Universidade do Estado do Rio de Janeiro

FACULDADE DE TECNOLOGIA ENGENHARIA DE PRODUO DEPARTAMENTO DE QUMICA E AMBIENTAL

MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

APOSTILA DAS AULAS PRTICAS

Professora Denise Celeste G. de A. Rodrigues

ndice
1. Consideraes Gerais sobre Segurana no Laboratrio .............................................. 1 1.1. Noes de Biossegurana ....................................................................................... 1 1.2. Normas de segurana no laboratrio de microbiologia ............................................ 5 2. Preparao de culturas microbianas ............................................................................... 7 2.1. Procedimentos asspticos: ...................................................................................... 7 3. Aula prtica 01: Presena de Microrganismos no Ambiente .........................................10 3.1. Preparo de meio nutriente em Placas de Petri.........................................................10 3.2. Exposio das placas a diferentes ambientes..........................................................11 3.3. Relatrio ...............................................................................................................11 4. Consideraes Gerais sobre Desinfeco e Esterilizao ..............................................12 4.1. Esterilizao:.........................................................................................................12 4.1.1. Esterilizao por calor seco (Estufa ou forno de Pasteur) ................................13 4.1.2. Esterilizao pelo Calor mido ......................................................................14 5.1.3. Controle da Esterilizao ................................................................................15 4.2. Desinfeco...........................................................................................................16 4.2.1. Desinfeco por agentes fsicos: .....................................................................16 4.2.2. Desinfeco por agentes qumicos: .................................................................16 5. Aula prtica 02: Desinfeco........................................................................................20 5.1. Identificao das Placas de Petri............................................................................20 5.2. Desinfeco das mos e inoculao das Placas de Petri..........................................20 5.3. Relatrio ...............................................................................................................21 6. Aula prtica 03: Testando produtos de limpeza ..........................................................22 6.1. Procedimento ........................................................................................................22 6.2. Relatrio ...............................................................................................................22 7. Microscopia .................................................................................................................23 8. Aula prtica 04: Microscopia a Fresco..........................................................................26 8.1. Sem corante...........................................................................................................26 8.2. Com corante ..........................................................................................................26 8.3. Com outras culturas...............................................................................................27 8.4. Relatrio ...............................................................................................................27 9. Aula prtica 05: Microscopia de Gram .........................................................................28 9.1. Esfregao de cultura bacteriana slida: ..................................................................28 9.2. Adio de Corantes: ..............................................................................................28 9.3. Relatrio ...............................................................................................................29 10. Aula prtica 06: Inoculao de uma cultura de leveduras por espalhamento em meio slido...............................................................................................................................30 10.1. Preparao de uma srie de diluies decimais de uma cultura de leveduras ........30 10.2. Inoculao de uma cultura de leveduras por espalhamento em meio slido ..........32 10.3. Relatrio .............................................................................................................33 11. Aula prtica 07: Isolamento de microrganismos de tecido vegetal ..............................34 11.1. Desinfeco superficial........................................................................................34 11.2. Inoculao e incubao........................................................................................34

11.3. Relatrio .............................................................................................................34 12. Aula prtica 08: Isolamento de microrganismos do ar.................................................35 12.1. Exposio das placas mtodo da sedimentao .................................................35 12.2. Relatrio .............................................................................................................35 13. Aula prtica 09: Estragando o mingau ........................................................................36 13.1. Procedimento ......................................................................................................36 13.2. Relatrio .............................................................................................................36 14. Aula prtica 10: Microrganismos em Processos Biotecnolgicos................................37 14.1. Procedimento ......................................................................................................37 14.2. Relatrio .............................................................................................................37 15. Confeco dos relatrios ............................................................................................38

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

1. Consideraes Gerais sobre Segurana no Laboratrio

A segurana num laboratrio de microbiologia envolve implementao de procedimentos particulares, associados s metodologias necessrias para manipular culturas microbianas. Por um lado, devido s reduzidas dimenses das clulas, que para ns so imperceptveis, e por outro, pela necessidade de trabalhar com culturas celulares puras e/ou impuras, as quais podem conter um nmero elevadssimo de clulas microbianas. Em qualquer espao laboratorial, os procedimentos realizados devem incluir o cumprimento de regras de funcionamento, de medidas de segurana obrigatrias e o manuseamento correto e cuidadoso do material, dos reagentes qumicos e do equipamento laboratorial. Atender a estes princpios contribui para a preveno de acidentes e para impedir a existncia de fontes de contgio ou de perigo no local de trabalho.

1.1. Noes de Biossegurana

Conceitos de biossegurana:

Condio de segurana alcanada por um conjunto de aes destinadas a prevenir, controlar, reduzir ou eliminar riscos inerentes s atividades que possam comprometer a sade humana, animal e vegetal e o meio ambiente. (Comisso de Biossegurana em Sade, 2002) o conjunto de aes voltadas para preveno, minimizao ou eliminao de riscos inerentes s atividades de pesquisa, produo, ensino, desenvolvimento tecnolgico e prestao de servios, as quais possam compromete a sade do homem, dos animais, das plantas, do ambiente ou a qualidade dos trabalhos desenvolvidos. (Comisso de Biossegurana da Fundao Oswaldo Cruz, 2003) Os acidentes em laboratrios de microbiologia envolvem risco biolgico em contrair infeces por microrganismos patognicos. Esto sujeitos a estas infeces desde
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

os tcnicos, pesquisadores, at o pessoal da limpeza e lavagem de materiais de laboratrio, podendo ocorrer atravs: da pele - projeo de culturas microbianas sobre a pele escoriada, picadas de agulhas contaminadas, mordida de animais inoculados, etc. das vias digestivas e mucosa bucal - ingesto de alimentos e bebidas durante o trabalho, insuficiente desinfeco das mos antes de comer ou fumar, etc. das vias respiratrias e mucosa nasal - aspirao de aerossis contaminados, projeo de culturas contaminadas, etc. dos olhos e ouvidos - projeo de culturas microbianas, insuficiente desinfeco das mos, etc. Os agentes biolgicos responsveis pelas infeces laboratoriais so classificados em grupos de risco, baseado nos seguintes fatores: Capacidade patognica do agenteModo de transmisso e hospedeiros susceptveis - pode depender dos nveis de imunidade, da densidade populacional, da presena de vetores apropriados e das normas de higiene ambiental Disponibilidade de medidas de preveno eficazes - profilaxia (vacinas e soros); luta contra reservatrios de artrpodes vetores e importao de animais ou produtos de animais infectados Disponibilidade de tratamento eficaz - imunizao passiva e vacinao (exposio); administrao de antibiticos e quimioterapia

Empregando-se tais critrios tem-se a seguinte classificao dos agentes biolgicos por grupo de risco: Grupo de Risco 1 (riscos: individual e comunitrio baixo) Microrganismos com pouca probabilidade de provocar doenas humanas ou doenas de importncia veterinria nos animais. Grupo de Risco 2 (riscos: individual moderado e comunitrio limitado)

