Informe de prcticas de Fundamentos de Microbiologa

Tincin de Gram
Antonio Ortega Jimnez Grado en Bioqumica Universidad de Sevilla

ndice Lunes 22 Creacin de medio de cultivo..2 Siembra de microorganismos..3 Martes 23 Antibiograma...4 Preparacin in vivo de levaduras.5 Tincin de Gram..6 Micoles 24 Preparacin in vivo de bacterias (movilidad)..7 Recuento de clulas viables.....8 Tincin de cpsulas..9 Jueves 25
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Tincin de PHB...10 Tincin de cido resistencia11

Prcticas de Microbiologa Lunes 22 Lunes 22 Preparacin de medio de cultivo Polipeptona Extracto de carne Sal comn Siembra de microorganismos Martes 23 Mircoles 24 Jueves 25 Viernes 26

EL MEDIO DE CULTIVO

El medio de cultivo permite el crecimiento de los microorganismos. Por tanto, debe cubrir 3 necesidades fundamentales, a saber materiales, energticas y de factores de crecimiento en auxtrofos. El medio puede ser slido o lquido, atendiendo a nuestro inters. El slido se consigue aadiendo agar, un polisacrido extrado del alga Gelidium corneum, insoluble en agua a temperatura ambiente, y que por tanto forma un gel. En resumen, un medio de cultivo es una solucin de componentes de utilidad para los microorganismos en agua. Preparacin del medio Mtodo: Los ingredientes que vamos a utilizar son polipeptona, extracto de carne, y sal comn, NaCl, cada uno en una concentracin de 5g/l. Llenaremos una probeta con 1 litro de agua, de la cual verteremos 500600 ml en un bote Pyrex. A este bote aadimos 5 gramos de los ingredientes secuencialmente, en cualquier orden, y agitando moderadamente para que se diluyan los componentes tras cada adicin. Cuando hemos aadido el ltimo, vertemos el resto del agua hasta completar el litro, con esto conseguimos facilitar la disolucin de los ingredientes. Repartimos la preparacin en 2 botes Pyrex de medio litro. En este momento, antes de la adicin del agar, es cuando mediremos el pH, pero no despus. Despus vertemos el agar, en una cantidad de 10 g (2g/100ml * 500ml) y ya tendremos nuestro medio. Solo queda autoclavar el medio para volverlo asptico. Vertemos el medio autoclavado en placas de Petri sobre las que realizaremos el cultivo. SIEMBRA DE MICROORGANISMOS Vamos a sembrar muestras de microorganismos aportados por el profesor, tanto Gram positivas como Gram negativas. Para realizar una correcta siembra debemos mantener unas condiciones de asepsia, que conseguiremos con la ayuda de un Mechero Bunsen. Adems permiten esterilizar nuestras herramientas. La siembra de las placas de Petri se realiza por zonas, con el objetivo de aislar colonias. El criterio para saber si hemos hecho una buena siembra por zonas es que, en ese caso, seremos capaces de tocar una colonia sin tocar otra.
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Material: Gram negativas Enterobacter cloacae Pseudomonas aeroginosa Escherichia coli Gram positivas Bacillus megaterium Micrococcus luteus Mtodo: Placas de Petri: Extraemos biomasa de los cultivos con el asa y la inoculamos en la placa, repartiendo por un sector circular. Flameamos, dejamos enfriar, rotamos un cuarto de vuelta la placa y a partir de la primera zona esparcimos las bacterias por una segunda zona. Flameamos, enfriamos y otra vez rotamos un cuarto de vuelta y esparcimos. La 4 zona tender al centro y no tocar ninguna de las 2 primeras. Con este mtodo reducimos la concentracin de bacterias en cada zona. Caldo: Flameamos el asa, extraemos biomasa, abrimos la probeta, flameamos la boca, mojamos el asa en el caldo, flameamos la boca, cerramos y flameamos el asa. Agar inclinado: Similar al caldo, pero en vez de mojar, moveremos el asa en zig-zag por la superficie del agar suavemente, cubriendo el mximo. Agar recto: Con la aguja. Tras esta operacin ponemos todos los cultivos en la incubadora, reparando en poner la placa de Petri boca abajo, para evitar que los gases emitidos empaen la tapa. Asimismo rotularemos en la placa en s, no en la tapa para evitar confusiones. Resultado: De momento no consigo aislar bacterias en las placas de Petri, sin embargo en los dems cultivos si obtuve buenos resultados. En el agar inclinado observo colonias en zig-zag, en el recto se ve el trazo de la aguja al penetrar el agar y en el caldo la turbidez ha aumentado notablemente
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Klebsida pneumoniae Serratia marcensans

