INFORME MICROBIOLOGA

FLOR ELISA CORREA RINCON BRIYITH PAOLA MARTINEZ EDISON CAMILO SILVA

INSTRUCTORA: ELSY CAROLINA PLAZAS

TECNOLOGO EN CONTROL DE CALIDAD DE ALIMENTOS SENA DUITAMA 2011

TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCION ............................................................................................................................................... 3 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. OBJETIVOS ............................................................................................................................................... 4 GENERAL ................................................................................................................................................. 4 ESPECIFICOS ............................................................................................................................................ 4 MARCO TERICO ..................................................................................................................................... 5 MESFILO:............................................................................................................................................... 5 ESCHERICHIA COLI: .................................................................................................................................. 5 TINCIN DE GRAM O COLORACIN DE GRAM: ........................................................................................ 5 NUMERO MS PROBABLE: ...................................................................................................................... 6 MICROPIPETA: ......................................................................................................................................... 6 VORTEX: .................................................................................................................................................. 6 CALDO VERDE BILIS BRILLANTE:............................................................................................................... 7 AGUA PEPTONADA: ................................................................................................................................. 7 PLACAS DE PETRIFILM: ............................................................................................................................ 7 MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS ...................................................................................................... 8 PROCEDIMIENTOS ................................................................................................................................... 9 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO ................................................................................................... 9 RECUENTO EN PLACA DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS ..................................................10 RECUENTO DE HONGOS Y LEVADURAS ...................................................................................................11 DETERMINACION DE COLIFORMES TOTALES (NMP) ...............................................................................12 PRUEBA CONFIRMATIVA PARA FECALES .................................................................................................12 TINCIN DE GRAM .................................................................................................................................13 CLCULOS ...............................................................................................................................................14 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO AGAR PLATE COUNT .................................................................14 DILUCION SALTEADA ..............................................................................................................................14 FACTOR DE CORRECCION ........................................................................................................................14 RESULTADOS ..........................................................................................................................................15 ANALISIS DE RESULTADOS ......................................................................................................................18 CONCLUSIONES ......................................................................................................................................20 BIBLIOGRAFA .........................................................................................................................................21

INTRODUCCION

En la realizacin de las diferentes pruebas tales como recuento de microorganismos mesfilos aerobios, recuento de hongos y levaduras y determinacin de coliformes totales y fecales numero ms probable (NMP), podremos determinar la cantidad y los microorganismos presentes en los alimentos y as establecer las condiciones del mismo, diciendo si es o no apto para consumo humano.

La evaluacin microbiolgica de los alimentos es esencial antes de sacar un producto al mercado.

Existen diferentes clases de microorganismos que se pueden presentar en los productos alimenticios entre estos se encuentran los patgenos y los benficos, se puede decir que los benficos no causaran dao en la salud de los consumidores pues son estos los utilizados para la fermentacin y elaboracin de productos tales como el pan, el yogurt, kumis, cerveza, vinagre entre otros, lo importante de esta evaluacin es verificar la calidad del producto mediante presencia o ausencia de microorganismos perjudiciales como la E-coli, el clostridium y la salmonella.

1. OBJETIVOS

GENERAL

Evaluar la calidad del salchichn mediante la realizacin de procedimientos microbiolgicos para determinar si cumple con las caractersticas microbiolgicas establecidas por la norma.

ESPECIFICOS

Implementar tcnicas como recuento en placa y NMP para la determinacin de la calidad higinica de productos alimenticios.

Conocer los diferentes pasos que debemos seguir para la preparacin de un medio de cultivo y los respectivos procesos de siembra e incubacin.

Conocer el nmero de microorganismos aerobios mesfilos, hongos y levaduras y bacterias y coliformes presentes en la muestra analizada.

Observar el crecimiento de determinados microorganismos como hongos y levaduras, bacterias mesfilas y coliformes en el salchichn.