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

Microrganismos que podem provocar doenas humanas ou enfermidade animais, mas que possuem poucas possibilidades de causar um risco grave para: pessoal de laboratrio, comunidade, agropecuria e meio ambiente. Exemplos: bactrias (clostrdios, salmonelas); parasitas (toxoplasmas, girdias) e vrus (enterovrus, vrus da influenza) Grupo de Risco 3 (riscos: individual elevado e comunitrio baixo) Microrganismos que provocam doenas graves em humanos, mas que no se propagam de uma pessoa infectada outra. Tratamento e medidas preventivas eficazes. Exemplos: Mycobacterium tuberculosis, vrus da raiva Grupo de Risco 4 (riscos: individual e comunitrio elevados) Microrganismos que provocam enfermidades graves em humanos e podem propagar-se de um indivduo a outro, direta ou indiretamente. No existe tratamento, vacinas e medidas preventivas eficazes disponveis. Exemplos: febre hemorrgica, Congo-Crimean Classe de risco especial (riscos: alto risco de causar doena animal grave e de disseminao no meio ambiente): Inclui agentes biolgicos de doena animal no existentes no Pas e que, embora no sejam obrigatoriamente patgenos de importncia para o homem, podem gerar graves perdas econmicas e/ou na produo de alimentos. Exemplos: Vrus da influenza A aviria ; Vrus da peste eqina africana As aes a serem implementadas, visando a biossegurana, compreendem medidas: educacionais treinamento individual e coletivo administrativas estrutura organizacional, organizao e mtodos, sistemas de documentao tcnicas - programa de garantia e controle de qualidade, programa de preveno de acidentes, sistemas de documentao mdicas programa de medicina ocupacional

Na tabela 1 encontram-se algumas recomendaes para os nveis de biossegurana.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

TABELA 1: SUMRIO DAS RECOMENDAES DOS NVEIS DE BIOSSEGURANA POR AGENTES INFECTANTES Nvel de Tcnicas e Prticas Equipamentos de Segurana Instalaes Biossegurana 1 Boas prticas de laboratrio microbiolgico (aventais, no pipetar com a boca, autoclavar materiais infectantes) Prticas do nvel 1, mais: *descontaminao de todos os resduos infectantes *limitado acesso *proteo com luvas e sinalizao de biossegurana *manipulao de seringas, agulhas *manipulao de biossegurana Idem ao nvel 2, mais *aventais especiais e acesso controlado com mais rigor Equipamentos bsicos *bancadas que permitem limpeza adequada *sala com porta *autoclave, etc Requisitos do nvel 1, mais: *cmara de fluxo laminar de segurana biolgica classes I e II, para conduzir procedimentos e manipular amostras com alto potencial de produzir aerossis *luvas, mscaras especiais para amostras com exposio ocupacional aumentada *sinalizaes Requisitos do nvel 2, mais: *sinalizao especial, luvas e mscaras *cmara de fluxo laminar pra toda manipulao do agente *linhas de vcuo protegidas com filtro *dupla porta de segurana Requisitos do nvel 3, mais: *cmara de fluxo laminar classe III, em combinao com presso positiva na sala e roupa especial com respirador artificial, para todos os procedimentos e atividades bsica

bsica

Prticas do nvel 3, mais: *entrada aps troca de roupa especial na sala e remoo especial de resduos *banho antes de sair e todos os resduos so descontaminados antes de sair das instalaes

Requerem instalaes especiais: *salas com presso negativa *exausto para fora Requisito mximo de segurana (chuveiro na sala, etc)

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

1.2. Normas de segurana no laboratrio de microbiologia

01- O uso do guarda-p obrigatrio. 02- Cabelos longos devem ser amarrados de forma a no interferir com reagentes e equipamentos. 03- Limpar e desinfetar a superfcie das bancadas antes e depois de cada aula prtica. 04- Limpar a bancada de trabalho convenientemente com lcool etlico a 70% (v/v) e manter o material em ordem 05- Lavar e sanitizar as mos ao iniciar a anlise, ao sair do laboratrio e sempre que for necessrio. Se for portador de algum ferimento nas mos, procurar no tocar no material. 06- Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a anlise. 07- No manuseio de compostos qumicos considerados perigosos, evitar o contato cutneo ou a sua inalao, recorrendo ao uso de luvas, mscara ou culos de proteo, consoante as caractersticas dos compostos. 08- No pipetar com a boca. 09- Estabelecer regras bem definidas para o circuito do material de vidro e de plstico no laboratrio, assim como para a sua lavagem. 10- Manusear com muita precauo certos materiais e aparelhos frgeis e/ou muito sensveis e mant-los devidamente limpos. 11- Utilizar exclusivamente material estril para a anlise. 12- No caso de derramamento do material contaminado, proceder imediatamente a desinfeco e esterilizao. O mesmo procedimento dever ser repetido se ocorrer ferimentos ou cortes. 13- No comer, beber ou fumar no laboratrio. 14- Manter canetas, dedos e outros longe da boca. 15- No utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho. 16- Avisar ao professor em caso de contaminao acidental. 17- Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais deixando-o sobre a bancada. 18- Flambar as alas, agulhas e pinas antes e aps o uso.
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

19- Os cultivos aps a leitura devem ser esterilizados, portanto no os colocar na estufa ou despejar na pia. 20- Ao acender o Bico de Bunsen, verificar se no h vazamento de gs ou substncias inflamveis por perto. 21- Manter os bicos de Bunsen e as lamparinas acesas apenas enquanto so necessrios. 22- Trabalhe sempre prximo ao fogo.

OBS: A utilizao do Bico de Bunsen essencial, pois visa a diminuio de microrganismos no campo de trabalho atravs do calor. Para isso ele apresenta uma regulagem que torna possvel selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da Microbiologia deve ser utilizada a chama azul porque esta atinge maior temperatura e no forma fuligem. importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato importante para que o processo de flambagem seja executado adequadamente, j que certas zonas da chama devem ser evitadas. As zonas da chama so: Zona Neutra ( uma zona fria e, portanto, no deve ser utilizada para flambagem), Zona Redutora e Zona Oxidante (so zonas onde j ocorre a combusto e, portanto, j podem ser usadas para a flambagem). (Figura 1).

Figura 1

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

2. Preparao de culturas microbianas

A preparao de culturas microbianas, e em particular a inoculao da espcie ou espcies microbianas que pretendemos fazer crescer, envolve uma srie de procedimentos asspticos que devero ocorrer em condies apropriadas.

