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Universidad Nacional Autnoma de Mxico Facultad de Qumica Bioqumica experimental

PARTE II. Factores que modifican la actividad de las enzimas: efecto de la concentracin de sustrato y de un inhibidor

Factores que modifican la actividad de las enzimas: efecto de la concentracin de sustrato y de un inhibidor Resumen: Las estructuras que forman el cuerpo de los seres vivos se construyen mediante reacciones qumicas. Son tambin reacciones qumicas las que fabrican las molculas que forman esas estructuras. Y reacciones qumicas son las que, en ltimo trmino, dan lugar a las funciones que todo ser vivo realiza. Las enzimas son las encargadas de dirigir toda esa variedad de reacciones: hacen que ocurra la reaccin necesaria, en el lugar adecuado y en momento preciso. Por eso es importante conocer los factores que pueden modificar su actividad .Estos estudios proporcionan informacin directa acerca de la concentracin de sustrato en la cual la enzima alcanza su velocidad mxima, as como los parmetros cinticos de la reaccin catalizada por la LDH utilizando diferentes grficos de la ecuacin linealizada de Michaelis- Menten; adems de determinar el efecto de un inhibidor en la actividad de la lactato deshidrogenasa. Se determinaran las contantes cinticas, Km y Vmax, de la lactato deshidrogenasa de msculo de pollo, para la reaccin en el sentido de piruvato lactato, manteniendo constante la concentracin de enzima, el pH y la temperatura de la reaccin. Tambin se determinara el tipo de inhibicin que el oxamato produce en la actividad de la enzima. Introduccin: Las enzimas son molculas de naturaleza proteica que actan como catalizadores en todas las reacciones del metabolismo. En estas reacciones, las enzimas actan sobre unas molculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en molculas diferentes denominadas productos. La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan informacin directa acerca del mecanismo de la reaccin cataltica y de la especifidad de la enzima. La cintica de Michaelis-Menten describe la velocidad de reaccin de

[Escriba texto] muchas reacciones enzimticas. Este modelo slo es vlido cuando la concentracin del sustrato es mayor que la concentracin de la enzima, y para condiciones de estado estacionario, es decir, cuando la concentracin del complejo enzima-sustrato es constante. La actividad de las enzimas puede ser afectada por otras molculas. Los inhibidores son molculas que regulan la actividad enzimtica, inhibiendo su actividad. A grandes rasgos, pueden clasificarse en reversibles e irreversibles. Las reversibles se unen de forma reversible a la enzima, pudiendo clasificarse a su vez, segn la forma en que intervienen en la reaccin, en competitivas, acompetitivas y mixtas. Habitualmente, por su amplia presencia en multitud de procesos, se habla tambin de inhibicin no competitiva, que en realidad no es ms que una variante de la ya mencionada inhibicin mixta. Se espera que en el experimento que determinar el efecto de la concentracin un aumento de la concentracin de sustrato en un principio produzca un aumento rpido de la velocidad de reaccin, pero si se sigue aumentando la concentracin de sustrato, la velocidad de reaccin comenzar a disminuir, ya que los centros activos de la enzima se encontraran saturados. Mientras que el tipo de inhibicin que ejercer el oxamato ser de tipo competitivo al tener una gran similitud con el sustrato de la enzima (piruvato). Mtodos: -Determinacin del efecto de la concentracin de sustrato. Se utiliz la fraccin 3 obtenida en la purificacin de la LDH, diluida 1:15. Se hicieron 6 ensayos variando la cantidad de sustrato (10 mM piruvato) las cantidades utilizadas de sustrato fueron: 6, 9, 15, 25, 36 y 50 L. Se leyeron las absorbancias a una longitud de onda de 340 nm por 3 minutos cada 15 segundos. -Determinacin del efecto del oxamato en la actividad de la LDH. Se utiliz la fraccin 3 obtenida en la purificacin de la LDH, diluida 1:15. Se hicieron 6 ensayos variando la cantidad de sustrato (10 mM piruvato) las cantidades utilizadas de sustrato fueron: 6, 9, 15, 25, 36 y 50 L y manteniedo constante la cantidad (34 L) de inhibidor (10 Mm oxamato).Se leyeron las absorbancias a una longitud de onda de 340 nm por 3 minutos cada 15 segundos.