Bacillus cereus

Martes 23 Lunes 22 Preparacin de medio de cultivo Polipeptona Extracto de carne Sal comn Siembra de microorganismos Martes 23 Antibiograma Penicilina cido nadixlico Preparacin in vivo de levadura S.Cerevisiae Tincin de Gram ANTIOBIOGRAMA El antibiograma sirve para ver qu antibiticos son ms eficaces contra una determinada bacteria. Material: B.cereus Mtodo: De nuestro caldo extraemos 100 l (tengamos en cuenta que hay entre 10 y 10 bacterias por ml) con una pipeta automtica y suelto la gota en la placa de Petri. Extiendo la gota por toda la superficie con la esptula, esterilizada con el Bunsen y alcohol. Una de las cajas se cierra y se guarda como control, mientras que a la otra le colocamos 2 discos de antibiticos. Yo puse penicilina y cido nalidxico. Resultado: Mircoles 24 Jueves 25 Viernes 26

Halo de antibitico NA

Csped control

La placa control desarrolla un csped que cubre casi toda la placa, mientras que la placa con antibiticos experimenta lo siguiente: alrededor del cido nalidxico tengo un halo bastante apreciable, mientras que la penicilina no ha surtido efecto, de lo que deduzco que B.cereus es resistente a penicilina pero no al cido nalidxico. OBSERVACIN DE LEVADURAS Vamos a intentar observar al microscopio clulas de levaduras (eucariotas), fcilmente observables debido a su mayor tamao Material: Saccharomyces cerevisiae Mtodo: Colocamos un porta encima de un apoyaportas en una ensaladera. Vertemos unas gotas de agua y con el asa ponemos un poco de biomasa de la levadura.. Extendemos, tambin con el asa. Para teir usaremos azul de metileno durante 1 minuto y para asegurarnos de que alcanza a todo el cultivo, extendemos otra vez. Le ponemos el cubre y vamos al microscopio a 100 aumentos con el aceite de inmersin. Resultado: Podremos ver principalmente 2 tipos de clulas. Por un lado azules, que no han expulsado el colorante porque estn muertas, y por el otro, las que siguen blancas porque estn vivas y han expulsado el colorante.

TINCIN DE GRAM Se trata de una tincin diferencial, que me permite distinguir entre bacterias Gram negativas (rosa) y Gram positiva (violeta). Material: Enterobacter cloacae Mtodo: A)Preparacin de la muestra En nuestro porta colocamos 2 o 3 gotas de agua. Luego ponemos la Gram negativa que elegimos (E. cloacae), flameamos el asa y pondremos la Gram positiva (B. megaterium), de manera que se mezclen ambas bacterias. Extendemos de extremo a extremo y secamos la muestra con el mechero Bunsen. Adems fijaremos las bacterias al cristal para evitar que se vayan con la tincin, pasando levemente por el fuego 3 veces. B)Tincin de Gram Aplicamos cristal violeta 1 minuto y eliminamos el exceso. Aadimos lugol, un mordiente, durante 30 segundos. Con esto estabilizamos el cristal violeta en las clulas. Lavamos con agua abundante. Seguidamente aplicamos alcohol de 96 durante 15 segundos exactos con el objetivo de desteir totalmente las Gram negativa y mantener el colorante en las Gram positivas. A los 15 segundos lavamos con agua muy abundante para garantizar que se detiene el proceso de destincin. Ahora coloreamos las Gram negativas con safranina, colorante rosa, durante 1 o 2 minutos. Lavamos con agua y secamos. Vamos al microscopio con 100 aumentos. Resultado: Distingo perfectamente las colonias de B. megaterium, teidas de azul y E. cloacae en rosa. Bacillus megaterium

Mircoles 24 Lunes 22 Preparacin de medio de cultivo Polipeptona Extracto de carne Sal comn Siembra de microorganismos Martes 23 Antibiograma Penicilina cido nadixlico Mircoles 24 Observacin in vivo de E. coli (Movilidad Bacteriana) Jueves 25 Viernes 26

Preparacin in Recuento de vivo de levadura clulas S.cerevisiae viables Tincin de Gram Tincin de cpsulas

OBSERVACIN IN VIVO DE E. coli. MOVILIDAD Vamos a hacer un experimento de movilidad bacteriana, intentaremos observar el movimiento de las bacterias por la preparacin. Material: E. coli