2.1. Procedimentos asspticos:

H certas precaues que devem ser tomadas durante a inoculao de uma cultura microbiana de modo a evitar a contaminao das culturas, das pessoas ou do ambiente: Certificar-se de que ao dar incio s operaes, todo o material necessrio est ao alcance imediato, de forma a realizar o trabalho o mais rapidamente possvel. Desinfetar com soluo apropriada e arrumar convenientemente a bancada de trabalho. Os recipientes devem permanecer abertos o mnimo tempo possvel e, enquanto abertos, todo o trabalho deve ser realizado junto chama do bico de Bunsen. Uma vez abertos os recipientes, como tubos, bales e frascos, o seu bocal deve ser flamejado de imediato. A fim de evitar as contaminaes durante as manipulaes que envolvam placas de Petri, a exposio das superfcies internas estreis deve durar o mnimo de tempo possvel. A extremidade da pipeta estril que vai ser colocada em contacto com as culturas celulares, ou com os recipientes estreis, no deve ser tocada nem entrar em contato com superfcies no estreis, como o caso da roupa, superfcie da rea de trabalho, o exterior de tubos, de bales ou quaisquer outros materiais.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

A utilizao das alas, pipetas e espalhadores, assim como a manipulao de frascos e tubos de ensaio, em condies de assepsia, envolve alguns cuidados particulares:

- Alas As alas so esterilizadas pela passagem na chama do bico de Bunsen, antes e depois de serem utilizadas. Devem ser aquecidas at ficarem ao rubro para assegurar que todos os esporos sejam destrudos. Devem ser agarradas quase pelo topo num ngulo praticamente vertical. O dedo mindinho deve ficar livre para segurar a tampa do recipiente.

- Pipetas Para transferir culturas, meios e solues estreis deve-se utilizar pipetas graduadas ou pipetas Pasteur estreis de acordo com as normas descritas a seguir: 1. Remover a pipeta de vidro do pacote pela extremidade que contm o tampo de algodo, tendo o cuidado para no tocar mais do que o necessrio de modo a segurar firmemente. 2. Colocar a pro-pipete. 3. Segurar a pipeta como uma caneta, mas no apertar a pro-pipete. O dedo mindinho deve ficar livre para segurar na rolha de algodo/ tampa do tubo/ frasco. 4. Apertar a pro-pipete com cuidado e retirar a quantidade de fluido necessria, mas que no atinja nem molhe o tampo de algodo. 5. Colocar a pipeta usada num contentor de plstico com desinfetante, devidamente identificado para esse fim. 6. A pro-pipete no deve ser retirada at a pipeta estar dentro do contentor de plstico, de modo a evitar que gotas de cultura contaminem a superfcie de trabalho.

- Frascos, bales e tubos de ensaio Quando se pretende manipular frascos, bales ou tubos de ensaio em condies asspticas deve-se proceder do seguinte modo: 1. Desapertar a tampa dos frascos/bales ou tubos de ensaio de modo a poder ser retirada facilmente. 2. Segurar o frasco/ tubo com a mo esquerda. 3. Retirar a tampa/ rolha de algodo com o dedo mindinho da mo direita.
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

4. No pousar a tampa/ rolha de algodo. 5. Flamejar o gargalo do frasco/ tubo fazendo-o passar pela chama do bico de Bunsen. 6. Recolocar a tampa do recipiente.

- Espalhadores Os espalhadores, ou alas de Drigalski, so usados para distribuir inculos sobre a superfcie de placas j preparadas com meios de cultura. Podem ser esterilizados em estufa uma vez empacotados, ou por flamejao com lcool.

- Esterilizao com lcool A esterilizao de espalhadores com lcool envolve os seguintes procedimentos: 1. Mergulhar a extremidade do espalhador num pequeno volume de lcool a 70% (v/v) contido num recipiente com tampa ou coberto com papel de alumnio. 2. Passar rapidamente atravs da chama do bico de Bunsen; o lcool vai arder esterilizando o vidro. 3. Afastar o espalhador ligeiramente da chama at o lcool parar de arder. 4. Pousar o espalhador numa superfcie estril como uma caixa de Petri ou um copo graduado.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

3. Aula prtica 01: Presena de Microrganismos no Ambiente

Objetivos: Mostrar a diversidade de culturas microbianas existentes no ambiente e familiarizar-se com o preparo de meios de cultura.

3.1. Preparo de meio nutriente em Placas de Petri

1. Esterilizao das placas de petri: deve-se esteriliz-las secas e limpas, embrulhadas em papel manilha ou semelhante, em autoclave, a 1 atm por 20 min.

2. Preparo do meio gar nutriente (seguir as especificaes do fabricante): Pesar a quantidade adequada de gar nutriente em erlenmeyer de 250 mL Adicionar a quantidade de gua destilada necessria. Levar o conjunto ao banho-maria at dissoluo do gel. A seguir o gar colocado em recipiente prprio para esterilizao e tampado Autoclavar o meio nutriente por 15 min.

3.Aps a esterilizao deixar o gar esfriar, em temperatura ambiente, at que se consiga segurar o frasco com as mos, sem queim-las.

4.Verter o meio nas placas assepticamente, prximo chama.

5.Deixar o gar solidificar em temperatura ambiente e depois estocar adequadamente as placas, para posterior utilizao.

OBS: as placas devem ser estocadas e/ou incubadas sempre invertidas, para que qualquer condensado, por ventura formado, no se misture ao meio de cultura.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

10

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

3.2. Exposio das placas a diferentes ambientes

1. Expor placas de Petri contendo gar nutriente a uma das seguintes condies: Manter uma delas aberta durante 15 minutos em um ambiente qualquer (banheiro, sala de aula, cantina, etc) Em outra placa, tocar os dedos no material nutriente ou expor ao contato de materiais tais como: fio de cabelo, solo, p de giz, etc. Falar ou tossir sobre o meio de cultura da terceira placa Manter uma placa sem exposio, para servir como controle.

2. Identificar as placas, anotando na tampa o tipo de exposio a que foram submetidas, data, grupo, etc

3. Na estufa, incubar as placas na posio invertida temperatura de 30C por sete dias. Observar as placas diariamente fazendo anotaes quando necessrio. No esquecer de anotar a composio do meio de cultura utilizado.

4. Aps a utilizao das placas estas devem ser esterilizadas na autoclave, antes do material ser descartado, e limpas.

3.3. Relatrio
1. Avaliar a presena de colnias, sua abundncia e diversidade e compar-la com a dos outros grupos e com o controle. 2. Pesquisar em livros ou na internet outros meios de cultura existentes para o cultivo e armazenamento de microrganismos.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

11

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

4. Consideraes Gerais sobre Desinfeco e Esterilizao

ESTERILIZAO : Processo que visa a destruio total de todas as formas de vida de um material ou ambiente, atravs de mtodos fsicos ou qumicos.

DESINFECO : Consiste na destruio, remoo ou reduo dos microrganismos presentes num material inanimado. Visa eliminar a potencialidade infecciosa do objeto, superfcie ou local.

ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar o retorno da contaminao a um objeto, superfcie ou local.

ANTI-SEPSSIA: Desinfeco de tecidos vivos, como pele e mucosas. Pode ser feita, por exemplo, atravs do Clorexidine a 0,12% para anti-sepsia intra bucal.

LIMPEZA: Remoo de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos de desinfeco ou esterilizao.

4.1. Esterilizao:
A melhor maneira de garantirmos a destruio de microrganismos presentes em instrumentos e equipamentos mediante o uso do calor. A maioria dos microrganismos que causam infeces em seres humanos desenvolve-se em temperaturas prximas a do corpo, ou seja, 37C. Assim, ao serem expostos a altas temperaturas, so destrudos; o que no acontece quando os colocamos em contato com baixas temperaturas, pois nesse caso o microrganismo fica apenas inibido, e no destrudo. Alguns microrganismos produzem esporos, que so formas de resistncia, podendo permanecer inativos por longos perodos e depois voltar ao estgio inicial de infectividade, 12

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

portanto as tcnicas de esterilizao devem destruir tanto a clula bacteriana, como os esporos. Existem diversos mtodos de esterilizao: Fsicos ou Qumicos. Os mtodos de esterilizao mais empregados em laboratrio so os que utilizam o calor, seja este mido (autoclave) ou seco (estufa, ou forno de Pasteur), sendo que o desempenho do calor mido (autoclave) melhor.

4.1.1. Esterilizao por calor seco (Estufa ou forno de Pasteur) Este tipo de esterilizao realizado a temperaturas de 140C a 180C, com tempo de exposio de 60 a 120 minutos em estufas eltricas equipadas com termostatos. O calor seco ou ar quente em temperatura suficientemente alta levam a desnaturao e oxidao das protenas, que resultam na morte dos microrganismos. A utilizao do calor seco leva mais tempo que o calor mido, mas como existem materiais que no podem ser esterilizados no calor mido, o calor seco o preferido. indicado para esterilizar vidrarias, instrumentos de corte ou de ponta, os quais podem oxidar na presena do vapor da autoclave, e materiais impermeveis como ceras, pomadas e leos. Para ser eficiente, este processo depende de: Aquecimento da estufa at a temperatura desejada antes da colocao do material. Os materiais devem estar rigorosamente limpos e adequadamente embalados. A colocao do material deve permitir a circulao do ar, portanto a estufa no pode estar abarrotada de material. Deve ser mantida uma distncia de 2 cm entre os objetos. O tempo de esterilizao deve ser contado apenas aps a colocao do material na estufa, e a partir do momento em que a temperatura foi atingida novamente.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

13

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

4.1.2. Esterilizao pelo Calor mido O calor mido pode ser utilizado para destruir microrganismos presentes em materiais atravs das formas de: vapor dgua, gua fervente e gua aquecida abaixo de seu ponto de ebulio.

- gua fervente a gua levada ao ponto de ebulio: 100C, este procedimento destri os microrganismos vegetativos presentes no meio lquido. Entretanto, os materiais ou objetos contaminados no so esterilizados com segurana pois alguns esporos bacterianos podem resistir a 100C por mais de 1 hora.

- Vapor dgua O vapor dgua sob presso a mais prtica e segura aplicao do calor mido. O aparelho destinado a este fim a AUTOCLAVE. um processo mais eficiente para destruir os microrganismos e os esporos, que o calor seco. A autoclavao feita a 121 C com tempo de exposio de 15 a 30 minutos. A penetrao do vapor no material garante maior nvel de destruio dos microrganismos, e por este motivo mais rpido. Funcionamento da autoclave: 1A cmara de parede dupla da autoclave lavada com vapor fluente para remover todo o ar; 2 ento preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada temperatura e presso por um perodo especfico de tempo. essencial que todo o ar residual inicialmente presente na cmara seja completamente substitudo por vapor dgua, porque se o ar estiver presente reduzir a temperatura interna da autoclave; 3A autoclave usualmente operada a uma presso de 15 lb./pol , na qual a temperatura do vapor de 121C.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

14

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

A eficincia do processo de esterilizao em autoclaves depende de alguns fatores: Os materiais devem ser limpos antes do processo, sendo adequadamente embalados. O tempo deve ser contado a partir do momento em que a temperatura de 121C atingida. A distribuio do material no interior da autoclave deve garantir que o vapor atinja todo o material por igual. Se o material sair mido da autoclave indica falhas no processo, neste caso deve ser novamente esterilizado.

5.1.3. Controle da Esterilizao

imprescindvel o controle de qualidade nos processos de esterilizao. Como se trata de um processo que inclui diversas variveis (tempo, temperatura, limpeza prvia, conhecimento da pessoa responsvel pelo processo, etc), se qualquer destas variveis for negligenciada, o processo no ser efetivo e o risco de contaminao eminente. O controle deve ser realizado atravs de mtodos qumicos e bacteriolgicos. Os mtodos qumicos utilizam uma fita especial que mostra, atravs da mudana de cor, se a temperatura desejada foi atingida. Os mtodos bacteriolgicos utilizam a bactria chamada Bacillus subtilis, que por ser produtora de esporos, uma eficiente indicadora da qualidade do processo. Este controle deve fazer parte da rotina do laboratrio para garantir a segurana de toda a equipe.

Consideraes importantes:

1. importante lembrar que necessria uma limpeza perfeita do material antes de serem submetidos esterilizao. A presena de matria orgnica (leo, gordura, pus, sangue, e outras secrees) protege o microrganismo da ao esterilizante. adequado lavar manualmente o material com detergente e gua morna antes da esterilizao.
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

15

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

2. Depois de esterilizados, os materiais devem ser conservados em embalagens apropriadas, caso contrrio voltam a se contaminar com microrganismos presentes no ambiente.

4.2. Desinfeco
Este processo pode ser realizado de forma fsica (Pasteurizao) e qumica (desinfetantes), e pode ser classificado como sendo uma desinfeco de alto, intermedirio ou de baixo nvel, dependendo da quantidade de microrganismos inativados. 1- Desinfeco de alto nvel: inativa todos os microrganismos, exceto esporos. Ex: HBV, HIV e M. tuberculosis. 2- Desinfeco de nvel intermedirio: aquela que inativa bactrias na forma vegetativa (M. tuberculosis), fungos e a maioria dos vrus. 3- Desinfeco de baixo nvel: inativa a maioria das bactrias na forma vegetativa, exceto M. tuberculosis, alguns fungos e vrus.

4.2.1. Desinfeco por agentes fsicos: Temperaturas abaixo de seu ponto de ebulio (100 C) Pasteurizao: o aquecimento lento a baixas temperaturas, suficiente para eliminar as clulas vegetativas de microrganismos, mas no os esporos, portanto, um mtodo de desinfeco de alto nvel. indicado o uso de temperatura de 77C por 30 minutos.