2. MARCO TERICO

MESFILO:

Microorganismo cuya temperatura de crecimiento ptima est entre los 15 y los 40C (un rango considerado moderado). Este trmino es usado sobre todo en el campo de la microbiologa. Por el contrario, los que prefieren temperaturas fras se denominan psicrfilos y los que crecen de forma ptima a altas, termfilos. El hbitat de estos organismos incluye el suelo, el cuerpo de un animal, etc.

ESCHERICHIA COLI:

Bacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales, y por ende en las aguas negras. Fue descrita por primera vez en 1885 por Theodore von Escherich, bacterilogo alemn, quien la denomin Bacterium coli. sta y otras bacterias son necesarias para el funcionamiento correcto del proceso digestivo, adems de producir las vitaminas B y K. Es un bacilo que reacciona negativamente a la tincin de Gram. (gram negativo). Es anaerobio facultativo, mvil por flagelos peritricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa.

TINCIN DE GRAM O COLORACIN DE GRAM:

Es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan

de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo.

NUMERO MS PROBABLE:

(NMP) es una estrategia eficiente de estimacin de densidades poblacionales especialmente cuando una evaluacin cuantitativa de clulas individuales no es factible. La tcnica se basa en la determinacin de presencia o ausencia (pos o neg) en rplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Por lo tanto, un requisito importante de este mtodo es la necesidad de poder reconocer un atributo particular de la poblacin(es) en el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrn de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla probabililstica.

MICROPIPETA:

Instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir pequeos volmenes de lquidos y permitir su manejo en las distintas tcnicas cientficas. Los volmenes captables por estos instrumentos varan segn el modelo. Es de destacar que el uso de micropipetas permite emplear distintos lquidos sin tener que lavar el aparato: para ello, se emplean puntas desechables, de plstico, que habitualmente son estriles.

VORTEX:

Equipo de laboratorio utilizado para homogenizar muestras mediante un efecto de remolino producido por el giro de una masa de fluido ms o menos cilndrica.

CALDO VERDE BILIS BRILLANTE:

En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepcin de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentacin de la lactosa con produccin de cido y gas.

AGUA PEPTONADA:

Medio de enriquecimiento no selectivo, recomendado para ser utilizado en lugar de solucin fisiolgica para recuperar clulas de entero bacterias daadas por procesos fisicoqumicos, a los que ha sido sometido el alimento. Si es utilizado como medio base para la fermentacin de hidratos de carbono, se debe adicionar el indicador de Andrade y el hidrato de carbono en cuestin.

PLACAS DE PETRIFILM:

Su diseo consiste en una pelcula plstica cubierta de nutrientes y agentes gelificantes, por lo que estn listas para utilizarse en cualquier momento. Al utilizar las Placas Petrifilm que ahorran tiempo de mano de obra, usted tendr tiempo para monitorear puntos crticos de control con mayor frecuencia. El resultado final es un mejor control del proceso y un producto de alta calidad.

3. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS MATERIALES

Cajas petri Reloj de vidrio Erlenmeyer Frascos schoot Pipetas Tubos de ensayo Tubos taparrosca Mechero de bunsen

Campanas de durham Placas de petrifilm. Asa de inoculacin. Gradillas. Laminas portaobjetos. Laminillas. Micro pipetas. Puntas de micropipetas

EQUIPOS Incubadoras. Cmara extractora. Autoclave. Microscopio. Vortex. Balanza analtica.

REACTIVOS Agar Plate Count. Agar Ogy. Caldo Lactosado Bilis Verde Brillante. Lugol. Fucsina. Cristal de Violeta. Alcohol Acetona. Aceite de Inmersin.

4. PROCEDIMIENTOS

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

1. AGAR PLATE COUNT (AGAR PEPTONA DE CASEINA GLUCOSA EXTRACTO DE LEVADURA)

Preparacin: Disolver

22.5 gramos por litro de agua destilada, homogenizar y

esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 C.

2. AGAR OGY (OXITETRACICLINA GLUCOSA EXTRACTO DE LEVADURA)

Preparacin: Disolver 30 gramos por litro de agua destilada y esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121C.

3. CALDO LACTOSADO BILIS VERDE BRILLANTE

Preparacin: Disolver 40 gramos por litro de agua destilada, distribuir 9 ml en tubos de ensayo provistos de campanas de Durham invertidas y esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 C.