Mtodo: Lo ms importante es reducir la agitacin de la probeta de E. coli para mantener los flagelos de la bacteria y observar ms movimiento. Simplemente colocaremos unas gotas del caldo en un porta con el asa. Lo cubrimos y vamos al microscopio con un 100 aumentos y una luz tenue. Es muy importante el enfoque. Resultado: No consegu observar mucha movilidad pero s que apreci un movimiento aleatorio. Tras unos minutos se produce el corrimiento por agua debido a que la muestra se seca.
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RECUENTO DE CLULAS VIABLES En los cultivos bacterianos se estima que hay entre 10 y 10 bacterias/ml. Esta enorme densidad de poblacin me impide contar con exactitud cuantas bacterias tengo. Sin embargo podemos arreglarlo diluyendo nuestro cultivo en un factor de dilucin que me simplifique el recuento. El factor de dilucin aplicado en cada dilucin se obtiene haciendo el cociente FD=volumen total/volumen aadido, La cantidad contada en una placa, multiplicada por el FD me dar la cantidad de clulas en el cultivo. Puesto que me interesa alcanzar una cantidad de bacterias en la placa de 100 y parto de 10/10 tengo que usar un FD concreto. El FD global que necesito sobre mi muestra viene dado por la expresin FD=n de clulas estimadas/n de clulas que quiero contar en este caso FD=10/10=10. Material: E. coli Mtodo: Para hacer las diluciones nos servimos de tubos Eppendorf y pipetas automticas de 900 l para llenarlos de agua estril y de 100 l para poner la muestra. Calculamos dos FD alternativos que aplicar al cultivo, 10 y 10 . Disponemos 6 tubos Eppendorf y vamos diluyendo con cada tubo en un FD de 10. En las placas ponemos las diluciones de FD=10^5 y FD=10^6 y guardamos. Resultado: Utilizamos las placas de FD=10^7 porque las placas menos diluidas tenan un nmero de bacterias demasiado alto. Contabilizamos en las 4 placas 130, 177, 59 y 54 colonias, una segregacin anmala, por lo que solo
Placa de 53 colonias, demasiado poco y descartada

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tendremos en cuenta las 2 primeras para hacer la media aritmtica que resulta ser 153.5. Por tanto la poblacin del cultivo era 153.5 * 10^7 o 1.53 *10^9 clulas/ml. TINCIN DE CPSULAS Trataremos de ver, por tincin negativa, la cpsula de K. pneumoniae, en un medio de agar glucosado que favorece la formacin de cpsula, al igual que todos los medios ricos en carbono y pobres en nitrgeno. Existen 2 mtodos, inicialmente similares, describir solo el primero porque es el usado. Material: Klebsiella pneumoniae Mtodo: En un porta con unas gotas de agua extendemos nuestra muestra de K. pneumoniae y dejamos secar. Aadimos colorante de azul metileno y dejamos teir 2 minutos. Tiramos el exceso a la ensaladera y secamos. Con esto teimos el interior de la bacteria. Luego aadimos 40 ml de Nigrosina, un colorante muy negro, en un extremo del porta y la extendemos hasta el otro extremo cubriendo todo, con esto consigo colorear el fondo y que solo permanezca sin teir la cpsula. Observamos al microscopio con 100 aumentos. Resultado: El interior de la bacteria no se ha teido apenas de azul, pero se pueden ver cpsulas blancas contra el fondo grisceo de la nigrosina. Importante: Si vamos a usar un bote de tinta muy negra que mancha mucho no se debe dejar en la gradilla sin la tapa ni un momento porque puede tambalearse, caerse y manchar la mesa de trabajo.
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Acmulo de cpsulas

Jueves 25 Lunes 22 Preparacin de medio de cultivo Polipeptona Extracto de carne Sal comn Siembra de microorganismos Martes 23 Antibiograma Penicilina cido nadixlico Preparacin in vivo de levadura S.cerevisiae Tincin de Gram Mircoles 24 Jueves 25 Viernes 26

Observacin Tincin de poli- Examen in vivo de E. a las coli hidroxibutirato 11:00 (Movilidad Bacteriana) Recuento de Tincin de cido clulas resistencia viables Tincin de cpsulas Tincin de endospora

TINCIN DE POLI--HIDROXIBUTIRATO Nuestro objetivo es observar las inclusiones de PHB en Gram positiva. Las inclusiones de PHB son creadas por las bacterias como almacn de carbono cuando el medio ofrece ms de lo que necesitan.
PHB

Material: Bacillus megaterium Mtodo: Tras preparar una muestra de nuestro bacilo en un porta y haberlo fijado con los procedimientos anteriormente descritos empezamos la tincin. El primer colorante es negro sudn durante 4 minutos para teir las inclusiones. Lavamos con agua y aplicamos safranina durante 2-2 minutos y medio. Lavamos con agua, secamos y vamos al microscopio Resultado: Se aprecia dentro de algunos bacilos estructuras teidas de negro que
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corresponden a las inclusiones de PHB. TINCIN DE CIDO RESISTENCIA Esta es una tincin diferencial porque distingue entre bacteria cido resistente AR+ y no cido resistente o AR-. Necesitaremos un hisopo Material: Mycobacterium Phlei (AR+) Mtodo: Preparamos el porta con una muestra de ambas bacterias mezcladas y fijadas. Vertemos la fucsina fenicada y la flameamos hasta que empiecen a salir vapores, durante 5 minutos y enjuago. Con alcohol clorhdrico durante 15 segundos (cido) destio las clulas AR-. Lavo con agua abundante y aplico un colorante de contraste como el azul de metileno durante 1-2 minutos. Lavo, seco y miro al microscopio. Resultado: Las clulas cido resistentes aparecen teidas del rojo de la fucsina y las cido resistentes de azul. TINCIN DE ENDOSPORA. No realizada Bacillus megaterium (AR-)

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