4.2.2. Desinfeco por agentes qumicos: a) Mtodo de Desinfeco de alto nvel:

Glutaraldedo : indicado para qualquer objeto sensvel ao calor, e para rpida desinfeco de itens reutilizados. utilizado em soluo a 2% com pH alcalino (7,5-8,5) por 30 minutos.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

16

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

Formaldedo: Pode ser encontrado na forma slida (pastilhas formalina) ou como soluo aquosa 37-40% (diludo em lcool ou gua). A soluo deve ser usada por30 minutos sendo a concentrao de 8% em soluo alcolica e 10% em soluo aquosa.

Perxido de Hidrognio: Age em presena de matria orgnica e deve-se fazer a imerso do material em soluo com concentrao de 3-6% por 15-30 minutos.

cido Peractico: A concentrao de uso varivel para a desinfeco, sendo que o tempo de exposio deve ser no mnimo de 20 minutos.

b) Mtodo de Desinfeco de nvel intermedirio:

Compostos Clorados: Causam a inibio de reaes enzimticas intracelulares, desnaturao de protenas, e inativao de cidos nuclicos.Apresentam atividade antimicrobiana de amplo espectro, tem baixo custo e ao rpida, entretanto seu uso limitado, pois irritante, instvel por 24 horas, fotossensvel e voltil, alm de ser corrosivo para metais. Seu uso indicado para artigos de vidro e borracha, sendo contra-indicado para metais ( corrosivo). Apresenta-se na forma lquida (ex: Hipoclorito de sdio) e na forma slida (ex: Hipoclorito de Clcio), e o tempo de exposio dos artigos a estes compostos de aproximadamente 10 minutos.

lcoois(Etlicos e Isoproplicos): Seu mecanismo de ao atravs da desnaturao de protenas. So usados em concentrao de 70% peso por 10 minutos, para a desinfeco de superfcies. O uso destas substncias contraindicado para borracha, plsticos e acrlico.

Fenlicos: Seu mecanismo de ao atravs do rompimento da parede celular, precipitando protenas, quando usado em alta concentrao, e alterao dos sistemas enzimticos fundamentais, quando utilizado em baixa concentrao. Sua concentrao para uso de 0,4-5% sendo que o tempo de exposio deve ser menor ou igual a 10 minutos. Seu uso indicado para descontaminao de ambiente hospitalar, itens cirrgicos e mdicos no-crticos, sendo que devem ser consideradas as limitaes devido a toxicidade (hiperbilirrubinemia crianas berrios), e ao residual em materiais porosos.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

17

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

Iodforos: Sua ao atravs de seu alto poder de penetrao na parede celular, levando a ruptura de protenas. So utilizados em concentrao de 30 a 50 ppm por um tempo menor ou igual a 10 minutos.

c) Mtodo de Desinfeco de baixo nvel

lcoois Compostos Clorados Fenlicos: em concentrao menor que 5% Iodforos: em concentrao menor que 30 ppm Compostos de Amnio Quaternrio: Age atravs da inativao de enzimas, desnaturao de protenas essenciais, ruptura da membrana celular. Sua concentrao para uso de 0,4 a 0,6% por um tempo de no mnimo 10 minutos. indicado para a limpeza de ambiente hospitalar (pisos, paredes e superfcies)

Detergentes: So agentes tensoativos, com ao detergente, umectante e emulsionante. Podem ser classificados como Catinicos (p. ex. Quaternrios de Amnio), Aninicos (p. ex. sabes, detergentes sulfatados ou sulfonados), e Enzimticos. Este ltimo tem como princpio ativo enzimas proteinases, amilase e lpases, e,portanto, causam transformaes em protenas, polissacardeos e gorduras (ex: Endozime)

Na tabela 2 encontram-se os principais compostos utilizados em desinfeco e assepsia.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

18

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

Tabela 2: Principais Compostos Utilizados em Desinfeco e Assepsia

Agente lcoois (7080%) Fenis Espectro de ao* Gram-positivas Gram-negativas BAAR** Gram-positivas Gram-negativas BAAR Gram-positivas Gram-negativas Uso Antisspticos Desinfectantes Desinfectantes Modo de ao Desnaturao protica dissoluo de lipdeos Desnaturao protica Alterao da membrana celular bacteriana Tempo de exposio Curto (10-15 min) Efeito imediato Desvantagens Pouco ativo contra esporos Fenol puro corrosivo e de odor desagradvel No age sobre BAAR e esporos

Compostos Quaternrios de amnio

Cloro

Iodo

Iodforos

Aldedos***

Gram-positivas Gram-negativas BAAR Gram-positivas Gram-negativas BAAR Gram-positivas Gram-negativas BAAR Gram-positivas Gram-negativas BAAR Gram-positivas Gram-negativas

Antisspticos Sanitizantes Desinfectantes (instrumentos cirrgicos) Tratamento da gua Antisspticos Desinfectantes Antisspticos Desinfectantes Desinfectantes (instrumentos e superfcies)

Curto (10-30 min)

Inativao enzimtica agente oxidante Inativao enzimtica Inativao enzimtica Desnaturao protica agente alquilante

Efeito imediato

Odor irritante pouco ativo contra esporos Odor irritante pouco ativo contra esporos Pouco ativo contra esporos

Efeito imediato

Efeito imediato

Metais pesados

*- Formas vegetativas; **- Bacilos lcool-cido resistentes;

Curto (formas Tempo de exposio vegetativas) longo Prolongado (esporos) Antisspticos Inativao S agem No atuam sobre enzimtica enquanto em BAAR e esporos contato Fonte: Trabulsi, L.R., Microbiologia. Livraria Atheneu, R.J., 1991. ***- Ativos contra esporos

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

19

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

5. Aula prtica 02: Desinfeco

Objetivo: verificar a ao de antisspticos sobre a microbiota das mos.

5.1. Identificao das Placas de Petri

1- Pegar uma placa de Petri contendo gar, e dividi-la em 4 partes iguais. Utilizar para isso a caneta de retroprojetor, fazendo a diviso na parte de baixo da placa.

2- Identificar cada quadrante com os respectivos ttulos: Controle (C), Mo Suja (MS), Detergente (Det), lcool 70% (A), gua (gua ) e Sabonete (S). Devem ser preparadas 2 placas seguindo o esquema abaixo.

gua

5.2. Desinfeco das mos e inoculao das Placas de Petri

1- No quadrante identificado como Mo Suja o aluno deve encostar o dedo (sem lavar) no gar por 1 minuto. 2- A seguir o mesmo aluno deve lavar as mos com detergente, sec-las levemente e encostar o mesmo dedo no quadrante do gar identificado como Detergente por 1 minuto. 3 -O mesmo aluno deve ento lavar as mos com lcool, sec-las e encostar o mesmo dedo no quadrante do gar identificado como lcool por 1 minuto.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

20

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

4- Proceder de maneira semelhante para a outra placa, substituindo o detergente por gua e o lcool por sabonete (protex). 5- As placas devem ser levadas para incubao, a 30 C por 7 dias.

