinar la potencia del producto final de vacunas con virus muertos se pueden emplear animales hospedadores o pruebas de vacunacin/serologa con animales de laboratorio o pruebas de vacunacin/desafo. Los ensayos en paralelo empleando tcnicas tipo ELISA que cuantifican antgeno para comparar un estndar con el producto final son adecuados para determinar la potencia relativa de un producto. El estndar debe proporcionar proteccin en el animal hospedador.

d)

Duracin de la inmunidad
Los estudios de la duracin de la inmunidad se realizan antes de que la vacuna reciba la acreditacin final. Para la forma respiratoria del SRRP, la duracin debe ser elevada hasta la edad de puesta en mercado de los cerdos. La duracin de la inmunidad para la forma reproductiva debe cubrir la etapa de destete de los lechones.

e)

Estabilidad
Todas las vacunas tienen inicialmente un periodo de validez de 24 meses antes de expirar. Los estudios de estabilidad en tiempo real se llevan a cabo para confirmar si es correcta la fecha de expiracin.

f)

Conservantes
Los antibiticos se aaden durante la produccin, generalmente gentamicina sulfato o neomicina, no excediendo los 30 g/ml.

g)

Precauciones (riesgos)
La vacunacin slo se recomienda para cerdos de piaras PRRSVpositivas. Las vacunas MLV tratan de ser una ayuda en la reduccin de la enfermedad asociada con la forma respiratoria y/o reproductiva del SRRP y no est recomendada para ser usada en cerdas gestantes, ni en cerdas jvenes o machos en edad de crianza. La vacunacin de machos en edad de crianza con la vacuna MLV no se recomienda debido al posible vertido del virus de la vacuna en el semen (11, 12). La primera vacuna MLV para el SRRP basado en el virus tipo americano, se ha observado que se transmite a animales no vacunados (6, 42) y por tanto causa defectos en la reproduccin tpicos del SRRP inducidos por el virus de la vacuna en las explotaciones afectadas (6, 31).

5.
a)

Pruebas sobre el producto final

Inocuidad
Ver seccin C.4.b.

b)

Potencia
Ver seccin C.4.c.

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* * *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para el Sndrome reproductivo y respiratorio porcino (ver el Cuadro en la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar el sitio Web de la OIE para encontrar un listado ms actualizado: www.oie.int).

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