Tiempo NADH 0 15 30 45 60

0.06 1.05 0.935 0.811 0.731 0.678 0.648

Concentracin de piruvato(mM) 0.09 0.15 0.25 0.36 0.749 1.065 0.97 1.138 0.651 0.892 0.735 0.927 0.597 0.671 0.445 0.591 0.361 0.466 0.227 0.359 0.26 0.312 0.093 0.177 0.201 0.209 0.013 0.073

0.5 0.83 0.63 0.338 0.124 0.03 0.005

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75 90 105 120 135 150 165 180 Vol enzima Enzima (mg) m Actividad 0.63 0.619 0.613 0.608 0.605 0.603 0.602 0.601 10 0.000838 0.0014 6220 0.000269 0.165 0.141 0.124 0.114 0.106 0.102 0.098 0.095 10 0.000838 0.0028 6220 0.000537 0.131 0.081 0.044 0.018 0 0 0 0 10 0.000838 0.0063 6220 0.001209 0.007 0.006 0.005 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 10 0.000838 0.0097 6220 0.001861 0.021 0 -0.011 -0.015 -0.017 -0.016 -0.016 -0.016 10 0.000838 0.01 6220 0.001919 0 -0.002 -0.002 -0.003 -0.003 -0.003 -0.003 -0.003 10 0.000838 0.0104 6220 0.001995

Resultados:

Tabla 1. Efecto de la concentracin de sustrato. Lecturas de absorbancia de la actividad de la LDH a diferentes concentraciones piruvato 10 mM (sustrato).
Michaelis-Menten [S] V 0.06 0.000269

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0.09 0.15 0.25 0.36 0.5 Vmx km km 0.000537 0.001209 0.001861 0.001919 0.001995 0.001995 -0.89444 0.4088

Lineweaver-Burk 1/[S] 1/V 16.66667 3717.472 11.11111 1862.197 6.666667 827.1299 4 537.3455 2.777778 521.1047 2 501.2531 Vmx Km 0.004083 0.891389

Hanes-Woolf [S] [S]/V 0.06 223.0483 0.09 167.5978 0.15 124.0695 0.25 134.3364 0.36 187.5977 0.5 250.6266 Vmx Km 0.002644 0.145483

Tiempo

0.06

Efecto del inhibidor Concentracin de piruvato(mM) 0.09 0.15 0.25 0.36

0.5

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NADH 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 Vol enzima Enzima (mg) m Actividad 1.189 1.177 1.171 1.161 1.142 1.129 1.118 1.106 1.092 1.078 1.07 1.058 1.048 1.038 10 0.000838 0.0008 6220 0.000153 1.09 1.06 1.015 0.976 0.944 0.918 0.891 0.867 0.841 0.819 0.801 0.777 0.758 0.74 10 0.000838 0.0017 6220 0.000326 1.082 1.041 1.004 0.973 0.94 0.895 0.852 0.811 0.767 0.724 0.688 0.653 0.616 0.577 10 0.000838 0.0026 6220 0.000499 0.734 0.693 0.633 0.554 0.475 0.407 0.333 0.277 0.217 0.17 0.123 0.087 0.061 0.041 10 0.000838 0.0038 6220 0.000729 0.542 0.495 0.376 0.263 0.212 0.159 0.12 0.103 0.099 0.098 0.098 0.098 0.098 0.098 10 0.000838 0.0043 6220 0.000825 1.057 0.982 0.923 0.836 0.72 0.576 0.481 0.387 0.312 0.24 0.183 0.135 0.104 0.083 10 0.000838 0.0054 6220 0.001036

Tabla 2. Registro de absorbancias de la actividad de la LDH en presencia de oxamato 10 mM (inhibidor) y actividad enzimtica especfica.
Michaelis-Menten [S] V 0.06 0.000153 0.09 0.000326 0.15 0.000499 0.25 0.000729 0.36 0.000825 0.5 0.001036 Vmx Km Km 0.001036 -0.66 0.5168

Lineweaver-Burk 1/[S] 1/V

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16.66667 11.11111 6.666667 4 2.777778 2 Vmx Km 6535.948 3067.485 2004.008 1371.742 1212.121 965.251 0.019446 6.957841

Hanes-Woolf [S] [S]/V 0.06 392.1569 0.09 276.0736 0.15 300.6012 0.25 342.9355 0.36 436.3636 0.5 482.6255 Vmx Km 0.001828 0.399141

Discusin:

Conclusiones:

Referencia: Lehninger, A.L. Principios de bioqumica. 4a edicin. Editorial Omega. Barcelona. 2005.