OBS: Nada deve encostar no quadrante identificado como Controle.

5.3. Relatrio
1- Faa uma representao esquemtica dos resultados obtidos na avaliao da microbiota das mos.

Crescimento Bacteriano
Controle Placa I Mo Suja Detergente lcool 70% Controle Placa II Mo Suja gua Sabonete
2. Discuta os resultados encontrados. 3. Como voc interpreta os resultados obtidos? Qual a importncia da antissepsia das mos no seu dia-dia?

++

+++

++++

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

21

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

6. Aula prtica 03: Testando produtos de limpeza

Objetivo: verificar a eficcia de desinfetantes e outros produtos que prometem acabar com os microorganismos.

6.1. Procedimento
1. Raspe um pouco dos microrganismos que esto nas placas j contaminadas de uma das prticas anteriores; dilua-as em alguns mililitros de gua estril (use um tubo de ensaio).

2. Espalhe 1 ml da mistura de gua com microrganismos nas placas de Petri com meio de cultura, com auxlio da pipeta automtica e da ala de Drigalski.

Aurola transparente: quanto mais eficiente o produto, maior ela ser.

3. Com a pina, molhe o filtro de papel em um dos produtos (desinfetante, gua sanitria, detergente e antibitico)

4. Coloque cada crculo no meio de uma das placas previamente contaminadas e guarde-as na estufa.

5. Aguarde alguns dias. Quanto melhor o produto, maior ser a aurola transparente que aparecer em volta do papel; se for ruim, nada acontecer.

6.2. Relatrio
Relate as observaes realizadas durante a semana, comparando as placas e os produtos entre si. Pesquise sobre a forma de atuao de cada produto utilizado. 22

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

7. Microscopia
O microscpio foi inventado em 1590 por Hans Janssen e seu fiIho Zacharias, dois holandeses fabricantes de culos. Tudo indica, porm, que o primeiro a fazer observaes microscpicas de materiais biolgicos foi o neerlands Antonie van Leeuwenhoek (1632 1723). Os microscpios de Leeuwenhoek eram dotados de uma nica lente, pequena e quase esfrica. Nesses aparelhos ele observou detalhadamente diversos tipos de material biolgico, como embries de plantas, os glbulos vermelhos do sangue e os espermatozides presentes no smen dos animais. Foi tambm Leeuwenhoek quem descobriu a existncia dos micrbios, como eram antigamente chamados os seres microscpicos, hoje conhecidos como microorganismos. Dividem-se basicamente em duas categorias:

Microscpio Luminoso ou tico

Microscopia de Campo Claro Microscopia de Campo Escuro Microscopia de Fluorescncia Microscopia de Contraste de Fase

Microscpio Eletrnico (alemo Ernest Ruska)

Microscpio Eletrnico de Transmisso - MET (para observao de cortes ultrafinos) Microscpio Eletrnico de Varredura MEV (para observao de superfcies) Microscpio Eletrnico de Tunelamento - ME (para visualizao de tomos)

Dentre as tcnicas empregadas em microscopia destacam-se: 1. Microscopia de fundo escuro uma aplicao do princpio de Tyndall. Assim os corpsculos a examinar so fortemente iluminados por feixes luminosos que penetram lateralmente, o que conseguido com condensadores especiais. Deste modo, a nica luz que penetra na objetiva

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

23

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

a difratada pelas partculas presentes na preparao, pelo que passam a ser visveis em fundo escuro.

2. Microscopia de fluorescncia Permite observar microorganismos capazes de fixar substncias fluorescentes. A luz UV, ao incidir nessas partculas, provoca a emisso de luz visvel e observa-se os microorganismos a brilhar em fundo escuro. Como exemplo, o bacilo da tuberculose fixa a auramina, pelo que o diagnstico da doena pode ser feito por microscopia de fluorescncia.

3. Microscopia de contraste de fase Permite a observao de microrganismos vivos, sem colorao, atravs do contraste devido diferena de fase dos raios luminosos que atravessam o fundo relativamente fase da luz que atravessa os microrganismos. Esta diferena de fase conseguida por utilizao de uma objetiva de fase, que consiste num disco de vidro com um escavao circular, de modo que a luz que atravessa a escavao tem diferena de 1/4 de fase em relao que travessa a outra poro do vidro. Assim, os objetos no corados podem funcionar como verdadeiras redes de difrao, pois os pormenores da sua estrutura resultam de pequenas diferenas nos ndices de refraco dos componentes celulares, e estes originam diferenas de fase nas radiaes que os atravessam

Microscpio ptico Poro mecnica P ou base serve de apoio dos restantes componentes do microscpio. Coluna ou Brao fixo base, serve de suporte a outros elementos. Platina onde se fixa a preparao a observar; tem uma janela por onde passam os raios luminosos e tambm parafusos dentados que permitem deslocar a preparao. Tubo ou canho suporta a ocular na extremidade superior. Revlver pea giratria portadora de objetivas de diferentes ampliaes. Parafuso macromtrico a sua rotao responsvel por movimentos verticais da platina, rpidos e de grande amplitude.
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

24

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

Parafuso micromtrico a sua rotao responsvel por movimentos verticais da platina, lentos e de pequena amplitude, permitem aperfeioar a focagem. Charriot - Movimenta a lmina de um lado para o outro, permitindo uma anlise da lmina como um todo.

Parte ptica: Condensador conjunto de duas ou mais lentes convergentes que orientam e espalham regularmente a luz emitida pela fonte luminosa sobre o campo de viso do microscpio. Diafragma permite regular a intensidade da luz que incide no campo de viso do microscpio. Objetivas permitem ampliar a imagem do objeto 10x, 40x, 50x, 90x ou 100x. As objetivas de 10x, 40x e 50x so designadas objetivas secas, pois entre a preparao e a objetiva existe somente ar. As objetivas de 90x e 100x so designadas objetivas de imerso, uma vez que, para as utilizar, necessrio colocar uma gota de leo de imerso entre elas e a preparao, a qual, por ter um ndice de refrao semelhante ao do vidro, evita o desvio do feixe luminoso para fora da objetiva. Oculares sistema de lentes que permitem ampliar a imagem real fornecida pela objetiva, formando uma imagem virtual que se situa a aproximadamente 25 cm dos olhos do observador. As oculares mais utilizadas so as de ampliao 10x, mas nos microscpios binoculares tambm existem oculares de 12,5x, 8x e 6x. Fonte luminosa luz artificial, fornecida por uma lmpada de tungstnio ou de halognio, includa no aparelho juntamente com um interruptor com reostato, que permite regular a intensidade da luz emitida

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

25

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

8. Aula prtica 04: Microscopia a Fresco

Objetivos: utilizar o microscpio para visualizar lminas de microrganismos preparadas pela tcnica a fresco e verificar a morfologia celular.