4. AGUA PEPTONADA AL 0,1%

Preparacin: Disolver 1 gramo por litro de peptona en agua destilada, distribuir en frascos de dilucin o en tubos, en volmenes predeterminados de tal forma que despus del tratamiento en autoclave 15 minutos a 121 C, el volumen sea el deseado. 2%.

RECUENTO EN PLACA DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS

Preparacin de la muestra

Preparacin de diluciones

Adicin del agar

20 ml de agar Plate Count en cada caja de petri.

Transferencia por duplicado

Alcuotas de 1 ml de cada una de las diluciones

Adicin del inoculo

1 ml en profundidad y 0.1 ml en superficie

homogenizacin

Incubacin

35C +/- 2C durante 48 horas.

RECUENTO DE HONGOS Y LEVADURAS

PREPARAR LA MUESTRA CON LAS DILUCIONES

VERTER EN LAS CAJAS PETRI 20 ml. DE AGRA OGY

DEJAR SOLIDIFICAR EL MEDIO

ADICIONAR 1 ml. DE INOCULO Y HOMOGENIZAR

INVERTIR LAS PLACAS PETRI E INCUBARLAS A 27 C.

DEJAR INCUBANDO POR 5 DIAS

DETERMINACION DE COLIFORMES TOTALES (NMP)

TOMAR 1 ml. DE LA DILUCION 10 -1

VERTERLO EN UN TUBO TAPARROSCA CON 9 ML DE CALDO BILIS VERDE BRILLANTE HOMOGENIZAR Y REPETIR EL PROCESO DE LA MISMA DILUCION EN 2 TUBOS IGUALES

HOMOGENIZAR LAS DILUCIONES EN EL VORTEX

INCUBAR A 35 C DURANTE 28 48 HORAS

ANOTAR LOS TUBOS QUE MUESTREN PRODUCCION DE GAS

PRUEBA CONFIRMATIVA PARA FECALES

ADICIONAR 1 ml. DE 10 -1EN LA PLACA PETRIFILM

INCUBAR A 35 C POR 28 48 HORAS

OBSERVAR LOS RESULTADOS - LEER

TINCIN DE GRAM

TOMARLA MUESTRA CON UN ASA ESTRERILIZADA (POR FLAMEO)

DEPOSITAR UNA GOTA DE AGUA DESTILADA EN EL PORTAOBJETOS

HOMOGENIZAR LA MUESTRA SOBRE EL POTA OBJETOS

DEJAR SECAR AL LADO DEL MECHERO

ADICIONAR 1 GOTA DE CRISTAL VIOLETA

DEJAR ACTUAR EN POR UN MINUTO Y LAVAR

ADICIONAR UNA GOTA DE LUGOL

CUBRIR LA MUESTRA CON ALCOHOL ACETONA POR 10 MINUTOS Y LAVAR

ADICIONA SAFRANINA POR 1 MINUTO

SECAR LA PLACA Y OBSERVAR EN EL MICROSCOPIO.

5. CLCULOS PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO AGAR PLATE COUNT

22.5 X X = 2.92

1000 ml. 130

AGAR OGY: Preparar 100 ml para lo cual se adicionaran 3 gr. de agar. CALDO LACTOSADO BILIS VERDE BRILLANTE: Se preparan 10 ml para ello se adicionan 4 gr. de caldo. AGUA PEPTONADA AL 0,1%: 0.12 gr de peptona para 120 ml de agua peptonada.

DILUCION SALTEADA

VOLUMEN 1 * CONCENTRACION 1 = VOLUMEN2 * CONCENTRACION 2 V1 * 10(-1) = 10 * 10-3 V1 = 10 * 10- 3 10 (-1)

V1 = 10 * 0.001 0.1 V1= 0.1 FACTOR DE CORRECCION

UFC = # de colonias * fcdil * fcs UFC = 47 * 100000 *10 UFC = 47 * 106 4.7 * 107.