Sabemos que as bactrias so seres microscpicos, portanto a sua observao direta depende do uso do microscpio. Essa observao pode ser feita mediante o uso de corantes ou a fresco, sem colorao. A microscopia a fresco permite verificar viabilidade, tamanho, forma natural dos microrganismos e atividades celulares como a mobilidade bacteriana. A utilizao do azul de metileno como corante permite verificar a viabilidade celular. Clulas coradas indicam que as clulas esto mortas. As clulas vivas permanecem incolores quando submetidas a esse tratamento, pois usa atividade metablica reduz o corante tornando-o incolor.

8.1. Sem corante

1. Misturar fermento biolgico em gua estril. 2. Com auxlio de uma ala de platina ou ala de inoculao estril, transferir uma gotcula da cultura para o centro de uma lmina. 3. Recobrir a cultura com uma lamnula e levar a microscpio para focalizao.

8.2. Com corante

1. Adicionar algumas gotas de azul de metileno preparao de fermento e aguardar 2 min. 2. Proceder como nos itens 2 e 3 do procedimento (8.1). 3. Observar se as clulas esto coradas ou no.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

26

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

8.3. Com outras culturas

1.Escolher culturas microbianas em meio slido, isoladas em prticas anteriores. 2.Transferir com auxlio da ala de platina ou de inoculao uma gota de gua estril para o centro de uma lmina. 3.Com auxlio da ala de platina retirar um pouco da cultura slida de uma placa de Petri e transferir para a gota de gua sobre a lmina. Se desejar colocar uma gota de azul de metileno sobre a preparao e aguardar 2 min. 4.Proceder como nos itens 2 e 3 do procedimento (8.1).

8.4. Relatrio

1. Desenhe o que foi visualizado na observao direta de microrganismos nas trs lminas.

2. Relatar o que aconteceu quando se utilizou o azul de metileno. 3. Pesquisar outros corantes que possam ser empregados em microscopia.
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

27

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

9. Aula prtica 05: Microscopia de Gram

Objetivos: utilizar o microscpio para visualizar lminas de microrganismos preparadas pela tcnica de Gram e verificar a morfologia celular.

A colorao de Gram consiste em tratar bactrias sucessivamente com cristal violeta, lugol, lcool-acetona e fuccina (ou safranina). As Gram-positivas permanecem roxas, enquanto as Gram-negativas ficam avermelhadas.

9.1. Esfregao de cultura bacteriana slida:

1- Flambe uma ala, deixa esfriar, mantendo-a prximo a chama. 2- Retire uma gota da gua estril e deposite sobre a lmina. 3- Flambe novamente a ala, espere esfriar, e retire uma amostra da cultura slida. 4- Leve a amostra at a gota de gua depositada sobre a lmina, e homogeinize com movimentos circulares, para obter um esfregao de forma oval, uniforme e fino. 5- Fixe o esfregao, passando a lmina na chama do bico de Bunsen, como se cortando a chama, repetindo este procedimento 3 vezes, para que o material fique bem aderido.

9.2. Adio de Corantes:

1- Coloque a lmina com o esfregao sobre um suporte. 2- Cubra a lmina com cristal violeta (Gram I) e deixe agir por 1 minuto. 3- Lave a lmina em jato fraco de gua corrente, do lado contrrio ao esfregao. 4- Cubra a lmina com lugol (Gram II), deixe agir por 1 minuto e depois lave novamente a lmina. 5- Cubra a lmina com a soluo de lcool-acetona (Gram III), verifique a descolorao que deve ocorrer em cerca de 20 segundos. 28

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

6- Cubra a lmina com fuccina (Gram IV), deixe agir por 30 segundos, e, novamente lave a lmina. 7- Seque inicialmente o lado da lmina oposto ao esfregao com papel toalha, e a seguir seque o restante da lmina na chama do bico de Bunsen (como se estivesse cortando a chama). 8- Leve a lmina ao microscpio e observe em objetiva de imerso. (No esquea de colocar uma gota de leo para imerso sobre o esfregao)

9.3. Relatrio
1- Faa um desenho esquemtico do que foi visualizado no microscpio, mostrando a morfologia bacteriana e a reao tintorial.

2- Fale sobre o fundamento da tcnica de Gram, relacionando-o com a estrutura celular da parede das bactrias e de outros microrganismos.
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

29

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

10. Aula prtica 06: Inoculao de uma cultura de leveduras por espalhamento em meio slido
Objetivos: aplicar tcnica de diluio decimal para contagem de colnias microbianas e determinar o nmero de microrganismos por ml.

O objetivo desta anlise determinar o nmero de microrganismos por ml, para isso: Seleciona-se uma das placas incubadas, que contenha entre 20 e 200 colnias; Conta-se o nmero de colnias; Calcula-se a quantidade de microrganismos utilizando a seguinte frmula:

UFC* = (n de colnias) x 10** x (diluio utilizada para contagem) * UFC significa Unidade Formadora de Colnia, uma vez que a contagem feita referente s colnias e no s clulas presentes. ** 10 um fator de correo.

EXEMPLO: Se so contadas 105 colnias em uma placa onde foi feita diluio de 10-2 , o clculo final ser: UFC= 105 x 10 x 102 = 1,05 x 105 UFC/ml

10.1. Preparao de uma srie de diluies decimais de uma cultura de leveduras

1. Preparar tubos de ensaio contendo 9 ml de gua destilada. 2. Esterilizar em autoclave durante 20 minutos a 120C e a 1 atm. 3. Preparar uma suspenso densa da levedura S. cerevisiae num tubo contendo gua estril (Figura 1).
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

30

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

4. Agitar o tubo de ensaio no vortex (cerca de 5 segundos). 5. Com uma pipeta estril de 1 ml ou usando uma pipeta automtica com pontas estreis, retirar assepticamente 1 ml da suspenso microbiana. 6. Introduzir o volume de 1ml da suspenso no primeiro tubo de diluio (10 ). 7. Homogeneizar a suspenso por agitao no vortex. 8. Com uma nova pipeta estril retirar 1 ml da diluio 10 e transferir para outro tubo para obter a diluio 10 . 9. Continuar este procedimento at obter a diluio 10 -6.
-2 -1 -1

Figura 1: Diluies decimais de uma cultura microbiana e inoculao por espalhamento em meio de cultura slido.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