6. RESULTADOS

HONGOS Y LEVADURAS < 10-3

BACTERIAS MESOFILAS 47 * 10-5 UFC/ gr. o ml.

COLIFORMES TOTALES 35 UFC/ gr. o ml.

COLIFORMES FECALES Ausente menor de 10-1

TINCION DE GRAM +

HONGOS Y LEVADURAS: Se realizo la siembra en el Agar OGY y despus de un periodo de incubacin de 4 das se presentaron colonias blancas, cremosas, redondas con borde uniforme y ms claro que el centro, debido a las caractersticas de estas colonias podemos deducir que no se encuentran clasificadas dentro de hongos ni levaduras por lo cual se presume son bacterias mesfilas. En el recuento de hongos se encontraron algunas colonias no representativas en la dilucin 10-4 pero en la dilucin ms concentrada no se hallo nada lo que se presume se debi a contaminacin. BACTERIAS MESOFILAS: Las colonias presentes en el medio de cultivo plate count presentaron las siguientes caractersticas: Blancas redondas Borde uniforme Cremosas Centro oscuro Borde claro

Al realizar el conteo de los microorganismos hubo un total de 47 * 10-5 UFC/ gr. En la dilucin 10 -5 y en conteo con la misma dilucin con siembra en otra placa petri se obtuvo 49 ufc / gr.

Las diluciones mas concentradas presentaron error debido a que el agar no se encontraba muy bien gelificado y al momento de pintar este se rayo o se dividi, adems se presentaron cajas petri con gran cantidad de microorganismos, a estas no se les pudo realizar lectura. COLIFORMES TOTALES: El conteo de los microorganismos coliformes totales se realizo por medio del mtodo NMP en el cual se sembr por triplicado, en cada una de las diluciones (10-1, 10-2 y 10-3) se presentaron tubos con presencia de gas, turbidez y cambio de color del caldo a un verde ms claro.

10-1. 10-2. 10-3.

2 Tubos 2 Tubos 2 Tubos

Basados en la tabla probabilstica y de acuerdo a los resultados anteriores se determina que el numero de colonias de acuerdo a estos tubos es de 35 UFC/ gr. o ml.

COLIFORMES FECALES: Sembrado el inoculo en placas de petrifilm y posteriormente incubado 35 C no se observ presencia de E-coli tan solo se presento gas y un pequeo cambio de color pero debido al tiempo de incubacin. Recuento de colonias: 0 TINCION DE GRAM: Se pudo observar bacilos gran negativos () estos tienen en su pared celular una delgada capa de peptidoglucano ligada a una membrana externa por molculas de lipopolisacridos. Esta membrana externa es daada por el alcohol y/o acetona de la decoloracin, permitiendo que el primer colorante acomplejado con iodo escape y sea reemplazado por el contra colorante por esta razn se tien de rosado claro (fucsina).

7. ANALISIS DE RESULTADOS

MESOFILOS AEROBIOS: De acuerdo a la NTC 1325 que nos da los parmetros para evaluar la calidad microbiolgica y permitida en Colombia, en cuanto a productos crnicos procesados cocidos, el recuento de mesfilos aerobios no se encuentra en el ndice permitido ya que es de 100.000 UFC/g en nivel aceptable de calidad. Debido a la gran cantidad de flora bacteriana presente por gramo de salchichn se puede deducir que es un efecto de riesgo mayor y puede haber presencia de microorganismos patgenos y a su vez llega puede llegar a indicar que es un alimento en deterioro lo que puede ser muy factible si no se encontraba en las condiciones de refrigeracin y conservacin adecuadas; las Buenas Prcticas de Manufactura realizadas por los manipuladores influyen en la elevacin de recuento y as mismo la eficiencia del procedimiento de elaboracin y proceso, la condicin de higiene del equipo y utensilios y la relacin tiempo- temperatura de almacenamiento. Adems hubo al momento de sembrar en unas cajas de petri 10 -4 poca solidificacin del medio, lo cual causo un error para poder leer las colonias que se desarrollaron; la causa de este error fue posiblemente la mala homogenizacin de medio al momento de ser adicionado a las cajas de petri.

COLIFORMES TOTALES Y FECALES (E. COLI): Nuestra muestra de salchichn determin presencia de bacterias coliformes, y este indicador nos puede mostrar que probablemente hubo contaminacin postproceso trmico o este mismo fue deficiente ya que los organismos coliformes se eliminan fcilmente con tratamiento de calor; aunque la presencia de coliformes no significa que hay contaminacin fecal o de patgenos entricos riesgosos para la salud humana, en nuestra prueba de E. Coli hubo ausencia, pero esto no asegura que no haya presencia de patgenos entricos, los cuales se determinan con distintas pruebas.

HONGOS Y LEVADURAS: Tienen una accin deteriorante, que pudre las materias primas y productos manufacturados como el salchichn, tambin por la capacidad de algunos hongos para sintetizar gran variedad de micotoxinas, para provocar infecciones e incluso, para provocar reacciones alrgica en personas hipersensibles a los antgenos

fngicos. Por estos motivos, para conocer la calidad microbiolgica de un producto, es pertinente realizar un recuento de hongos y levaduras. Se realizo la siembra en el Agar OGY y despus de un periodo de incubacin de 4 das se presentaron colonias blancas, cremosas, redondas con borde uniforme y ms claro que el centro, debido a las caractersticas de estas colonias podemos deducir que no se encuentran clasificadas dentro de hongos ni levaduras por lo cual se presume que hay presencia de otros microorganismos. En el recuento de hongos se encontraron algunas colonias no representativas en la dilucin 10-4 pero en la dilucin ms concentrada no se hallo nada lo que se presume se debi a contaminacin. Ya que este agar: En el momento de la siembra tambin agares que no estaban totalmente solidificados es decir muy aguados y otros estaban ms coagulados debido a que no se agit bien el medio en la cmara extractora al momento de porcionar los medios en las cajas petri provocando as que las primeras tuvieran pocos nutrientes y las ultimas estuvieran concentradas, este factor que pudo haber afectado el resultado ya que involucra la preparacin del medio de cultivo. Si hay demasiados nutrientes el medio se vuelve hipertnico. Lo que esto significa que habr una mayor concentracin de partculas en la solucin de nutrientes, que hay en las clulas en divisin del micelio. TINCIN DE GRAM: La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azulviolcea

8. CONCLUSIONES Es importante manipular adecuadamente tanto las cajas petri como las placas de petrifilm para evitar la contaminacin con el medio ambiente y dar informes que no se vean afectados por ello. A pesar de ser el agar OGY un medio selectivo para enumerar y determinar hongos y levaduras presentes en un alimento es vital conocer si realmente se trata de este tipo de microorganismos o de bacterias que se pueden adaptar a este medio de cultivo. Es necesario conocer tanto la temperatura como el tiempo de incubacin para el adecuado crecimiento y desarrollo de las diferentes clases de microorganismos. Se debe realizar una correcta tincin para la determinacin de bacterias tanto gram + como gram -, evitando la presencia de aglutinaciones que impidan la lectura, dando resultados errneos por falsos positivos. Los resultados positivos de coliformes totales no significa la presencia de coliformes fecales ni de microorganismos entricos para ello se debe llevar a cabo una prueba confirmativa.

9. BIBLIOGRAFA

(CARLOS, 2004)(SANDRA)(MARTINEZ, 1995) (FERNEY, 2001)

CARLOS, C. (2004). analisis de microorganismos mesofilos aerobios. Obtenido de http://www.analizacalidad.com/arm2004-4.pdf FERNEY, G. (2001). Tecnica de tincion. Obtenido http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/seminariotinciones.htm de Fundamentos:

MARIA, V. (1999). Enumeracion bacteriana: el numero mas probable (NMP). Obtenido de http://www.uprm.edu/biology/profs/massol/manual/p4nmpenumeracion.pdf MARTINEZ, M. (1995). Recuento de hongos y levaduras. vol.1 N.2-3. SANDRA, M. (s.f.). Recuento de mesofilos. http://www.geocities.com/seguridad_alimentaria/recuento.ref Obtenido de