31

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

10.2. Inoculao de uma cultura de leveduras por espalhamento em meio slido

1. Antes de proceder sementeira das placas de Petri, estas devem ser marcadas na parte marginal da sua base com as seguintes indicaes: diluio, data do ensaio, identificao do grupo de trabalho. 2. Selecionar as trs ltimas diluies da suspenso de S. cerevisiae 10 ,10 e 10 . 3. Agitar vigorosamente cada um dos tubos de ensaio contendo a diluio antes de proceder sua inoculao em meio slido. 4. Entreabrir trs placas de Petri com meio YEPD e colocar 0,1 ml de cada uma das trs diluies. 5. Mergulhar o espalhador no copo contendo lcool puro e pass-lo na chama do bico de Bunsen. Deixar a chama apagar no espalhador e esperar cerca de 30 segundos at ele arrefecer. 6. Passar o espalhador sobre a superfcie do meio rodando as placas de Petri com cuidado. Aps algum tempo nota-se uma certa resistncia na movimentao do espalhador, o que indica que o inculo foi absorvido pelo meio. 7. Todas as placas de Petri inoculadas devem ser incubadas temperatura ambiente, durante 24 a 48 horas. Verificar se todas as placas esto devidamente identificadas antes de se colocarem na estufa (25 a 30 C).
-4 -5 -6

As diluies decimais realizadas a partir de suspenses densas de leveduras, se forem adequadas, permitem-nos obter, em placas com YEPD, colnias perfeitamente isoladas o que possibilita a sua contagem com maior rigor. fundamental que o nmero de colnias desenvolvidas nas placas no seja demasiado grande porque algumas clulas podero no formar colnias e a contagem no ser correta. Tambm no deve ser demasiado pequeno de modo a inviabilizar o significado estatstico da contagem. A prtica usual mais vlida consiste em contar colnias apenas nas placas que tenham entre 20 e 200 colnias.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

32

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

OBS:

Composio do meio YEPD* Extrato de levedura 5 g/l Peptona 10 g/l Glicose 20 g/l Agar 20 g/l (para meios de cultura slidos)

10.3. Relatrio
1. Conte o nmero de colnias e calcule o nmero de unidades formadoras de colnias.

2. Pesquise outros procedimentos que permitam determinar a concentrao de microrganismos em uma dada amostra

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

33

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

11. Aula prtica 07: Isolamento de microrganismos de tecido vegetal

Objetivo: isolar microrganismos de tecido vegetal.

11.1. Desinfeco superficial

1.Deixar a amostra vegetal imersa em lcool 70%, em recipiente esterilizado, por 5 min. 2.Proceder lavagem com gua destilada estril para remoo do lcool.

11.2. Inoculao e incubao

1.Inocular em placa de petri contendo gar nutriente. A inoculao deve ser realizada retirando-se pequenos pedaos do material, com auxlio de pina esterilizada, que dever ser colocado ou espalhado sobre o meio. 2.Repetir o procedimento para a placa de petri contendo gar dextrose. 3.Repetir o procedimento para a placa de petri contendo gar carne 4.Incubar em estufa a 30C por alguns dias.

Ateno: no esquecer de anotar a composio e pH dos meios utilizados na prtica, bem como o fabricante.

11.3. Relatrio
1.Avaliar o crescimento e, se possvel contar o nmero de colnias diferentes que possam ter aparecido, em cada uma dos meios utilizados. 2.Comparar os resultados observados para cada placa. OBS: importante verificar quais os microrganismos normalmente isolados em cada meio empregado, para melhor discutir os resultados obtidos.12. Aula prtica 08: Isolamento de microrganismos do ar

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

34

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

12. Aula prtica 08: Isolamento de microrganismos do ar

Objetivo: isolar microrganismos do ar.

12.1. Exposio das placas mtodo da sedimentao

1.Escolher o local de coleta 2.Colocar uma placa de petri contendo o meio gar nutriente, uma contendo gar dextrose e duas contendo gar carne. 3.Aps 5 minutos fechar as placas de gar nutriente, gar dextrose e uma de gar carne. 4.Aps 10 minutos, fechar a segunda placa de gar carne. 5.Incubar a 30 C por 48 h.

Ateno: no esquecer de anotar a composio e pH dos meios utilizados na prtica, bem como o fabricante.

12.2. Relatrio
1.Avaliar o crescimento e, se possvel contar o nmero de colnias diferentes que possam ter aparecido, em cada uma dos meios utilizados para os microrganismos isolados do ar.

2.Comparar os resultados observados para cada placa do item 2, destacando as diferenas observadas em ralao ao tempo de exposio das placas contendo gar carne.

OBS: importante verificar quais os microrganismos normalmente isolados em cada meio empregado, para melhor discutir os resultados obtidos.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

35

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

13. Aula prtica 09: Estragando o mingau

Objetivo: Perceber a necessidade de guardar bem os alimentos para que eles no se contaminem.

13.1. Procedimento
1. Prepare o mingau com o amido de milho e 1 copo de gua. Misture bem e leve ao fogo at engrossar. 2. Coloque o mingau ainda quente at a metade dos bcheres numerados de 1 a 5. 3. Deixe o bcher 1 aberto, em cima da pia do laboratrio. 4. Cubra o 2 com o filme plstico, vede-o, e deixe-o tambm sobre a pia. 5. O 3 completado com 1 colher de sopa de leo. 6. E o 4, completado com 1 colher de sopa de vinagre. 7. O 5 colocado na geladeira, sem cobertura.

13.2. Relatrio
1. Observe em qual mingau apareceram as primeiras alteraes. Depois de uma semana, descrever a aparncia de cada bcher.

2. Discuta os resultados obtidos.

3. Faa pesquisas sobre tcnicas antigas de conservao de alimentos compare com as modernas.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

36

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

14. Aula prtica 10: Microrganismos em Processos Biotecnolgicos

Objetivo: Identificar os microrganismos presentes em produtos comerciais obtidos pela atividade microbiana.

14.1. Procedimento
1.Preparar lminas a fresco e coradas pelo mtodo de Gram, a partir de fermento de po, iogurte, yakult, vinho, etc. 2.Visualizar atravs de microscpio ptico. 3.Identificar os microrganismos presentes.

14.2. Relatrio
Faa um desenho esquemtico do que foi visualizado no microscpio, mostrando a morfologia microbiana e a reao tintorial.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

37

Apostila das aulas prticas de Microbiologia Industrial

15. Confeco dos relatrios

Comear os relatrios com uma breve introduo, de forma a deixar claro os objetivos e as tcnicas que sero empregadas na prtica em questo. No necessrio incluir o procedimento constante do roteiro. Mostrar os resultados obtidos. Pesquisar o que foi pedido no roteiro, neste caso colocando a bibliografia utilizada. Fazer uma concluso.

OBS: A data de entrega do relatrio ser sempre uma semana aps a concluso da prtica. O no cumprimento do prazo implicar na diminuio do valor do mesmo.

Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues

38